CN106434476A

CN106434476A - 一种碱性果胶酶高产菌株及其应用

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Publication number: CN106434476A
Application number: CN201610939523.1A
Authority: CN
Inventors: 张霞; 齐建; 石增秀; 黄亦钧
Original assignee: Qingdao Vland Biotech Group Co Ltd
Current assignee: Qingdao Vland Biotech Group Co Ltd
Priority date: 2016-11-02
Filing date: 2016-11-02
Publication date: 2017-02-22

Abstract

本发明涉及酶制剂技术领域，具体涉及一种高产碱性果胶酶的突变菌株。本发明通过紫外诱变筛选获得的突变菌株枯草芽孢杆菌PW‑2，保藏编号为CCTCC NO:M2016601，其碱性果胶酶的产量得到显著提高，摇瓶发酵酶活高达459U/mL，是出发菌的10倍；而且，其产碱性果胶酶的酶学性质与出发菌株相同，并未发生改变，取得了意料不到的技术效果。所述突变菌株可广泛应用于碱性果胶酶的生产，有利于降低生产成本，实现碱性果胶酶的有效推广和使用。

Description

一种碱性果胶酶高产菌株及其应用

技术领域

本发明涉及基因工程技术领域，具体涉及一种碱性果胶酶高产菌株及其应用。

技术背景

果胶酶为一系列能降解果胶质的复合酶的统称。通常情况下，可根据果胶酶优先作用的底物类型将其分为：原果胶酶、果胶解聚酶、果胶酯酶；根据对底物的作用方式可分为去酯化酶和解聚酶；切割底物的位置分为外切酶和内切酶。

果胶酶按其作用的最适值，分为酸性果胶酶和碱性果胶酶。碱性果胶酶酶来源较广，普遍存在于细菌、酵母菌、霉菌、植物和某些寄生线虫体内。来源于不同微生物的碱性果胶酶生物、理化性质也不同，微生物来源的原果胶酶、果胶醋酶、聚半乳糖醛酸酶和果胶裂解酶的最适有偏酸的、也有偏碱的，而果胶酸裂解酶则全部属于碱性果胶酶。真菌来源的果胶酶最适较细菌来源的偏酸。

自1972年第一篇关于产碱性果胶酶（来自枯草芽孢杆菌）的论文发表后，己发现多种微生物来源的碱性果胶酶，多数为假单胞菌、芽孢杆菌、欧文氏杆菌等细菌，以及少数真菌。2000年之后，分子生物学和基因工程技术发展迅速，逐渐将其应用到碱性果胶酶的生产，构建重组细胞来达到碱性果胶酶高产的目的。

碱性果胶酶应用广范，在茶发酵过程中加入果胶酶可以分解细胞壁中的架胶、破坏细胞壁使茶叶细胞完全浸绩，还可以改善速溶茶粉在冲泡过程中形成泡沫的性，进而改进茶叶发酵；在植物油的榨取时加入果胶酶可以降解细胞壁，还可破坏起乳化作用的果胶，提高了油的收率，而且榨出的油存时也非常稳定，多紛类物质和含量也有所增力口；果胶酶可以作为新型生物防预农药，因其可降解寄主组织的果胶质产生寡聚糖片段，可以与植物细胞膜上的“受体”结合，产生激发植物防卫反应的信号，而且有对人畜无害、不污染环境、不伤害天敌、病原物不会产生抗药性、用量低等有点；在纺织工业中，用碱性果胶酶代替碱，对棉、麻等织物进行煮练加工和整理工艺，以去除初生胞壁中的果胶物质，在比较缓和的值和温度条件下使处理后的织物手感柔软，强度高，取代了耗能大、污染严重的传统热碱脱胶工艺，还可避免因微生物处理造成的纤维素的降解；在造纸行业中，真叶木原料中释放的溶解性胶体物质会严重影响过滤，果胶酶可以降解果胶或聚半乳糖酸酸，减少阳离子聚合物的消耗量，提高纸架的质量；利用果胶还可以处理柑橘加工和蔬菜加工过程中会产生大量含果胶的废水，传统方法成本高、处理时间长，加入果胶酶或产果胶酶的微生物可以分解废水中的果胶，而克服了以上缺点，成本低、效果好且不产生二次污染。碱性果胶酶在饲料添加剂与洗洚剂等方面也都有应。

为了使碱性果胶酶在工业上有更加广泛的应用,使其在不同的反应体系中保持良好的活性，筛选新型碱性果胶酶高产菌株以适应各种pH和温度等是本发明所解决的重点问题。

发明内容

本发明为解决现有技术问题，提供了一株高产碱性果胶酶的枯草芽孢杆菌(Bacillus Subtilis) 菌株。所述枯草芽孢杆菌是通过紫外诱变的方法筛选出的突变株，能大大提高碱性果胶酶的产量，为低成本、规模化生产碱性果胶酶奠定了基础。

本发明一方面涉及一种突变菌株枯草芽孢杆菌PW-2 (Bacillus subtilis PW-2)，已于2016年10月31日保存于中国武汉武汉大学的中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO:M2016601。

本发明还涉及上述枯草芽孢杆菌在碱性果胶酶生产中的应用。

一种生产碱性果胶酶的发酵方法，是以上述枯草芽孢杆菌为发酵菌株。

所述的发酵方法中使用的发酵培养基各组分及其质量百分比分别为：酵母粉1~2%，豆饼粉2~5%，麦芽糊精5~10%，柠檬酸钠0.1~0.5%，CaCl₂ 0.1~0.5%，MgSO₄ 0.1~0.5%，K₂HPO₄ 0.5~2%。

所述的发酵方法中发酵温度选用37℃。

本发明通过紫外诱变筛选获得的突变菌株枯草芽孢杆菌PW-2，其碱性果胶酶的产量得到显著提高，摇瓶发酵酶活高达459U/mL，是出发菌的10倍；而且，其产碱性果胶酶的酶学性质与出发菌株相同，并未发生改变，取得了意料不到的技术效果。所述突变菌株可广泛应用于碱性果胶酶的生产，有利于降低生产成本，实现碱性果胶酶的有效推广和使用。

具体实施方式

下面结合实例对本发明的方法做进一步说明。但实例仅限于说明，并不限于此。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常可按常规条件，如J.萨姆布鲁克（Sambrook）等编写的《分子克隆实验指南》中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件运行。本领域相关的技术人员可以借助实施例更好地理解和掌握本发明。但是，本发明的保护和权利要求范围不限于所提供的案例。

对于本发明所涉及的术语及相关测定方法解释如下：

酶活单位定义：1mL酶液在45℃，pH为9.0条件下，每分钟使聚半乳糖醛酸裂解产生1μmol的不饱和聚半乳糖醛酸的酶量。

酶活测定方法：反应体系中包括粗酶稀释液20 μL，0.2%聚半乳糖醛酸的甘氨酸-氢氧化钠（0.2 mol/L）缓冲液（pH 9.0，含有0.44 mmol/L的CaCl2）2 mL，反应条件为45℃温育15 min，用3 mL0.03 mol/L的磷酸终止反应，在235 nm处测定其吸光度值。酶空白：将2mL上述缓冲体系配制的底物保温2min后，依次加入3 mL0.03 mol/L的磷酸和20μL与实验样相同稀释倍数的灭活的酶液，混匀。其他操作与实验样相同。

计算公式：

酶活力（U/mL）=(103×t×4600×b×粗酶液体积)/( OD235×106×稀释倍数×反应混合液体积)

式中：4600（L.mol-1cm-1）----不饱和聚半乳糖醛酸在235 nm处的摩尔吸光系数

t（min）----酶促反应时间（在酶反应的线性范围内）

b（cm）----比色杯厚度

经简化：酶活力（U/mL）=3.6232×稀释倍数×OD₂₃₅

实施例1枯草芽孢杆菌PW的紫外诱变与筛选

1.1菌悬液制备

将一株重组表达碱性果胶酶的工程菌株枯草芽孢杆菌PW（该菌株是由发明人张霞于2015年2月自行构建得到的）在含氯霉素5 ug/mL的LB固体（胰蛋白胨1%，酵母粉0.5%，氯化钠1%，琼脂2%）平板上划线接种，37℃培养24h；加入10 mL 0.85%的生理盐水，将平板上的菌全部冲洗下来，菌悬液全部转入15mL离心管，5000rpm 离心5min 收集菌体；去上清，用10mL生理盐水悬浮菌体，离心收集菌体，重复两次，涡旋振荡5min，使菌悬液中全部为单细胞菌体，最后调节细胞浓度至OD600=0.3。

1.2 紫外诱变处理及剂量确定

打开9W紫外灯开关，预热约30min。取直径9cm无菌平皿，加入上述细胞浓度为OD600＝0.25的菌悬液7mL，放入一根无菌磁力搅拌器；打开磁力搅拌器，然后打开皿盖，在垂直距离为15cm处，分别搅拌照射0s、10s、20s、30s、40s、50s、60s，盖上皿盖，关闭紫外灯，黑暗中孵育30min。将照射后的菌悬液用0.85％生理盐水10倍稀释法梯度稀释成10^-1～10^-5；取10^-3、10^-4、10^-5三个稀释度的菌悬液各100μL，涂布LB固体平板，每个稀释度涂布三个平板，均匀涂满整个平板表面；以同样的操作，取未经紫外线照射的菌液稀释涂平板作对照。将上述涂布均匀的平板，用报纸包好后，置37℃过夜培养。

统计不同照射时间时每个稀释度下平板上长出的单菌落数，若在某个稀释度下平板上长出的单菌落数在30～300个之间，则认为该稀释度合适。将该稀释度下三个平板上长出的单菌落数求平均值，按下列公式计算菌悬液浓度：

菌悬液浓度(CFU/mL)＝某个稀释度下的菌落平均数×稀释倍数×10

按下列公式计算某个紫外处理剂量下的致死率：

致死率=(未诱变的菌悬液浓度-诱变后的菌悬液浓度)/未诱变的菌悬液浓度×100%

经计算，不同紫外诱变剂量下枯草芽孢杆菌PW的致死率如表1所示

表1 紫外线诱变致死率

从表1的数据可以看出，菌悬液经紫外照射20s后致死率就达到98％，因此最终确定诱变时间为20s。

1.3 透明圈初筛

紫外照射处理20s后，菌悬液中活细胞浓度约10⁵cfu/mL；梯度稀释10²倍，在每个含氯霉素终浓度为5ug/mL的果胶固体培养基平板(果胶5g/L，酵母粉5g/L，蛋白胨5g/L，硫酸镁2g/L，磷酸氢二钾1g/L，pH7.0-7.5) 上均匀涂布100μL上述菌悬液；用报纸包好，37℃培养24h，向平板中加入少量1%CTAB，静置，观察透明圈大小；将透明圈大的菌落重新点种果胶固体培养基平板（含氯霉素5μg/mL），并点种出发菌株枯草芽孢杆菌PW作对照，37℃培养过夜，再比较透明圈大小。最终，申请人获得4株透明圈的直径明显比出发菌大的突变菌株，分别命名为枯草芽孢杆菌PW-1，PW-2，PW-3，PW-4。

1.4 摇瓶复筛

挑取活化后的出发菌株PW和突变菌株PW-1，PW-2，PW-3，PW-4单菌落，分别接种于30mL种子培养基（酵母浸粉0.5%，胰蛋白胨0.5%，葡萄糖1%，K₂HPO₄ 1.8%，氯霉素5μg/mL）中，37℃，200rpm发酵培养6-7 h，获得种子液；按2%的接种量再将种子液转接到30mL发酵培养基（酵母粉1~2%，豆饼粉2~5%，麦芽糊精5~10%，柠檬酸钠0.1~0.5%，CaCl₂ 0.1~0.5%，MgSO₄ 0.1~0.5%，K₂HPO₄ 0.5~2%）中，37℃，200rpm发酵培养24 h，获得发酵液；离心去除菌体，即得到含有碱性果胶酶的粗酶液；分别测定粗酶液中碱性果胶酶的酶活力，具体结果见表2。

表2 出发菌株和突变菌株摇瓶发酵酶活

从表2的结果可以看出，突变菌株枯草芽孢杆菌PW-2的发酵酶活最高，为459U/mL，是出发菌株的10倍，取得了意料不到的技术效果。

实施例2 枯草芽孢杆菌PW-2产碱性果胶酶酶学性质分析

2.1 最适作用温度分析

用pH9.0，0.2mol/L的甘氨酸-氢氧化钠缓冲溶液稀释枯草芽孢杆菌PW-2的发酵粗酶液至20u/ml左右，分别测定35℃、40℃、45℃、50℃、55℃、60℃，65℃、70℃条件下粗酶液中碱性果胶酶的酶活力，以最高酶活计100%，计算相对酶活，做温度-相对酶活曲线，并以出发菌发酵粗酶液中的碱性果胶酶酶活作为对照。

结果显示，本发明获得的突变菌株枯草芽孢杆菌 PW-2产碱性果胶酶的最适作用温度为60℃，在40℃至60℃范围内能保持40%以上的酶活，与出发菌株一致。

2.2 最适作用pH分析

分别采用pH为7.5、8.0、8.5、8.6、9.0、9.6、10.0、10.6的甘氨酸-氢氧化钠缓冲溶液，将枯草芽孢杆菌PW-2的发酵粗酶液稀释到20u/ml左右，多聚半乳糖醛酸底物也分别用对应pH的缓冲液配制，在60℃条件下分别测定粗酶液中碱性果胶酶的酶活力，以最高酶活计100%，计算相对酶活，做pH-相对酶活曲线，并以出发菌株发酵粗酶液中的碱性果胶酶酶活作为对照。

结果显示，本发明获得的突变菌株枯草芽孢杆菌 PW-2产碱性果胶酶的最适作用pH值为9.0，在pH8.5至pH9.5范围内能保持40%以上的酶活，与出发菌株一致。

综上，与出发菌株相比，本发明通过紫外诱变筛选获得的突变菌株枯草芽孢杆菌PW-2，其碱性果胶酶的产量得到显著提高，摇瓶发酵酶活高达459U/mL，是出发菌的10倍；而且，其产碱性果胶酶的酶学性质与出发菌株相同，并未发生改变。

申请人已于2016年10月31日将突变菌株枯草芽孢杆菌 PW-2（Bacillus subtilisPW-2）保藏于中国武汉武汉大学的中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO:M2016601。

Claims

1.一种枯草芽孢杆菌，其特征在于，其保藏编号为CCTCC NO:M2016601。

2.根据权利要求1所述的枯草芽孢杆菌在发酵生产碱性果胶酶中的应用。

3.一种生产碱性果胶酶的发酵方法，其特征在于，以如权利要求1所述的枯草芽孢杆菌为发酵菌株。

4.根据权利要求3所述的发酵方法，其特征在于，所述发酵方法中使用的发酵培养基各组分及其质量百分比分别为：酵母粉1~2%，豆饼粉2~5%，麦芽糊精5~10%，柠檬酸钠0.1~0.5%，CaCl₂ 0.1~0.5%，MgSO₄ 0.1~0.5%，K₂HPO₄ 0.5~2%。

5.根据权利要求3或4所述的发酵方法，其特征在于，所述的发酵温度为37℃。