CN105018447B - 一种利用木霉属真菌高产纤维素酶的方法 - Google Patents

一种利用木霉属真菌高产纤维素酶的方法 Download PDF

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Abstract

一种利用木霉属真菌高产纤维素酶的方法，通过引入辐照技术对水稻秸秆进行改性处理，改善诱导效果，并采用分段诱导发酵工艺，具体包括以下步骤：无菌环境下将木霉属真菌的孢子接种于PDA平板培养基培养，然后挑取一环接种于种子培养基中，摇床振荡培养后得到种子液；按一定接种量将获得的种子液接种到含乳糖的发酵产酶培养基中进行发酵培养；将含槐糖的新鲜碳源通过无菌操作加入到发酵体系中，继续发酵培养；发酵结束后，将获得的发酵液进行离心分离，得到的上清液即为高产纤维素酶酶液。通过本发明获得的纤维素酶酶系结构更加完善，产量高。

Description

一种利用木霉属真菌高产纤维素酶的方法
技术领域
本发明涉及纤维素酶发酵生产技术领域，特别涉及一种利用木霉属真菌高产纤维素酶的方法。
背景技术
纤维素酶是将秸秆中的纤维素催化转化为糖，实现秸秆能源化的关键催化剂，主要由微生物产生。国内目前纤维素酶主要应用于纺织、饲料、食品等领域，年产量较低，难以满足目前市场需求。若秸秆能源化关键技术突破后，纤维素酶的市场需求量将直线上升，有预测需求量可达25～40万吨/年，市场前景巨大。
纤维素酶是一种诱导复合酶，不同的底物对酶系中不同酶的诱导效果不一样，目前采用最多的是玉米秸秆、小麦秸秆等作物秸秆进行诱导，但效果并不理想，因此很多企业逐渐开始利用木材作为替代诱导物。这一方面将增加生产成本，导致纤维素酶成本的增加，直接影响纤维素酶的推广应用，一方面将导致森林资源紧张，不利于环境保护。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是，克服以上背景技术中提到的不足和缺陷，提供一种安全环保、产酶量高、成本低、产品品质好的利用木霉属真菌高产纤维素酶的方法。
为解决上述技术问题，本发明提出的技术方案为一种利用木霉属真菌高产纤维素酶的方法，包括以下步骤：
(1)无菌环境下将木霉属(Trichoderma)真菌的孢子接种于PDA平板培养基培养，然后挑取一环接种于种子培养基中，摇床振荡培养后得到种子液；
(2)按一定接种量将步骤(1)中获得的种子液接种到含乳糖的发酵产酶培养基(特别优选是以辐照水稻秸秆粉和乳糖为诱导碳源的发酵产酶培养基)中进行发酵培养；
(3)将含槐糖的新鲜碳源通过无菌操作加入到步骤(2)后的发酵体系中，继续发酵培养；
(4)发酵结束后，将步骤(3)后获得的发酵液进行离心分离，得到的上清液即为高产纤维素酶酶液。
上述方法的步骤(1)中，优选的，用作发酵菌株的木霉属真菌为绿色木霉(Trichoderma viride)、里氏木霉(Trichoderma reesei)、康氏木霉(Trichodermakoningi)或拟康氏木霉(Trichoderma pseudokoningii)。
上述方法的步骤(1)中，优选的，PDA平板培养基培养是指在28～32℃下培养96～120h。
上述方法的步骤(1)中，优选的，所述种子培养基的制作过程为：将200g马铃薯切成小块加入800ml水，煮沸30min，用纱布过滤，滤液冷却后加入20g葡萄糖，定容至1L，120℃下灭菌15min。在种子培养基中进行培养是指在28～32℃、转速100～200r/min的摇床中振荡培养24～72h。
上述方法的步骤(2)中，优选的，所述接种量为4％～8％，所述发酵培养是指在温度为28～32℃、转速为100～200r/min的摇床中发酵60～84h。
上述方法的步骤(2)中，优选的，所述发酵产酶培养基包含以下质量份数的组分：
硫酸铵1～3份，
胰蛋白胨0.2～0.6份，
吐温-800.5～1.5份
硫酸镁0.2～0.4份，
硫酸锰0.2～0.4份，
氯化钴0.01～0.02份，
氯化钙0.2～0.4份，
磷酸二氢钾0.5～1.5份，
乳糖2～6份，
辐照水稻秸秆粉4～8份，
水900～1200份。
以上组分混合后105～125℃下灭菌10～20min。
上述方法的步骤(3)中，优选的，所述新鲜碳源的制作过程包括：
按质量比1～2∶1称取干甜叶菊渣和辐照水稻秸秆粉，加水后，90～120℃下保持20～30min。
上述新鲜碳源的加工制作中，选用的原料甜叶菊渣和水稻秸秆粉都属于天然纤维碳源，且都是我国农业的常见废弃物，在我国有很大的产量，通过利用农业生产中的废弃物作为本发明发酵培养基的碳源，不仅节省成本，而是还可实现纤维素酶的高产。另外，甜叶菊中的甜菊苷含有槐糖基，而经辐照预处理后水稻秸秆粉在水溶液中释放出有机酸，在高温下能将甜叶菊渣中残留的甜菊苷转化为槐糖，槐糖是目前公认的诱导纤维素酶产生的最佳诱导物质，微量的槐糖就能起到明显的诱导作用。
上述方法中，更优选的，所述辐照水稻秸秆粉是采用下述方法制备得到：
将干燥的水稻秸秆粉碎至30～50目，充氧密封包装，包装袋中氧气浓度≥21％，然后用60Co-γ射线对其中的水稻秸秆进行辐照处理，处理剂量在20～200kGy，处理完成后得到辐照水稻秸秆粉。
上述辐照水稻秸秆粉的加工制作中，我们特别采用了辐照预处理工艺，辐照预处理是一种利用高能射线将秸秆降解的预处理手段，绿色环保无污染；采用辐照对水稻秸秆进行预处理，能使秸秆中部分大分子物质如纤维素类被降解成小分子纤维素、寡糖、二糖甚至单糖，一部分物质在辐照过程中被氧化成其它物质如糖酸、糖酯等物质，这些小分子物质具有诱导维素酶产生菌产生纤维素酶的作用，从而能提高纤维素酶的产量。
上述方法的步骤(3)中，优选的，继续发酵培养的温度为28～32℃，时间为48～72h。
上述本发明的方法中采用了分段发酵方式，即先通过含乳糖和辐照水稻秸秆粉的发酵产酶培养基进行发酵培养，再通过添加新鲜含槐糖和辐照水稻秸秆粉的碳源进行后续发酵培养，之所以采用这种分段发酵方式，是因为乳糖能很好诱导β-葡萄糖苷酶产生，而槐糖诱导外切酶和内切酶效果很好，但对β-葡萄糖苷酶诱导效果不佳，甚至抑制其产生，因此前期采用乳糖诱导β-葡萄糖苷酶生成，后期采用补加碳源方式诱导酶系中其它酶生成，这样能够改善纤维素酶的组分的结构比例，提高纤维酶产量。
与现有技术相比，本发明的优点在于：
1)本发明充分利用甜叶菊渣和水稻秸秆等现有的农业废弃物作为发酵原料，不仅节省了纤维素酶的生产成本，而且解决了农业废弃物的处理问题：既有助于减少农业废弃物对环境的影响，又提供了一种变废为宝的途径；
2)本发明将辐照技术引入到微生物发酵制备纤维素酶的工艺中：通过引入辐照预处理措施可将水稻秸秆这一农业废弃物加工成优质的发酵培养基的碳源，改善了水稻秸秆粉的诱导效果；加以合适的条件，辐照处理的水稻秸秆能使甜叶菊渣释放出槐糖这种高效纤维素酶诱导剂，大大改善了诱导效果；
3)本发采用了不同碳源分段诱导的纤维素酶制备工艺，克服了现有生物发酵制备纤维素酶过程中酶产量低、诱导底物效果不理想的问题，使得纤维素酶酶系结构更加完善，产量得到提高。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为本发明利用木霉属真菌高产纤维素酶的方法的工艺流程图。
具体实施方式
为了便于理解本发明，下文将结合说明书附图和较佳的实施例对本发明作更全面、细致地描述，但本发明的保护范围并不限于以下具体的实施例。
除非另有定义，下文中所使用的所有专业术语与本领域技术人员通常理解的含义相同。本文中所使用的专业术语只是为了描述具体实施例的目的，并不是旨在限制本发明的保护范围。
除非另有特别说明，本发明中用到的各种原材料、试剂、仪器和设备等均可通过市场购买得到或者可通过现有方法制备得到。
实施例1：
一种如图1所示的利用绿色木霉(Trichoderma viride)高产纤维素酶的方法，包括以下步骤：
(1)无菌环境下将绿色木霉的孢子接种于PDA平板培养基培养，于30℃下振荡培养96h，然后挑取一环接种于种子培养基中。种子培养基的制作过程为：将200g马铃薯切成小块加入800ml水，煮沸30min，用纱布过滤，滤液冷却后加入20g葡萄糖，定容至1L，120℃下灭菌15min。在种子培养基中进行摇床振荡培养，在温度30℃、转速130r/min的摇床中培养48h，振荡培养后得到种子液。
(2)按5％的接入量接入步骤(1)中得到的种子液到发酵产酶培养基中，在温度为30℃、转速为130r/min的摇床中发酵70h。发酵产酶培养基的配方及制作方法为：称取硫酸铵2g，胰蛋白胨0.4g，吐温-801mL，硫酸镁0.3g，硫酸锰0.3g，氯化钴0.01g，氯化钙0.3g，磷酸二氢钾1.0g，乳糖3g，辐照水稻秸秆粉5g，加入1L水，120℃下灭菌15min。
(3)将新鲜碳源通过无菌操作加入步骤(2)后的发酵体系中，在30℃下继续发酵48h。新鲜碳源制作过程为：称取干甜叶菊渣4g和辐照水稻秸秆粉4g，加入50ml水，100℃下保持30min。
上述步骤用到的辐照水稻秸秆粉的制作过程为：将干燥的水稻秸秆粉碎至40目，充氧密封包装，包装袋中氧气浓度为80％，用60Co-γ射线辐照处理，处理剂量约为100kGy。
(4)发酵结束后，将步骤(3)后获得的发酵液进行离心分离，在4000r/min离心机上离心10min，得到的上清液即为高产纤维素酶酶液。
对比例：
一种利用绿色木霉(Trichoderma viride)产纤维素酶的方法，包括以下步骤：
(1)无菌环境下将绿色木霉的孢子接种于PDA平板培养基培养，于30℃下振荡培养96h，然后挑取一环接种于种子培养基中。种子培养基的制作过程为：将200g马铃薯切成小块加入800ml水，煮沸30min，用纱布过滤，滤液冷却后加入20g葡萄糖，定容至1L，120℃下灭菌15min。在种子培养基中进行摇床振荡培养，在温度30℃、转速130r/min的摇床中培养48h，振荡培养后得到种子液。
(2)按5％的接入量接入步骤(1)中得到的种子液到发酵产酶培养基中，在温度为30℃、转速为130r/min的摇床中发酵136h。发酵产酶培养基的配方及制作方法为：称取硫酸铵2g，胰蛋白胨0.4g，吐温-801mL，硫酸镁0.3g，硫酸锰0.3g，氯化钴0.01g，氯化钙0.3g，磷酸二氢钾1.0g，水稻秸秆粉20g，加入1L水，120℃下灭菌15min。
(3)发酵结束后，将步骤(2)后获得的发酵液进行离心分离，在4000r/min离心机上离心10min，得到的上清液即为纤维素酶酶液。
通过本实施例1获得的滤纸酶活力为279FPU/ml，而采用对比例的步骤获得滤纸酶活力为188FPU/ml，本发明获得的滤纸酶活力较对照提高了约48％。
实施例2：
一种如图1所示的利用里氏木霉(Trichoderma reesei)高产纤维素酶的方法，包括以下步骤：
(1)无菌环境下将里氏木霉的孢子接种于PDA平板培养基培养，于28℃下振荡培养96h，然后挑取一环接种于种子培养基中。种子培养基的制作过程为：将200g马铃薯切成小块加入800ml水，煮沸30min，用纱布过滤，滤液冷却后加入20g葡萄糖，定容至1L，120℃下灭菌15min。在种子培养基中进行摇床振荡培养，在温度28℃、转速130r/min的摇床中培养48h，振荡培养后得到种子液。
(2)按4％的接入量接入步骤(1)中得到的种子液到发酵产酶培养基中，在温度为28℃、转速为130r/min的摇床中发酵72h。发酵产酶培养基的配方及制作方法为：称取硫酸铵2g，胰蛋白胨0.4g，吐温-801mL，硫酸镁0.3g，硫酸锰0.3g，氯化钴0.015g，氯化钙0.3g，磷酸二氢钾1.0g，乳糖4g，辐照水稻秸秆粉6g，加入1L水，120℃下灭菌15min。
(3)将新鲜碳源通过无菌操作加入步骤(2)后的发酵体系中，在28℃下继续发酵48h。新鲜碳源制作过程为：称取干甜叶菊渣4.5g和辐照水稻秸秆粉4g，加入40ml水，100℃下保持20min。
上述步骤用到的辐照水稻秸秆粉的制作过程为：将干燥的水稻秸秆粉碎至40目，充氧密封包装，包装袋中氧气浓度为90％，用60Co-γ射线辐照处理，处理剂量约为80kGy。
(4)发酵结束后，将步骤(3)后获得的发酵液进行离心分离，在4000r/min离心机上离心10min，得到的上清液即为高产纤维素酶酶液。
对比例：
一种利用里氏木霉(Trichoderma reesei)产纤维素酶的方法，包括以下步骤：
(1)无菌环境下将里氏木霉的孢子接种于PDA平板培养基培养，于30℃下振荡培养96h，然后挑取一环接种于种子培养基中。种子培养基的制作过程为：将200g马铃薯切成小块加入800ml水，煮沸30min，用纱布过滤，滤液冷却后加入20g葡萄糖，定容至1L，120℃下灭菌15min。在种子培养基中进行摇床振荡培养，在温度30℃、转速130r/min的摇床中培养48h，振荡培养后得到种子液。
(2)按5％的接入量接入步骤(1)中得到的种子液到发酵产酶培养基中，在温度为30℃、转速为130r/min的摇床中发酵136h。发酵产酶培养基的配方及制作方法为：称取硫酸铵2g，胰蛋白胨0.4g，吐温-801mL，硫酸镁0.3g，硫酸锰0.3g，氯化钴0.01g，氯化钙0.3g，磷酸二氢钾1.0g，水稻秸秆粉20g，加入1L水，120℃下灭菌15min。
(3)发酵结束后，将步骤(2)后获得的发酵液进行离心分离，在4000r/min离心机上离心10min，得到的上清液即为纤维素酶酶液。
通过本实施例获得的滤纸酶活力为261FPU/ml，而采用对比例的步骤获得的滤纸酶活力仅为169FPU/ml，本发明获得的滤纸酶活力较对照提高了约54％。
实施例3：
一种如图1所示的利用康氏木霉(Trichoderma koningi)高产纤维素酶的方法，包括以下步骤：
(1)无菌环境下将康氏木霉的孢子接种于PDA平板培养基培养，于30℃下振荡培养96h，然后挑取一环接种于种子培养基中。种子培养基的制作过程为：将200g马铃薯切成小块加入800ml水，煮沸30min，用纱布过滤，滤液冷却后加入20g葡萄糖，定容至1L，120℃下灭菌15min。在种子培养基中进行摇床振荡培养，在温度30℃、转速130r/min的摇床中培养48h，振荡培养后得到种子液。
(2)按6％的接入量接入步骤(1)中得到的种子液到发酵产酶培养基中，在温度为30℃、转速为130r/min的摇床中发酵60h。发酵产酶培养基的配方及制作方法为：称取硫酸铵2g，胰蛋白胨0.4g，吐温-801mL，硫酸镁0.3g，硫酸锰0.3g，氯化钴0.02g，氯化钙0.3g，磷酸二氢钾1.0g，乳糖3g，辐照水稻秸秆粉5g，加入1L水，120℃下灭菌15min。
(3)将新鲜碳源通过无菌操作加入步骤(2)后的发酵体系中，在30℃下继续发酵48h。新鲜碳源制作过程为：称取干甜叶菊渣4g和辐照水稻秸秆粉4g，加入50ml水，100℃下保持30min。
上述步骤用到的辐照水稻秸秆粉的制作过程为：将干燥的水稻秸秆粉碎至40目，充氧密封包装，包装袋中氧气浓度为90％，用60Co-γ射线辐照处理，处理剂量约为80kGy。
(4)发酵结束后，将步骤(3)后获得的发酵液进行离心分离，在4000r/min离心机上离心10min，得到的上清液即为高产纤维素酶酶液。
对比例：
一种利用康氏木霉(Trichoderma koningi)产纤维素酶的方法，包括以下步骤：
(1)无菌环境下将康氏木霉的孢子接种于PDA平板培养基培养，于30℃下振荡培养96h，然后挑取一环接种于种子培养基中。种子培养基的制作过程为：将200g马铃薯切成小块加入800ml水，煮沸30min，用纱布过滤，滤液冷却后加入20g葡萄糖，定容至1L，120℃下灭菌15min。在种子培养基中进行摇床振荡培养，在温度30℃、转速130r/min的摇床中培养48h，振荡培养后得到种子液。
(2)按5％的接入量接入步骤(1)中得到的种子液到发酵产酶培养基中，在温度为30℃、转速为130r/min的摇床中发酵136h。发酵产酶培养基的配方及制作方法为：称取硫酸铵2g，胰蛋白胨0.4g，吐温-801mL，硫酸镁0.3g，硫酸锰0.3g，氯化钴0.01g，氯化钙0.3g，磷酸二氢钾1.0g，水稻秸秆粉20g，加入1L水，120℃下灭菌15min。
(3)发酵结束后，将步骤(2)后获得的发酵液进行离心分离，在4000r/min离心机上离心10min，得到的上清液即为纤维素酶酶液。
通过本实施例获得的滤纸酶活力为164FPU/ml，而采用对比例的步骤获得的滤纸酶活力仅为118FPU/ml，本发明获得的滤纸酶活力较对照提高了约39％。
实施例4：
一种如图1所示的利用拟康氏木霉(Trichoderma pseudokoningii)高产纤维素酶的方法，包括以下步骤：
(1)无菌环境下将拟康氏木霉的孢子接种于PDA平板培养基培养，于30℃下振荡培养96h，然后挑取一环接种于种子培养基中。种子培养基的制作过程为：将200g马铃薯切成小块加入800ml水，煮沸30min，用纱布过滤，滤液冷却后加入20g葡萄糖，定容至1L，120℃下灭菌15min。在种子培养基中进行摇床振荡培养，在温度30℃、转速130r/min的摇床中培养48h，振荡培养后得到种子液。
(2)按5％的接入量接入步骤(1)中得到的种子液到发酵产酶培养基中，在温度为30℃、转速为130r/min的摇床中发酵72h。发酵产酶培养基的配方及制作方法为：称取硫酸铵2g，胰蛋白胨0.4g，吐温-801mL，硫酸镁0.3g，硫酸锰0.3g，氯化钴0.02g，氯化钙0.3g，磷酸二氢钾1.0g，乳糖4g，辐照水稻秸秆粉5g，加入1L水，120℃下灭菌15min。
(3)将新鲜碳源通过无菌操作加入步骤(2)后的发酵体系中，在30℃下继续发酵72h。新鲜碳源制作过程为：称取干甜叶菊渣5g和辐照水稻秸秆粉3g，加入40ml水，100℃下保持25min。
上述步骤用到的辐照水稻秸秆粉的制作过程为：将干燥的水稻秸秆粉碎至30目，充氧密封包装，包装袋中氧气浓度为100％，用60Co-γ射线辐照处理，处理剂量约为80kGy。
(4)发酵结束后，将步骤(3)后获得的发酵液进行离心分离，在4000r/min离心机上离心10min，得到的上清液即为高产纤维素酶酶液。
对比例：
一种利用拟康氏木霉(Trichoderma pseudokoningii)产纤维素酶的方法，包括以下步骤：
1)无菌环境下将拟康氏木霉(Trichoderma pseudokoningii)的孢子接种于PDA平板培养基培养，于30℃下振荡培养96h，然后挑取一环接种于种子培养基中。种子培养基的制作过程为：将200g马铃薯切成小块加入800ml水，煮沸30min，用纱布过滤，滤液冷却后加入20g葡萄糖，定容至1L，120℃下灭菌15min。在种子培养基中进行摇床振荡培养，在温度30℃、转速130r/min的摇床中培养48h，振荡培养后得到种子液。
(2)按5％的接入量接入步骤(1)中得到的种子液到发酵产酶培养基中，在温度为30℃、转速为130r/min的摇床中发酵136h。发酵产酶培养基的配方及制作方法为：称取硫酸铵2g，胰蛋白胨0.4g，吐温-801mL，硫酸镁0.3g，硫酸锰0.3g，氯化钴0.01g，氯化钙0.3g，磷酸二氢钾1.0g，水稻秸秆粉20g，加入1L水，120℃下灭菌15min。
(3)发酵结束后，将步骤(2)后获得的发酵液进行离心分离，在4000r/min离心机上离心10min，得到的上清液即为纤维素酶酶液。
通过本实施例获得的滤纸酶活力为136FPU/ml，而采用对比例的步骤获得的滤纸酶活力仅为103FPU/ml，本发明获得的滤纸酶活力较对照提高了约32％。

Claims (9)

1.一种利用木霉属真菌高产纤维素酶的方法，包括以下步骤：
(1) 无菌环境下将木霉属(Trichoderma) 真菌的孢子接种于PDA 平板培养基培养，然后挑取一环接种于种子培养基中，摇床振荡培养后得到种子液；
(2) 按一定接种量将步骤(1) 中获得的种子液接种到含乳糖的发酵产酶培养基中进行发酵培养60 ～84h；
(3) 将按质量比1 ～ 2 ∶ 1 称取干甜叶菊渣和辐照水稻秸秆粉，加水后，90 ～ 120℃下保持20 ～ 30min制得的含有槐糖的新鲜碳源通过无菌操作加入到步骤(2) 后的发酵体系中，继续发酵培养；
(4) 发酵结束后，将步骤(3) 后获得的发酵液进行离心分离，得到的上清液即为高产纤维素酶酶液。
2.根据权利要求1 所述的方法，其特征在于，所述步骤(1) 中，用作发酵菌株的木霉属真菌为绿色木霉(Trichodermaviride)、里氏木霉(Trichodermareesei)、康氏木霉(Trichodermakoningi) 或拟康氏木霉(Trichoderma pseudokoningii)。
3.根据权利要求1 所述的方法，其特征在于，所述步骤(1) 中，PDA 平板培养基培养是指在28℃～ 32℃下培养96 ～ 120h。
4.根据权利要求2 所述的方法，其特征在于，所述步骤(1) 中，摇床振荡培养是指在28℃～ 32℃、转速100 ～ 200r/min 的摇床中培养24 ～ 72h。
5.根据权利要求1 所述的方法，其特征在于，所述步骤(2) 中，所述接种量为4％～8％，所述发酵培养是指在温度为28℃～ 32℃、转速为100 ～ 200r/min 的摇床中发酵。
6.根据权利要求1 ～ 5 中任一项所述的方法，其特征在于，所述步骤(2) 中，所述发酵产酶培养基包含以下质量份数的组分：
硫酸铵 1 ～ 3 份，
胰蛋白胨 0.2 ～ 0.6 份，
吐温 -80 0.5 ～ 1.5 份,
硫酸镁 0.2 ～ 0.4 份，
硫酸锰 0.2 ～ 0.4 份，
氯化钴 0.01 ～ 0.02 份，
氯化钙 0.2 ～ 0.4 份，
磷酸二氢钾 0.5 ～ 1.5 份，
乳糖 2 ～ 6 份，
辐照水稻秸秆粉 4 ～ 8 份，
水 900 ～ 1200 份。
7.根据权利要求6 所述的方法，其特征在于，所述辐照水稻秸秆粉是采用下述方法制备得到：
将干燥的水稻秸秆粉碎至30 ～ 50 目，充氧密封包装，包装袋中氧气浓度≥ 21％，然后用60Co-γ射线对其中的水稻秸秆进行辐照处理，处理剂量在20 ～ 200kGy，处理完成后得到辐照水稻秸秆粉。
8.根据权利要求1 所述的方法，其特征在于，所述步骤(3) 中辐照水稻秸秆粉是采用下述方法制备得到：
将干燥的水稻秸秆粉碎至30 ～ 50 目，充氧密封包装，包装袋中氧气浓度≥ 21％，然后用60Co-γ射线对其中的水稻秸秆进行辐照处理，处理剂量在20 ～ 200kGy，处理完成后得到辐照水稻秸秆粉。
9.根据权利要求1 ～ 5 中任一项所述的方法，其特征在于，所述步骤(3) 中，继续发酵培养的温度为28 ～ 32℃，时间为48 ～ 72h。
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