CN106434519A - 芽孢杆菌芽孢的纯化方法 - Google Patents

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Abstract

本案涉及芽孢杆菌芽孢的纯化方法，包括：无菌水洗涤，浓缩；重盐洗液洗涤；酶溶液孵育；表面活性剂溶液洗涤；酶抑制剂溶液洗涤；无菌水再次洗涤；置于80℃水浴中灭菌；最终得到的芽孢杆菌芽孢以无菌水混悬，保存。本案在保证制备的芽孢数量的同时，极大提高了芽孢纯度；通过本案纯化方法可有效去除菌体营养细胞、培养基残留物质及破裂营养细胞释放的蛋白酶等活性物质，有效避免上述物质对芽胞的诱导转化；更利于芽孢悬液在水溶液中的长期保存；本工艺操作简单，工艺易于放大，衰减小，重复性好，易于工业化生产。

Description

芽孢杆菌芽孢的纯化方法
技术领域
本发明涉及一种微生物芽孢制备领域，具体涉及一种芽孢杆菌芽孢的纯化方法。
背景技术
芽孢是在一定条件下，细菌的细胞质高度浓缩脱水所形成的一种抗逆性很强的休眠体，其具有极强的抗逆性，可耐受高温、低温、干燥、化学药物、营养缺乏等恶劣环境；依据其特点，芽孢杆菌的芽孢在各领域被广泛应用。
由于芽孢杆菌的芽孢在颗粒料、粉料的加工过程中以及酸性环境中具有较高稳定性，储藏时间长，部分益生芽孢杆菌芽孢作为微生物添加剂，被用于饲料添加剂、口服益生菌制剂等，如枯草芽孢杆菌。同时，芽孢作为目前整个微生物界中抗逆性最强的生命体，在抗热，抗化学药物和抗辐射等方面，抵抗力极强，因此是否能消灭芽孢是衡量各种消毒灭菌手段的最重要的指标。
生物指示剂以芽孢为指示菌株，用以监测消毒灭菌效果，是判断灭菌效果的金标准。比如，嗜热脂肪芽孢杆菌(ATCC 7953)芽孢被用于监测压力蒸汽灭菌、过氧化氢低温等离子体灭菌等，枯草芽胞杆菌黑色变种(ATCC 9372)芽胞被用于监测环氧乙烷灭菌、干热灭菌等。
芽孢的纯度及芽孢抗力是准确评价各种因子对医疗器械消毒与灭菌效果的前提。依据中国药典及美国药典的要求，生物指示剂中的芽孢数量、芽孢与菌体营养细胞的比例必须达到一定程度，才能较好的反映灭菌效果。
目前，芽孢生产制备的方案较多，主要集中在提高产孢数量和芽孢产率方面，但芽孢率均未能达到100％。因此，为达到更充分的利用效果，需要对生产制备的芽孢进行分离纯化，除去其中的细菌营养细胞、其他培养基残留营养、及菌体裂解产生的酶等芽孢活化因子(诱导芽孢转化为营养细胞)。
在现有研究文献中，将达到一定芽孢率的芽孢、菌体混合物收集，采用如下方法纯化芽孢：
(1)离心法：如将混合物2000rpm离心，(芽孢为白色，菌体及培养基杂质近乎灰色)，芽孢位于离心管底部，菌体杂质位于芽孢上面，通过用小心刮取，去除菌体杂质。
(2)热激法：将装载混合物的离心管，置于100℃水浴，加热5min。离心3次，去除上清，获得芽孢沉淀。
(3)玻璃珠破碎法：将混合物中加入玻璃珠，涡旋震荡，破碎5min不等。再纱布过滤，收集后离心洗涤3次，悬于纯水，4℃保存。
上述三种方法缺点分别为：(1)离心法：操作可控性差。(2)热激可能激活芽孢，使之发芽转化为营养细胞。(3)玻璃珠破碎法：芽孢损失严重。且这三种方法的操作性较差，纯度不能达到100％，工艺放大衰减严重，重现性较差。
发明内容
针对现有技术的不足之处，本发明的目的在于提出一种芽孢杆菌芽孢的纯化方法，其在不损伤芽孢，保证芽孢抗力的前提下，去除芽孢悬液中的培养基残留营养、菌体营养细胞及破裂营养细胞释放的蛋白酶等活性物质，保证芽孢在水溶液中长期保存。
为实现上述目的，本发明的技术方案概述如下：
一种芽孢杆菌芽孢的纯化方法，其包括以下步骤：
1)无菌水洗涤：将芽孢杆菌芽孢粗品用无菌水在5000rpm、4℃下离心洗涤；并将芽孢杆菌芽孢的浓度调节至105-108/mL，得到芽孢菌体混合液；
2)重盐洗涤：向所述芽孢菌体混合液中加入5-15倍重量的重盐洗液，混匀，在5000rpm、4℃下离心，去上清，得沉淀一；
3)酶溶液孵育：向所述沉淀一中加入酶消化液，悬浮沉淀，调节芽孢浓度至104-106/mL，37℃水浴加热1h后，在5000rpm、4℃下离心，去上清，得沉淀二；
4)表面活性剂溶液洗涤：向所述沉淀二中加入表面活性剂溶液，使芽孢浓度达到104-106/mL，混匀后，在5000rpm、4℃下离心，去上清，得沉淀三；
5)酶抑制剂溶液洗涤：向沉淀三中加入酶抑制剂溶液，混匀后，在5000rpm、4℃下离心，去上清，得沉淀四；
6)无菌水洗涤：向所述沉淀四加入无菌水(洗去残留的洗涤剂和杂质)，震荡混匀后，在5000rpm、4℃下离心，去上清，得沉淀五；再次加入无菌水，混匀，置于80℃水浴中灭菌20min，离心；最终得到的芽孢杆菌芽孢以无菌水混悬，保存。
优选的是，所述的芽孢杆菌芽孢的纯化方法，其中，所述高盐溶液包括有1M的KCl、0.5M的NaCl和无菌水。高盐溶液的作用是改变渗透压，使菌体脱水。
优选的是，所述的芽孢杆菌芽孢的纯化方法，其中，所述酶消化溶液包括有50μg/ml的溶菌酶和无菌水。溶菌酶有破壁的功能，能去除菌体。
优选的是，所述的芽孢杆菌芽孢的纯化方法，其中，所述表面活性剂溶液包括有0.05wt％的十二烷基硫酸钠和无菌水。表面活性剂溶液可使蛋白变性，从而去除营养物质及菌体裂解物质。
优选的是，所述的芽孢杆菌芽孢的纯化方法，其中，所述酶抑制剂溶液包括有50mM的Tris-HCl缓冲液、10mM的EDTA、2mM的苯甲基磺酰氟和无菌水。酶抑制剂溶液的作用是抑制酶活性、除去离子等。
优选的是，所述的芽孢杆菌芽孢的纯化方法，其中，所述高盐溶液还包括有0.1M的ZnCl2。
优选的是，所述的芽孢杆菌芽孢的纯化方法，其中，所述高盐溶液还包括有0.1M的AlCl3。
本发明的有益效果是：
1、本案在保证制备的芽孢数量的同时，极大提高了芽孢纯度；
2、通过本案纯化方法可有效去除菌体营养细胞、培养基残留物质及破裂营养细胞释放的蛋白酶等活性物质，有效避免上述物质对芽胞的诱导转化；更利于芽孢悬液在水溶液中的长期保存；
3、本工艺操作简单，工艺易于放大，衰减小，重复性好，易于工业化生产。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明做进一步的详细说明，以令本领域技术人员参照说明书文字能够据以实施。
实施例1
一种芽孢杆菌芽孢的纯化方法，其包括以下步骤：
1)无菌水洗涤：将芽孢杆菌芽孢粗品(投放量1g)用无菌水在5000rpm、4℃下离心洗涤；并将芽孢杆菌芽孢的浓度调节至108/mL，得到芽孢菌体混合液；
2)重盐洗涤：向芽孢菌体混合液中加入15倍重量的重盐洗液，混匀，在5000rpm、4℃下离心，去上清，得沉淀一；
3)酶溶液孵育：向沉淀一中加入酶消化液，悬浮沉淀，调节芽孢浓度至106/mL，37℃水浴加热1h后，在5000rpm、4℃下离心，去上清，得沉淀二；
4)表面活性剂溶液洗涤：向沉淀二中加入表面活性剂溶液，使芽孢浓度达到106/mL，混匀后，在5000rpm、4℃下离心，去上清，得沉淀三；
5)酶抑制剂溶液洗涤：向沉淀三中加入酶抑制剂溶液，混匀后，在5000rpm、4℃下离心，去上清，得沉淀四；
6)无菌水洗涤：向沉淀四加入无菌水，震荡混匀后，在5000rpm、4℃下离心，去上清，得沉淀五；再次加入无菌水，混匀，置于80℃水浴中灭菌20min，离心；最终得到的芽孢杆菌芽孢以无菌水混悬，保存。
其中，高盐溶液包括有1M的KCl、0.5M的NaCl和无菌水。
其中，酶消化溶液包括有50μg/ml的溶菌酶和无菌水。
其中，表面活性剂溶液包括有0.05wt％的十二烷基硫酸钠和无菌水。
其中，酶抑制剂溶液包括有50mM的Tris-HCl缓冲液、10mM的EDTA、2mM的苯甲基磺酰氟和无菌水。
结果分析：纯化前，芽孢杆菌芽孢粗品的芽孢纯度为89％；纯化后，芽孢纯度为97％，芽孢数量保持在108/mL，未发生损失。
实施例2
一种芽孢杆菌芽孢的纯化方法，其包括以下步骤：
1)无菌水洗涤：将芽孢杆菌芽孢粗品(投放量1g)用无菌水在5000rpm、4℃下离心洗涤；并将芽孢杆菌芽孢的浓度调节至105/mL，得到芽孢菌体混合液；
2)重盐洗涤：向芽孢菌体混合液中加入5倍重量的重盐洗液，混匀，在5000rpm、4℃下离心，去上清，得沉淀一；
3)酶溶液孵育：向沉淀一中加入酶消化液，悬浮沉淀，调节芽孢浓度至104/mL，37℃水浴加热1h后，在5000rpm、4℃下离心，去上清，得沉淀二；
4)表面活性剂溶液洗涤：向沉淀二中加入表面活性剂溶液，使芽孢浓度达到104/mL，混匀后，在5000rpm、4℃下离心，去上清，得沉淀三；
5)酶抑制剂溶液洗涤：向沉淀三中加入酶抑制剂溶液，混匀后，在5000rpm、4℃下离心，去上清，得沉淀四；
6)无菌水洗涤：向沉淀四加入无菌水，震荡混匀后，在5000rpm、4℃下离心，去上清，得沉淀五；再次加入无菌水，混匀，置于80℃水浴中灭菌20min，离心；最终得到的芽孢杆菌芽孢以无菌水混悬，保存。
其中，高盐溶液包括有1M的KCl、0.5M的NaCl和无菌水。
其中，酶消化溶液包括有50μg/ml的溶菌酶和无菌水。
其中，表面活性剂溶液包括有0.05wt％的十二烷基硫酸钠和无菌水。
其中，酶抑制剂溶液包括有50mM的Tris-HCl缓冲液、10mM的EDTA、2mM的苯甲基磺酰氟和无菌水。
结果分析：纯化前，芽孢杆菌芽孢粗品的芽孢纯度为88％；纯化后，芽孢纯度为97％，芽孢数量保持在同一数量级，未发生损失。
实施例3
将实施例1的投放量放大100倍，其余与实施例1相同。
结果分析：纯化前，芽孢杆菌芽孢粗品的芽孢纯度为89％；纯化后，芽孢纯度为96％，芽孢数量保持在108/mL，未发生损失。
实施例4
将实施例1的投放量放大10000倍，其余与实施例1相同。
结果分析：纯化前，芽孢杆菌芽孢粗品的芽孢纯度为89％；纯化后，芽孢纯度为95％，芽孢数量保持在108/mL，未发生损失。
实施例5
高盐溶液中还包括有0.1M的ZnCl2，其余与实施例1相同。
结果分析：纯化前，芽孢杆菌芽孢粗品的芽孢纯度为89％；纯化后，芽孢纯度为98％，芽孢数量保持在108/mL，未发生损失。
实施例6
将实施例5的投放量放大10000倍，其余与实施例5相同。
结果分析：纯化前，芽孢杆菌芽孢粗品的芽孢纯度为89％；纯化后，芽孢纯度为96.5％，芽孢数量保持在108/mL，未发生损失。
实施例7
高盐溶液中还包括有0.1M的AlCl3，其余与实施例5相同。
结果分析：纯化前，芽孢杆菌芽孢粗品的芽孢纯度为89％；纯化后，芽孢纯度＞99％，芽孢数量保持在108/mL，未发生损失。
实施例8
将实施例7的投放量放大10000倍，其余与实施例7相同。
结果分析：纯化前，芽孢杆菌芽孢粗品的芽孢纯度为89％；纯化后，芽孢纯度为98％，芽孢数量保持在108/mL，未发生损失。
上述数据表明，将投放量放大后，所得结果没有发生明显衰减，说明该工艺稳定，具备量产基础。
本案发现，在整个工艺环节中，重盐洗涤的效果对最终芽孢纯度和工艺稳定性的影响最大，因为它的作用是使菌体脱水，而脱水效果的好坏将直接影响后续其他工艺步骤的实施，因此，对重盐洗液配方的改进就显得尤为重要。实施例5说明了锌离子的加入有利于芽孢纯度在一定程度上的提升；实施例7说明了铝离子能够与锌离子产生协效作用，共同提高菌体脱水的效率，从而改善最终芽孢的纯度。
表1是对本工艺重复性的考察，列出了实施例4、实施例6和实施例8分别重复10次所得到的芽孢纯度的浮动情况：
表1
表1表明锌离子和铝离子可以减小芽孢纯度的波动幅度，提高该工艺的重复性，利于在大规模生产时保证产品质量。而锌离子和铝离子的组合使用相较于单独添加锌离子可以获得更高的数据重现性。
尽管本发明的实施方案已公开如上，但其并不仅仅限于说明书和实施方式中所列运用，它完全可以被适用于各种适合本发明的领域，对于熟悉本领域的人员而言，可容易地实现另外的修改，因此在不背离权利要求及等同范围所限定的一般概念下，本发明并不限于特定的细节。

Claims (7)

1.一种芽孢杆菌芽孢的纯化方法，其特征在于，包括以下步骤：
1)无菌水洗涤：将芽孢杆菌芽孢粗品用无菌水在5000rpm、4℃下离心洗涤；并将芽孢杆菌芽孢的浓度调节至105-108/mL，得到芽孢菌体混合液；
2)重盐洗涤：向所述芽孢菌体混合液中加入5-15倍重量的重盐洗液，混匀，在5000rpm、4℃下离心，去上清，得沉淀一；
3)酶溶液孵育：向所述沉淀一中加入酶消化液，悬浮沉淀，调节芽孢浓度至104-106/mL，37℃水浴加热1h后，在5000rpm、4℃下离心，去上清，得沉淀二；
4)表面活性剂溶液洗涤：向所述沉淀二中加入表面活性剂溶液，使芽孢浓度达到104-106/mL，混匀后，在5000rpm、4℃下离心，去上清，得沉淀三；
5)酶抑制剂溶液洗涤：向沉淀三中加入酶抑制剂溶液，混匀后，在5000rpm、4℃下离心，去上清，得沉淀四；
6)无菌水洗涤：向所述沉淀四加入无菌水，震荡混匀后，在5000rpm、4℃下离心，去上清，得沉淀五；再次加入无菌水，混匀，置于80℃水浴中灭菌20min，离心；最终得到的芽孢杆菌芽孢以无菌水混悬，保存。
2.根据权利要求1所述的芽孢杆菌芽孢的纯化方法，其特征在于，所述高盐溶液包括有1M的KCl、0.5M的NaCl和无菌水。
3.根据权利要求1所述的芽孢杆菌芽孢的纯化方法，其特征在于，所述酶消化溶液包括有50μg/ml的溶菌酶和无菌水。
4.根据权利要求1所述的芽孢杆菌芽孢的纯化方法，其特征在于，所述表面活性剂溶液包括有0.05wt％的十二烷基硫酸钠和无菌水。
5.根据权利要求1所述的芽孢杆菌芽孢的纯化方法，其特征在于，所述酶抑制剂溶液包括有50mM的Tris-HCl缓冲液、10mM的EDTA、2mM的苯甲基磺酰氟和无菌水。
6.根据权利要求2所述的芽孢杆菌芽孢的纯化方法，其特征在于，所述高盐溶液还包括有0.1M的ZnCl2。
7.根据权利要求6所述的芽孢杆菌芽孢的纯化方法，其特征在于，所述高盐溶液还包括有0.1M的AlCl3。
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