CN105368754B - 一种茎瘤芥根瘤内生细菌gj-06、含有该内生细菌的根肿病防治剂及应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开一种茎瘤芥根瘤内生细菌GJ‑06、含有该内生细菌的根肿病防治剂及应用，所述茎瘤芥根瘤内生细菌（Bacillus subtilis）GJ‑06保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏日期为2015年11月9日，菌种保藏号为CCTCC NO：M 2015665；所述根肿病防治剂包括上述茎瘤芥根瘤内生细菌GJ‑06，上述茎瘤芥根瘤内生细菌GJ‑06作为有效成分；所述茎瘤芥根瘤内生细菌GJ‑06和根肿病防治剂可在根肿病防治中应用。本发明内生细菌GJ‑06将茎瘤芥的根肿病发病指数从75.3降低到36.1，对茎瘤芥的防治率达到52%，可有效减缓田间根肿病发病程度，取得了意想不到的效果。

Description

一种茎瘤芥根瘤内生细菌GJ-06、含有该内生细菌的根肿病防 治剂及应用

技术领域

本发明属于内生菌技术领域，具体涉及一种茎瘤芥根瘤内生细菌（Bacillus subtilis）GJ-06、含有该内生细菌的根肿病防治剂及应用。

背景技术

芸苔根肿菌(Plasmodiop hora brassicae Woron)属于原生生物界根肿菌门根肿菌纲根肿菌目根肿菌科，其主要危害白菜、油菜、榨菜、萝卜等十字花科植物，造成植物根部肿大，影响植物吸收，同时根肿菌侵染造成植物根系表皮破裂，土壤其他病原菌侵入，导致植物根系腐烂，植株矮小黄化甚至死亡，严重减产。芸薹根肿菌可在土壤中长期存活，一旦田间发病，难以消除，田块无法继续种植十字花科作物。近年来，随着我国十字花科作物种植面积的增加、种子和蔬菜广泛调运、连作年限增加等因素的影响，我国十字花科根肿病发生逐年加重，严重威胁十字花科作物的生产。

榨菜（茎瘤芥）(Brassica juncea var.tumidaTsen etLee)属十字花科芸薹属芥菜种叶芥亚种大叶芥变种的变种。“涪陵榨菜”已经成为我国重庆的特色农业，涪陵区榨菜的种植面积和产量均居全国第一位。自1994年在涪陵地区发现榨菜根肿病起，目前该病已成为榨菜的主要病害，田间发病率30-50%，发病田块很难再继续种植榨菜，造成榨菜种植面积下降，严重威胁榨菜的可持续发展（高明泉, 彭洪江,王旭,等. 涪陵榨菜根肿病的危害与产量损失测定. 植物保护, 2002, 28(6): 31-33；肖崇刚,郭向华,韩海波,等.涪陵榨菜根肿病病菌鉴定及主要特性.西南农业大学学报,2002,24(4): 539-541）。涪陵地区榨菜种植连作年限达10-20年，单一作物长期连作会导致连作障碍，造成土壤酸化、土壤微生物生态系统失衡、土传病害增加等问题（.Zhang X, Pan Z, Zhou X, et al. Autotoxici tyand Continuous Cropping Obstacles:A Review. Chinese Journal of Soil Science,2007, 4: 33-38）。目前，涪陵地区榨菜连作田土壤已经呈现酸化，根肿菌休眠孢子在酸性环境下更容易存活（Narisawak, Ohhi K T, Hashiba T.Suppressio n of clubroot andverticilli um yellowsin Chinese cabbage in the field by the root endophyticfungus Heteroconi umchaetospir a. Plant Pathology, 2000, 49: 141-146），这也导致根肿病逐年加重。作为土传病害，根肿病的发生与土壤微生物、植物根系分泌物和土壤理化性质密切相关。

发明内容

针对现有技术存在的上述不足，本发明所要解决的技术问题是：如何提供一种能够抑制根肿病的内生细菌和根肿病防治剂，使其可应用于根肿病防治中，有效降低茎瘤芥的根肿病病情指数。

为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：一种茎瘤芥根瘤内生细菌（Bacillus subtilis）GJ-06，其分类命名为枯草芽孢杆菌GJ-06（Bacillus subtilis GJ- 06），保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏单位地址：中国武汉武汉大学，保藏日期为2015年11月9日，菌种保藏号为CCTCC NO：M 2015665；所述茎瘤芥根瘤内生细菌（Bacillus subtilis）GJ-06的16SrDNA序列如SEQ ID NO.1所示。

上述茎瘤芥根瘤内生细菌（Bacillus subtilis）GJ-06在根肿病防治中的应用。

一种根肿病防治剂，其组分包括上述茎瘤芥根瘤内生细菌（Bacillus subtilis）GJ-06；其中，上述茎瘤芥根瘤内生细菌（Bacillus subtilis）GJ-06作为有效成分。

上述根肿病防治剂在根肿病防治中的应用。

相比现有技术，本发明具有如下有益效果：

1、本发明从茎瘤芥中分离出内生细菌，并通过试验研究发现，内生细菌GJ-06将茎瘤芥的根肿病病情指数从75.3降低到36.1，对茎瘤芥根肿病的抑制达到52%，可有效减缓田间根肿病发病程度，取得了意想不到的效果。

2、接种本发明GJ-06菌株的茎瘤芥发病时间较晚，茎瘤芥产量与健康菌株相当，经第二年田间试验表明，该菌可以稳定地抑制茎瘤芥根肿病，具有良好的稳定性。

3、本发明根肿病防治剂以茎瘤芥根瘤内生细菌GJ-06为有效成分，且通过研究发现当该根肿病防治剂中GJ-06的浓度为2×10⁸ cfu·mL^-1时，对茎瘤芥根肿病抑制效果更好，抑制率达到52%。

附图说明

图1为内生细菌GJ-06的高倍显微镜图；

图2为内生细菌GJ-06的扫描电镜图；

图3为接种根肿病内生细菌GJ-06后茎瘤芥发病程度图。

具体实施方式

下面结合具体实施例和说明书附图对本发明作进一步详细说明。本实施案例在以本发明技术为前提下进行实施，现给出详细的实施方式和具体的操作过程，来说明本发明具有创造性，但本发明的保护范围不限于以下的实施例。下述实施例中使用的化学药品如无特殊说明，即为普通市售产品。

实施例1

茎瘤芥根部内生细菌的分离：

将茎瘤芥（永安小叶）根肿病产生的根结和健康根表面消毒，放入无菌研钵中研磨成浆液，涂布于NA平板（牛肉浸膏3 g/L，蛋白胨2.5 g/L，葡萄糖5 g/L，琼脂16g/L。）上，37℃培养48 h后，挑取细菌菌落，纯化，备用。

将分离得的根瘤内生细菌，经菌落形态及革兰氏染色初步鉴定，共得到8株内生细菌，初步标号为GJ-01、GJ-02、GJ-03、GJ-04、GJ-05、GJ-06、GJ-07、GJ-08，采用NA培养基液体发酵培养，培养条件37℃培养12 h，用于后续试验，以清水为对照(CK)。

实施例2

内生细菌的鉴定：

以细菌通用引物16SrDNA序列为设计引物（16S-F:agagtttgatcctggctcag，16S-R:tacggctaccttgttacgactt），利用PCR方法（95℃,5min；95℃,30s，55℃,30s,72℃,1min30s，32cycle；72℃,10min；12℃,forever）扩增GJ-06菌株的16SrDNA序列，将扩增的序列转化大肠杆菌感受态细胞，挑取阳性克隆测序，在NCBI比较分析确定其分类地位；结果显示GJ-06与细菌域、厚壁菌门、芽孢杆菌纲、芽孢杆菌目、芽孢杆菌科、芽孢杆菌属细菌16SrDNA序列一致性为100%，表明该菌属于枯草芽孢杆菌。

对GJ-06菌株进行高倍显微镜（目镜十倍，物镜100倍，放大1000倍）和扫描电镜表征，分析其形态特征，确定内生细菌种类。结果如图1和图2所示，单个细胞0.7-0.8×2-3微米，无荚膜，周生鞭毛，能运动，芽孢0.6椭圆到柱状，位于菌体中央或稍偏。其结构特征也与枯草芽孢杆菌相符，因此，鉴定该菌为枯草芽孢杆菌。

实施例3

内生细菌对茎瘤芥根肿病的抗性分析：

选择根肿病病发病重的茎瘤芥地块进行，在移栽时，将茎瘤芥幼苗截根处理，

将100 mL实施例1培养后的八种菌株悬浮液(1×10⁹ cfu·mL^-1)分别加水至500mL并混合均匀，进行浸根每个处理100棵，3次重复操作。以清水为空白对照，小区随机排列，管理同一般大田。分别在处理区和对照区调查田间病株率和病情指数，测算处理区菌株的防治效果。

将茎瘤芥根肿病严重度分级定为5 级，其标准为(高明泉,2012):

0 级：健株。

1 级：侧根发病，肿瘤小而少，呈白色，对植株生长无或轻微影响，产量损失为0-5%。

2 级：肿瘤主要在主根中部、上、下侧根多，或侧根上肿瘤大而多，呈白色或米黄色，对植株生长有一定影响，但地上部分无明显症状，产量损失6-20%。

3 级：主根肿瘤大且变黑，表面粗糙龟裂，有少量侧根，地上部分生长受阻，中心叶片变为深绿色，在阳光下出现轻度萎蔫，产量损失21-35%。

4 级：主根肿瘤龟裂或腐烂变黑，几乎无侧根，地上部分生长严重受阻，株型矮小，叶色暗绿，菜头小且皮厚筋多，在阳光下，整株严重萎蔫，极易拔起，产量损失(不包括无实际收获价值的病株)在36%以上。

分别将8株内生细菌接种于大田栽种的茎瘤芥幼苗，收割前统计根肿病病情指数。结果如图3所示：接种根瘤内生细菌GJ-06的处理，根肿病的病情指数为36.1，显著低于其他菌株及对照（病情指数为75.3）的病情指数，使病情指数从75.3降到36.1，该菌株对茎瘤芥根肿病的防治达到52%，可有效减缓田间根肿病发病程度。同时接种GJ-06菌株的茎瘤芥发病时间较晚，茎瘤芥产量与健康菌株相当，经第二年田间试验表明，该菌可以稳定地抑制茎瘤芥根肿病。由此可见，GJ-06菌株对茎瘤芥根肿病具有良好的防治效果。

最后说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的宗旨和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。

<110> 长江师范学院；

<120> 一种茎瘤芥根瘤内生细菌GJ-06、含有该内生细菌的根肿病防治剂及应用；

<160> 3

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 1205

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> SEQ ID NO.1

<400> 1

ggttacctca ccgacttcgg gtgttacaaa ctctcgtggt gtgacgggcg gtgtgtacaa 60

ggcccgggaa cgtattcacc gcggcatgct gatccgcgat tactagcgat tccagcttca 120

cgcagtcgag ttgcagactg cgatccgaac tgagaacaga tttgtgggat tggcttaacc 180

tcgcggtttc gctgcccttt gttctgtcca ttgtagcacg tgtgtagccc aggtcataag 240

gggcatgatg atttgacgtc atccccacct tcctccggtt tgtcaccggc agtcacctta 300

gagtgcccaa ctgaatgctg gcaactaaga tcaagggttg cgctcgttgc gggacttaac 360

ccaacatctc acgacacgag ctgacgacaa ccatgcacca cctgtcactc tgcccccgaa 420

ggggacgtcc tatctctagg attgtcagag gatgtcaaga cctggtaagg ttcttcgcgt 480

tgcttcgaat taaaccacat gctccaccgc ttgtgcgggc ccccgtcaat tcctttgagt 540

ttcagtcttg cgaccgtact ccccaggcgg agtgcttaat gcgttagctg cagcactaag 600

gggcggaaac cccctaacac ttagcactca tcgtttacgg cgtggactac cagggtatct 660

aatcctgttc gctccccacg ctttcgctcc tcagcgtcag ttacagacca gagagtcgcc 720

ttcgccactg gtgttcctcc acatctctac gcatttcacc gctacacgtg gaattccact 780

ctcctcttct gcactcaagt tccccagttt ccaatgaccc tccccggttg agccgggggc 840

tttcacatca gacttaagaa accgcctgcg agccctttac gcccaataat tccggacaac 900

gcttgccacc tacgtattac cgcggctgct ggcacgtagt tagccgtggc tttctggtta 960

ggtaccgtca aggtaccgcc ctattcgaac ggtacttgtt cttccctaac aacagagctt 1020

tacgatccga aaaccttcat cactcacgcg gcgttgctcc gtcagacttt cgtccattgc 1080

ggaagattcc ctactgctgc ctcccgtagg agtctgggcc gtgtctcagt cccagtgtgg 1140

ccgatcaccc tctcaggtcg gctacgcatc gttgccttgg tgagccgtta cctcaccaac 1200

tagct 1205

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 16S-F

<400> 2

agagtttgat cctggctcag 20

<210> 3

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 16S-R

<400> 3

tacggctacc ttgttacgac tt 22

Claims (4)

1.一种茎瘤芥根瘤内生细菌（Bacillus subtilis）GJ-06在茎瘤芥根肿病防治中的应用，其特征在于，所述GJ-06的16SrDNA序列如SEQ ID NO.1所示，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏日期为2015年11月9日，菌种保藏号为CCTCC NO：M 2015665。

2.一种茎瘤芥根肿病防治剂，其特征在于，其组分包括权利要求1中所述茎瘤芥根瘤内生细菌（Bacillus subtilis）GJ-06；其中，权利要求1中所述茎瘤芥根瘤内生细菌（Bacillus subtilis）GJ-06作为有效成分。

3.根据权利要求2所述茎瘤芥根肿病防治剂，其特征在于，所述茎瘤芥根瘤内生细菌（Bacillus subtilis）GJ-06在防治剂中的浓度为2×10⁸cfu·mL^-1。

4.权利要求2所述茎瘤芥根肿病防治剂在茎瘤芥根肿病防治中的应用。