CN105368754A - 一种茎瘤芥根瘤内生细菌gj-06、含有该内生细菌的根肿病防治剂及应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开一种茎瘤芥根瘤内生细菌GJ-06、含有该内生细菌的根肿病防治剂及应用,所述茎瘤芥根瘤内生细菌(<i>Bacillus?subtilis</i>)GJ-06保藏于中国典型培养物保藏中心,保藏日期为2015年11月9日,菌种保藏号为CCTCC?NO:M?2015665;所述根肿病防治剂包括上述茎瘤芥根瘤内生细菌GJ-06,上述茎瘤芥根瘤内生细菌GJ-06作为有效成分;所述茎瘤芥根瘤内生细菌GJ-06和根肿病防治剂可在根肿病防治中应用。本发明内生细菌GJ-06将茎瘤芥的根肿病发病指数从75.3降低到36.1,对茎瘤芥的防治率达到52%,可有效减缓田间根肿病发病程度,取得了意想不到的效果。
Description
技术领域
本发明属于内生菌技术领域,具体涉及一种茎瘤芥根瘤内生细菌(Bacillussubtilis)GJ-06、含有该内生细菌的根肿病防治剂及应用。
背景技术
芸苔根肿菌(PlasmodiophorabrassicaeWoron)属于原生生物界根肿菌门根肿菌纲根肿菌目根肿菌科,其主要危害白菜、油菜、榨菜、萝卜等十字花科植物,造成植物根部肿大,影响植物吸收,同时根肿菌侵染造成植物根系表皮破裂,土壤其他病原菌侵入,导致植物根系腐烂,植株矮小黄化甚至死亡,严重减产。芸薹根肿菌可在土壤中长期存活,一旦田间发病,难以消除,田块无法继续种植十字花科作物。近年来,随着我国十字花科作物种植面积的增加、种子和蔬菜广泛调运、连作年限增加等因素的影响,我国十字花科根肿病发生逐年加重,严重威胁十字花科作物的生产。
榨菜(茎瘤芥)(Brassicajunceavar.tumidaTsenetLee)属十字花科芸薹属芥菜种叶芥亚种大叶芥变种的变种。“涪陵榨菜”已经成为我国重庆的特色农业,涪陵区榨菜的种植面积和产量均居全国第一位。自1994年在涪陵地区发现榨菜根肿病起,目前该病已成为榨菜的主要病害,田间发病率30-50%,发病田块很难再继续种植榨菜,造成榨菜种植面积下降,严重威胁榨菜的可持续发展(高明泉,彭洪江,王旭,等.涪陵榨菜根肿病的危害与产量损失测定.植物保护,2002,28(6):31-33;肖崇刚,郭向华,韩海波,等.涪陵榨菜根肿病病菌鉴定及主要特性.西南农业大学学报,2002,24(4):539-541)。涪陵地区榨菜种植连作年限达10-20年,单一作物长期连作会导致连作障碍,造成土壤酸化、土壤微生物生态系统失衡、土传病害增加等问题(.ZhangX,PanZ,ZhouX,etal.AutotoxicityandContinuousCroppingObstacles:AReview.ChineseJournalofSoilScience,2007,4:33-38)。目前,涪陵地区榨菜连作田土壤已经呈现酸化,根肿菌休眠孢子在酸性环境下更容易存活(Narisawak,OhhiKT,HashibaT.SuppressionofclubrootandverticilliumyellowsinChinesecabbageinthefieldbytherootendophyticfungusHeteroconiumchaetospira.PlantPathology,2000,49:141-146),这也导致根肿病逐年加重。作为土传病害,根肿病的发生与土壤微生物、植物根系分泌物和土壤理化性质密切相关。
发明内容
针对现有技术存在的上述不足,本发明所要解决的技术问题是:如何提供一种能够抑制根肿病的内生细菌和根肿病防治剂,使其可应用于根肿病防治中,有效降低茎瘤芥的根肿病病情指数。
为了实现上述目的,本发明采用如下技术方案:一种茎瘤芥根瘤内生细菌(Bacillussubtilis)GJ-06,其分类命名为枯草芽孢杆菌GJ-06(BacillussubtilisGJ-06),保藏于中国典型培养物保藏中心,保藏单位地址:中国武汉武汉大学,保藏日期为2015年11月9日,菌种保藏号为CCTCCNO:M2015665;所述茎瘤芥根瘤内生细菌(Bacillussubtilis)GJ-06的16SrDNA序列如SEQIDNO.1所示。
上述茎瘤芥根瘤内生细菌(Bacillussubtilis)GJ-06在根肿病防治中的应用。
一种根肿病防治剂,其组分包括上述茎瘤芥根瘤内生细菌(Bacillussubtilis)GJ-06;其中,上述茎瘤芥根瘤内生细菌(Bacillussubtilis)GJ-06作为有效成分。
上述根肿病防治剂在根肿病防治中的应用。
相比现有技术,本发明具有如下有益效果:
1、本发明从茎瘤芥中分离出内生细菌,并通过试验研究发现,内生细菌GJ-06将茎瘤芥的根肿病病情指数从75.3降低到36.1,对茎瘤芥根肿病的抑制达到52%,可有效减缓田间根肿病发病程度,取得了意想不到的效果。
2、接种本发明GJ-06菌株的茎瘤芥发病时间较晚,茎瘤芥产量与健康菌株相当,经第二年田间试验表明,该菌可以稳定地抑制茎瘤芥根肿病,具有良好的稳定性。
3、本发明根肿病防治剂以茎瘤芥根瘤内生细菌GJ-06为有效成分,且通过研究发现当该根肿病防治剂中GJ-06的浓度为2×108cfu·mL-1时,对茎瘤芥根肿病抑制效果更好,抑制率达到52%。
附图说明
图1为内生细菌GJ-06的高倍显微镜图;
图2为内生细菌GJ-06的扫描电镜图;
图3为接种根肿病内生细菌GJ-06后茎瘤芥发病程度图。
具体实施方式
下面结合具体实施例和说明书附图对本发明作进一步详细说明。本实施案例在以本发明技术为前提下进行实施,现给出详细的实施方式和具体的操作过程,来说明本发明具有创造性,但本发明的保护范围不限于以下的实施例。下述实施例中使用的化学药品如无特殊说明,即为普通市售产品。
实施例1
茎瘤芥根部内生细菌的分离:
将茎瘤芥(永安小叶)根肿病产生的根结和健康根表面消毒,放入无菌研钵中研磨成浆液,涂布于NA平板(牛肉浸膏3g/L,蛋白胨2.5g/L,葡萄糖5g/L,琼脂16g/L。)上,37℃培养48h后,挑取细菌菌落,纯化,备用。
将分离得的根瘤内生细菌,经菌落形态及革兰氏染色初步鉴定,共得到8株内生细菌,初步标号为GJ-01、GJ-02、GJ-03、GJ-04、GJ-05、GJ-06、GJ-07、GJ-08,采用NA培养基液体发酵培养,培养条件37℃培养12h,用于后续试验,以清水为对照(CK)。
实施例2
内生细菌的鉴定:
以细菌通用引物16SrDNA序列为设计引物(16S-F:agagtttgatcctggctcag,16S-R:tacggctaccttgttacgactt),利用PCR方法(95℃,5min;95℃,30s,55℃,30s,72℃,1min30s,32cycle;72℃,10min;12℃,forever)扩增GJ-06菌株的16SrDNA序列,将扩增的序列转化大肠杆菌感受态细胞,挑取阳性克隆测序,在NCBI比较分析确定其分类地位;结果显示GJ-06与细菌域、厚壁菌门、芽孢杆菌纲、芽孢杆菌目、芽孢杆菌科、芽孢杆菌属细菌16SrDNA序列一致性为100%,表明该菌属于枯草芽孢杆菌。
对GJ-06菌株进行高倍显微镜(目镜十倍,物镜100倍,放大1000倍)和扫描电镜表征,分析其形态特征,确定内生细菌种类。结果如图1和图2所示,单个细胞0.7-0.8×2-3微米,无荚膜,周生鞭毛,能运动,芽孢0.6椭圆到柱状,位于菌体中央或稍偏。其结构特征也与枯草芽孢杆菌相符,因此,鉴定该菌为枯草芽孢杆菌。
实施例3
内生细菌对茎瘤芥根肿病的抗性分析:
选择根肿病病发病重的茎瘤芥地块进行,在移栽时,将茎瘤芥幼苗截根处理,
将100mL实施例1培养后的八种菌株悬浮液(1×109cfu·mL-1)分别加水至500mL并混合均匀,进行浸根每个处理100棵,3次重复操作。以清水为空白对照,小区随机排列,管理同一般大田。分别在处理区和对照区调查田间病株率和病情指数,测算处理区菌株的防治效果。
将茎瘤芥根肿病严重度分级定为5级,其标准为(高明泉,2012):
0级:健株。
1级:侧根发病,肿瘤小而少,呈白色,对植株生长无或轻微影响,产量损失为0-5%。
2级:肿瘤主要在主根中部、上、下侧根多,或侧根上肿瘤大而多,呈白色或米黄色,对植株生长有一定影响,但地上部分无明显症状,产量损失6-20%。
3级:主根肿瘤大且变黑,表面粗糙龟裂,有少量侧根,地上部分生长受阻,中心叶片变为深绿色,在阳光下出现轻度萎蔫,产量损失21-35%。
4级:主根肿瘤龟裂或腐烂变黑,几乎无侧根,地上部分生长严重受阻,株型矮小,叶色暗绿,菜头小且皮厚筋多,在阳光下,整株严重萎蔫,极易拔起,产量损失(不包括无实际收获价值的病株)在36%以上。
分别将8株内生细菌接种于大田栽种的茎瘤芥幼苗,收割前统计根肿病病情指数。结果如图3所示:接种根瘤内生细菌GJ-06的处理,根肿病的病情指数为36.1,显著低于其他菌株及对照(病情指数为75.3)的病情指数,使病情指数从75.3降到36.1,该菌株对茎瘤芥根肿病的防治达到52%,可有效减缓田间根肿病发病程度。同时接种GJ-06菌株的茎瘤芥发病时间较晚,茎瘤芥产量与健康菌株相当,经第二年田间试验表明,该菌可以稳定地抑制茎瘤芥根肿病。由此可见,GJ-06菌株对茎瘤芥根肿病具有良好的防治效果。
最后说明的是,以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制,尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明,本领域的普通技术人员应当理解,可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换,而不脱离本发明技术方案的宗旨和范围,其均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。
<110>长江师范学院;
<120>一种茎瘤芥根瘤内生细菌GJ-06、含有该内生细菌的根肿病防治剂及应用;
<160>3
<170>PatentInversion3.5
<210>1
<211>1205
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>SEQIDNO.1
<400>1
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cgcagtcgagttgcagactgcgatccgaactgagaacagatttgtgggattggcttaacc180
tcgcggtttcgctgccctttgttctgtccattgtagcacgtgtgtagcccaggtcataag240
gggcatgatgatttgacgtcatccccaccttcctccggtttgtcaccggcagtcacctta300
gagtgcccaactgaatgctggcaactaagatcaagggttgcgctcgttgcgggacttaac360
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ttcagtcttgcgaccgtactccccaggcggagtgcttaatgcgttagctgcagcactaag600
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ttcgccactggtgttcctccacatctctacgcatttcaccgctacacgtggaattccact780
ctcctcttctgcactcaagttccccagtttccaatgaccctccccggttgagccgggggc840
tttcacatcagacttaagaaaccgcctgcgagccctttacgcccaataattccggacaac900
gcttgccacctacgtattaccgcggctgctggcacgtagttagccgtggctttctggtta960
ggtaccgtcaaggtaccgccctattcgaacggtacttgttcttccctaacaacagagctt1020
tacgatccgaaaaccttcatcactcacgcggcgttgctccgtcagactttcgtccattgc1080
ggaagattccctactgctgcctcccgtaggagtctgggccgtgtctcagtcccagtgtgg1140
ccgatcaccctctcaggtcggctacgcatcgttgccttggtgagccgttacctcaccaac1200
tagct1205
<210>2
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<220>
<223>16S-F
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<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>16S-R
<400>3
tacggctaccttgttacgactt22
Claims (6)
1.一种茎瘤芥根瘤内生细菌(Bacillussubtilis)GJ-06,其特征在于,保藏于中国典型培养物保藏中心,保藏日期为2015年11月9日,菌种保藏号为CCTCCNO:M2015665。
2.根据权利要求1所述茎瘤芥根瘤内生细菌(Bacillussubtilis)GJ-06,其特征在于,所述茎瘤芥根瘤内生细菌(Bacillussubtilis)GJ-06的16SrDNA序列如SEQIDNO.1所示。
3.权利要求1或2所述茎瘤芥根瘤内生细菌(Bacillussubtilis)GJ-06在根肿病防治中的应用。
4.一种根肿病防治剂,其特征在于,其组分包括权利要求1或2所述茎瘤芥根瘤内生细菌(Bacillussubtilis)GJ-06;其中,权利要求1或2所述茎瘤芥根瘤内生细菌(Bacillussubtilis)GJ-06作为有效成分。
5.根据权利要求4所述根肿病防治剂,其特征在于,所述茎瘤芥根瘤内生细菌(Bacillussubtilis)GJ-06在防治剂中的浓度为2×108cfu·mL-1。
6.权利要求5所述根肿病防治剂在根肿病防治中的应用。
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