CN102899299A

CN102899299A - 碱性果胶酶突变体及其重组表达工程菌

Info

Publication number: CN102899299A
Application number: CN2012103263353A
Authority: CN
Inventors: 肖志壮; 张霞; 王海; 刘鲁民; 郝荣耀
Original assignee: Weifang Kdn Biotechnology Co Ltd; Qingdao Vland Biotech Group Co Ltd
Current assignee: Weifang Kdn Biotechnology Co Ltd; Qingdao Vland Biotech Group Co Ltd
Priority date: 2012-09-06
Filing date: 2012-09-06
Publication date: 2013-01-30
Anticipated expiration: 2032-09-06
Also published as: CN102899299B

Abstract

本发明涉及一种碱性果胶酶突变体及其重组表达工程菌，所述的碱性果胶酶突变体，其氨基酸序列为SEQ ID NO:4；其编码核苷酸序列为SEQ ID NO:3。用于表达上述突变体的枯草芽孢杆菌工程菌株，其保藏编号为CGMCC NO.6489。本发明的碱性果胶酶突变体在枯草芽孢杆菌中的表达量高达1140U/mL，是突变前的40多倍，且具有更好的酶学性质，对温度、pH和双氧水的耐受性都得到很大的提高。本发明的碱性果胶酶突变体最适作用温度为60℃，60℃处理20min后，仍能保留38%的酶活，是突变前的4倍；最适pH为9.0，在pH9.0条件下，60℃处理1h，仍能保留64.7%的酶活，是突变前的5.7倍；在含H₂O₂的缓冲体系中处理60min，仍能保留31.3%的酶活，是突变前的3.8倍。

Description

碱性果胶酶突变体及其重组表达工程菌

技术领域

本发明涉及基因工程技术领域，具体涉及一种碱性果胶酶突变体及其重组表达工程菌。

技术背景

果胶酶是指能催化果胶质分解的多种酶的总称，对果胶质结构化学的研究表明，果胶质的化学结构比较复杂，能催化其分解的果胶酶也是种类繁多。根据分解糖苷键的反应性质或降解底物的性质，果胶酶可以分为3类：果胶水解酶、果胶裂解酶和果胶酯酶。果胶酶按其作用最适pH分为酸性果胶酶和碱性果胶酶。目前研究和应用最多的是酸性果胶酶，主要用于水果榨汁和果汁澄清。

碱性果胶酶是在碱性范围内具有较高活性的果胶酶，在造纸、纺织等行业有着巨大的应用前景，已经引起广泛的关注。碱性果胶酶可用于棉麻织物杂质的有效去除，提高织物润湿性，且不会像纤维素酶那样降低棉纤维的强度。以碱性果胶酶为主要成分的脱胶酶，在苎麻、亚麻等麻类植物的脱胶工艺中的应用也越来越受到重视，可以不破坏植物纤维，不污染环境、节约能源。但现有碱性果胶酶，酶活水平普遍较低，只有几十个酶活单位，且碱性果胶酶对过氧化氢的耐受性低，不能满足工业生产的需要。

目前工业上多采用构建重组表达工程菌株的方法来提高酶制剂的产量，常用的有大肠杆菌、毕赤酵母、曲霉、枯草芽孢杆菌等表达系统，其中枯草芽孢杆菌发酵周期短、工艺成熟，因此得到广泛使用。

发明内容

本发明的目的是提供一种碱性果胶酶突变体及其重组表达工程菌，即通过随机突变的方法对来源于枯草芽孢杆菌的碱性果胶酶基因进行改造，获得了酶活水平极大提高的突变体。同时，突变体的酶学性质也比突变前有了很大的改进，为碱性果胶酶的产业化提供了有力的支持。

本发明的一个方面涉及一种碱性果胶酶突变体，其氨基酸序列为SEQ ID NO:4；其编码核苷酸序列为SEQ ID NO:3。

本发明另一个方面涉及一种重组载体，所述的重组载体为携带有序列为SEQ ID NO:3的核苷酸片段的表达载体。

上述的表达载体为原核表达载体。

本发明的另一方面涉及一种枯草芽孢杆菌工程菌，该工程菌携带有能表达上述碱性果胶酶突变体的表达载体。

所述枯草芽孢杆菌工程菌株，命名为Bacillus subtilis PL113，已于2012年8月31日，保藏于地址为北京市朝阳区北辰西路 1号院中科院微生物研究所(邮编:100101)的中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏号为：CGMCC NO：6489。

本发明另一方面涉及上述工程菌株的应用，用于生产碱性果胶酶突变体。

本发明还涉及上述碱性果胶酶突变体在纺织等领域的应用。

本发明的碱性果胶酶突变体在枯草芽孢杆菌168中的表达量高达1140U/mL，是突变前的40多倍，且具有更好的酶学性质，对温度、pH和双氧水的耐受性都得到很大的提高。本发明的碱性果胶酶突变体最适作用温度为60℃，60℃处理20min后，仍能保留38%的酶活，是突变前的4倍；最适pH为9.0，在pH9.0条件下，60℃处理1h，仍能保留64.7%的酶活，是突变前的5.7倍；在含H₂O₂10g/L的缓冲体系中处理60min，仍能保留31.3%的酶活，是突变前的3.8倍。

附图说明

图1：表达载体pWB980-PL113的构建示意图；

图2：碱性果胶酶突变体相对酶活-温度变化曲线图；

图3：碱性果胶酶突变体相对酶活-pH变化曲线图。

具体实施方式

下面结合实例对本发明的方法做进一步说明。但实例仅限于说明，并不限于此。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常可按常规条件，如J.萨姆布鲁克（Sambrook）等编写的《分子克隆实验指南》中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件运行。本领域相关的技术人员可以借助实施例更好地理解和掌握本发明。但是，本发明的保护和权利要求范围不限于所提供的案例。

实施例1碱性果胶酶基因PL的克隆

一、枯草芽孢杆菌CGMCC1.897染色体的提取

所述枯草芽孢杆菌CGMCC1.897购自“中国普通微生物菌种保藏管理中心”，分类命名为枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis），保藏号为：CGMCC1.897。

，挑取新鲜的枯草芽孢杆菌CGMCC1.897单菌落于5mL LB液体培养基中，37℃摇床200rpm振荡培养过夜，按照Tiangen细菌基因组提取试剂盒（天根生化科技有限公司）的说明提取染色体。

二、引物设计

根据NCBI上碱性果胶酶同源序列设计引物，

上游引物为：5'ATGAAACGACTTTTTTTATGGTTCA 3'；下游引物为：5'TCAGTAGCCAAATACCAGAGTTG 3'。

三、目的基因PL PCR扩增

以枯草芽孢杆菌CGMCC1.897染色体为模板，利用上下游引物进行扩增，扩增条件为：94℃预变性5min，94℃变性40s，60℃退火40s，72℃延伸60s，30个循环后，72℃延伸10min。凝胶回收试剂盒回收PCR扩增产物，命名为PL，大小为1038bp。

四、基因测序验证

将目的基因PL克隆至pMD18-T载体，送至北京华大基因测序中心进行测序，测得PL基因序列为SEQ ID NO:1，其编码氨基酸序列为SEQ ID NO:2。通过NCBI同源序列比对，确定扩增的基因为碱性果胶酶基因，且与Genbank中YP 004203799.1的氨基酸序列同源性达100%。

实施例2枯草芽孢杆菌工程菌株的构建

一、目的基因的PCR扩增

根据载体pWB980多克隆位点上的单酶切位点SalI和SphlI，设计引物，上游引物为PLF：5'CCGGTCGACGATGAAACGACTTTTTTTATGGTTC 3'；下游引物为PLR：5'CCAGCATGCTCAGTAGCCAAATACCAGAGTTG 3'。

以枯草芽孢杆菌CGMCC1.897染色体为模板，利用上下游引物扩增目的基因PL。

二、重组载体的构建

将回收的PL PCR扩增产物和载体pWB980，利用限制性内切酶SalI和SphlI，37℃酶切过夜。酶切产物用1.5%琼脂糖凝胶电泳进行回收。按照PL：pWB980摩尔比3:1比例进行连接反应，22℃连接5h，得到重组表达质粒pWB980-PL的连接产物，构建过程见图1。

三、宿主菌感受态细胞制备

1、将宿主菌Bacillus subtilis 168在LB平板上活化。

2、挑单菌落于5mLGMI培养基中，30℃，125r/min振荡培养过夜。

3、次日取过夜培养物1mL接到9mLGMI培养基中，37℃，200rpm,振荡培养3.5h。

4、取2mL上一步的培养液转接到18mL的GMII培养基中，37℃，200r/min振荡培养90分钟。

5、上一步培养液，5000g/min室温离心10分钟，收集菌体，用2mL原培养液上清重悬菌体，悬浮后的菌体即为感受态细胞。

四、重组质粒转化宿主菌

1、将全部连接产物与250uL制备好的宿主菌感受态细胞混合，37℃，200rpm,振荡培养0.5h。

2、涂布含有30ug/mL卡纳霉素的LB平板，筛选得到含有重组表达质粒的枯草芽孢杆菌工程菌株，工程菌株命名为Bacillus subtilis PL。

3、测序分析

按照omega质粒提取试剂盒的操作说明，提取重组菌Bacillus subtilis PL的质粒，进行测序分析，验证连接后获得的是正确的表达阅读框。

枯草芽孢杆菌168感受态细胞制备用溶液：

10×盐溶液：15%K₂HPO₄.3H₂O,6%KH₂PO₄,2%(NH4)₂SO₄,0.2%MgSO₄.7H₂O，1%柠檬酸钠，在蒸馏水中一次溶解，115℃高温灭菌，室温贮存。

枯草芽孢杆菌168感受态细胞制备用培养基：

10mLGMI培养基：9.61mL1×盐溶液,0.1mL10%酵母粉，0.25mL 20%葡萄糖，0.04mL 5%水解酪蛋白。

10mLGMII培养基：9.662mL 1×盐溶液，0.05mL 10%酵母粉，0.25mL 20%葡萄糖0.008mL 5%水解酪蛋白，0.025mL 1MMgCl₂溶液，0.005mL 1M CaCl₂溶液。

实施例3碱性果胶酶基因PL的随机点突变及突变文库构建

利用易错PCR对基因PL进行随机点突变。

一、易错PCR条件的确定

根据文献经验，本发明中选用的Mn²⁺终浓度为0.5mmol/L。在这个浓度下，根据不同Mg²⁺浓度下扩增出目的条带的亮度和特异性，最终选择Mg²⁺浓度为6mmol/L。

二、易错PCR扩增

以质粒pWB980-PL为模板，上游引物PLF：

5'CCGGTCGACGATGAAACGACTTTTTTTATGGTTC 3'；

下游引物PLR：5'CCAGCATGCTCAGTAGCCAAATACCAGAGTTG 3'，随机突变碱性果胶酶基因PL。

每100μL体系为：10xPCR buffer 10μL；dATP(10mmol/L)2μl； dGTP(10mmol/L)2μl；dCTP(50mmol/L)1.0μl；dTTP(50mmol/L)1.0μl；MgCl2(25mmol/L)24μl；引物PLF(10μmol/L)4μl；引物PLR(10μmol/L)4μl；ddH2O 40.5μl；Mn²⁺（5mmol/L）10μL；DNA Primerstar 1μl(5Μ/μl)；模板pWB980-PL 0.5μl。

反应条件为：94℃4min；94℃1min、60℃40s、72℃1min，30个循环；72℃10min。

三、突变文库构建

1.5%琼脂糖凝胶检测易错PCR结果，同时用凝胶回收试剂盒回收PCR片段，具体操作按照Omega Gel Extraction Kit说明书进行。将回收产物经SalI和SphII双酶切，克隆到表达载体pWB980上，重组质粒转化宿主菌Bacillus subtilis 168，构建随机突变文库，共得到120个单菌落。

实施例4突变文库筛选和酶活测定

分别挑取活化后的实施例3所述工程菌Bacillus subtilis PL和突变文库中的120个重组枯草芽孢杆菌单菌落，接种于30mL种子培养基中，37℃，200rpm发酵培养10h，获得种子液；按2%的接种量再将种子液转接到30mL发酵培养基中，37℃，200rpm发酵培养24h，获得发酵液；离心去除菌体，即得到含有碱性果胶酶的粗酶液。

分别测定Bacillus subtilis PL和上述各突变重组菌株粗酶液中碱性果胶酶的酶活力，酶活测定方法如下：

酶活单位定义：1mL酶液在45℃，pH为9.0条件下，每分钟使聚半乳糖醛酸裂解产生1μmol的不饱和聚半乳糖醛酸的酶量。

反应体系中包括粗酶稀释液20μL，0.2%聚半乳糖醛酸的甘氨酸-氢氧化钠（0.2mol/L）缓冲液（pH9.0，含有0.44mmol/L的CaCl₂）2mL，反应条件为45℃温育15min，用3mL0.03mol/L的磷酸终止反应，在235nm处测定其吸光度值。酶空白：将2mL上述缓冲体系配制的底物保温2min后，依次加入3mL0.03mol/L的磷酸和20μL与实验样相同稀释倍数的灭活的酶液，混匀。其他操作与实验样相同。

计算公式：

式中：4600（L·mol^-1cm^-1）-不饱和聚半乳糖醛酸在235nm处的摩尔吸光系数

t（min）—酶促反应时间（在酶反应的线性范围内）

b（cm）—比色杯厚度

经简化：酶活力（U/mL）=3.6232×稀释倍数×OD₂₃₅

其中Bacillus subtilis PL（PL）和酶活较高的九株突变重组菌的碱性果胶酶酶活如表1所示。

表1粗酶液中碱性果胶酶酶活比较

菌株	酶活（U/mL）	菌株	酶活（U/mL）
				PL	27.57	PL77	134
PL1	195.3	PL80	167.90
				PL32	205.67	PL104	186
PL35	356.87	PL113	1140
				PL63	231.4	PL117	275.35

如表1所示，Bacillus subtilis PL粗酶液中碱性果胶酶的酶活仅为27.57U/mL，而突变重组菌中Bacillus subtilis PL113的碱性果胶酶酶活最高，达1140U/mL，远高于其他突变重组菌，是Bacillus subtilis PL酶活水平的40多倍。

将上述突变重组菌Bacillus subtilis PL113于2012年8月31日，送至“中国普通微生物菌种保藏管理中心”进行保藏，保藏号为：CGMCC NO：6489。

实施例5碱性果胶酶基因PL的突变片段PL113的序列测定

提取突变重组菌Bacillus subtilis PL113的质粒，具体操作见omega质粒提取试剂盒操作说明。将重组质粒送至北京华大基因测序中心进行测序，PL113基因序列为SEQ ID NO:3，其编码的氨基酸序列为SEQ ID NO:4。

经序列比对可知，共有七个位点发生了点突变，其中第87个碱基G突变为A，第123个碱基T突变为A，这两个突变均未引起氨基酸的改变；第148个碱基G突变为T，引起第50位氨基酸由丙氨酸突变为丝氨酸；第195个碱基C突变为T，第384个碱基T突变为C，第510个碱基C突变为T，第525个碱基T突变为C，这四个突变均未引起氨基酸的改变。

突变后的碱性果胶酶酶活性大幅度提高可能由2个方面的变化引起：一是突变的碱基并未改变基因编码的氨基酸序列，而只是对其在枯草芽孢杆菌中的翻译效率有所提高，从而最终使得酶蛋白的表达量提高；二是突变的碱基改变了酶的氨基酸序列，改变的氨基酸很可能正位于该酶的催化位点或者结合位点。

实施例6碱性果胶酶突变体酶学性质分析

1.碱性果胶酶突变体最适作用温度和热稳定性分析

用pH9.0，0.2mol/L的甘氨酸-氢氧化钠缓冲溶液稀释重组菌PL113的粗酶液至20U/ml左右，分别测定35℃、40℃、45℃、50℃、55℃、60℃，65℃、70℃条件下粗酶液中碱性果胶酶突变体的酶活力，以最高酶活为100%，计算相对酶活，做温度-相对酶活曲线，并以Bacillus subtilis PL粗酶液中的原始碱性果胶酶酶活为对照。

结果如图2所示，本发明的碱性果胶酶突变体最适作用温度为60℃，在40℃至60℃范围内能保持40%以上的酶活。

用pH9.0，0.2mol/L的甘氨酸-氢氧化钠缓冲溶液稀释重组菌PL113的粗酶液至20U/ml左右，60℃水浴处理0min，20min,40min,60min，测定剩余酶活；以起始酶活为100%，计算酶活残留率，并以Bacillus subtilis PL粗酶液中的原始碱性果胶酶为对照，结果如表2所示。

表1碱性果胶酶突变体温度耐受性分析

由表1可以看出，当60℃水浴处理60min后，原始碱性果胶酶和突变体的酶活基本都丧失，但碱性果胶酶突变体的温度耐受性有了很大提高。60℃水浴处理20min后，碱性果胶酶突变体的酶活残留率为38%，是原始酶的4倍；60℃水浴处理40min后，碱性果胶酶突变体的酶活残留率为16.3%，是原始酶的3倍。

2、碱性果胶酶突变体最适作用pH和pH稳定性分析

分别采用pH为7.5、8.0、8.5、8.6、9.0、9.6、10.0、10.6的甘氨酸-氢氧化钠缓冲溶液，将重组菌PL113的粗酶液稀释到20U/ml左右，多聚半乳糖醛酸底物也分别用对应pH的缓冲液配制，在60℃下分别测定粗酶液中碱性果胶酶突变体的酶活力，以最高酶活为100%，计算相对酶活，做pH-相对酶活曲线，并以Bacillus subtilis PL粗酶液中的原始碱性果胶酶为对照。

结果如图3所示，碱性果胶酶突变体的最适作用pH值为9.0，在pH8.5 至pH9.5范围内能保持40%以上的酶活。

分别用pH为8.0、9.0、10.0的0.2mol/L甘氨酸-氢氧化钠缓冲液（添加0.44mmol/L氯化钙）稀释重组菌PL113的粗酶液至20U/mL，60℃处理1h，结束后测定剩余酶活，以起始酶活为100%，计算酶活残留率，并以Bacillus subtilis PL粗酶液中的原始碱性果胶酶为对照，结果如表2所示。

表2碱性果胶酶突变体pH耐受性分析

从表2可看出，当pH>10.0时，原始碱性果胶酶和突变体的酶活基本都丧失，但碱性果胶酶突变体在pH8.0-9.0范围内pH耐受性得到大大提高。在pH8.0条件下，60℃处理1h，碱性果胶酶突变体的酶活残留率为55.5%，是原始酶的3倍；在pH9.0条件下，60℃处理1h，碱性果胶酶突变体的酶活残留率是64.7%，是原始酶的5.7倍。

3.碱性果胶酶突变体H₂O₂耐受性分析

配制pH为9.0，浓度为0.2mol/L，H₂O₂添加量为10g/L的Glycine-NaOH处理缓冲液，将重组菌PL113的粗酶液以20U/mL的添加量添加到上述缓冲液中，在60℃条件下分别处理0min、30min、1h，结束后测定剩余酶活。以0min时样品的起始酶活为100%，计算酶活残留率，并以Bacillus subtilis PL粗酶液中的原始碱性果胶酶为对照，结果如表3所示。

表3碱性果胶酶突变体H₂O₂耐受性分析

由表3可以看出，碱性果胶酶突变体对H₂O₂的耐受性得到显著的提高，在含H₂O₂10g/L的缓冲体系中处理30min后，碱性果胶酶突变体的酶活残留率为65.1%，是原始酶的约3倍；处理60min后，碱性果胶酶突变体的酶活残留率为31.3%，是原始酶的3.8倍。

实施例7碱性果胶酶突变体的应用-对针织布的润湿应用实验

将3g针织布用沸水煮5分钟；50℃条件下，在pH9.0的0.2mol/L甘氨酸-氢氧化钠缓冲体系中，加入本发明的碱性果胶酶突变体，至终浓度为60g/L，处理针织布3小时。酶处理后，将针织布用95℃热水洗1道，冷水洗2道，60℃烘干3小时。分别将2mL水滴到处理后的布面上，计算完全润湿的时间，每块布取10个点计时，取平均值，并以Bacillus subtilis PL中的原始碱性果胶酶为对照，结果如表4。

表4针织布润湿实验

由表4可看出，经碱性果胶酶突变体处理的针织布，润湿时间比经原始碱性果胶酶处理的针织布缩短了5秒，说明突变后碱性果胶酶对针织布的处理效果得到大大提升。

Claims

1.一种碱性果胶酶突变体，其特征在于，所述的碱性果胶酶突变体的氨基酸序列为SEQ ID NO:4。

2.一种核苷酸，其特征在于所述的核苷酸用于编码权利要求1所述的碱性果胶酶突变体。

3.如权利要求2所述的核苷酸，其特征在于所述的核苷酸的序列为SEQID NO:3。

4.一种重组载体，其特征在于所述的重组载体为携带有权利要求3所述的核苷酸片段的表达载体。

5.如权利要求4所述的重组载体，其特征在于所述的表达载体为原核表达载体。

6.用于表达权利要求1所述的碱性果胶酶突变体的枯草芽孢杆菌工程菌，其特征在于，所述的枯草芽孢杆菌工程菌携带有权利要求4所述的重组载体。

7.如权利要求6所述的枯草芽孢杆菌工程菌，其保藏编号为CGMCCNO.6489。

8.权利要求1所述的碱性果胶酶突变体在纺织领域中的应用。