CN104862295B - 热稳定碱性果胶酶突变体及其编码基因以及它们的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种果胶酶蛋白，其中，所述果胶酶蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No：5或SEQ ID No：6所示。另外，本发明还提供了含有该编码基因的重组载体和转基因细胞，含有所述果胶酶蛋白作为活性成分的组合物，以及如上所述的果胶酶蛋白、编码基因、重组载体、转基因细胞和组合物在水解果胶中的应用。本发明提供的果胶酶蛋白具有较高的热稳定性和活性。

Description

热稳定碱性果胶酶突变体及其编码基因以及它们的应用

技术领域

本发明涉及一种果胶酶蛋白，所述果胶酶蛋白的编码基因，含有该编码基因的重组载体和转基因细胞，含有所述果胶酶蛋白作为活性成分的组合物，以及如上所述的果胶酶蛋白、编码基因、重组载体、转基因细胞和组合物在水解果胶中的应用。

背景技术

果胶质是一种酸性多糖物质，广泛存在于植物界，主要存在于植物的细胞初生壁和细胞中间层，为内部细胞的支撑物质。果胶的化学结构复杂，果胶的主链是部分甲酯化的半乳聚糖，支链依据果胶质来源的不同而改变。去酯化的果胶被称作果胶酸或者多聚半乳糖醛酸。水解这类果胶物质的酶被广泛称作果胶酶。内切聚半乳糖醛酸裂解酶（EC.4.2.2.2）是通过β消除作用随机裂解果胶酸的α-1,4-糖苷键将其降解。碱性果胶酶可应用于一些传统的工业过程，如纺织和植物纤维处理、咖啡和茶业发酵、油料提取、含有果胶物质的工业废水处理。由于微生物酶法在生物精炼及植物纤维脱胶等处理过程比传统的化学处理具有明显的优势，它能够减少化学处理过程中采用高浓度的强碱溶液对植物纤维的损害及后期污水的处理，因而也引起越来越多的研究。

酶学特性和酶的稳定性是影响其应用的关键因素之一。由于脱胶的过程多数是在碱性和较高温度条件下进行的，也就要求了参与这过程中的酶要必须要能耐受较高的温度和碱性。其中酶的热稳定性对于工业应用来说十分重要，而且高温条件下，酶的反应速度更快，能缩短反应周期，节约成本，也有利于避免反应过程中被其他微生物污染。

从嗜碱芽孢杆菌Bacillus sp. N16-5（CGMCC N0.0369）克隆得到的果胶酶Bsp165PelA具有活性高，最适反应pH高，同时它并不需要额外添加Ca²⁺就能保持活性，在生物脱胶等方面具有较大的工业应用潜力，但由于其热稳定性不理想，50℃保温30min就基本丧失了活性，提高其热稳定性具有重要意义。

发明内容

本发明的目的是为了克服现有果胶酶不能够耐高温的缺陷，提供了一种耐高温的果胶酶蛋白及其编码基因，另外，还提供了含有编码所述果胶酶蛋白的基因的重组载体、细胞，以及含有所述果胶酶蛋白的组合物，以及它们的应用。

为了实现上述目的，一方面，本发明提供了一种果胶酶蛋白，其中，所述果胶酶蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No：5或SEQ ID No：6所示。

第二方面，本发明提供了一种编码基因，其中，所述编码基因能够编码如上所述的果胶酶蛋白。

第三方面，本发明提供了一种重组载体，其中，所述重组载体含有如上所述的编码基因。

第四方面，本发明提供了一种转基因细胞，其中，所述转基因细胞含有如上所述的编码基因。

第五方面，本发明提供了一种组合物，其中，所述组合物含有如上所述的果胶酶蛋白作为活性成分。

第六方面，本发明提供了如上所述的果胶酶蛋白、如上所述的编码基因、如上所述的重组载体、如上所述的转基因细胞、如上所述的组合物在水解果胶中的应用。

通实施例可以看出，本发明提供的果胶酶蛋白的热稳定性能明显得到了提高。

本发明的其他特征和优点将在随后的具体实施方式部分予以详细说明。

附图说明

附图是用来提供对本发明的进一步理解，并且构成说明书的一部分，与下面的具体实施方式一起用于解释本发明，但并不构成对本发明的限制。在附图中：

图1显示了果胶酶蛋白突变体以及野生型果胶酶蛋白在50℃下保温不同时间的残余酶活。

具体实施方式

以下对本发明的具体实施方式进行详细说明。应当理解的是，此处所描述的具体实施方式仅用于说明和解释本发明，并不用于限制本发明。

第一方面，本发明提供了一种果胶酶蛋白，其中，所述果胶酶蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No：5（表示为2B9）或SEQ ID No：6（表示为EA）所示。

根据本发明，所述果胶酶蛋白的来源没有特别的限制，只要能够获得如上氨基酸序列的果胶酶蛋白即可。例如，所述果胶酶蛋白可以由人工合成获得，也可以通过该果胶酶蛋白的氨基酸序列获得其编码基因，然后再进行相应的生物表达获得。

基于此，本发明提供了一种编码基因，其中，所述编码基因能够编码如上所述的果胶酶蛋白。

本领域技术人员公知，遗传密码子具有简并性，因此，在了解如上果胶酶蛋白的氨基酸序列的情况下，本领域技术人员根据常规的技术手段能够获得核苷酸序列不同的、且能够编码如上果胶酶蛋白的编码基因。

优选的情况下，编码SEQ ID No：5的基因的核苷酸序列如SEQ ID No：2所示、编码SEQ ID No：6的基因的核苷酸序列如SEQ ID No：3所示。

其中，编码野生型果胶酶蛋白SEQ ID No：4（表示为WT）的基因的核苷酸序列如SEQID No：1所示。

第三方面，本发明提供了一种重组载体，其中，所述重组载体含有如上所述的编码基因。

第四方面，本发明提供了一种转基因细胞，其中，所述转基因细胞含有如上所述的编码基因。

所述转基因细胞优选为原核细胞，更优选为大肠杆菌。

根据本发明，本发明提供的转基因细胞可以用于所述果胶酶蛋白的制备，具体地，所述转基因细胞可以为大肠杆菌，可以在35-40℃的条件下进行培养，当OD值达到0.6左右时，加入诱导剂继续培养4-6小时。所述诱导剂通常为异丙基硫代半乳糖苷（IPTG），其终浓度例如可以为0.8-1.2mM。

第五方面，本发明提供了一种组合物，其中，所述组合物含有如上所述的果胶酶蛋白作为活性成分。

根据本发明，所述组合物中所述果胶酶蛋白的浓度没有特别的限制，可以根据具体的情况进行具体的选择，在此不再详细赘述。

另外，根据预定的用途不同，本发明提供的组合物可以制备为不同的剂型，并且添加有相应的赋形剂等成分。具体的选择为本领域技术人员所公知，在此不再详细赘述。

第六方面，本发明提供了如上所述的果胶酶蛋白、如上所述的编码基因、如上所述的重组载体、如上所述的转基因细胞、如上所述的组合物在水解果胶中的应用。

以下通过实施例进一步详细说明本发明。

下列实施例中未注明具体条件的试验方法，按照常规条件进行，例如《分子克隆：实验室手册》中所述的条件，或按照相应生物学试剂的制造厂商所建议的条件。

实施例1

易错PCR方法构建果胶酶突变文库

首先采用PCR方法（pelA上游引物序列为：5’-GTGCGCTAGCATGGGACG-3’，如SEQ IDNo：9所示； pelA下游引物序列为5’-GCGAAGCTTTCATCGATTTG-3’， 如SEQ ID No：10所示）从嗜碱芽孢杆菌Bacillus sp. N16-5（CGMCC N0.0369）基因组扩增获得果胶酶Bsp165PelA基因pelA，构建重组质粒pET28a-pelA。再以pET28a-pelA为模板，利用易错PCR技术在体外向pelA引入核苷酸突变。随机突变引物序列为如SEQ ID No：7（MegaF：5’-GCGGCAGCCATATGGCTAGCT-3）和SEQ ID No：8（MegaR：5’-GCTCGAGTGCGGCCGCAAGCTTC-3）所示。

扩增体系为：

PCR扩增条件为：94 ℃ 4min；94 ℃ 45s，55 ℃ 1min，72 ℃ 1min，30个循环；72℃ 10min。

全质粒的构建采用大引物的PCR扩增法（Megaprimer PCR for of wholeplasmid, MEGAWHOP）。将上述易错PCR扩增产物经DNA纯化试剂盒纯化后，直接作为大片段引物，以重组质粒pET28a-pelA为模板，对全质粒进行PCR扩增。MEGAWHOP PCR扩增程序：94℃，4min；94℃，45s，55℃，1min，72℃，7min，24个循环；72℃，20min。

扩增体系如下：

所得产物经DpnI酶切过夜后，电转化至E. coli BL21 (DE3)Gold电转感受态细胞（自制）。然后涂布于LB（含50ng/μL卡那霉素）平板。培养过夜后，用灭菌的牙签将单克隆挑于含160μL LB（含50ng/μL卡那霉素）液体培养基的96孔板中，培养过夜后，加入50μL 60%甘油混匀后于-80 ℃保存，构成随机突变库，含有约12000个克隆子。

实施例2

热稳定性提高突变体的筛选

用灭菌的96孔板针复制器将突变体以及野生型菌株复制于新鲜的LB（含50ng/μL卡那霉素，0.1mM IPTG）液体培养基中，诱导培养过夜。所得的菌液用于进一步的筛选。

1、96孔板初筛：将诱导培养的菌液稀释10倍，65℃保温10min后置于冰上冷却，吸取20μL菌液与80μL含0.2%聚半乳糖醛酸（PGA）（w/v）的Glycin-NaOH缓冲液（pH10.0）混匀，于55 ℃反应5min后于冰上冷却，加入80μL DNS（3,5-二硝基水杨酸）溶液，并于98℃反应10min，测定OD₅₄₀。在该选择的温度下保温10min后野生型的残余酶活基本为0，因而颜色较浅；如果在该选择的温度下保温10min后突变体的颜色较深，即表明突变体的残余酶活明显高于野生型，初步认定为热稳定性提高的突变体。

2、突变体复筛：为了进一步确定突变体的热稳定性，将初步得到的热稳定性提高的突变体和野生型Bsp165PelA进行蛋白纯化并测定其在50℃条件下的半衰期t_1/2。

酶蛋白纯化过程如下：

将过夜活化的突变体和野生型培养液按照1体积%的接种量转接至100ml新鲜的LB（含卡那霉素50μg/mL）液体培养基中，37℃培养至OD₆₀₀达到0.6左右，加入终浓度为1mM的IPTG继续诱导培养5h。将培养液6000g离心10min收集菌后重悬于10ml 结合缓冲液（20mMTris-HCl，500mMNaCl，10mM咪唑，pH7.9）中，超声破碎菌体（16v，20min），4℃，15,000g离心10 min，收集上清，即为粗酶液。

将制备好的粗酶液加入结合缓冲液平衡过的His Bind Column（Novagen 公司生产）中，用10倍床体积结合缓冲液洗涤，除去未结合的杂蛋白；5倍床体积漂洗缓冲液（20mMTris-Cl，0.5M NaCl，60mM咪唑，pH7.9）洗涤，除去结合较弱的杂蛋白；5倍床体积洗脱缓冲液（20mM Tris-Cl，0.5MNaCl，500mM咪唑，pH7.9）洗脱，收集目的蛋白洗脱液约5ml。

将收集液在AKTA FPLC系统上进行脱盐，脱盐缓冲液为20mMTris-HCl，pH8.0。

测试例

按照以下方法对以上得果胶酶蛋白的热稳定性进行测试：

将实施例2中得到的目的蛋白洗脱液稀释至1μg/mL后，于50℃保温不同时间后取出测定残余酶活，以未经保温的酶活为初始酶活，残余酶活为初始酶活一半时所对应的保温时间为酶在该条件下的半衰期。其中，以果胶酶蛋白在50℃条件下的半衰期t_1/2表示其热稳定性。

果胶酶蛋白的活性的测试：

吸取10μL酶溶液与200μL含0.2%（w/v）聚半乳糖醛酸（PGA）的Glycin-NaOH缓冲液（pH10.0）混匀后，于50℃反应10min，加入210μL DNS（3,5-二硝基水杨酸）于沸水浴中反应5min后测定OD₅₄₀。每次试验重复3次。酶活定义为一定条件下每分钟产生1μmol对应的半乳糖醛酸的酶量为一个酶活单位。

通过上述筛选，最终得到了热稳定性和活性均明显提高的果胶酶蛋白突变体2B9和EA。将确定热稳定性和活性提高的突变体基因测序后，确定突变体的氨基酸突变。表1示出了突变体所发生的氨基酸取代及t_1/2。图1所示果胶酶突变体蛋白以及野生型果胶酶蛋白在50℃保温不同时间的残余酶活。

表1

注：S271G表示SEQ ID No：4的第271位的丝氨酸突变为甘氨酸；N186D表示SEQ IDNo：4的第186位的天冬酰胺突变为天冬氨酸；I211V表示SEQ ID No：4的第211位的异亮氨酸突变为缬氨酸；A254T表示SEQ ID No：4的第254位的丙氨酸突变为苏氨酸；N289H表示SEQID No：4的第289位的天冬酰胺突变为组氨酸。

由以上表1可以看出，本发明提供的果胶酶突变体蛋白与野生型的果胶酶蛋白相比具有较高的热稳定性，同时它们的活性与野生型相比也得到了明显的提高。其中果胶酶蛋白2B9的半衰期t_1/2提高了3.5倍，同时其活性比野生型提高了约60%。而果胶酶蛋白EA的半衰期t_1/2比野生型提高了24倍，同时活性比野生型提高了约23%，具有较大的应用潜力。

以上详细描述了本发明的优选实施方式，但是，本发明并不限于上述实施方式中的具体细节，在本发明的技术构思范围内，可以对本发明的技术方案进行多种简单变型，这些简单变型均属于本发明的保护范围。

另外需要说明的是，在上述具体实施方式中所描述的各个具体技术特征，在不矛盾的情况下，可以通过任何合适的方式进行组合。为了避免不必要的重复，本发明对各种可能的组合方式不再另行说明。

此外，本发明的各种不同的实施方式之间也可以进行任意组合，只要其不违背本发明的思想，其同样应当视为本发明所公开的内容。

Claims (8)

1.一种果胶酶蛋白，其特征在于，所述果胶酶蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No：5或SEQID No：6所示。

2.一种编码基因，其特征在于，所述编码基因能够编码权利要求1所述的果胶酶蛋白。

3.根据权利要求2所述的编码基因，其中，所述编码基因的核苷酸序列如SEQ ID No：2或SEQ ID No：3所示。

4.一种重组载体，其特征在于，所述重组载体含有权利要求2所述的编码基因。

5.一种转基因细胞，其特征在于，所述转基因细胞含有权利要求2所述的编码基因。

6.根据权利要求5所述的转基因细胞，其中，所述转基因细胞为原核细胞。

7.一种组合物，其特征在于，所述组合物含有权利要求1所述的果胶酶蛋白作为活性成分。

8.权利要求1所述的果胶酶蛋白、权利要求2所述的编码基因、权利要求4所述的重组载体、权利要求5所述的转基因细胞、权利要求7所述的组合物在水解果胶中的应用。