CN102021157A

CN102021157A - 一种果胶酶及其编码基因

Info

Publication number: CN102021157A
Application number: CN2009100939254A
Authority: CN
Inventors: 马延和; 李刚; 薛燕芬
Original assignee: Institute of Microbiology of CAS
Current assignee: Institute of Microbiology of CAS
Priority date: 2009-09-23
Filing date: 2009-09-23
Publication date: 2011-04-20
Anticipated expiration: 2029-09-23
Also published as: CN102021157B

Abstract

本发明公开了一种果胶酶及其编码基因。本发明提供的蛋白质，是如下(a)或(b)的蛋白质：(a)由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质；(b)将序列1的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有果胶酶活性的由序列1衍生的蛋白质。所述蛋白的编码基因、以及含有所述基因的重组表达载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌均属于本发明的保护范围。所述蛋白、所述基因、所述重组表达载体、所述表达盒、转基因细胞系或重组菌均可应用于降解多聚半乳糖醛酸。本发明的PelA蛋白可以应用于苎麻脱胶等工业过程。

Description

一种果胶酶及其编码基因

技术领域

本发明涉及一种果胶酶及其编码基因。

背景技术

果胶分子是由不同酯化度的半乳糖醛酸以α-1，4糖苷键聚合而成的多糖链，常带有鼠李糖、阿拉伯糖、半乳糖、木糖、海藻糖、芹菜糖等组成的侧链。果胶存在于所有的高等植物中，沉积于初生细胞壁和细胞间层，在初生壁中与不同含量的纤维素、半纤维素、木质素的微纤丝以及某些伸展蛋白相互交联，使各种细胞组织结构坚硬，表现出固有的形态。

多种微生物都能够产生果胶酶，如细菌、酵母、真菌、放线菌。

果胶酶大致分为果胶水解酶(pectin hydrolases)、果胶裂解酶(pentin lyases，PL)、果胶酯酶(pectin esterases，PE)和原果胶酶等。其中果胶水解酶又可分为聚半乳糖醛酸酶(polygalacturonases，PG)、聚半乳糖醛酸甲酯水解酶(polymethylgalacturonases，PMG)、聚鼠李半乳糖醛酸酶(rhamnogalacturonases，RHG)、阿拉伯聚糖酶、半乳聚糖酶、木糖基半乳糖醛酸酶。

微生物产生的果胶酶在工业上有着广泛的应用。酸性果胶酶广泛应用于果汁和酒类的提取中。碱性果胶酶应用于：处理蔬菜食品加工过程中产生的废水、纺织加工、植物纤维(如苎麻、印度麻、亚麻、黄麻)的解聚和去皮、造纸和纸浆工业、油料的提取、咖啡和茶业的发酵过程。尤其在纺织工业上，应用碱性果胶酶可以特异性的作用于非纤维素类物质，不会影响纤维的长度，同时能够减少原材料的损失和化学品的消耗，是一种能够代替化学处理的环境友好的方法。因此，获得能够在高碱性条件下表现高活性的碱性果胶酶就成为研究开发与应用碱性果胶酶的关键。

发明内容

本发明的目的是提供一种果胶酶及其编码基因。

本发明提供的果胶酶(PelA)，属于多糖裂解酶家族1，来自芽孢杆菌(Bacillus sp.)，是如下(a)或(b)的蛋白质：

(a)由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质；

(b)将序列1的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有果胶酶活性的由序列1衍生的蛋白质。

序列1所示的PelA蛋白由362个氨基酸残基组成。

为了使(a)中的PelA便于纯化，可在由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质的氨基末端或羧基末端连接上如表1所示的标签。

表1标签的序列

标签	残基	序列
			Poly-Arg	5-6(通常为5个)	RRRRR
Poly-His	2-10(通常为6个)	HHHHHH
			FLAG	8	DYKDDDDK
Strep-tagII	8	WSHPQFEK
			c-myc	10	EQKLISEEDL

上述(b)中的PelA可人工合成，也可先合成其编码基因，再进行生物表达得到。上述(b)中的PelA的编码基因可通过将序列表中序列2自5′端第1至1089位核苷酸所示的DNA序列中缺失一个或几个氨基酸残基的密码子，和/或进行一个或几个碱基对的错义突变，和/或在其5′端和/或3′端连上表1所示的标签的编码序列得到。

编码上述PelA蛋白的基因(pelA)也属于本发明的保护范围。

所述基因是如下1)或2)或3)或4)的DNA分子：

1)编码序列是序列表中序列2自5′端第109至1089位核苷酸所示的DNA分子；

2)编码序列是序列表中序列2所示的DNA分子；

3)在严格条件下与1)或2)限定的DNA序列杂交且编码所述蛋白的DNA分子；

4)与1)或2)或3)限定的DNA序列具有90％以上同源性，且编码具有果胶酶活性的蛋白的DNA分子。

序列2所示pelA基因由1089个核苷酸组成。

上述严格条件可为在6×SSC，0.5％SDS的溶液中，在65℃下杂交，然后用2×SSC，0.1％SDS和1×SSC，0.1％SDS各洗膜一次。

含有以上任一所述基因的重组载体也属于本发明的保护范围。

所述重组载体具体可为将所述基因插入pUC18质粒的多克隆位点得到的重组质粒。

所述重组载体具体可为重组表达载体。可用现有的表达载体构建含有所述基因的重组表达载体。使用所述基因构建重组表达载体时，在其转录起始核苷酸前可加上任何一种增强型启动子或组成型启动子，它们可单独使用或与其它的启动子结合使用；此外，使用本发明的基因构建重组表达载体时，还可使用增强子，包括翻译增强子或转录增强子，这些增强子区域可以是ATG起始密码子或邻接区域起始密码子等，但必需与编码序列的阅读框相同，以保证整个序列的正确翻译。所述翻译控制信号和起始密码子的来源是广泛的，可以是天然的，也可以是合成的。翻译起始区域可以来自转录起始区域或结构基因。

所述重组表达载体具体可为将所述基因插入pET28a质粒的多克隆位点得到的重组质粒。具体来说，所述重组表达载体为将pET28a质粒NheI和HindIII酶切位点之间的小片段取代为所述基因得到的重组质粒。

含有以上任一所述基因(pelA)的表达盒、转基因细胞系及重组菌均属于本发明的保护范围。

所述重组菌可为将所述重组表达载体转化大肠杆菌BL21(DE3)得到的重组菌。

本发明同时保护一种制备果胶酶的方法，是培养所述重组菌，得到果胶酶。所述制备果胶酶的方法具体可为：将所述重组菌37℃培养3h，OD₆₀₀＝0.7时，加入IPTG至终浓度0.8μM，转至30℃继续培养4h。

扩增所述基因(pelA)全长或任一片段的引物对也属于本发明的保护范围。

所述蛋白、所述基因、所述重组表达载体、所述表达盒、转基因细胞系或重组菌均可应用于降解多聚半乳糖醛酸。

应用所述蛋白降解多聚半乳糖醛酸时，温度为40-70℃，pH为9-12。应用所述蛋白降解多聚半乳糖醛酸时，40℃时、pH11.5具有最高酶活性。应用所述蛋白降解多聚半乳糖醛酸时，pH10时、50℃具有最高酶活性。

本发明的PelA蛋白具有果胶酶活性，属于碱性果胶酶。PelA蛋白与其它已报导的果胶酶的氨基酸序列相比，相似性小于47％，属于多糖裂解酶家族1中的一员。本发明的PelA蛋白可以应用于苎麻脱胶等工业过程。

附图说明

图1为果胶酶活性随温度的变化。

图2为果胶酶活性随pH的变化。

具体实施方式

以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。

多聚半乳糖醛酸：Cat.N081325，sigma。

芽孢杆菌(Bacillus sp.)N16-5于1999年1月27日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址为：北京市朝阳区大屯路)，保藏编号为CGMCC No.0369。芽孢杆菌N16-5在以甘露聚糖为碳源的培养条件下可产生芽孢，生长的pH范围为8-11.5，在5-8％的NaCl中生长良好。

实施例1、碱性果胶酶的发现

一、芽孢杆菌N16-5总DNA的提取

采用芽孢杆菌(Bacillus sp.)N16-5，取其新鲜湿菌体20克，悬于10毫升50mM Tris缓冲液中(pH8.0)，加入少量溶菌酶和8毫升0.25mM EDTA(pH8.0)，混匀后37℃放置20min；之后加入2毫升10％SDS，55℃放置5min，分别用等体积酚、氯仿各抽提一次；取最后一次的上清溶液，加入2倍体积乙醇，回收DNA，分别用70％和无水乙醇洗；沉淀溶于0.5毫升TE缓冲液(pH8.0，10mM Tris，1mMEDTA)，加入10mg/ml RNase 3μl，37℃保温1小时，分别用等体积酚、氯仿各抽提一次；上清溶液加入2倍体积乙醇，回收DNA，分别用70％和无水乙醇洗，真空干燥，用去离子水溶解。DNA溶液的紫外分光光度计测定结果：A260/A280＝1.98，A260/A230＝2.18。

二、碱性果胶酶的发现

1、取总DNA溶液10μl(约50μg DNA)，用限制性内切酶Sau3AI部分酶切，经琼脂糖凝胶电泳，回收2-8kb DNA片段。

2、连接反应16小时

连接体系(20μl)：2μl(5μg)Sau3AI酶解DNA片段；

1μl(1μg)经BamHI酶解并去磷酸化的质粒pUC18DNA；

2μl 10x连接缓冲液；

1μl T4DNA连接酶；

14μl水。

3、用连接反应产物感受态大肠杆菌DH5α，然后涂于含50ug/ml Amp(氨苄青霉素)、0.5％果胶的固体培养基上，37℃培养16-18小时，菌落周围有透明圈的即为阳性克隆。

4、阳性克隆在Amp-LB培养基中37℃培养16-18小时，经活性测试具有碱性果胶酶活性。

对阳性克隆中的重组质粒进行了测序。测序结果显示，重组质粒中，在pUC18DNA骨架中插入了一个DNA片段，该DNA片段含有一个长1089bp的开放阅读框架(ORF)，ORF核苷酸序列如序列表的序列2所示，其中自5’端第1至108位核苷酸为信号肽。

序列2所示核苷酸编码一个由362个氨基酸组成的蛋白质(PelA蛋白)。PelA蛋白属多糖裂解酶家族1，与Bacillus licheniformis中的同源蛋白具有最高相似性(47％)。将PelA蛋白的编码基因命名为pelA基因。

实施例2、碱性果胶酶的表达

一、pelA基因的制备

根据pelA基因的核苷酸序列(如序列表的序列2所示)，设计引物对如下：

正向引物：5′-TATCGCTAGCTCTAACGGTCCACAAGGCTATG-3′；

反向引物：5′-CAGCAAGCTTCTTAGTTGATAACACCTACTCC-3′；

正向引物的下划线部分为NheI的酶切位点，反向引物的下划线部分为HindIII酶切位点。

以芽孢杆菌(Bacillus sp.)N16-5的总DNA为模板，用设计的引物对进行PCR扩增。

PCR反应体系：

10x缓冲液 5μl

dNTP 4μl

Taq DNA聚合酶 0.5μl

正向引物 1μl

反向引物 1μl

模板 0.5μl。

PCR反应条件：94℃预变性4min，然后94℃变性30秒-55℃退火30秒-72℃延伸30秒30个循环，最后72℃延伸10min。

PCR产物用1％琼脂糖凝胶电泳检测产量和特异性，并用DNA纯化试剂盒(超薄离心柱型，天根公司生产)纯化。将纯化的PCR产物进行测序，结果表明获得了序列表的序列2自5’端第109至1089位核苷酸所示的DNA片段。

二、重组表达载体的构建

1、将测序正确的PCR产物用NheI和HindIII双酶切，琼脂糖电泳回收酶切产物。

2、将质粒pET28a(Cat.N069864-3，Novogen)用NheI和HindIII双酶切，琼脂糖电泳回收酶切产物。

3、将步骤1的酶切产物和步骤2的酶切产物进行连接，得到重组质粒。

将重组质粒进行测序。结果表明，在pET28a的NheI和HindIII酶切位点之间插入了序列表的序列2自5’端第109至1089位核苷酸所示的pelA基因，将该重组质粒命名为pET28a-pelA。

三、工程菌的制备

用pET28a-pelA电击转化大肠杆菌BL21(DE3)(Cat.N0CB105，TIANGEN)后涂布于含有50μg/ml卡那霉素的LB平板，37℃过夜培养，得到含有pET28a-pelA的重组菌，即为工程菌。

用pET28a代替pET28a-pelA，转化大肠杆菌BL21(DE3)，步骤同上，得到含有pET28a的重组菌，作为对照菌。

四、果胶酶的制备和纯化

将步骤三制备的工程菌培养于含有50μg/ml卡那霉素的LB培养基中，37℃培养3h；0D₆₀₀＝0.7时，加入IPTG至终浓度0.8μM，转至30℃继续培养4h。

5000rpm、10min离心收集菌体，悬浮于溶液A(20mM Tris-Cl，pH7.9，0.5M NaCl，10mM咪唑；pH7.9)中，于冰浴中超声破碎(60w，10min；超声2s，停止2s)，之后15000rpm离心10min除去细胞碎片，上清过Ni-IDA His·Bind Superflow纯化柱，用5ml溶液A冲洗，再用10ml溶液B(20mM Tris-Cl，pH7.9，0.5M NaCl，60mM咪唑)漂洗，最后用5ml溶液C(20mM Tris-Cl，pH7.9，0.5M NaCl，500mM咪唑)洗脱，收集洗脱液。然后将洗脱液用FPLC(快速蛋白液相层析)脱盐，获得纯化的PelA蛋白(PelA蛋白)。

SDS-PAGE电泳显示纯化的PelA蛋白的分子量约为38kDa，基本符合理论推断的36kDa。

将步骤三制备的对照菌采用相同的步骤进行培养和纯化，得到的溶液作为对照酶液。

五、果胶酶活性测定

酶活单位定义为1min内催化产生1μmol还原糖所需的酶量。

1、最适温度

活性测定体系为1ml，由0.9ml溶液A和0.1ml PelA蛋白(或对照酶液)组成；

溶液A：在pH10.0、50mM的Glycine-NaOH buffer中加入PGA(多聚半乳糖醛酸，使其终浓度为0.2％(每100毫升溶液中含有0.2克PGA)。

将反应体系在特定温度温育20min后，加入1ml二硝基水杨酸溶液(DNS)终止反应，然后沸水浴5min后测定540nm的吸光值。

在50℃时，果胶酶液具有最高的酶活性。以最高酶活性体系的吸光值作为相对活性100％，其它反应体系的吸光值与最高酶活性体系的吸光值的比值作为各自的相对活性。

果胶酶活性随温度的变化见图1。结果表明：pH10.0的环境中，40℃-70℃时，PelA蛋白(果胶酶液)均具有较高的活性，50℃时，PelA蛋白(果胶酶液)具有最佳酶活性。而不管在哪个温度条件下，对照酶液均没有活性。

2、最适pH

活性测定体系为1ml，由0.9ml溶液B(B1、B2、B3、B4、B5、B6或B7)和0.1mlPelA蛋白(或对照酶液)组成；

溶液B1：在pH7.0、50mM的Tris-HCl buffer中加入PGA(多聚半乳糖醛酸，使其终浓度为0.2％(每100毫升溶液中含有0.2克PGA)。

溶液B2：在pH8.0、50mM的Tris-HCl buffer中加入PGA(多聚半乳糖醛酸，使其终浓度为0.2％(每100毫升溶液中含有0.2克PGA)。

溶液B3：在pH9.0、50mM的Tris-HCl buffer中加入PGA(多聚半乳糖醛酸，使其终浓度为0.2％(每100毫升溶液中含有0.2克PGA)。

溶液B4：在pH10.0、50mM的Glycine-NaOH buffer中加入PGA(多聚半乳糖醛酸，使其终浓度为0.2％(每100毫升溶液中含有0.2克PGA)。

溶液B5：在pH11.0、50mM的KCl-NaOH buffer中加入PGA(多聚半乳糖醛酸，使其终浓度为0.2％(每100毫升溶液中含有0.2克PGA)。

溶液B6：在pH11.5、50mM的KCl-NaOH buffer中加入PGA(多聚半乳糖醛酸，使其终浓度为0.2％(每100毫升溶液中含有0.2克PGA)。

溶液B7：在pH12.0、50mM的KCl-NaOH buffer中加入PGA(多聚半乳糖醛酸，使其终浓度为0.2％(每100毫升溶液中含有0.2克PGA)。

将反应体系在40℃温育20min后，加入1ml二硝基水杨酸溶液(DNS)终止反应，然后沸水浴5min后测定540nm的吸光值。

在pH11.5时，果胶酶液具有最高的酶活性。以最高酶活性体系的吸光值作为相对活性100％，其它反应体系的吸光值与最高酶活性体系的吸光值的比值作为各自的相对活性。

果胶酶活性随pH的变化见图2。结果表明：40℃时，pH9-pH12时，PelA蛋白(果胶酶液)均具有活性，pH11.5时，PelA蛋白(果胶酶液)具有最佳酶活性。而不管在哪个pH条件下，对照酶液均没有活性。

序列表

<110>中国科学院微生物研究所

<120>一种果胶酶及其编码基因

<130>CGGNARY92557

<160>2

<210>1

<211>362

<212>PRT

<213>芽孢杆菌(Bacillus sp.)

<400>1

Val Ser Asn Val Thr Lys Val Phe Lys Leu Leu Leu Ala Leu Ala Leu

1 5 10 15

Val Leu Pro Val Ile Ser Leu Gly Ser Pro Ala Ser Gln Ala Ala Ser

20 25 30

Asn Gln Pro Thr Ser Asn Gly Pro Gln Gly Tyr Ala Ser Met Asn Gly

35 40 45

Gly Thr Thr Gly Gly Ala Gly Gly Arg Val Glu Tyr Ala Ser Thr Gly

50 55 60

Ala Gln Ile Gln Gln Leu Ile Asp Asn Arg Ser Arg Ser Asn Asn Pro

65 70 75 80

Asp Glu Pro Leu Thr Ile Tyr Val Asn Gly Thr Ile Thr Gln Gly Asn

85 90 95

Ser Pro Gln Ser Leu Ile Asp Val Lys Asn His Arg Gly Lys Ala His

100 105 110

Glu Ile Lys Asn Ile Ser Ile Ile Gly Val Gly Thr Asn Gly Glu Phe

115 120 125

Asp Gly Ile Gly Ile Arg Leu Ser Asn Ala His Asn Ile Ile Ile Gln

130 135 140

Asn Val Ser Ile His His Val Arg Glu Gly Glu Gly Thr Ala Ile Glu

145 150 155 160

Val Thr Asp Asp Ser Lys Asn Val Trp Ile Asp His Asn Glu Phe Tyr

165 170 175

Ser Glu Phe Pro Gly Asn Gly Asp Ser Asp Tyr Tyr Asp Gly Leu Val

180 185 190

Asp Met Lys Arg Asn Ala Glu Tyr Ile Thr Val Ser Trp Asn Lys Phe

195 200 205

Glu Asn His Trp Lys Thr Met Leu Val Gly His Thr Asp Asn Ala Ser

210 215 220

Leu Ala Pro Asp Lys Ile Thr Tyr His His Asn Tyr Phe Asn Asn Leu

225 230 235 240

Asn Ser Arg Val Pro Leu Ile Arg Tyr Ala Asp Val His Met Phe Asn

245 250 255

Asn Tyr Phe Lys Asp Ile Asn Asp Thr Ala Ile Asn Ser Arg Val Gly

260 265 270

Ala Arg Val Phe Val Glu Asn Asn Tyr Phe Asp Asn Val Gly Ser Gly

275 280 285

Gln Ala Asp Pro Thr Thr Gly Phe Ile Lys Gly Pro Val Gly Trp Phe

290 295 300

Tyr Gly Ser Pro Ser Thr Gly Tyr Trp Asn Leu Arg Gly Asn Val Phe

305 310 315 320

Val Asn Thr Pro Asn Ser His Leu Asn Ser Thr Thr Asn Phe Thr Pro

325 330 335

Pro Tyr Ser Tyr Gln Val Gln Ser Ala Thr Gln Ala Lys Ser Ser Val

340 345 350

Glu Gln His Ser Gly Val Gly Val Ile Asn

355 360

<210>2

<211>1089

<212>DNA

<213>芽孢杆菌(Bacillus sp.)

<400>2

gtgagtaacg tgactaaagt ctttaaattg ttactggcat tagctctcgt tttaccagtt 60

atctcattgg gttctcctgc ctcacaagct gcttcaaatc agccaacttc taacggtcca 120

caaggctatg cgtcaatgaa tggaggcaca accggtggtg caggtggccg tgtcgaatat 180

gcaagcaccg gagcgcaaat tcagcaatta atagataacc gcagccgaag taataatcct 240

gatgaaccat taacgattta tgtaaacgga acgattacac aaggaaattc cccacagtcc 300

cttattgatg ttaaaaatca ccgtggaaaa gctcatgaaa ttaaaaacat ctctattatc 360

ggtgtaggga caaatggaga gtttgatggc attgggataa gactatcaaa cgcccataat 420

atcattatcc aaaatgtgtc aattcatcat gtgcgagagg gagaaggcac ggctattgaa 480

gtgacagatg acagtaaaaa cgtgtggatc gatcacaacg agttttatag tgaatttcca 540

ggtaatgggg actcggatta ttacgatggt ctcgtagaca tgaaaagaaa cgctgaatat 600

atcacagttt cttggaataa gtttgagaat cattggaaaa cgatgctcgt cggtcatact 660

gataatgcat cattagcgcc agataaaatt acgtatcatc acaattattt taataatctt 720

aattcacgtg tcccgcttat tcgatacgct gatgtccaca tgttcaataa ctattttaaa 780

gacattaatg atacagcgat taacagtcgt gtaggggctc gtgtctttgt agaaaacaac 840

tattttgaca acgtaggatc aggacaagct gacccaacga ctggttttat taaagggcct 900

gttggttggt tctatggaag tccgagtact gggtattgga atttacgtgg aaatgtattt 960

gtcaatacac cgaatagtca tttaaactct acaacaaact ttacaccacc atatagttac 1020

caagtccaat cagctactca agcaaaatca tctgttgaac aacattctgg agtaggtgtt 1080

atcaactaa 1089

Claims

1.一种蛋白质，是如下(a)或(b)的蛋白质：

(a)由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质；

2.编码权利要求1所述蛋白的基因。

3.根据权利要求2所述的基因，其特征在于：所述基因是如下1)或2)或3)或4)的DNA分子：

2)编码序列是序列表中序列2所示的DNA分子；

4.含有权利要求2或3所述基因的重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌。

5.如权利要求4所述的重组载体，其特征在于：所述重组载体为如下(I)或(II)的重组质粒：

(I)将权利要求2或3所述基因插入pUC18质粒的多克隆位点得到的重组质粒；

(II)将权利要求2或3所述基因插入pET28a质粒的多克隆位点得到的重组质粒。

6.如权利要求4所述的重组菌，其特征在于：所述重组菌是将权利要求5的(II)所述的重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)得到的。

7.一种制备果胶酶的方法，是培养权利要求4或6所述的重组菌，得到果胶酶。

8.扩增权利要求2或3所述基因的全长及其任意片段的引物对。

9.权利要求1所述蛋白、权利要求2或3所述基因、权利要求4、5或6所述重组表达载体、所述表达盒、转基因细胞系或重组菌中的任意一种在降解多聚半乳糖醛酸中的应用。

10.如权利要求9所述的应用，其特征在于：应用权利要求1所述蛋白降解多聚半乳糖醛酸时，温度为40-70℃，pH为9-12。