JP5932644B2 - ポルフィラナーゼ、及び多糖の加水分解のためのその使用 - Google Patents
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Description
本発明者は、このたびが初の報告となる、2つのポルフィラナーゼを単離し特徴付けた。それらは糖質加水分解酵素のGH16のファミリーに属するが、ゾベリア・ガラクタニボラン(Z. galactanivorans)に存在するこのファミリーの他のメンバーとの配列同一性は26%未満である。
本発明者は、このたびが初の報告となるポルフィラナーゼを単離し特徴付けた。従って、本発明は、ポルフィラナーゼ活性を有することを特徴とする単離ポリペプチドに関する。
−配列番号2の残基19-274 (触媒ドメイン、PorA_CMと呼ばれる断片を含むPorAの断片に相当する);
−配列番号2の残基19-510 (成熟タンパク質PorAに相当する);
−配列番号2の残基1-510(完全タンパク質PorAに相当する);
−配列番号5の残基22-293(成熟タンパク質PorBに相当する); 又は
−配列番号5の残基1-293(完全タンパク質PorBに相当する)、
から選択される配列を含み、又はこれらの中から選択される配列から成る。
a)残基:
−配列番号2の19-274;
−配列番号2の19-510;
−配列番号2の1-510;
−配列番号5の22-293; 又は
−配列番号5の1-293、
と少なくとも26、30、40、50、60、70、80、90、95、96、97、98又は99 %同一である配列
b)配列 (a)の少なくとも20、50、100、150、200、210、220、230、240又は250個の連続するアミノ酸の断片; 及び
c)残基:
−配列番号2の19-274;
−配列番号2の19-510;
−配列番号2の1-510;
−配列番号5の22-293; 又は
−配列番号5の1-293、
に存在する配列の少なくとも20、50、100、150、200、210、220、230、240又は250個の連続するアミノ酸の断片、
から選択される配列を含み、又はこれらの中から選択される配列から成る。
本発明はまた、本発明のポリペプチドをコードする単離核酸に関する。本発明のこのポリペプチドは、上記段落で記載したいずれかのポルフィラナーゼに対応し得る。
a)配列番号1のヌクレオチド1−1533又は55−1533;
b)配列番号4のヌクレオチド1−882又は64−882; 及び
c)配列(a) 又は (b)と相補的な配列、
から選択される配列を含み、又はこれらの中から選択される配列から成ってよい。
a)ヌクレオチド:
−配列番号1の1−1533又は55−1533; 又は
−配列番号4の1−882又は64−882、
と少なくとも30、40、50、60、70、80、90、95、96、97、98又は99%同一である配列
b)配列(a)の少なくとも60、150、300、450、600又は750個の連続するヌクレオチドの断片;
c)ヌクレオチド:
−配列番号1の1−1533又は55−1533; 又は
−配列番号4の1−882又は64−882、
に存在する配列の少なくとも60、150、300、450、600又は750個の連続するヌクレオチドの断片
d)高ストリンジェントな条件下で配列番号1又は4とハイブリッド形成する核酸によってコードされる配列; 及び
e)配列 (a)−(d)の1つと相補的な配列、
から選択される配列を含み、又はこれらの中から選択される配列から成る核酸を含む。
本発明はまた、本発明の核酸を含む発現ベクターに関する。例えばプラスミドとすることができるこれらの発現ベクターは、本発明の核酸配列に加えて、その発現に必要な手段を含む。これらの手段は、例えば転写ターミネーター又はプロモーターを含む。発現ベクターは、他の要素、例えば複製開始点、マルチクローニングサイト、転写促進因子、クローン化中にフェーズにおいて本発明のポリペプチドと融合され得るシグナルペプチド、及び1又は2以上の選択マーカー等もまた含んでよい。
本発明者は、酵素PorA及びPorBをポルフィランの加水分解に使用することができ、それらにより特定の構造及びサイズを有するオリゴ糖が得られることを見出した。より詳細には、PorA及びPorBによるポルフィランの加水分解によって、オリゴポルフィラン、特にネオポルフィロビオース、ネオポルフィロテトラオース及び/又はネオポルフィロヘキサオースを得ることが可能である。
a)本発明のポリペプチド又は本発明の宿主細胞を供する工程; 及び
b)加水分解された多糖を得ることにつながる条件下、例えば完全な加水分解につながる条件下で、ポリペプチド又は宿主細胞を多糖と接触させる工程、
を含む。
配列番号1は、ポルフィラナーゼAのヌクレオチド配列を表す。
配列番号2は、ポルフィラナーゼAのタンパク質配列を表す。
配列番号3は、実施例2において生成される組換えポルフィラナーゼAのタンパク質配列を表す。
配列番号4は、ポルフィラナーゼBのヌクレオチド配列を表す。
配列番号5は、ポルフィラナーゼBのタンパク質配列を表す。
配列番号6は、実施例2において生成される組換えポルフィラナーゼBのタンパク質配列を表す。
配列番号7−10は、ポルフィラナーゼA及びポルフィラナーゼBをコードする遺伝子のクローン化に適したプライマーを表す。
酵素PorA及びPorBをコードする翻訳領域を、ゾベリア・ガラクタニボラン(Z. galactanivorans)のゲノム配列に基づいて構築した。PCRによって標的遺伝子を、ゾベリア・ガラクタニボラン(Z. galactanivorans)のゲノムDNA物質から、以下の表1に示すように5’及び3’プライマーで同時に増幅した。
PorA_CM及びPorBを、大腸菌(E. coli)細胞 (株BL21, DE3)中で過剰発現させた。100 μg mL-1のアンピシリンを含む1 LのZYP-5052培地中で、過剰発現を20 ℃で行った(Studier 2005 Protein Expr. Purif. 41(1):207-34)。培養の3日と半日後に、遠心分離 (4,000g、20 分、4℃) によって細胞を回収した (600 nmの最終OD: 約16)。続いて、緩衝液A (20 mM トリス pH 8、200 mM NaCl、20 mM イミダゾール、pH 7.5、リゾチーム、デオキシリボヌクレアーゼ)中で沈渣を懸濁した。それにより懸濁した細胞をリゾチームで氷上で30分間溶解し、続いて、超音波処理に供した。可溶化液を遠心分離 (50,000g, 30分, 4℃)、続いて、0.2 μmフィルター(Millipore) を使用した濾過によって分離させた。その濾過溶液を、NiSO4 溶液で充填された10 mLのIMAC HyperCell (Pall Corporation)カラム上に負荷した。カラムをリゾチーム及びデオキシリボヌクレアーゼの何れも含まない緩衝液Aで予め平衡化させた。緩衝液Aでの洗浄工程後(10カラム容積)に、緩衝液A及び60%の緩衝液B(20 mM トリス pH 8, 200 mM NaCl 及び500 mM イミダゾール) を添加した緩衝液A間の直線勾配の生成によって、60 mL中で1 mL分-1でタンパク質を溶出させた。最終体積約5mLを得るために、Amicon膜(ポリエーテルサルホン, 制限サイズ30 kDa) 上で超濾過によってタンパク質を濃縮させた。続いて、緩衝液C (PorA_CM 用の20 mM トリス pH 8, 4 % (v/v) グリセロール、及びPorB用の20 mM トリス)で事前に平衡化したセファクリル(Sephacryl)(登録商標)S-200 (GE Healthcare) カラム上で速度mL分-1で、第二の精製工程を行った。(SDS-PAGEで分析される) 純粋タンパク質を含む画分全てを添加し、濾過/遠心分離によって、PorA_CMに関して2.6 mg/mL及びPorBに関して約 8 mg/mLで濃縮した (Amicon, 制限サイズ10 kDa)。クロマトグラフィ法は全て、AKTA Explorer システム(GE-Healthcare) で室温で行った。
1% (w/v)の多糖を含む溶液を、ポルフィラナーゼA及びBでの酵素加水分解のために使用した。総量50 mLの多糖溶液を、6 μgの酵素で30℃で一晩インキュベートした。完全な加水分解が達成されるまで (約14時間)、加水分解のために一定分量を取り出した。
GE HealthCareから購入した3つのSuperdex 30 (26/60) カラムで、順に調製用排除クロマトグラフィによってオリゴポルフィランの精製、インジェクターシステム/液体回収HPLCシステム(Gilson)上での統合を行った。オリゴ糖の屈折率 (Spectra System RI-50 検出器)、及びソフトウェアパッケージUnipoint (Gilson)によるデータの統合(Gilson 及び屈折検出器) によってオリゴ糖を検出した。
細菌ゾベリア・ガラクタニボラン(Zobellia galactanivorans)(SDMZコレクションに1998年5月8日に番号DSM 12170で寄託) の完全なゲノムの配列決定を達成した。配列決定により、糖質加水分解酵素のGH16 ファミリーに属する16個の遺伝子の同定ができた。これらの16個の遺伝子間で、κ-カラギーナーゼ、CgkA及びβ-アガラーゼAgaA及びAgaBをコードする遺伝子は、既に周知であり特徴付けされている(Barbeyron et al. Mol. Biol. Evol. 1998 15:528-37 ; Jam et al. Biochem. J. 2005 385:703-13 ; Allouch et al. J. Biol. Chem. 2003 278:47171-80)。
Claims (15)
- ポルフィラナーゼ活性を有する単離ポリペプチドであって、
配列番号2の配列の残基19〜274、又は
配列番号5の配列の残基22〜293、
と少なくとも90%同一である配列を含む、単離ポリペプチド。 - 配列番号2の配列の残基19〜510、又は
配列番号5の配列の残基22〜293、
と少なくとも90%同一である配列を含む、請求項1に記載のポリペプチド。 - シグナルペプチドをさらに含む、請求項1又は2に記載のポリペプチド。
- 前記シグナルペプチドが、タンパク質の天然のシグナルペプチドである、請求項1〜3のいずれか1項に記載のポリペプチド。
- 配列番号2の配列の残基1〜510、又は
配列番号5の配列の残基1〜293、
と少なくとも90%同一である配列を含む、請求項1〜4のいずれか1項に記載のポリペプチド。 - 配列番号2の配列又は配列番号5の配列と、保存置換の存在のみ異なる、請求項1〜5のいずれか1項に記載のポリペプチド。
- ポリペプチドが組換えポリペプチドである、請求項1〜6のいずれか1項に記載のポリペプチド。
- 請求項1〜7のいずれか1項に記載のポリペプチドをコードする、単離核酸。
- 請求項8に記載の核酸を含む、発現ベクター。
- 請求項9に記載の発現ベクターによって形質転換された、宿主細胞。
- 請求項1〜7のいずれか1項に記載のポリペプチドの、多糖の加水分解のための使用。
- 多糖を加水分解する方法であって、
a)請求項1〜7のいずれか1項に記載のポリペプチド、又は、請求項10に記載の宿主細胞を供する工程、
b)加水分解された多糖が得られる条件下で、ポリペプチド又は宿主細胞を多糖と接触させる工程、
を含む方法。 - 加水分解された多糖を精製する工程c)をさらに含む、請求項12に記載の方法。
- 加水分解及び精製された多糖を含む農産食品、化粧品又は医薬組成物を調製する工程d)をさらに含む、請求項13に記載の方法。
- 多糖がポルフィランを含む、請求項12〜14のいずれか1項に記載の方法。
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