ES2617181T3 - Porfiranasas y su uso para hidrolizar polisacáridos - Google Patents
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Abstract
Polipéptido aislado caracterizado porque posee una actividad porfiranasa, que comprende una secuencia elegida entre: (i) una secuencia al menos un 90 % idéntica a los residuos 19 a 274 de la secuencia SEQ ID NO: 2, (ii) una secuencia al menos un 90 % idéntica a los residuos 22 a 293 de la secuencia SEQ ID NO: 5, y (iii) un fragmento con al menos 200 aminoácidos consecutivos de la secuencia (i) o (ii).
Description
con tres columnas Superdex 30 (26/60) de GE HealthCare en serie, integradas en un sistema HPLC system inyector/colector líquido (Gilson). Los oligosacáridos se detectaron mediante su índice refractivo (detector Spectra System RI-50) y la integración de los datos (Gilson y detector de refracción) mediante el programa Unipoint (Gilson).
5 [0077] El producto de digestión polisacarídica, congelado y liofilizado, se diluyó en agua desmineralizada para obtener una solución al 4 % (w/v). Tras filtración sobre una membrana porosa de 0,45 µm, se inyectaron 4 mL de la muestra, después se eluyeron con carbonato de amonio [(NH4)2CO3] 50 mM a una velocidad de 1,5 mL/min durante 650 minutos. Las fracciones de oligosacáridos se recogieron y analizaron directamente mediante HPLC.
10 [0078] Según este procedimiento, es posible preparar oligosacáridos compuestos únicamente por el motivo de repetición porfirano u oligosacáridos híbridos que contengan motivos porfirano asociados a motivos de tipo agarosa. Así hemos aislado y purificado oligoporfiranos del disacárido al hexasacárido (Figuras 3 y 4), correspondiente al peso molecular de 420,344 Da (neoporfirobiosa, llamada diporfirano en la Figura 4), 840,69 y/o 743,62 Da (neoporfirotetraosa, llamada tetraporfirano en la Figura 4) y 1261,04 y/o 1163,97 Da (neoporfirohexaosa,
15 llamada hexaporfirano en la Figura 4), respectivamente.
Ejemplo 5: Resultados y discusión
[0079] Se realizó la secuenciación del genoma completo de la bacteria Zobellia galactanivorans (registrada
20 en la Colección DSMZ el 8 de mayo 1998 con el número DSM 12170). La secuenciación permitió identificar dieciséis genes que pertenecen a la familia GH16 de las glucosidasas. Entre estos dieciséis genes, los genes codificantes de la κ-carragenasa CgkA y las β-agarasas AgaA y AgaB ya se conocen y están caracterizados (Barbeyron et al. Mol Biol Evol. 1998 15: 528-37; Jam et al. Biochem J. 2005 385:703-13; Allouch et al. J Biol Chem. 2003 278: 47171-80).
25 [0080] Otros dos genes que pertenecen a la familia GH16 de las glucosidasas se clonaron como se expone en el ejemplo 1 anterior. Dichos genes, denominados porA y porB son codificantes de las proteínas denominadas PorA y PorB respectivamente. La proteína PorA está compuesta por 510 aminoácidos y tiene una masa molecular teórica de 57311 kDa. Tras la eliminación del péptido señal, dicha proteína tiene una masa molecular calculada de 55193 kDa. La proteína PorB está compuesta por 293 aminoácidos. Tras la eliminación del péptido señal, dicha
30 proteína tiene una masa molecular teórica de 31271 kDa.
[0081] Como se muestra en la tabla 2 que aparece más abajo, estos dos genes presentan menos del 25 % de identidad con las β-agarasas y la κ-carragenasa de Zobellia galactanivorans.
35 Tabla 2: Matriz de identidad de secuencia entre los módulos catalíticos de ciertas glucosidasas de la familia GH16 de Zobellia galactanivorans.
- 1
- 2 3 4 5
- 1. AgaA
- 35,6 24,2 25,2 22,8
- 2. AgaB
- 18,4 22,0 20,0
- 3. CgkA
- 23,3 21,0
- 4. PorA
- 26,9
- 5. PorB
[0082] Una vez realizada la clonación, las proteínas PorA y PorB se sobreexpresaron en Escherichia coli 40 como se expone en el ejemplo 2.
[0083] La actividad de las proteínas PorA y PorB sobre varios galactanos de algas rojas se estudió a continuación (ejemplo 3). Se constató que dichas enzimas no tienen ninguna actividad sobre los carragenanos o sobre la agarosa (Figura 2A). En cambio, dichas enzimas presentan una fuerte actividad sobre el porfirano (Figura
[0084] La purificación de los oligosacáridos producidos y su caracterización mediante 1H-RMN (ejemplo 4) demuestra que las enzimas PorA y PorB hidrolizan específicamente el porfirano y descomponen los enlaces β-1,4 entre las unidades Dgalactosa y las unidades L-galactosa sulfatada en posición 6. La sulfatación es necesaria para
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