JP3071068B2 - ポルフィラン分解酵素、ネオアガロオリゴ糖およびそれらの製造方法 - Google Patents
ポルフィラン分解酵素、ネオアガロオリゴ糖およびそれらの製造方法Info
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- JP3071068B2 JP3071068B2 JP5160931A JP16093193A JP3071068B2 JP 3071068 B2 JP3071068 B2 JP 3071068B2 JP 5160931 A JP5160931 A JP 5160931A JP 16093193 A JP16093193 A JP 16093193A JP 3071068 B2 JP3071068 B2 JP 3071068B2
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- Y02P—CLIMATE CHANGE MITIGATION TECHNOLOGIES IN THE PRODUCTION OR PROCESSING OF GOODS
- Y02P20/00—Technologies relating to chemical industry
- Y02P20/50—Improvements relating to the production of bulk chemicals
- Y02P20/52—Improvements relating to the production of bulk chemicals using catalysts, e.g. selective catalysts
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明はポルフィランに作用して
ネオアガロオリゴ糖およびアガロメガロ糖を生産するポ
ルフィラン分解酵素および該ポルフィラン分解酵素の製
造方法に関し、さらに上記分解酵素を用いてポルフィラ
ンを分解して得られる新規なネオアガロオリゴ糖および
その製造方法に関する。
ネオアガロオリゴ糖およびアガロメガロ糖を生産するポ
ルフィラン分解酵素および該ポルフィラン分解酵素の製
造方法に関し、さらに上記分解酵素を用いてポルフィラ
ンを分解して得られる新規なネオアガロオリゴ糖および
その製造方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】近年、オリゴ糖類は、消化性の低い低カ
ロリー甘味料としての用途ばかりでなく、保湿性、水分
活性調節性、タンパク質の保護・安定化、デンプンの老
化抑制などの優れた物性をもつものであることがわか
り、食品産業上有用な素材として注目を集めている。ま
た、オリゴ糖類には、難う蝕性・抗う蝕性、静菌作用、
整腸作用、血糖上昇抑制作用など有用な生理作用もあ
り、機能性食品素材としても注目されるようになった。
ロリー甘味料としての用途ばかりでなく、保湿性、水分
活性調節性、タンパク質の保護・安定化、デンプンの老
化抑制などの優れた物性をもつものであることがわか
り、食品産業上有用な素材として注目を集めている。ま
た、オリゴ糖類には、難う蝕性・抗う蝕性、静菌作用、
整腸作用、血糖上昇抑制作用など有用な生理作用もあ
り、機能性食品素材としても注目されるようになった。
【０００３】オリゴ糖とは単糖類が２〜１０個位化学結
合してできた糖類の総称である。特に最近では、微生物
起源の種々の加水分解酵素や糖転移酵素により、澱粉、
しょ糖、乳糖、キシロース、アガロース等に関連した新
しいオリゴ糖の開発が進められている。
合してできた糖類の総称である。特に最近では、微生物
起源の種々の加水分解酵素や糖転移酵素により、澱粉、
しょ糖、乳糖、キシロース、アガロース等に関連した新
しいオリゴ糖の開発が進められている。
【０００４】オリゴ糖の製造方法としては、前述のよう
に糖転移酵素を用いて合成する方法や糖質分解酵素を用
いて多糖類を分解する方法があるが、前者の方法が多用
されている。一方、海藻類は最近食品産業において、乳
化剤、ゲル化剤、増粘剤等の原料として用いられている
が、オリゴ糖を製造するための多糖類原材料としても注
目されており、例えば寒天についてもその分解酵素の研
究がなされている。寒天分解能を有する微生物として
は、シュードモナス（Pseudomonas ）属、ビブリオ（Vi
brio）属、フラボバクテリウム（Flavobacterium）属、
サイトファーガ（Cytophaga)属、アクロモバクター（Ac
hromobacter)属、コリネバクテリウム（Corynebacteriu
m ）属等に属する微生物が報告されている。
に糖転移酵素を用いて合成する方法や糖質分解酵素を用
いて多糖類を分解する方法があるが、前者の方法が多用
されている。一方、海藻類は最近食品産業において、乳
化剤、ゲル化剤、増粘剤等の原料として用いられている
が、オリゴ糖を製造するための多糖類原材料としても注
目されており、例えば寒天についてもその分解酵素の研
究がなされている。寒天分解能を有する微生物として
は、シュードモナス（Pseudomonas ）属、ビブリオ（Vi
brio）属、フラボバクテリウム（Flavobacterium）属、
サイトファーガ（Cytophaga)属、アクロモバクター（Ac
hromobacter)属、コリネバクテリウム（Corynebacteriu
m ）属等に属する微生物が報告されている。
【０００５】ところで、あまのり属の食物繊維には、マ
ンナン、キシラン、ポルフィラン等の多糖類があるが、
このうちではポルフィランが最も多くて主成分となって
いる。ポルフィランはガラクトース、３，６−アンヒド
ロガラクトース、６−Ｏ−メチルガラクトースおよび６
−Ｏ−硫酸ガラクトースからなり、構造上は寒天に類似
しているが、ゲル化能をもたない硫酸多糖類である。ポ
ルフィランに関する研究は構造に関するものがいくつか
なされているが、利用に関する研究はほとんどなされて
いない。また、ポルフィランに由来するオリゴ糖に関し
てはまったく未知の分野である。なお、寒天分解能をも
つ酵素は寒天ばかりでなくポルフィランをも分解するこ
とが知られているが、寒天を分解せずポルフィランのみ
を分解する酵素は現在まだ知られていない。
ンナン、キシラン、ポルフィラン等の多糖類があるが、
このうちではポルフィランが最も多くて主成分となって
いる。ポルフィランはガラクトース、３，６−アンヒド
ロガラクトース、６−Ｏ−メチルガラクトースおよび６
−Ｏ−硫酸ガラクトースからなり、構造上は寒天に類似
しているが、ゲル化能をもたない硫酸多糖類である。ポ
ルフィランに関する研究は構造に関するものがいくつか
なされているが、利用に関する研究はほとんどなされて
いない。また、ポルフィランに由来するオリゴ糖に関し
てはまったく未知の分野である。なお、寒天分解能をも
つ酵素は寒天ばかりでなくポルフィランをも分解するこ
とが知られているが、寒天を分解せずポルフィランのみ
を分解する酵素は現在まだ知られていない。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】本発明は上記状況に鑑
みてなされたもので、海苔の多糖類であるポルフィラン
を分解してポルフィラン由来の新規で有用なオリゴ糖を
製造することを目的とするものであり、かかるポルフィ
ラン分解能を有する酵素を提供することを目的とし、さ
らにかかる酵素の製造方法を提供することを目的とする
ものである。
みてなされたもので、海苔の多糖類であるポルフィラン
を分解してポルフィラン由来の新規で有用なオリゴ糖を
製造することを目的とするものであり、かかるポルフィ
ラン分解能を有する酵素を提供することを目的とし、さ
らにかかる酵素の製造方法を提供することを目的とする
ものである。
【０００７】
【課題を解決するための手段】すなわち本発明は、下記
の理化学的性質 （１）酵素作用：ポルフィランを加水分解し、重合度２
および４を主体とするネオアガロオリゴ糖を生成する反
応を触媒する。 （２）基質特異性：ポルフィランに対し高い特異性を示
し、あまのり属以外の紅藻類や褐藻類に含有される多糖
類に対しては特異性が低い。（３）（ａ）ポルフィラン分解に対する至適ｐＨが６．
０、至適温度が６０℃、ｐＨ安定域が６．０〜８．０で
あり、分子量が約２８，０００、等電点がｐＨ５．２、
ポルフィランに対するＫｍ値が０．０２％である。また
は、（ｂ）ポルフィラン分解に対する至適ｐＨが５．
０、至適温度が５０℃、ｐＨ安定域が５．０〜９．５で
あり、分子量が約４２，０００、等電点がｐＨ６．８、
ポルフィランに対するＫｍ値が０．０９８％である 。を
有するポルフィラン分解酵素に関する。
の理化学的性質 （１）酵素作用：ポルフィランを加水分解し、重合度２
および４を主体とするネオアガロオリゴ糖を生成する反
応を触媒する。 （２）基質特異性：ポルフィランに対し高い特異性を示
し、あまのり属以外の紅藻類や褐藻類に含有される多糖
類に対しては特異性が低い。（３）（ａ）ポルフィラン分解に対する至適ｐＨが６．
０、至適温度が６０℃、ｐＨ安定域が６．０〜８．０で
あり、分子量が約２８，０００、等電点がｐＨ５．２、
ポルフィランに対するＫｍ値が０．０２％である。また
は、（ｂ）ポルフィラン分解に対する至適ｐＨが５．
０、至適温度が５０℃、ｐＨ安定域が５．０〜９．５で
あり、分子量が約４２，０００、等電点がｐＨ６．８、
ポルフィランに対するＫｍ値が０．０９８％である 。を
有するポルフィラン分解酵素に関する。
【０００８】また、本発明は、シュードモナス（Pseudo
monas ）属に属するポルフィラン分解能を有する微生物
を培養し、その培養物からポルフィラン分解酵素を採取
することを特徴とする上記ポルフィラン分解酵素の製造
方法に関する。
monas ）属に属するポルフィラン分解能を有する微生物
を培養し、その培養物からポルフィラン分解酵素を採取
することを特徴とする上記ポルフィラン分解酵素の製造
方法に関する。
【０００９】また、本発明は、あまのり属海藻類に含ま
れるポルフィランを前記酵素を用いて加水分解して得ら
れる重合度２および４を主体とする新規なネオアガロオ
リゴ糖に関し、さらにその製造方法に関する。
れるポルフィランを前記酵素を用いて加水分解して得ら
れる重合度２および４を主体とする新規なネオアガロオ
リゴ糖に関し、さらにその製造方法に関する。
【００１０】本発明のネオアガロオリゴ糖は、鶏卵しょ
う尿膜法で、鶏卵しょう尿膜における血管新生を阻害す
る活性を示す。また、本発明のネオアガロオリゴ糖の製
造方法は、あまのり属海藻類に含まれるポルフィランま
たはポルフィラン含有物を、前記酵素を用いて、酸性ま
たは弱酸性の条件下で加水分解することを特徴とする。
う尿膜法で、鶏卵しょう尿膜における血管新生を阻害す
る活性を示す。また、本発明のネオアガロオリゴ糖の製
造方法は、あまのり属海藻類に含まれるポルフィランま
たはポルフィラン含有物を、前記酵素を用いて、酸性ま
たは弱酸性の条件下で加水分解することを特徴とする。
【００１１】本発明に用いられるシュードモナス属に属
するポルフィラン分解能を有する微生物としては、シュ
ードモナス（Pseudomonas ）Ｂ−２４１１（生技研寄託
Ｐ−１３６３７号）が挙げられる。該菌株の透過型電子
顕微鏡写真を図１に示す。染色は酢酸ウランで行った。
するポルフィラン分解能を有する微生物としては、シュ
ードモナス（Pseudomonas ）Ｂ−２４１１（生技研寄託
Ｐ−１３６３７号）が挙げられる。該菌株の透過型電子
顕微鏡写真を図１に示す。染色は酢酸ウランで行った。
【００１２】次に上記菌株の性状を示す。 (a) 形態 (1) 細胞の形および大きさ 捍菌、幅 0.5〜 0.8μｍ、長さ 0.8〜３μｍ (2) 細胞の多形性の有無 鞭毛が脱落しやすい (3) 運動性の有無、鞭毛の着性状態 運動性ほとんどなし、極鞭毛 (4) 胞子の有無 なし (5) グラム染色性 陰性 (6) 抗酸性 なし
【００１３】(b) 各培地における生育状態 (1) 肉汁寒天平板培養 大きさ： 直径４〜４．５ｍｍ 生育程度： 中程度 形： 円形または楕円 隆起： 丘状 周辺の形状： 正縁 表面の形状： なめらか 色： 乳白色 光沢： あり 性質： 粘性 (2) 肉汁寒天斜面培養 形状： 糸状 生育の程度： 中程度 隆起： 丘状 臭気： なし 表面の形状： なめらか
【００１４】(3) 肉汁液体培養 表面発育の有無： 菌環の形成あり 濁度： 培養２日目から白濁 沈殿： なし ガス産生： なし 指示薬の色調変化： 中性（ＢＴＢで緑青色） 臭気： なし (4) 肉汁ゼラチン穿刺培養 生育の状態： 上部５ｍｍにのみ生育し、培地内は繊毛
状 ゼラチンの液化： なし (5) リトマス・ミルク培地 反応： なし（青紫色） 凝固： なし
状 ゼラチンの液化： なし (5) リトマス・ミルク培地 反応： なし（青紫色） 凝固： なし
【００１５】(c) 生理学的性質 (1) 硝酸塩の還元： なし (2) 脱窒反応： なし (3) ＭＲテスト： 陰性 (4) ＶＰテスト： 陰性 (5) インドールの生成： なし (6) 硫化水素の生成： なし (7) デンプンの加水分解： なし (8) クエン酸の利用： なし (9) 無機窒素源の利用（硝酸塩）： あり （アンモニウム塩）： あり (10)色素の生成： なし (11)ウレアーゼ： なし (12)オキシダーゼ： 陰性 (13)カタラーゼ： 陽性 (14)生育の範囲（ｐＨ）： 初発ｐＨ 4.5〜 7.5で生
育、ｐＨ４で生育しない （温度）： ３５℃以上で生育せず (15)酸素に対する態度： 好気性 (16)Ｏ−Ｆテスト： 分解せず
育、ｐＨ４で生育しない （温度）： ３５℃以上で生育せず (15)酸素に対する態度： 好気性 (16)Ｏ−Ｆテスト： 分解せず
【００１６】(17)糖類からの酸およびガス生成の有無 Ｌ−アラビノース： なし Ｄ−キシロース： なし Ｄ−グルコース： なし Ｄ−マンノース： なし Ｄ−フラクトース： なし Ｄ−ガラクトース： なし 麦芽糖： なし ショ糖： なし 乳糖： なし トレハロース： なし Ｄ−ソルビット： なし イノシット： なし グリセリン： なし デンプン： なし
【００１７】(d) 新種の特徴を示す諸性質 (1) 糖類の分解生成物： ポルフィランから２糖、４糖
を主とするオリゴ糖を生成する (2) アルギニンの分解： なし (3) 温度抵抗性： ８５℃、１０分もしくは８０℃、３
０分で死滅 (4) 塩化ナトリウムの耐性： ０〜３％で生育（ペプト
ン水） (5) リパーゼ： Tween 80を分解（１％Tween 80−ペプ
トン水） (6) 菌体中のＤＮＡのＧ＋Ｃ含量： 62.7 mol％（高速
液体クロマトグラフ法）
を主とするオリゴ糖を生成する (2) アルギニンの分解： なし (3) 温度抵抗性： ８５℃、１０分もしくは８０℃、３
０分で死滅 (4) 塩化ナトリウムの耐性： ０〜３％で生育（ペプト
ン水） (5) リパーゼ： Tween 80を分解（１％Tween 80−ペプ
トン水） (6) 菌体中のＤＮＡのＧ＋Ｃ含量： 62.7 mol％（高速
液体クロマトグラフ法）
【００１８】上記した諸特性から該菌株はシュードモナ
ス属に属する菌種であると考えられる。生理学的性質は
シュードモナス・マリナに近似しているが、ＮａＣｌを
要求せず、ツィーン８０を分解する等異なった性質を示
しているので、シュードモナス属の新菌種とするのが妥
当である。なお、シュードモナス属に属する菌種で寒天
分解能を有する菌種は今までにいくつか報告されている
が、これらの菌種の糖の発酵能、オキシダーゼ生成、硝
酸塩還元能などの性質は本発明の上記菌株の性質と異な
っており、本発明の菌株はこれらとは異なるものであ
る。なお、上記菌株の分類学的地位の決定は、「バージ
ェーズ・マニュアル・オブ・システマティク・バイオロ
ジイ」第１巻（ウィリアムズ・アンド・ウィルキンス、
ＵＳＡ、１９８４）に基づく。
ス属に属する菌種であると考えられる。生理学的性質は
シュードモナス・マリナに近似しているが、ＮａＣｌを
要求せず、ツィーン８０を分解する等異なった性質を示
しているので、シュードモナス属の新菌種とするのが妥
当である。なお、シュードモナス属に属する菌種で寒天
分解能を有する菌種は今までにいくつか報告されている
が、これらの菌種の糖の発酵能、オキシダーゼ生成、硝
酸塩還元能などの性質は本発明の上記菌株の性質と異な
っており、本発明の菌株はこれらとは異なるものであ
る。なお、上記菌株の分類学的地位の決定は、「バージ
ェーズ・マニュアル・オブ・システマティク・バイオロ
ジイ」第１巻（ウィリアムズ・アンド・ウィルキンス、
ＵＳＡ、１９８４）に基づく。
【００１９】次に本発明の酵素の製造方法について説明
する。菌株を培養する培地は液状でも固体状でもよい。
通常は液体培地使用する方が有利である。工業的には通
気攪拌培養がよい。培地中には上記菌株の利用し得る炭
素源、窒素源、その他菌株の生育および酵素生成に必要
な諸成分を含有させる必要がある。
する。菌株を培養する培地は液状でも固体状でもよい。
通常は液体培地使用する方が有利である。工業的には通
気攪拌培養がよい。培地中には上記菌株の利用し得る炭
素源、窒素源、その他菌株の生育および酵素生成に必要
な諸成分を含有させる必要がある。
【００２０】炭素源としては、菌株の生育に澱粉、デキ
ストリン、しょ糖、乳糖、麦芽糖、ぶどう糖、ガラクト
ース、果糖、廃糖蜜等が利用できるが、酵素生成にはポ
ルフィランあるいはポルフィランを含有する粗原料を添
加しなければならない。窒素源としては、アンモニウム
塩類、硝酸塩類、コーン・スティープリカー、ペプト
ン、肉エキス、カザミノ酸、大豆粉、小麦フスマ、尿素
などの無機または有機の窒素含有物が用いられる。その
他、酵母エキス、乾燥酵母などは酵素生成量の増加に有
効である。無機塩類としては、マグネシウム塩、カルシ
ウム塩、ナトリウム塩、燐酸塩、鉄塩、マンガン塩、亜
鉛塩などが用いられ、特にマグネシウム塩は重要であ
る。また、ビタミン類、生長促進物質などの栄養素を適
宜添加してもよい。
ストリン、しょ糖、乳糖、麦芽糖、ぶどう糖、ガラクト
ース、果糖、廃糖蜜等が利用できるが、酵素生成にはポ
ルフィランあるいはポルフィランを含有する粗原料を添
加しなければならない。窒素源としては、アンモニウム
塩類、硝酸塩類、コーン・スティープリカー、ペプト
ン、肉エキス、カザミノ酸、大豆粉、小麦フスマ、尿素
などの無機または有機の窒素含有物が用いられる。その
他、酵母エキス、乾燥酵母などは酵素生成量の増加に有
効である。無機塩類としては、マグネシウム塩、カルシ
ウム塩、ナトリウム塩、燐酸塩、鉄塩、マンガン塩、亜
鉛塩などが用いられ、特にマグネシウム塩は重要であ
る。また、ビタミン類、生長促進物質などの栄養素を適
宜添加してもよい。
【００２１】好ましい培地組成の例として、例えば、ペ
プトン、酵母エキス、ガラクトース、ポルフィラン、燐
酸水素二カリウム、塩化ナトリウム、硫酸マグネシウ
ム、塩化カルシウムの組合わせを挙げることができる。
プトン、酵母エキス、ガラクトース、ポルフィラン、燐
酸水素二カリウム、塩化ナトリウム、硫酸マグネシウ
ム、塩化カルシウムの組合わせを挙げることができる。
【００２２】培養温度は約２０〜３０℃が好適であり、
培養ｐＨは４〜８が好適である。好気条件下で２〜５日
間培養する。培養の結果培地中に上記酵素が生産される
ので、培養液から濾過あるいは遠心分離で菌体を除去
し、酵素液を得る。酵素液をさらに有機溶剤沈殿、塩
析、減圧濃縮、イオン交換体による吸着・脱離、ゲル分
画などの酵素精製法の常法にしたがって処理すること
で、酵素の純化・精製をすることができる。
培養ｐＨは４〜８が好適である。好気条件下で２〜５日
間培養する。培養の結果培地中に上記酵素が生産される
ので、培養液から濾過あるいは遠心分離で菌体を除去
し、酵素液を得る。酵素液をさらに有機溶剤沈殿、塩
析、減圧濃縮、イオン交換体による吸着・脱離、ゲル分
画などの酵素精製法の常法にしたがって処理すること
で、酵素の純化・精製をすることができる。
【００２３】
【作用】本発明の酵素はあまのり属の海藻類の成分であ
るポルフィランに特異的に作用してこれを加水分解し、
ネオアガロオリゴ糖を生成する。
るポルフィランに特異的に作用してこれを加水分解し、
ネオアガロオリゴ糖を生成する。
【００２４】本発明の酵素の諸性質について表１および
図２〜６に示す。すなわち、これらの表および図面につ
いては実施例においてさらに言及するが、ここでこれら
について説明すると、図２は本酵素の酵素活性におよぼ
すｐＨの影響を示すもので、実線は還元糖量測定による
酵素活性（ｍＵ／ｍｌ）を示し、破線は粘度低下率測定
による酵素活性（Ｕ／ｍｌ）を示す。図中、ｐＨ３〜６
域は１００ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ５．５〜８
域は６０ｍＭリン酸緩衝液、ｐＨ７．５〜９域は５０ｍ
Ｍトリス塩酸緩衝液、ｐＨ８．５〜１０域は１００ｍＭ
グリシン−水酸化ナトリウム緩衝液による。
図２〜６に示す。すなわち、これらの表および図面につ
いては実施例においてさらに言及するが、ここでこれら
について説明すると、図２は本酵素の酵素活性におよぼ
すｐＨの影響を示すもので、実線は還元糖量測定による
酵素活性（ｍＵ／ｍｌ）を示し、破線は粘度低下率測定
による酵素活性（Ｕ／ｍｌ）を示す。図中、ｐＨ３〜６
域は１００ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ５．５〜８
域は６０ｍＭリン酸緩衝液、ｐＨ７．５〜９域は５０ｍ
Ｍトリス塩酸緩衝液、ｐＨ８．５〜１０域は１００ｍＭ
グリシン−水酸化ナトリウム緩衝液による。
【００２５】図３は本酵素の酵素活性におよぼす温度の
影響を示すもので、図２同様、実線は還元糖量測定によ
る酵素活性を示し、破線は粘度低下率測定による酵素活
性を示す（以下、図４および図５において同じ）。図４
は本酵素の酵素活性のｐＨ安定性を示す図であり、図５
は本酵素の熱安定性を示す図である。
影響を示すもので、図２同様、実線は還元糖量測定によ
る酵素活性を示し、破線は粘度低下率測定による酵素活
性を示す（以下、図４および図５において同じ）。図４
は本酵素の酵素活性のｐＨ安定性を示す図であり、図５
は本酵素の熱安定性を示す図である。
【００２６】また、本発明の酵素をポルフィランに作用
させて生成したオリゴ糖およびメガロ糖をＴＬＣで検出
し、経時的に配列した図を図７に示す。図７において、
（Ａ）はＣＭ−IIｂａａ画分の酵素の場合、（Ｂ）はＣ
Ｍ−IIＩｄａａ画分の酵素の場合である。図中、Ｓ1 は
Ｄ−ガラクトース、Ｓ2 はネオアガロビオース（ＤＰ
２）＋ネオアガロテトラオース（ＤＰ４）＋ネオアガロ
ヘキサオース（ＤＰ６）、Ｓ3 はシュードモナス・アト
ランティカ（Pseudomonas atlantica)由来の酵素による
ポルフィラン分解物である。
させて生成したオリゴ糖およびメガロ糖をＴＬＣで検出
し、経時的に配列した図を図７に示す。図７において、
（Ａ）はＣＭ−IIｂａａ画分の酵素の場合、（Ｂ）はＣ
Ｍ−IIＩｄａａ画分の酵素の場合である。図中、Ｓ1 は
Ｄ−ガラクトース、Ｓ2 はネオアガロビオース（ＤＰ
２）＋ネオアガロテトラオース（ＤＰ４）＋ネオアガロ
ヘキサオース（ＤＰ６）、Ｓ3 はシュードモナス・アト
ランティカ（Pseudomonas atlantica)由来の酵素による
ポルフィラン分解物である。
【００２７】本発明で得られるネオアガロオリゴ糖は、
ポルフィランの有する血清コレステロール低下、血圧低
下、免疫賦活、抗変異原性、血管新生抑制などの活性が
さらに強化されており、特に血管新生抑制効果が著し
い。また、水溶性で粘性が低いので、食品素材としても
ポルフィランより扱いやすい。なお、上記したように酵
素活性は、ポルフィランを分解することで生ずる還元糖
の増加と粘性の低下の両方を測定して決めたが、それら
の測定方法について次に示す。
ポルフィランの有する血清コレステロール低下、血圧低
下、免疫賦活、抗変異原性、血管新生抑制などの活性が
さらに強化されており、特に血管新生抑制効果が著し
い。また、水溶性で粘性が低いので、食品素材としても
ポルフィランより扱いやすい。なお、上記したように酵
素活性は、ポルフィランを分解することで生ずる還元糖
の増加と粘性の低下の両方を測定して決めたが、それら
の測定方法について次に示す。
【００２８】すなわち、還元糖測定はソモギ・ネルソン
法に準拠し、ポルフィラン溶液を該酵素で分解した反応
液を試料溶液とし、この１ｍｌにＡ液（硫酸銅五水和物
２ｇ、酒石酸カリウムナトリウム ６ｇ、無水炭酸ナ
トリウム １２ｇ、無水硫酸ナトリウム １０ｇを蒸留
水に溶解し、５００ｍｌに定容したもの）を１ｍｌ加
え、２０分間沸騰後５分間水冷し、Ｂ液（モリブデン酸
アンモニウム ２５ｇ、硫酸２１ｍｌ、ヒ酸二ナトリウ
ム ３ｇを蒸留水に溶解し、５００ｍｌに定容したも
の）を１ｍｌ加え、よく混和した後、蒸留水４ｍｌを加
え、６６０ｎｍの吸光度を測定する。得られた数値を、
Ｄ−ガラクトースを標準品として作成した標準線から読
み取り、ガラクトース換算値として還元糖量を求めた。
法に準拠し、ポルフィラン溶液を該酵素で分解した反応
液を試料溶液とし、この１ｍｌにＡ液（硫酸銅五水和物
２ｇ、酒石酸カリウムナトリウム ６ｇ、無水炭酸ナ
トリウム １２ｇ、無水硫酸ナトリウム １０ｇを蒸留
水に溶解し、５００ｍｌに定容したもの）を１ｍｌ加
え、２０分間沸騰後５分間水冷し、Ｂ液（モリブデン酸
アンモニウム ２５ｇ、硫酸２１ｍｌ、ヒ酸二ナトリウ
ム ３ｇを蒸留水に溶解し、５００ｍｌに定容したも
の）を１ｍｌ加え、よく混和した後、蒸留水４ｍｌを加
え、６６０ｎｍの吸光度を測定する。得られた数値を、
Ｄ−ガラクトースを標準品として作成した標準線から読
み取り、ガラクトース換算値として還元糖量を求めた。
【００２９】粘度低下による測定は、試料液 ５．５ｍ
ｌをオスワルド粘度計（Ｎｏ．４）を用いて、３７℃に
おける流下速度を測定し、次式より粘度低下率（Ａ％）
として求めた。 Ａ％＝（Ｔａ−Ｔｔ）×１００／Ｔａ−Ｔｏ Ｔａ：ポルフィラン液と酵素液の混合直後の流下時間
（秒） Ｔｔ：上記混合液の反応ｔ時間後の流下時間（秒） Ｔｏ：水の流下時間（秒）
ｌをオスワルド粘度計（Ｎｏ．４）を用いて、３７℃に
おける流下速度を測定し、次式より粘度低下率（Ａ％）
として求めた。 Ａ％＝（Ｔａ−Ｔｔ）×１００／Ｔａ−Ｔｏ Ｔａ：ポルフィラン液と酵素液の混合直後の流下時間
（秒） Ｔｔ：上記混合液の反応ｔ時間後の流下時間（秒） Ｔｏ：水の流下時間（秒）
【００３０】
実施例１． ポルフィラン ０．１％ ペプトン ０．１％ Ｋ2 ＨＰＯ4 １．０％ ＮａＣｌ １．０％ ＭｇＳＯ4 ・７Ｈ2 Ｏ ０．０５％ からなる培地を初発ｐＨ７に調整し、３００ｍｌ容三角
フラスコに１００ｍｌ分注し、１２１℃で２０分間加圧
加熱殺菌する。この培地に菌株Ｂ−２４１１を１白金耳
植菌し、２５℃にて４日間旋回振とう培養（２００ｒｐ
ｍ）した。
フラスコに１００ｍｌ分注し、１２１℃で２０分間加圧
加熱殺菌する。この培地に菌株Ｂ−２４１１を１白金耳
植菌し、２５℃にて４日間旋回振とう培養（２００ｒｐ
ｍ）した。
【００３１】一方、 ポルフィラン ０．５％ ペプトン ０．４２％ 酵母エキス ０．０１％ ＮａＣｌ ０．１％ ＭｇＳＯ4 ・７Ｈ2 Ｏ ０．２５％ ＣａＣｌ2 ・２Ｈ2 Ｏ ０．０１％ からなる培地を初発ｐＨ７に調整し、１００ｍｌ容三角
フラスコに２０ｍｌ入れ、１２１℃で２０分間殺菌す
る。これに上記の培養液を２００μｌ植菌して、２５℃
で２４時間、２００ｒｐｍで旋回振とう培養した。培養
液を２０，０００×ｇで１０分間遠心して得られた上清
の酵素活性は、粘度低下法で３．２４Ｕ／ｍｌ、還元糖
測定法で９６ｍＵ／ｍｌであった。
フラスコに２０ｍｌ入れ、１２１℃で２０分間殺菌す
る。これに上記の培養液を２００μｌ植菌して、２５℃
で２４時間、２００ｒｐｍで旋回振とう培養した。培養
液を２０，０００×ｇで１０分間遠心して得られた上清
の酵素活性は、粘度低下法で３．２４Ｕ／ｍｌ、還元糖
測定法で９６ｍＵ／ｍｌであった。
【００３２】実施例２． 海苔粉末（乾海苔を粉砕機で砕き、約径０．２５ｍｍ の大きさにしたもの） ２％ Ｄ−グルコース ０．１％ ペプトン ０．１％ 酵母エキス ０．０５％ ＮａＣｌ ０．１％ ＭｇＳＯ4 ・７Ｈ2 Ｏ ０．２５％ ＣａＣｌ2 ・２Ｈ2 Ｏ ０．０１％ からなる培地を初発ｐＨ６に調整し、これを３００ｍｌ
容三角フラスコに３０ｍｌ分注し、１２１℃で２０分間
加圧加熱殺菌する。これに、実施例１と同様にして準備
した培養液を２００μｌ植菌して、２８℃で２日間、２
００ｒｐｍで旋回振とう培養した。培養液を２０，００
０×ｇで１０分間遠心して得られた上清の酵素活性は、
還元糖測定法で１９９ｍＵ／ｍｌであった。
容三角フラスコに３０ｍｌ分注し、１２１℃で２０分間
加圧加熱殺菌する。これに、実施例１と同様にして準備
した培養液を２００μｌ植菌して、２８℃で２日間、２
００ｒｐｍで旋回振とう培養した。培養液を２０，００
０×ｇで１０分間遠心して得られた上清の酵素活性は、
還元糖測定法で１９９ｍＵ／ｍｌであった。
【００３３】実施例３．実施例２と同様の培地を、３０
ｌ ｊａｒ ｆｅｒｍｅｎｔｏｒに１５ｌ分注し、スチ
ーム殺菌する。これに実施例２と同様にして得た培養液
を１５０ｍｌ植菌し、２８℃、４００ｒｐｍ、通気量
１５ｌ／ｍｉｎの条件で、１０％塩酸で培地ｐＨを７．
５に調整しながら６０時間培養した。培養液を濾過助材
（セライト）を用いて濾過し、還元糖測定法による活性
が３２２ｍＵ／ｍｌの濾液（粗酵素液）を１１，８８０
ｍｌ得た。
ｌ ｊａｒ ｆｅｒｍｅｎｔｏｒに１５ｌ分注し、スチ
ーム殺菌する。これに実施例２と同様にして得た培養液
を１５０ｍｌ植菌し、２８℃、４００ｒｐｍ、通気量
１５ｌ／ｍｉｎの条件で、１０％塩酸で培地ｐＨを７．
５に調整しながら６０時間培養した。培養液を濾過助材
（セライト）を用いて濾過し、還元糖測定法による活性
が３２２ｍＵ／ｍｌの濾液（粗酵素液）を１１，８８０
ｍｌ得た。
【００３４】粗酵素液をザルトコンモジュール膜（限界
分子量１０，０００）で８００ｍｌに濃縮した後、硫安
を用いて３０−７０％飽和画分を分取した。該画分をセ
ルロース透析膜で、４０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ５．５）
を外液として１２時間透析した。透析内液はポリエチレ
ングリコール２０００で６６ｍｌにまで濃縮した。この
段階での酵素学的性質を図２〜図５に示した。濃縮酵素
液を更にＣＭ−Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｃ−５０（ｐＨ５．
５）カラムに通搭したところ、活性画分としてカラム非
吸着画分（ＣＭ−II）と０．２Ｍ塩化ナトリウム溶出画
分（ＣＭ−III）を得た（図６）。
分子量１０，０００）で８００ｍｌに濃縮した後、硫安
を用いて３０−７０％飽和画分を分取した。該画分をセ
ルロース透析膜で、４０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ５．５）
を外液として１２時間透析した。透析内液はポリエチレ
ングリコール２０００で６６ｍｌにまで濃縮した。この
段階での酵素学的性質を図２〜図５に示した。濃縮酵素
液を更にＣＭ−Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｃ−５０（ｐＨ５．
５）カラムに通搭したところ、活性画分としてカラム非
吸着画分（ＣＭ−II）と０．２Ｍ塩化ナトリウム溶出画
分（ＣＭ−III）を得た（図６）。
【００３５】ＣＭ−IIは更に透析、濃縮、ＤＥＡＥ−Ｓ
ｅｐｈａｄｅｘ Ａ−５０カラム処理、Ｂｕｔｙ１−Ｔ
ｏｙｏｐｅａｒｌ ６５０Ｍカラム処理することで、Ｃ
Ｍ−III 画分は透析、濃縮、Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ ＨＷ
−５５Ｆカラム処理、ＤＥＡＥ−Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ａ
−５０カラム処理をすることで、いずれもＳＤＳ−ＰＥ
ＡＧＥによる電気泳動で単一バンドになるまで精製する
ことができた。両画分の酵素学的特性を表１に示す。
ｅｐｈａｄｅｘ Ａ−５０カラム処理、Ｂｕｔｙ１−Ｔ
ｏｙｏｐｅａｒｌ ６５０Ｍカラム処理することで、Ｃ
Ｍ−III 画分は透析、濃縮、Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ ＨＷ
−５５Ｆカラム処理、ＤＥＡＥ−Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ａ
−５０カラム処理をすることで、いずれもＳＤＳ−ＰＥ
ＡＧＥによる電気泳動で単一バンドになるまで精製する
ことができた。両画分の酵素学的特性を表１に示す。
【００３６】
【表１】
【００３７】両画分の特徴は基質特異性にあり、ポルフ
ィランおよび部分的に脱硫したポルフィランは分解でき
るが、寒天、カラギーナン、アルギン酸、デキストラ
ン、ペクチンなどの多糖類には作用できないことであ
る。ポルフィランを両画分でそれぞれ分解した反応液の
ＴＬＣを示す（図７）。図７の説明は前記した作用の項
に示したとおりである。この図に示されるように時間の
経過につれてより糖数の少ないオリゴ糖と糖数の多いメ
ガロ糖が増えてくることがわかる。両画分の作用機作は
明らかに異なっており、それぞれ単独で作用させるより
も、両者を併用する方が効果は大きい。
ィランおよび部分的に脱硫したポルフィランは分解でき
るが、寒天、カラギーナン、アルギン酸、デキストラ
ン、ペクチンなどの多糖類には作用できないことであ
る。ポルフィランを両画分でそれぞれ分解した反応液の
ＴＬＣを示す（図７）。図７の説明は前記した作用の項
に示したとおりである。この図に示されるように時間の
経過につれてより糖数の少ないオリゴ糖と糖数の多いメ
ガロ糖が増えてくることがわかる。両画分の作用機作は
明らかに異なっており、それぞれ単独で作用させるより
も、両者を併用する方が効果は大きい。
【００３８】次にポルフィランに本発明の酵素を作用さ
せて本発明のネオアガロオリゴ糖を生成する実施例を示
す。
せて本発明のネオアガロオリゴ糖を生成する実施例を示
す。
【００３９】実施例４ 少量のトルエンを添加した１０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ
５．５）５００ｍｌに、粗ポルフィランを１５ｇ加え、
１２１℃で２０分間加圧加熱して溶解する。これを放冷
後この溶液に７５単位の酵素剤を添加し、３７℃で４８
時間反応させた。
５．５）５００ｍｌに、粗ポルフィランを１５ｇ加え、
１２１℃で２０分間加圧加熱して溶解する。これを放冷
後この溶液に７５単位の酵素剤を添加し、３７℃で４８
時間反応させた。
【００４０】反応終了後、不溶性物質を２０，０００×
ｇで２０分間遠心分離して除いた。（画分Ａ）。得られ
た上清に、最終濃度が７０％になるようにエタノールを
徐々に加え、高分子物質を析出させ、生成した沈殿物は
上述の条件で再度遠心分離して除去した（画分Ｂ）。上
清中の全糖量をフェノール硫酸法で定量したところ、ガ
ラクトース換算で５．９ｇのポルフィラン分解物を得る
ことができた。
ｇで２０分間遠心分離して除いた。（画分Ａ）。得られ
た上清に、最終濃度が７０％になるようにエタノールを
徐々に加え、高分子物質を析出させ、生成した沈殿物は
上述の条件で再度遠心分離して除去した（画分Ｂ）。上
清中の全糖量をフェノール硫酸法で定量したところ、ガ
ラクトース換算で５．９ｇのポルフィラン分解物を得る
ことができた。
【００４１】画分Ｂを除いて得た上清の３００ｍｌをエ
バポレータで４３ｍｌに濃縮後、水を溶離液としてＳｕ
ｐｅｒ−Ｑ−Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ ６５０Ｍを充填した
カラム（ 2.6×40cm) に通塔した。非吸着画分を画分Ｃ
として分離し、吸着画分は０．５Ｍ塩化ナトリウムで溶
出した後５０ｍｌに濃縮した。濃縮液はＳｅｐｈａｄｅ
ｘ Ｇ−１０カラムでゲル濾過を行い、画分Ｄ〜Ｆに分
けた。
バポレータで４３ｍｌに濃縮後、水を溶離液としてＳｕ
ｐｅｒ−Ｑ−Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ ６５０Ｍを充填した
カラム（ 2.6×40cm) に通塔した。非吸着画分を画分Ｃ
として分離し、吸着画分は０．５Ｍ塩化ナトリウムで溶
出した後５０ｍｌに濃縮した。濃縮液はＳｅｐｈａｄｅ
ｘ Ｇ−１０カラムでゲル濾過を行い、画分Ｄ〜Ｆに分
けた。
【００４２】得られた６画分（Ａ〜Ｆ）の糖組成をＴＬ
Ｃで分析した。展開試薬はｎ−ブタノール：酢酸：水
（２：１：１）とし、室温にて８０分間展開した後、ジ
フェニルアミン−アニリン試薬を噴霧し、１０５℃で１
０分間加熱して発色させた。結果を図８に示す。画分Ａ
およびＢには低分子物質はなく、画分Ｃは糖が６個以上
のメガロ糖画分、画分Ｄは高重合度の糖区分であり、画
分ＥとＦにオリゴ糖が認められる。図中、Ｓ1 はネオア
ガロビオース＋ネオアガロテトラオース＋ネオアガロヘ
キサオース、Ｓ2 はＤ−ガラクトース。標品として用い
たアガロオリゴ糖サンプルと比較することで、各画分の
糖組成を判断することができる。次に、上記画分Ｅおよ
びＦをそれぞれToyopear１HW-40Sカラムを用いて精製
し、図７におけるオリゴ糖の２種のスポット成分を得
た。これらの成分を水素化ホウ素ナトリウムを用いてア
ルカリ下で脱硫酸化と還元化を行って相当する中性糖ア
ルコールとした。これを陰イオン交換クロマトグラフィ
ーで未反応物を除去した後、ＴＬＣで分析した。さら
に、図７のＳ１についても還元して相当する糖アルコー
ルとし、同時にＴＬＣで分析した。結果を図１０に示
す。図１０中、は標準となる重合度既知の中性糖、
はを還元して糖アルコール化したもの、は本発明の
Ｅ画分およびＦ画分のうち重合度の低い画分、はを
中性糖アルコール化したもの、は本発明のＥ画分およ
びＦ画分のうち重合度の高い画分、はを中性糖アル
コール化したものである。この図によれば、糖アルコー
ルは、標準糖アルコールの一番上のスポット（重合
度２の糖アルコール）に一致し、重合度２であることが
判明した。同様に糖アルコールは、標準糖アルコール
の二番目のスポット（重合度４の糖アルコール）に一
致し、重合度４であることが判明した。以上の実験か
ら、本発明で得られたオリゴ糖は重合度２および重合度
４を主体とするものであることが分かった。
Ｃで分析した。展開試薬はｎ−ブタノール：酢酸：水
（２：１：１）とし、室温にて８０分間展開した後、ジ
フェニルアミン−アニリン試薬を噴霧し、１０５℃で１
０分間加熱して発色させた。結果を図８に示す。画分Ａ
およびＢには低分子物質はなく、画分Ｃは糖が６個以上
のメガロ糖画分、画分Ｄは高重合度の糖区分であり、画
分ＥとＦにオリゴ糖が認められる。図中、Ｓ1 はネオア
ガロビオース＋ネオアガロテトラオース＋ネオアガロヘ
キサオース、Ｓ2 はＤ−ガラクトース。標品として用い
たアガロオリゴ糖サンプルと比較することで、各画分の
糖組成を判断することができる。次に、上記画分Ｅおよ
びＦをそれぞれToyopear１HW-40Sカラムを用いて精製
し、図７におけるオリゴ糖の２種のスポット成分を得
た。これらの成分を水素化ホウ素ナトリウムを用いてア
ルカリ下で脱硫酸化と還元化を行って相当する中性糖ア
ルコールとした。これを陰イオン交換クロマトグラフィ
ーで未反応物を除去した後、ＴＬＣで分析した。さら
に、図７のＳ１についても還元して相当する糖アルコー
ルとし、同時にＴＬＣで分析した。結果を図１０に示
す。図１０中、は標準となる重合度既知の中性糖、
はを還元して糖アルコール化したもの、は本発明の
Ｅ画分およびＦ画分のうち重合度の低い画分、はを
中性糖アルコール化したもの、は本発明のＥ画分およ
びＦ画分のうち重合度の高い画分、はを中性糖アル
コール化したものである。この図によれば、糖アルコー
ルは、標準糖アルコールの一番上のスポット（重合
度２の糖アルコール）に一致し、重合度２であることが
判明した。同様に糖アルコールは、標準糖アルコール
の二番目のスポット（重合度４の糖アルコール）に一
致し、重合度４であることが判明した。以上の実験か
ら、本発明で得られたオリゴ糖は重合度２および重合度
４を主体とするものであることが分かった。
【００４３】Ａ〜Ｆ画分の全糖量、３，６−アンヒドロ
ガラクトース量、硫酸基量、収率をまとめて表２に示
す。全糖量からの収率は画分Ｆで最も高く、硫酸基含量
も画分Ｆで高かった。
ガラクトース量、硫酸基量、収率をまとめて表２に示
す。全糖量からの収率は画分Ｆで最も高く、硫酸基含量
も画分Ｆで高かった。
【００４４】
【表２】
【００４５】実施例２ 実施例１で得られた画分Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆと基質ポルフィ
ランを凍結乾燥し、鶏卵のしょう尿膜（ＣＡＭ）法にて
血管新生抑制作用を測定した。試験はD.H.Ausprunk et
al., J.Dev.Biol., 38:237(1974)記載の方法に準じ実施
した。
ランを凍結乾燥し、鶏卵のしょう尿膜（ＣＡＭ）法にて
血管新生抑制作用を測定した。試験はD.H.Ausprunk et
al., J.Dev.Biol., 38:237(1974)記載の方法に準じ実施
した。
【００４６】新鮮な受精卵を入手し、ふ卵４日目の気室
側の卵殻を径３ｃｍ程剥離して除き、しょう尿膜を裸出
する。裸出部の中央にある径２ｍｍのしょう尿膜上に、
内径３ｍｍのシリコンリングを載せ、ここに１％メチル
セルロース生理食塩水と共に溶解した供試標品液を入れ
る（鶏卵１個当り標品１ｍｇ）。処理卵は37.8℃に保温
し、４０〜４６時間後、しょう尿膜の血管新生の度合い
を観察した。血管新生が阻害されている部位の直径を計
測し、以下のようにスコア化した。
側の卵殻を径３ｃｍ程剥離して除き、しょう尿膜を裸出
する。裸出部の中央にある径２ｍｍのしょう尿膜上に、
内径３ｍｍのシリコンリングを載せ、ここに１％メチル
セルロース生理食塩水と共に溶解した供試標品液を入れ
る（鶏卵１個当り標品１ｍｇ）。処理卵は37.8℃に保温
し、４０〜４６時間後、しょう尿膜の血管新生の度合い
を観察した。血管新生が阻害されている部位の直径を計
測し、以下のようにスコア化した。
【００４７】Ｇｒａｄｅ １ ； ６ｍｍ以上 Ｇｒａｄｅ ２ ； ４ｍｍ以上６ｍｍ未満 Ｇｒａｄｅ ３ ； ２ｍｍ以上４ｍｍ未満 Ｇｒａｄｅ ４ ； ２ｍｍ未満
【数１】
【００４８】結果を図９に示すが、オリゴ糖画分Ｆに基
質ポルフィランよりかなり強い活性が見られる。オリゴ
糖画分Ｃ、高重合糖画分Ｄには弱い活性が認められた。
質ポルフィランよりかなり強い活性が見られる。オリゴ
糖画分Ｃ、高重合糖画分Ｄには弱い活性が認められた。
【００４９】血管新生は、損傷や炎症部位での毛細血管
の増生、カポシ肉腫や血管腫での毛細管の過剰形成、固
形腫瘍の生長を支える血管の伸長などに深く係わる現象
であり、増殖性糖尿性網膜症など失明を招くような様々
な眼科疾患にもみられる。このような各種疾患におい
て、その阻害剤はこれら病的現象の解除に有効に用い得
るものとして期待されている。
の増生、カポシ肉腫や血管腫での毛細管の過剰形成、固
形腫瘍の生長を支える血管の伸長などに深く係わる現象
であり、増殖性糖尿性網膜症など失明を招くような様々
な眼科疾患にもみられる。このような各種疾患におい
て、その阻害剤はこれら病的現象の解除に有効に用い得
るものとして期待されている。
【００５０】
【発明の効果】本発明の酵素はあまのり属の海藻類の成
分であるポルフィランに特異的に作用してこれを加水分
解し、ネオアガロオリゴ糖を生成するので、本酵素によ
り容易に上記海藻類からネオアガロオリゴ糖を得ること
ができる。本発明で得られたネオアガロオリゴ糖は血管
新生阻害活性を有するので、血管新生作用に起因する諸
疾患に対して有効である。
分であるポルフィランに特異的に作用してこれを加水分
解し、ネオアガロオリゴ糖を生成するので、本酵素によ
り容易に上記海藻類からネオアガロオリゴ糖を得ること
ができる。本発明で得られたネオアガロオリゴ糖は血管
新生阻害活性を有するので、血管新生作用に起因する諸
疾患に対して有効である。
【図１】肉汁液体培地に培養して得た菌株Ｂ−２４１１
の透過型電子顕微鏡写真を示す図。
の透過型電子顕微鏡写真を示す図。
【図２】本発明の酵素の酵素活性におよぼすｐＨの影響
を示す図。
を示す図。
【図３】本発明の酵素の酵素活性におよぼす温度の影響
を示す図。
を示す図。
【図４】本発明の酵素の酵素活性のｐＨ安定性を示す
図。
図。
【図５】本発明の酵素の熱安定性を示す図。
【図６】酵素液をＣＭ−Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｃ−５０で
カラム処理した時の、主要活性画分ＣＭ−IIとＣＭ−II
I の分離パターンを示した図。
カラム処理した時の、主要活性画分ＣＭ−IIとＣＭ−II
I の分離パターンを示した図。
【図７】ＣＭ−IIおよびＣＭ−III をポルフィランに作
用させた時、生成されてくるオリゴ糖およびメガロ糖を
ＴＬＣで検出し、経時的に配列図示したもので、（Ａ）
はＣＭ−IIについて、（Ｂ）はＣＭ−III について図示
したものである。
用させた時、生成されてくるオリゴ糖およびメガロ糖を
ＴＬＣで検出し、経時的に配列図示したもので、（Ａ）
はＣＭ−IIについて、（Ｂ）はＣＭ−III について図示
したものである。
【図８】ポルフィランを酵素分解して得られた各区分の
ＴＬＣ展開パターンを示す図。
ＴＬＣ展開パターンを示す図。
【図９】ポルフィラン分解各画分の鶏卵しょう尿膜での
血管新生阻害効果を示した図。
血管新生阻害効果を示した図。
【図１０】
ポルフィランを酵素分解して得られたＥ区画
分およびＦ区画分を精製し、これを脱硫酸化および還元
化して得られた中性糖アルコールのＴＬＣ展開パターン
を示す図。
分およびＦ区画分を精製し、これを脱硫酸化および還元
化して得られた中性糖アルコールのＴＬＣ展開パターン
を示す図。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ (Ｃ１２Ｐ 19/00 Ｃ１２Ｒ 1:38） (72)発明者 芦野 洋美 千葉県船橋市本町19番１号 海老川マン ション609 (58)調査した分野(Int.Cl.7，ＤＢ名) C12N 9/00 - 9/99 C08B 37/00 - 37/18 C12P 19/00 - 19/64 ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ) ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ)
Claims (6)
- 【請求項１】 下記の理化学的性質を有するポルフィラ
ン分解酵素。 （１）酵素作用：ポルフィランを加水分解し、重合度２
および４を主体とするネオアガロオリゴ糖を生成する反
応を触媒する。 （２）基質特異性：ポルフィランに対し高い特異性を示
し、あまのり属以外の紅藻類や褐藻類に含有される多糖
類に対しては特異性が低い。（３）（ａ）ポルフィラン分解に対する至適ｐＨが６．
０、至適温度が６０℃、ｐＨ安定域が６．０〜８．０で
あり、分子量が約２８，０００、等電点がｐＨ５．２、
ポルフィランに対するＫｍ値が０．０２％である。また
は、 （ｂ）ポルフィラン分解に対する至適ｐＨが５．０、至
適温度が５０℃、ｐＨ安定域が５．０〜９．５であり、
分子量が約４２，０００、等電点がｐＨ６．８、ポルフ
ィランに対するＫｍ値が０．０９８％である 。 - 【請求項２】 シュードモナス（Pseudomonas ）属に属
するポルフィラン分解能を有する微生物を培養し、その
培養物からポルフィラン分解酵素を採取することを特徴
とする請求項１記載のポルフィラン分解酵素の製造方
法。 - 【請求項３】 シュードモナス（Pseudomonas ）属に属
するポルフィラン分解能を有する微生物がシュードモナ
ス（Pseudomonas ）Ｂ−２４１１（生技研寄託Ｐ−１３
６３７号）およびその変異株である請求項２記載のポル
フィラン分解酵素の製造方法。 - 【請求項４】 あまのり属海藻類に含まれるポルフィラ
ンを請求項１記載の酵素を用いて加水分解して得られ、
重合度２および４を主体とすることを特徴とするネオア
ガロオリゴ糖。 - 【請求項５】 鶏卵しょう尿膜法で、鶏卵しょう尿膜に
おける血管新生を阻害する活性を示す請求項４記載のネ
オアガロオリゴ糖。 - 【請求項６】 あまのり属海藻類に含まれるポルフィラ
ンまたはポルフィラン含有物を、請求項１記載の酵素を
用いて、酸性または弱酸性の条件下で加水分解すること
を特徴とするネオアガロオリゴ糖の製造方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP5160931A JP3071068B2 (ja) | 1993-06-30 | 1993-06-30 | ポルフィラン分解酵素、ネオアガロオリゴ糖およびそれらの製造方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP5160931A JP3071068B2 (ja) | 1993-06-30 | 1993-06-30 | ポルフィラン分解酵素、ネオアガロオリゴ糖およびそれらの製造方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH0716092A JPH0716092A (ja) | 1995-01-20 |
| JP3071068B2 true JP3071068B2 (ja) | 2000-07-31 |
Family
ID=15725351
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP5160931A Expired - Lifetime JP3071068B2 (ja) | 1993-06-30 | 1993-06-30 | ポルフィラン分解酵素、ネオアガロオリゴ糖およびそれらの製造方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP3071068B2 (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US7977379B2 (en) | 2002-05-15 | 2011-07-12 | Bhn Co., Ltd. | Method for angiogenesis inhibition or immunostimulation |
Families Citing this family (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPH11349485A (ja) * | 1998-06-09 | 1999-12-21 | Shirako Co Ltd | 肝臓障害改善剤 |
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| FR2948382B1 (fr) * | 2009-07-21 | 2013-06-28 | Centre Nat Rech Scient | Porphyranases et leur utilisation pour hydrolyser des polysaccharides |
-
1993
- 1993-06-30 JP JP5160931A patent/JP3071068B2/ja not_active Expired - Lifetime
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US7977379B2 (en) | 2002-05-15 | 2011-07-12 | Bhn Co., Ltd. | Method for angiogenesis inhibition or immunostimulation |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPH0716092A (ja) | 1995-01-20 |
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