KR860000373B1 - 소르비톨(Sorbitol)과 만니톨(Mannitol)을 함유한 감미료(甘味料)의 제조법 - Google Patents
소르비톨(Sorbitol)과 만니톨(Mannitol)을 함유한 감미료(甘味料)의 제조법 Download PDFInfo
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Description
본 발명은 수크로오스(sucrose)에 프룩토실 트란스페라제(fructosyl transferase)를 작용시켜 얻어지는 올리고당류(oligosaccharode), 즉 이것을 조성적으로 볼때 수크로오스에 프룩토오스(fructose)가 1내지 4분자를 결합한 올리고당류등 당류에 미반응의 수크로오스, 반응부생성물의 글루코오스와 프룩토오스를 함유하고 있는 당조성물증의 글루코오스와 프룩토오스만을 특정의 반응조건에서 선택적으로 접촉환원함으로써 소르비톨과 만니톨로 변화시켜 얻어지는 카리에스유발성(cariogenicity)이 어려운 감미료의 제조방법에 관한 것이다.
우식증(藕飾症)(dental caries)의 발생원인은 수크로오스가 우식증원균인 스트렙토콕커스 무탄스(stre-ptococcus mutans)등에 의하여 생산되는 덱스트란수크라제(dextran sucrase)의 작용에 의해 불용성덱스트란을 생성하며, 동시에 스트렙토콕커스 무탄스등의 우식증원인균을 흡착하고 치아표면에 부착하여 치대(tooth dirt)(齒苔)가 형성되는 과정과, 글루코오스와 수크로오스 등의 발효성당류(fermentable sugars)가 치아표면에 부착한 치대중의 미생물에 의하여 발효되어 유산(乳酸)을 주성분으로 하는 유기산을 생성하여 PH가 저하됨으로서 탈회현상(脫灰現象, deliming phenomenon)이 유발되는 과정으로 설명할수 있다.
본 발명자들은 수크로오스가 가진 우수한 특성을 내면서 충치유발이 어려운 수크로오스 관련 당질(糖質)에 대하여 연구한 결과 수크로오스에 프룩토실 트란스페라제를 작용시켜 얻어지는 올리고당류, 즉 수크로오스에 프룩토오스 1분자가 결합된물질(이하 GF2라함), 수크로오스에 프룩토오스 2분자가 결합된 물질(이하 GF3라함), 수크로오스에 프룩토오스 3분자가 결합된 물질(이하 GF4라함), 수크로오스에 프룩토오스 4분자가 결합된물질(이하 GF5라함)등의 올리고당이 스트렙토 콕커스 무탄스등 구중미생물(口中微生物, intracral microorganisms)에 의해 생성되는 덱스트란수크라제(dextran sucrase)의 작용을 받지아니하며, 덱스트란 수크라제에 의한 수크로오스에서 불용성 덱스트란의 생성을 억제하는 효과가 있음을 발견하였다.
여기서 사용된 GF2, GF3, GF4, GF5등을 올리고 당은 수크로오스에 프룩토실 트란스페라제를 작용시켜 얻어진 전이 당조성물(transfer sugar mixture)에서 카본크로마토그라피(carbon chromatatography), 이온교환 크로마토그라피(ion-exchange chromatography)등의 처리수단에 의해 분리, 정제할수 있으나, 실용적인면에서 볼때 이들의 올리고 당의 조성물을 이 이상 정제하지 않고 사용하는 것이 바람직하며, 이와같은 전이당조성물은 그 성분중에 미반응의 수크로오스, 전이반응에 의해 생성된 GF2, GF3등의 올리고 당 및 전이반응에 의해 부생(副生)한 글루코오스, 프룩토오스 등의 부생물을 함유하고 있다. 그러나, 이와 같은 당조성물은 스트렙토 콕커스 무탄스등을 생산하는 덱스트란 수크라제의 작용을 받지 않으므로 이것을 섭취하여도 불용성 덱스트란이 생성되지 않으며, 이와같은 의미에서 당조성물은 우식증이 발생하기가 어려우며, 그 조성물중의 GF2, GF3등 올리고 당류는 스트렙토콕커스무탄스등의 미생물에 의해 발효가 어려워 유기산의 생성은 적고, 미반응의 수크로오스와 반응에 의해 부생되는 글루코오스 및 프룩토오스로부터 유기산이생성되므로 이와 같은 당조성물로부터 유기산의 생성량은 수크로오스에 비하여 적으나 충분히 만족하지는 않다.
본 발명자들은 이점에 대하여 연구를 한결과 수크로오스에 프룩토실 트란스페라제를 작용시켜 얻어진 당조성물을 특정의 조건에서 접촉환원시킴으로써 조성물중에 소량 존재하는 글루코오스 및 프룩토오스만을 선택적으로 소르비톨과 만니톨로 변환시킬 수 있고, 이와 같은 조작에 의해 얻어진 감미조성물에서 미생물에 의한 유산의 생성량은 수크로오스로부터 생성량의 약 20%정도로된다는 것을 발견 하였다.
[실험예 3]
본 발명은 이와같은 발견에 의하여 완성한 것이다. 즉, 본 발명은 수크로오스에 프룩토실트란스페라제를 작용시켜 글루코오스, 프룩토오스, 수크로오스 및 수크로오스에 프룩토오스 1내지 4분자가 결합된 올리고당 당류를 함유한 당액을 얻은 다음 이 당액의 pH를 7-9로 조절하여 접촉환원을 함을 특징으로 하는 소르비톨 및 만니톨을 함유하는 새로운 감미료의 제조방법을 제공하는데 있다.
본 발명에 사용되는 프룩토실 트란스페라제는 주로 수크로오스에 작용하여 프룩토오스와 글루코오스의 β-1, 2결합을 절단시킨후 그 프룩토오스를 수크로오스로 전이하여 GF2를 생성하고, 또 프룩토오스를 GF2로 전이하여 GF3를 생성하는 작용을 갖고 있다. 반응생성물이 이와같이 GF2, GF3등과 같이 수크로오스에 프룩토오스가 결합된 올리고당인점에서 엔짐 노멘클래춰(Enzyme Nomenclature) (Academic press, 1978)에 기재된 이누로 수크라제(inulosucrase) [2. 4. 1. 9]의 레반 수크라제(levansucrase), [2. 4. 1. 10]와는 상이하다.
그 효소는 아스펠길러스(Aspergillus) 속 [(Aspergillus niger) (The genus Aspergillus, Williams & wilkins CO., 1965, 293페이지)등], 페니실륨(penicillium) 속 (penicillium nigricans 등), 푸사륨(Fusari-um)속 (Fusarium lini IAM 5008등), 글레오스포륨(Gloeosprium)속 (Gloeosporium kari IAM 5001등)의 균류(fungi), 삭카로미세스(Saccharomyces)속 (Saccharomyces cerevisiae등), 로도토룰라(Rhodotor-ulla)속 (Rhodotorulla glurinis등), 피히아(pichia)속 (pichia miso등), 한제넬라(Hansenula miso등)속, 칸디다(Candida)속 (Candida tropicalis등)의 효모등 미생물 기원(origin)의 효소나 아스파라가스 오피시날리스(Asparagus officinalis), 헤리안터스 튜버로서스 엘(Helianthus tuber osus L., )등 식물기원의 효소가 사용된다.
미생물 기원의 프룩토실 트랜스페라제는 적당한배지, 예로서 수크로오스 5.0%, 펩톤(peptane) 1.0%, 고기에키스(meat extract) 0.7%, NaCl 0.3%를 함유한 배지에 각각의 미생물을 최적온도, 즉 25-30℃에서 24-96시간 배양하여 배양종료후 균체를 여과 또는 심원분리등의 수단으로 제거한 배양여액을 얻으며, 한외여과법(ultrafiltration), 소듐설페이트(Sodium sulfate)염석법, 용제침전법, 겔여과법, 이온교환크로마토그라피등 효소정제에 관한 통상의 방법에 의해 정제한 효소 또는 그 여백을 사용할 수 있다. 도, 식물기원의 효소는 식물조직을 파쇄등 물리적수단에 의해 파괴한 후 효소를 추출하여 그 추출액 또는 추출액에서 통상의 방법으로 정제한 효소를 사용할 수 있다.
카리에스유발성이 어려운 최종생성물은 이 효소를 수크로오스에 작용시켜 얻을 수 있다. 그 효소를 수크로오스에 작용시킨 전이반응조건, 특히 공업적 전이반응조건에 대하여 여러가지로 검토한 결과, 다음의 조건에서 실시하는 것이 바람직하였다. 즉, 전이반응시의 수크로오스농도를 5-70%, 바람직하게는 30-60%로 하고, 또, pH4.0-7.0, 온도 25-65℃, 바람직하게는 50-60℃로 하며, 효소사용량에 대해서는 수크로오스 1g당 5-200단위, 바람직하게는 20-80단위로 하였다.
여기서 효소의 단위는 5%수크로오스용액 1.0ml, pH5.0의 완충액 1.0ml를 첨가하여 40℃에서 60분간 반응시킬때 반응액 2.5ml중에서 60분간 1μmole의 글루코오스를 생성하는 효소량을 1단위로 표시한다.
전이반응이 완료된 다음 가열하여 효소를 탈활(脫活) (deactivate)시켜 활성탄에 의해 탈색하며, 또, 이온교환수지로 탈 염한 다음 농축하여 목적물을 얻는다. 전이조성물의 분석은 예컨데 마이크로본다팩 CH컬럼(micrebondapack CH column) (Waters Limited 제)과 아세토니트릴; 물(80 : 20(v/v)의 용매계를 사용한 고속액체 크로마토 그래피법으로 실시할 수 있다.
이와 같이하여 얻어진 카리에스 유발성이 어려운 우식성 감미료의 조성은 예컨데 글루코오스 28% 프룩토오스 2%, 스크로오스 11%, GF228%, GF325%, GF45% 및 GF51%이며, 각각 구성당의 조성은 반응조건에 따라 여러가지의 값을 얻을 수 있다. 올리고당의 GF2로는 O-β-D-프룩토푸라노실-(2→1)-O-β-프룩토푸라노실-(2→1)-α-D-글루코피라노시드, O-β-D-프룩토푸라노실-(2→6)-O-β-글루코피라노실-(1→2)-β-D-프룩토푸라노시드, O-β-D-프룩토푸라노실-(2→6)-O-β-프룩토푸라노실-(2→1)-α-D-글루코리라노시드 등이 있으며, GF3로는 O-β-D-프룩토푸라노실-(2→[1-O-β-D-프룩토푸라노실]2→1]]-α-D-글루코피라노시드, O-β-D-프룩토푸라노실-(2→6)-O-[β-D-프룩토프라노실-(2→2)]-O-α-D-글루코피라노실-(1→2)-β-D-프룩토푸라노시드등이 있고, GF4로는 O-β-D-프룩토푸라노실-(2-[1-O-β-D-프룩토푸라노실-2]3→1)-α-D-글루코피라노시드등이 있다.
다음으로, 본 발명에 의한 감미료 및 그 성분인 GF2, GF3, GF4, GF5의 효과에 대해서는 다음의 실험예를 들어 상세히 설명한다. 스트렙토콕커스 무탄스 ATCC25175주를 배양하여 얻은 덱스트란 수크라제를 사용하여 GF2, GF3. GF4및 GF5에서 얻은 불용성 덱스트란의 생성량을 수크로오스와 비교한 것을 다음 시험예 1의 표 1에 표시하였다.
이 표에서 명백한 바와 같이 인 GF2, GF3, GF4및 GF5에서는 불용성 덱스트란이 전혀 생성되지 않았다. 동일하게, GF2와 GF3가 덱스트란수크라제에 의한 수크로오스에서 불용성 덱스트란의 생성을 억제하느냐 또는 억제하지않느냐를 검토한 결과 다음 시험예 2의 표 2에 표시하였다.
표에서 명백한 바와 같이 GF2와 GF3는 어느 것이나 수크로오스에서 불용성 덱스트란의 생성을 억제하고 있음을 나타내었다.
[시험예 1]
스트렙토콕커스 문타스(streptococcus muntas) ATCC25175주를 글루코오스와 트립토케이스(triptocase)를 함유한 배지에서 혐기성조건하에 배양하여 균체를 제거한 다음 한의 여과법에 의해 농축, 정제하여 덱스트란 수크라제를 조제하였다. 그다음, 1%당액 1.0ml, 0.67M인산완충액(pH7.0) 1.5ml, 상기 효소액 0.25ml를 혼합하여 37℃에서 4시간 반응시킨후 생성된 불용성덱스트란을 300rpm으로 15분간원심분리하여 침전부분을 모아 이것을 70%에타놀 5ml로 2회 세척한후 2.5ml의 1M-KOH 용액에 용해하고 페놀-황산법에 의해 덱스트란 생성량을 정량하였다.
이에또, 당액으로서 스크로오스, GF2, GF3, GF4및 GF5의 각각 1% 용액을 사용하였다.
GF2, GF3, GF4및 GF5는 스크로오스에 프룩토실 트란스페라제를 작용시켜 얻은 전이당조성물을 원료로하여 이것을 카본 크로마토그라피법에 의해 분리, 정제하고 박충크로마토그라피에 의하여 단일스포트를 나타낸 프락숀(fraction)을 사용하였다.
그결과를 표 1에 표시한다.
[표 1]
표 1에서와 같이 GF2, GF3, GF4및 GF5에서 덱스트란의 생성은 인정되지 않았다.
[시험예 2]
시험예 1에서 조제한 덱스트란수크라제를 사용하여 스크로오스의 존재하에 GF2, GF3를 첨가할때 수크로오스에서 불용성덱스트란의 생성을 GF2, GF3가 억제되는 가의 여부를 조사하였다. 또, 반응조건은 당액 1.0ml(각각 표 2에 기재된 당질을 포함).
0.67M인산 완충액(pH 7.0)1.5ml, 효소액 0.25ml를 각각 혼합하여 37℃에서 4시간 반응한 다음 시험예 1과 동일한 방법으로 반응액중에 생성하는 불용성덱스트란을 정량하였다.
[표 2]
위 표에서 괄호내의 숫자는 수크로오스에서 불용성 덱스트란의 생성량을 100으로 할경우 지수를 나타낸다.
본 발명자들은 위에서와 같이 얻어진 감미조성물중의 프룩토오스와 글루코오스만을 선택적으로 접촉환원하여 소르비톨, 만니콜로 변환하는 방법에 대하여 검토한 결과, 위 당조성물의 수용액에 예로서 제2인 산나트륨등을 첨가하여 수용액의 pH를 7-9로 조정하고, 고형분(soIids)을 기준으로하여 3-10%의 니켈촉매(라네이-니켈, 의산니켈, 니켈규조토등) 존재하에서 교반을 하여 반응온도 50-130℃, 반응수소압 50-120kg/cm2조건하에서 반응을 하면 GF2, GF3, GF4등 올리고당류가 분해하지 않고 조성물중의 글루코오스, 프룩토오스만이 선택적으로 환원되어 글루코오스에서는 소르비톨이 생성되고, 프룩토오스에서는 소르비톨과 만니톨이 생성됨을 발견하였다.
반응조건중, pH의 조정은 특히 중요하며, 예로서 pH 6이하의 반응조건에서 접촉환원을 하면 GF2, GF3, GF4등 올리고 당이 분해하여으로 다량소르비톨과 만니톨을 생성하고 글루코오스와 프룩토오스만을 선택적으로 환원하는 것은 곤란하다. 이와같이 처리하여 얻은 감미조성물은 예로서 소르비톨 37%, 만니톨 2% 수크로오스 10%, GF222%, GF322%, GF47%를 함유하고 있다. 시험예 3에서와 같이 스트렙토콕커스무탄스에 의한 유산(乳酸) 생성량이 수크로오스나 또는 수크로오스에 프룩토실 트란스페라제를 작용시켜 얻어진 당조성물에 비교하여 어느정도 적어진다는 것이 증명되었다.
이와같이, 그 조성물중 소르비톨, 만니톨, GF2, GF3, GF4등의 올리고 당류와 약간의 수크로오스를 포함하는 본 발명의 감미료 조성물은 스트렙토콕커스 무탄스에 의해 생성된 덱스트란 수크로오스의 기질로되기가 어렵고, 따라서 불용성덱스트란생산량이 근소하며, 이에 또, 스트렙토콕커스 무탄스에 의해 발효를 하기가 어려워 우식성발생의 원인이되는 유산생성량이 감소되므로 우식성발생이 어려운 우식효과가 강한 감미료이다.
[시험예 3]
스트렙토콕커스 무탄스(streptococcus mutans serotypec)를 말토오스 0.27%, L-시스틴(Cysteine)염산염 0.01%, L-글루타민산나트륨염 0.1%, NH4H2PO40.2%, MgSO4·7H2O 0.02%, NaCl 0.001%, MnSO40.01%, FeSO4·7H2O 0.01%를 함유한 배지에서 혐기성조건하에 배양한 다음, 원심분리에 의해 균체를 모아 0.05M인산 완충액중에서 10mg/ml의 농도가되도록 분산하였다.
유산생성량은 0.2M인산완충액 0.9ml, 22.5mMMgCl20.14ml, 1.7%당액 0.2ml 및 균체분산액 0.5ml를 흔합하여 37℃에서 30분간 진탕하여 반응을 시킨다음, 15분간 끓여 반응을 정지하고 원심분리법에 의해 균체를 제거한 후 상증액 중의 유산량을 효소법에 의해 정량하였다.
[표 3]
[실시예 1]
수크로오스 5%, 펩톤 1%, 고기엑키스(meat extract) 0.7%, NaCl 0.3%를 함유한 BS배지 10ml를 각각 2개의 시험관에 나누어 넣고, 120℃에서 30분간 상균한 다음 여기에 아스페르길러스 니가(Aspergill-us niger)를 하나의 백금와이어루우프(Platinum wire loop)에 식균(植菌)하고 28℃에서 24시간 배양하였다.
BS배지 200ml를 함유한 3각플라스크(120℃에서 30분간 살균) 2개에 각각 얻어진 배양액 10ml씩을 식균하여 28℃에서 24시간 동안 진탕배양을 하고 전배양(前培養)을 하였다.
BS배지 20l를 30l자 퍼 멘티(jar fermentor)에 넣고, 120℃에서 30분간 살균한 다음, 냉각하여 상기의 전배양액 400ml를 식균하고 300rpm, 28℃에서 72시간 배양하였다.
배양을 완료한 다음, 균체를 여과에 의해 제거하여 배양여액 20l를 얻었다.
이 배약여액 20l를 한외여과법에 의해 농축정재하여 효소액 2l를 얻었다.
그 효소활성은 240단위/ml이었다.
수크로오스 5kg에 물 3.3l를 가하여 용해하고 pH를 6.0으로 조정한 다음, 이 효소액을 수크로오스 1g당 60단위의 량으로 첨가하여 50℃에서 72시간 전이반응을 실시하였다.
전이반응을 완료한 다음 이 용액을 100℃에서 15분간 가열하여 효소를 탈활(脫活)시킨후 고형분에 대하여 0.5%의 활성탄을 가하여 탈색하였다.
활성탄을 제거한 다음 앰버라이트 1R.120과 앰버라이트 IRA-144의 이온교환수지로 이용액을 처리하여 75% w/w 농도로 농축하여 감미료 6kg을 얻었다.
이 감미료의 당 조성은 글루코오스 37%, 프룩토오스 2%, 스크로오스 10%, GF222%, GF323%, GF46%이었다.
위 감미조성물에 물 700l를 가하고, 여기에 10% Na2HPO415ml를 첨가하여 4% NaOH로 pH를 9.0으로 조정하였다.
여기에 라네이니켈 50g을 가하고 반응온도 80-90℃, 수소압 60-120kg/cm2로 교반하면서 반응을 실시하였다. 반응을 완료한 다음, 니켈촉매를 제거하고, 용액을 앰버라이트 IR-120B와 앰버라이트 IRA-411의 이온교환수지로 처리하고 75% w/w로 농축하여 제품 1kg을 얻었다.
이 감미료의 당 조성은 소르비톨 38%, 만니톨 2%, 수크로오스 9%, GF222%, GF323%, GF46%이었다.
Claims (1)
- 수크로오스에 프룩토실 트란스페라제를 작용시켜 글루코오스, 프룩토오스, 수크로오스 및 수크로오스에 1내지 4분자의 프룩토오스를 결합한 올리고당등 당류를 함유한 당액을 얻은다음 이 당액의 pH를 7내지 9로 조절하여 이 당액을 접촉환원시킴을 특징으로하는 소르비톨과 만니톨을 함유한 감미료의 제조법.
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