JPS6013677B2 - シュクロ−スの酵素的トランスフルクトシレ−ション法 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、シュクロースの酵素的トランスフルクトシレ
ーションに関し、更にフラクトースポリマー含有基質を
経由してシクロースからフルクトースを製造する方法に
関する。

又、本発明は、生成したフルクトース最終生成物の物理
的分離を行なうことなく、現在でんぷん加水分解物のグ
ルコース異性化により得られるものよりも箸るしくフル
クトース含量が高いフルクトースシロツプを酵素的に製
造する新規方法に関するものである。本発明の方法は、
５５％以上のフルクトースを含有するフルクトースシロ
ップを製造するために特に用いられる。更に本発明は、
このような製造に有用であることが見し、出されたイー
ストであるプルラリアプルランス（Ｐｕｌｌｕｌａｒｉ
ａＰｕｌＭａｎｓ）の培養物からの新規なトランスフル
クトシラーゼ酵素を使用するトランスフルクトシレーシ
ョン法である。本発明の方法により種々の生成物が得ら
れる。

これらの生成物としては、フルクトースそのもの又は高
フルクトース含量のシロップ並びにフルクトースポリマ
ー、初期フルクトースポリマー（又はポリサッカラィド
）含有基質、上記ポリマーを除去した基質及び異性化後
の（上記ポリマー含有又は不含有の）基質が挙げられる
。これらの生成物の各々は、独自に直接使用される。こ
れらの生成物の各々は、通常の糖及びシロップの性質を
保持しているので、糖及びシロップの通常の用途に用い
られる。

これらの用途としては、例えば食品のスイートニング剤
、薬品製造源料が挙げられる。更にこれらの生成物は、
糖及びシロップに関する通常の工業的用途にも用いられ
、接着剤、湿潤剤（ｈｕｍｅｃｔａｎｔＳ）、グラシン
紙、なめし剤、電気絶縁剤、鋳物コアバィンダ−、殺虫
剤、染料等の製造に用いられ、又更に一般的には可塑剤
、増粘剤（ｔｈｉｃｋｅｍｎｇａ袋ｎｔｓ）等の製造に
も用いられる。即ち、本発明の生成物は、これと類似の
化合物が既に用いられている広範囲の使用分野において
使用可能である。本明細書において用いられる技術用語
を以下に定義しておく。

「グルコース」及び「デキストロース」は、本明細書に
おいては互換的に用いられ、溶液状にしたもの及び乾燥
状（固体状）のもののいずれをも包含する。

「シュクロース」とは、各種シュクロ−ス原料源（例え
ばさとうきび又はさとうだし、こん）から得られる溶液
状又は乾燥状の粗製又は精製シュクロースを意味し、本
発明の実施に際してはシュクロース出発物質は水媒体中
で通常用いられる。

「フルクトース」及び「レブロース」は、この業界にお
いては、通常互換的に用いられ、デキストロースよりも
甘いデキストロ−ス異性体を意味する。フルクトースは
、デキストロースとともに蜂蜜や転化糖中に見し、出さ
れ、その甘さの故に価値あるものである。上述の如くレ
ブロース及びフルクトースは、本明細書において互換的
に用いられ、溶液状にしたもの及び乾燥状のもののいず
れをも意味する。「フルクトースポリサツカライド」と
は、フルクトシルモィェテイ（ｆｒＭｔｏｓｙ１ｍｏｊ
ｅｔｙ）を重量％で少なくとも６６％含むポリサッカラ
ィドである。

「酵素調剤（ｅｎｚｙｍｅｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ）」
とは、所望の酵素活性を示す組成物を意味する。

代表的として、生きている細胞そのもの、乾燥細胞、細
胞抽出物、細胞又は培養液から議導される精製濃縮調剤
が挙げられる。酵素調剤は、本発明の実施においては溶
液状で又は固定化された形で用いられる。「ィソメラー
ゼ酵素」とは、デキストロースをレブロースに異性化す
る酵素調剤を意味する。

ィソメラーゼ酵素は、この業界で良く知られており、デ
キストロースイソメラーゼ、キシロースイソメラーゼ及
びグルコースイソメラーゼが挙げられる。この種の酵素
は各種の微生物から譲導される。このような微生物の例
としては、ストレプトマィセス （Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙ
ｃｅｓ）属、バシルス（滋ｃｉ’ｌｕｓ）簾、ァ ル
ソ ロ バクタ −（ふｔｈｒｏ戊ｃｔＭ）属、アクチ
ノプラ ネ ス（枇ｔｉｎｏｐｌａ股ｓ）属、キュル
トバクテリウム（Ｃｍｔｏ舷ｃｔｅｒｊｕｍ）属等に属
する微生物が含まれる。本発明の実施に有用なィソメラ
ーゼ酵素として特に好ましいものは、米国特許第３８１
３３１８号及び３９５７斑７号明細書に開示された、ス
トレプトマィセスオリボクロモゲネス（Ｓｔｒｅｐｔｏ
ｍｙｃｅｓ。

ｌｉＶ。Ｃｈｍｍｏｇｅ船Ｓ）ＡＴＣＣ Ｎｏ．２１７
１３・ＡＴＣＣＮｏ．２１７１４又はＡＴＣＣＮｏ．２
１７１５（最後の番号のものはＡＴＣＣＮｏ．２１７１
３の単一コロニー単離物である。）から誘導されるもの
であり、これらは、特に米国特許第３７７０５８９号明
細書又は米国特許第紙１３３１８号明細書に開示された
方法によって調製されるのが好ましい。最近、水不溶性
不活性笹体上にィソメラーゼ酵素を固定化する手法が開
発されており、この固定ＴＱ酵素は、連続的にグルコー
スを高フルクトース含量のシロップに転化する際に好ま
しく用いられている。

固定化方法の例としては、米国特許第３７０８３９７号
、３７８８９４５号、３８５０７５１号及び３８６８３
０４号明細書、ベルギー特許第８１９８５計号明細書、
米国特許第３９６０６６３号（ベルギー特許第８１０４
８０号）明細書に開示されている方法が挙げられる。「
イソメラーゼ単位」は、次の「イソメラーゼ活性分析」
の項で述べられる異性化条件下に毎分１マイクロモルの
レプロースを製造するために必要とされる酵素活性量と
定義される。

「ィソメラーゼ活性分析」は、下記の標準条件下にグル
コース溶液から製造されたケトースを分光側光により測
定することを包含する分析方法を意味する。

貯蔵溶液は以下のように作られる。

分析用貯蔵溶液 成分 量 〇．ＩＭＭｇＳ。

４−７日２０ １のＺＯ‐００
１ＭＣ。

ＣＩ２・母Ｌ〇 １の【ＩＭ ナ
トリウムホスフエートバツフア一（ＰＨ７．５）
〇．５のＺ無水Ｄ−グル
コース ０．４４タ上記成分に蒸留
水を加え「総体積を７．５Ｍにする。分析される酵素調
剤を先ず希釈し、１泌当り１〜６のィソメラーゼ単位を
含有するようにする。

貯蔵溶液３の【に酵素調剤１の【を加え、６０℃で３ぴ
合間インキュベーションすることにより酵素的異性化反
応を行なった。インキュベーション時間の終りに試料１
の‘を採取し、９私の０．則過塩素酸中に加え急冷した
。冷却された試料を次いで２５０の‘の体積に希釈した
。インキュベーション期間の初めに溶液状酵素調剤１の
‘を水１の‘に置き換えてグルコースブランク試験を同
時に行ない、これを比較対照試験とした。次いでケトー
スをシスティン−硫酸法により定量した。

この分析において、１ィソメラーゼ単位とは、上述の異
性化条件下に毎分１マイクロモルのレブロースを製造す
るために必要な酵素活性量として定義される。「トラン
スフルクトシレーシヨン」とは、フルクトシルモィェテ
イをドナー（例えばシユクロース）からアクセプター（
例えばポリサツカライド）に転化させることを意味する
。

「フルクトシルトランスフアラーゼ酵素」とは、トラン
スフルクトシレーションを触媒する酵素を意味し、プル
ラリアプルランスＡＴＣＣ９３４８〔オーレオバシジウ
ムプルランス（ＡｕｒｅｏｂａｓｉｄｊｕｍＰ山ｌｕｌ
ａｎｓ）と同義〕から誘導される酵素調剤を包含する。

「フルクトシルトランスフアラーゼ単位」とは、以下の
条件下に毎分還元糖を１マイクロモル（グルコースとし
て計算）製造するために必要な酵素活性量を意味する。

条件【ａ｝ ＰＨ５．５【ｂ｝ 温度５５００ （ｃー 基質濃度 水性反応混合物１００地当り６０夕の食 品用グレードのシュクロースを含有す る。

還元糖側定（グルコースとして計算）は、テクニコンオ
ートアナライザーＤ（Ｔｅｃｈｎｉｃｏｎ、Ｉｎｃ．、
Ｔａｎれｏｗｎ、ＮｅｗＹｏｒｋ）を用いて行なった。

分析は、慣用のアルカリ性フェロシアナィド法（Ａおａ
ｌ〆ｉｃａＩＢｊｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、４５筈、２号
、５１７一５２４頁（１９７２王）参照）をオートアナ
ライザー０に適合させて行なった。特に言及しない限り
、酵素活性測定は、以下の組成から成る反応混合物を連
続的にモニターすることにより行なわれた。‘１１ ８
０％Ｗ／Ｖガ蔓品用グレードのシュクロース水溶液
７．５羽【２１ ０．１
Ｍくえん酸塩バッファー（ｐＨ５．５） ２．３の‘‘
３’毎分反応混合物１の【当り還元糖を５〜２５マイク
ログラム（グルコースとして計算）製造する量のフルク
トシルトランスフアラーゼを含有する酵素試料
０．２の‘「一次基質」とは、例え
ばシュクロース水溶液の如く、トランスフルクトシレー
ションに関与するに好適な形態をしており、又トランス
フルクトシレーションに関与するに有用なフルクトシル
モィェティを有するサッカラィドを意味する。「二次基
質」とは、一次基質にフルクトシルトランスフフラーゼ
酵素を作用させることにより生ずる反応生成物を意味す
る。本明細書において「部」とは、特にことわりない限
り重量部を意味し、「％」とは、特にことわりない限り
％Ｗ′Ｖ）を意味する。

「高圧液体クロマトグラフ分析」とは、以下の高圧液体
クロマトグラフィー方法に従って本発明のシロップを分
析する方法を意味する。

各成分は、これを水を用いてカルシウム形のカチオン交
≠剣樹脂から溶出させることによりクロマトグラフ分析
される。溶出成分は、示差屈折計により検出される。非
デキストロースカーボンハィドレートは、電子積分計を
用いて定量され、デキストロースは、差により求められ
た。一般的方法は、Ａｍ．Ｓｏｃ．Ｂｒｅｗ．Ｃｈｅｍ
．ＰｒＭ．（１９７３王）４３−４６頁の「液体クロマ
トグラフィーによる炭水化物混合物の分析法」に開示さ
れている。使用される樹脂は、カルシウム形のアミネツ
クス（Ａｍｉｎｅｘ）Ｑ１５−５（ Ｂｉｏ − Ｒ的
Ｌａかｒａｔｏｒｉｅｓ 、Ｒｉｃｈｍｏｎｄ 、Ｃ
ａｌｉｆｏｍｉａ）である。本発明者らは、シュクロー
スを多量のグルコースと少量のフルクトースを含有する
モノサッカラィドフラクション及び少なくとも６亀重量
％のフルクトシルモィェティを含有するポリサッカラィ
ドフラクションを含む生成物に転化させることが可能な
フルクトシルトランスフアラーゼ酵素調剤を一次基質で
あるシユクロースに作用させることにより高フルクトー
ス含量のシロップの製造方法を見し・出し、本発明を完
成するに至った。

ここに上記の生成物は、本発明の二次基質のことであり
、二次基質のこれらのポリサッカラィドは、２以上のモ
ノサッカラィドモィェティを有するフルクトース含有ポ
リマー（シュクロースを除く）を包含する。これらのポ
リマーは、更に（２→１）−ベータ結合により連結され
たフルクトシルモイェティを含有するポリサッカラィド
を包含するものとして特徴付けられる。下述の如く、与
えられたトランスフルクトシレーション条件下に生ずる
ポリサッカライドを予め決められた範囲内に優先的に存
在せしめることもでき、このように例えばポリサッカラ
ィドの大部分（例えば少なくとも６０モル％）が２〜１
０個（即ちＤＰ２−１０）、より好ましくは３〜６個（
即ちＤＰ３−６）のモノサツカライドモィェティを有す
るオリゴマ一である二次基質が製造され得る。その後、
上記グルコースは、ィソメラーゼ酵素の作用により上記
ポリサツカラィドの存在下フルクトースに異性化され、
更に活性ィソメラーゼ酵素の不存在下に上記ポリサッカ
ラィド‘ま加水分解される。加水分解は、インベルター
ゼを用いて酵素的に又はおだやかな条件下に酸加水分解
により行なわれる。本発明の他の態様によれば、ポリサ
ツカラィドは上記グルコース及びフルクトースから分離
され、その後上述の如く加水分解されて後二次基質中で
デキストロースを異性化することなく二次基質から直接
６６重量％以上（より好ましくは９の重量％以上）のフ
ルクトースを含有する、極めて高フルクトース舎量のシ
ロップが得られる。

上記の分離は、分子の大きれこ基ず〈慣用の物理的分離
方法、例えば通常の膜処理法（例えば限外炉過法、透析
法）、溶媒沈殿法、炭素吸収法等により行なわれる。膜
処理法の例が米国特許第３１７３８６７号、米国再発行
特許第２６０９７号、米国特許第３５４１００６号及び
３６９１０６８号明細書に記載されている。本発明の好
ましい態様として、シュクロースにフルクトシルトラン
スフアラーゼ酵素を作用させるに際して、酵素として例
えばＡＴＣＣ９３４８、ＡＴＣＣＩ２５３５、ＡＴＣＣ
Ｉ５２２３、ＮＲＲＬ１６７３、ＮＲＲＬＹ２３１１
、ＮＲＲＬ ＹＢ総９２、 ＮＲＲＬ ＹＢ３８６１
、ＮＲＲＬ３９３７の如きプルラリアプルランスから誘
導されたものを用いて高フルクトース舎量のシロップを
製造する方法が挙げられる。生成した生成物、即ち二次
基質は、ィソメラーゼ酵素の作用に付され、その後異性
化生成物は、活性ィソメラーゼ酵素の不存在下に加水分
解される。本発明の方法により得られた二次基質は新規
なものである。

この基質は、５５％以上のフルクトースを含量するシロ
ップの得るための異性化及びこれに続く加水分解のため
に極めて好ましく、シユクロースにフルクトシルトラン
スファラーゼ酵素調剤を作用させることにより得られる
。従って本発明は、‘１｝ 多量のグルコースと少量の
フルクトースを含量するモノサツカラィドを約２０〜約
６の雲量％及び‘２）６亀重量％以上のフルクトシルモ
ィェティを含有するポリサッカラィドを約７０〜約４の
重量％含むことを特徴とする、酵素的異性化及びこれに
続く加水分解によりフルクトースを５５％以上含有する
シロップを得るに好適な基質に関するものである。

特に好ましい二次基質としては、プルラリアプルランス
ＡＴＣＣ９３４８の菌株から誘導された有効量のフルク
トシルトランスフアラーゼ酵素調剤の存在下に約２５〜
約６５ｏｏ、より好ましくは約５０〜約６０℃の温度条
件と約４．５〜約６．５より好まくは約５．４〜約５．
６のｐＨ条件下にトランスフルクトシレーションするこ
とによりシュクロースから得られる二次基質が挙げられ
る。

用いられる初期のシュクロース濃度は、水１００机当り
１０夕のような低い範囲であることがきるが、可能な限
り高い乾燥物質濃度とするのが好ましく、特に最高反応
速度を得るためには約３０〜約６０夕／１００の‘とす
るのが良く、更にシュクロースの飽和点又は後述するよ
うに飽和点以上にすることもできる。シュクロース１夕
当り最低０．５単位のフルクトシルトランスフアラーゼ
を用いると、本発明の新規基質が得られる。

一般に、用いられる酵素の量は、経済的理由よりシュク
ロース１夕当り５山単位を超えてはならない。上述の処
理パラメーター内で経済的に許容できる時間内に所望の
二次基質を得るために特に好ましい範囲は、シュクロー
ス１夕当り約２〜約３山単位である。本発明の新規フル
クトシルトランスフアラーゼの製造操作は、通常の発酵
操作を利用して行なうことができるる（米国特許第３５
６５７５６号、３８０６４１９号及び３５３５１２３号
明細書及びＳ．Ｕｅｄａ ｅｔａｌ．ＡｐｐｌｉｅｄＭ
ｉｃｏｂｉｏｌｏ野、１１巻、２１１−２１５頁（１９
６３年）参照）。

以下に詳述するような新規な分離乃至精製操作を使用す
るのが好ましい。

以下の実施例は、プルラリアプルランスＡＴＣＣ９３４
８から酵素を製造するための典型的な発酵方法を示すも
のである。実施例 １フルクトシルトランスフアラーゼ
酵素調剤−セラィト担体の製造例Ａ 上記酵素を得るた
めに用いられる発酵方法上記酵素を製造するための接種
物議製（ｉｎｏｃｕＭｍｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ）及び
発酵に用いられる培地は以下の如くである。

二塩基性カリウムホスフェート ０．５％塩化ナ
トリウム ０．１％マグネシウ
ムスルフェート・７水和物 ０．０２％ジアンモニウム
スルフエート ０．０６％イーストエクスト
ラクト（Ｄｉｆｃｏいｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）
０，３％シュクロース（食品用グレード
） ７．５％ｐＨ
６８１００のとの無菌塔地を含有する接
種フラスコ（５００奴‘エルレンマイヤーフラスコ）に
ブラックイーストであるプルラリアプルランスのスラン
ト培養物を接種した。

用いられたブラックイーストの繭株は、アメリカンタイ
プカルチャーコレクション（略称はＡＴＣＣ、Ｒｏｃｋ
ｖｍｅ、Ｍａｒｙｌａｎｄ所在）のカタログによればＡ
ＴＣＣ９３４８と命名されている。３〆０で４報時間往
復動シェーカー上で培養した後、この接種フラスコを上
述の培地を２００机含有する発酵フラスコ（１そェルレ
ンマィャーフラスコ）に接種するために用いた。

使用された接種濃度は０．５％Ｗ／Ｖであった。発酵は
、３２００で７日間往復動シェーカー上で行なわれた。
Ｂ 発酵液（足ｒｍｅｎｔａｔｉｏｎＢｒｏｔｈ）から
の酵素の回収１そのシェーカーフラスコ４の固から集め
られた発酵液を一括し、フラスコを水で洗浄し、洗浄液
も発酵液に加えた。

希釈後の発酵液の最終体積は、１２そであった。最終発
酵液は、約８そであった。１２その発酵液をシャープレ
ス （Ｓ舷ｒｐｌｅｓ）型連続遠心分離機にかけ、イースト
細胞及び細胞砕片を除いた。

黒色の粘鋼液である処理液に塩化カルシウムを加えて０
．５％Ｗ′Ｖの濃度にし、生成溶液に水酸化ナトリウム
を加えて母７．０に調整した。この溶液をシャープレス
型遠心分離機にもう一度かけると色のうすし・粘穂な処
理液が得られた。脱色された処理液に塩酸を加えてｐＨ
を５．５に調整し、米国特許第３８０６４１ｙ号明細書
に記載されたように、プルラナーゼ（ｐ地ｕｌａｎａｓ
ｅ）を１０００単位加えた。生成した発酵液は飽和点ま
で加えられたトルェンとともに保存され、外気温で一晩
かけてプルラナーゼと反応させられた。一晩ブルラナー
ゼで消化後１％の濃度となるようにグレフコ＃５０３セ
ライト（Ｇｒｅｆｃｏ＃５０３Ｃｅｌｊｔｅ、Ｊｏｈ順
一Ｎねｎｏｖｍｅ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ Ｃｏｒｐｏｒａ
ｔｉｏｎ、Ｌｏｍｐｏｃ、Ｃａｌｉｆｏｍｉａ）を発酵
液に加えてスラリー化し、次いで体積で２倍量（２４そ
）のアセトンを加えた。沈殿物が形成したが、これを炉
週により集め、炉過ケーキをアセトンで洗浄し、外気温
下乾燥させた。回収された炉過ケーキは、固定化された
フルクトシルトランスフアラーゼ酵素を含有する。本実
施例１において、発酵液に塩化カルシウムを添加し、発
酵液のｐＨを調整すると存在する黒色色素及び酸性ポリ
サッカラィドが除去されることは注目すべきことである
（これらの酸性ポリサッカライドに関してはＡｃｔａ．
Ｃｈｅｍ．Ｓｃａｎｄ．１６巻、６１５−６２２頁（１
９６２王）を参照され度い。

）従って、最終酵素製品は、比較的純粋且つ無色の状態
で得られる。この精製操作は、本発明の好ましい態様を
構成するものであり、遠心分離、炉週、沈殿操作という
簡単な精製操作により良質の最終製品を得ることが可能
となった。従って、本発明は、ブラックイーストである
プルラリアプルランスの最終発酵液から酸性ポリサッカ
ラィドや黒色色素の如き副生成物を分離する方法を提供
するものである。そして、この方法によれば、発酵工程
で生ずる望ましくない色素や酸性ポリサツカラィドの如
き副生成物を含まない最終酵素調剤が得られる。これら
の副生成物は、これを除去しない場合には、発酵液に溶
媒を添加すると酵素と共に共沈する。本発明の精製酵素
調剤の回収法の他の好ましい態様として、発酵液中に固
有に存在するプルランポリサッカラィドを除去すること
が挙げられる。

その理由は、プルランポリサッカラィドは、発酵液に溶
媒添加するとフルクトシルトランスフアラーゼ酵素と共
沈するからである。従って、塩化カルシウム処理し、ｐ
Ｈ調整された後に得られた処理液を更に周知の加水分解
酵素であるプルラナーゼで処理するのが好ましい。プル
ラナーゼ酵素は、プルランを手当り次第加水分解し、低
分子量ポリマーを生成させるので、溶媒（例えばアセト
ン、アルコール等）処理におけるフルクトシルトランス
フアラーゼ酵素調剤の共沈及びこれに続く汚染が防止さ
れる。このようにしてフルクトシルトランスフアラーゼ
酵素を精製することも本発明の他の態様を構成する。本
発明のフルクトシルトランスフアラーゼ酵素調剤は、プ
ルランを除去することなく用いられ得る。

このように本発明は、プルラナーゼによるプルランの加
水分解を行なうことなく実施でき、この場合においてプ
ルランは、フルクトシルトランスフアラーゼ酵素の担体
として供せられる。以下の実施例は、担体としてプルラ
ンを用いる例を示す。実施例 ２ ブルラン担体上に担持されたフルクトシルトランスフア
ラーゼ酵素を用いる二次基質の製造例０．０秋のくぇん
酸バッファー（ＰＨ５．５）で緩衝化された２０％シュ
クロース溶液に実施例１により得られた乾燥プルランを
１％の濃度になるように加えた。

但し実施例１と異なりプルラナーゼを用いるプルランの
加水分解は行なっておらず、従ってプルランが担体とし
て働くので、セラィトは用いていない。フルクトシルト
ランスフアラーゼ活性は、プルラン１夕当り６７７単位
である。混合物が濁化する迄、外気温下で反応を行ない
、試料をサンプリングし、高圧液体クロマトグラフィー
分析を行なって、以下の結果を得た。高圧液体クロマト
グラフィー 分析によるサジヵラィド分布 フルク デキスト ト−ス ロ−ス ＤＰ２ ＤＰ３ ＤＰ４十
６．９ ４０．６ ６．２ １１．
１ ３５．２以下の実施例は、実施例１で得られた酵
素特性を示すものである。

実施例 ３ 酵素作用の生成物及び酵素熱安定性 スクリューキャプを付けた反応容器に６０夕の食品用グ
レードのシュクロース及びフルクトシルトランスフアラ
ーゼ酵素調剤を加えた。

酵素調剤は、適当量の実施例１の固体セライト−酵素製
品を所定量の水中に懸濁させ、所定濃度の酵素溶液を得
ることにより得られた。次いでセラィトを炉週により除
き、炉液を反応混合物に加え、シュクロース基質１夕当
り酵素が１０、２０及び３山単位となるようにした。こ
れらの混合物を水で希釈し、最終体積が１００の‘とな
るようにした。ｐＨ５．５、温度５５℃又は６０℃の条
件下に６曲時間転化を行なった。還元糖を定量し酵素活
性を確認するため２岬時間、４３時間及び６筋時間後に
試料を採取した。試料について還元糖の定量を行なった
後、残余の反応混合物を凍結し、酵素作用を停止させ、
試料を高圧液体クロマトグラフィーによる炭水化物組成
の定量に供した。以下の結果が得られた。還 元 糖
分 析（１） （１）フルクトシルトランスファラーゼ単位の定義の項
で引用された方法を用いたｏ（２ ンュクロース１夕当
りの酵素単位数高圧液体クロマトグラフィーにょる炭水
化物組成反応温度５５℃反応温度６０℃ 実施例３は、基質存在下にｐＨ５．５、温度５５ｑ０及
び６０ｏｏの条件下に６６時間置かれた酵素の熱安定性
、ひいては酵素の商品価値を示すものである。

更に本発明の新規フルクトシルトランスフアラーゼ酵素
調剤を用いてシュクロースを酵素的に転化させることに
より得られた二次基質は、炭水化物分析により、シュク
ロースから高フルクトース含量のシロップを製造するた
めに好適な好ましい価値ある生成物であることが判明し
た。その理由は、その主構成成分がデキストロース及び
後の加水分解処理により主モノサツカライドとしてフル
クトースを生じるポリマーであるからである。本実施例
は、又、本発明の新規酵素は、６０％（Ｗ′Ｖ）のシュ
クロース濃度においても有効であることも示している。
更に高濃度のグルコースの存在下における酵素の機能性
も又示されている。実施例 ４ 酵素活性に及ぼす温度の影響 フルクトシルトランスファラーゼ酵素の反応速度に及ぼ
す温度の影響をテクニコン社製オートアナライザーＯ型
を用いて以下のように検討した。

反応混合物は、８０％Ｗ′Ｖ）シュクロース溶液７．５
の‘、０．１Ｍくえん酸塩バッファー（ｐＨ５．５）２
．３ｍ‘及び２％Ｗ′Ｖ）プルラン酵素溶液（実施例２
の酵素調剤）０．２の【から成る。最終シュクロース濃
度は、６０％Ｗ′Ｖ）であった。試料を以下の温度に保
ち、テクニコン社製オートアナライザーＯ型上で１０分
間分析した。４ぴＣにおける酵素的反応速度は、３び０
におけるそれよりも１．８９倍であり、５０００におけ
る速度は４０ｑｏの１．２餅音であり、６ぴＣにおける
速度は、５０ｏｏの１．４８倍であることが判明し、こ
のことは温度が上昇するにつれ反応速度も上昇すること
を示している。

実施例 ５ フルクトシルトランスフアラーゼ酵素のミカェリスーメ
ンテン（Ｍｉｃｈａｅｌｉｓ−Ｍｅｎｔｅｎ）定数（Ｋ
ｍ）の算出酵素のＫｍとは、生成物形成速度が最高速度
（Ｖｍａｘ）の１′２である場合における基質濃度を意
味する。

フルクトツルトランスフアラーゼ酵素の物を得るために
以下の方法を用いた。０．１Ｍ〈えん酸バッファーを用
いてＰＨ５．５に調整された９０％Ｗ′Ｖ）シュクロー
ス貯蔵溶液を所定量ずつサンプリングし、希釈して７種
の所定濃度のシュクロース溶液（各９．＆【）を得た。

該シュクロース溶液は、これを更に希釈し最終体積１０
の‘にした場合にそれぞれシュクロース濃度が５、１０
、３０、４０、５０、６０及び７０％となるようになっ
ている。フルクトシルトランスフアラーゼ酵素を１．１
単位含有する０．２の‘の酵素溶液を上記の調整試料に
加え、直ちに上述のテクニコンオートアナラィザーロ型
を用いて５５００で分析した（上述のフルクトシルトラ
ソスフアラーゼ単位の項を参照され度い。）グルコース
スタンダード（仏夕／私で計算）が対照として含まれて
いる。実施例１のフルクトシルトランスフアラ−ゼ酵素
調剤を一定量（１．１単位）用いた場合の種々の基質濃
度におけるグルコ−ス生成速度を仏夕／机／分により示
したのが下表である。

｛ａ’６０％シュクロース貯蔵溶液を用いて翌日再実験
した。

Ｋｍは、０．２７モルシュクロース濃度である。

最高反応速度は、ｐＨ５．５温度５６０で１．３７４モ
ルシュクロースの基質濃度の時に認められた。実施例
６ シュクロースからの二次基質の調製及び異性化Ａ 二次
基質の調製食品用グレードのシユクロース６００夕を水
に溶解して８００の‘の体積とした。

この溶液のＰＨは、希塩酸を用いて５．５に調整された
。実施例１の如くに調製された活性度５５０単位／夕の
乾燥セラィト−酵素調剤１１９を１００の‘の水に加え
スラリー化した。スラリーをブフナー炉斗を用いてワッ
トマン（Ｗｈａｔｍａｎ）Ｎｏ．１炉紙上で真空下炉遇
した。炉過ケーキを更に１００の‘の水を用いて洗浄し
た。２００柵の炉液をスクリューキャップ付の０．５ガ
ロンの容器中のシュクロース溶液に加えた。

次いでこの容器を５８００の水浴中に置き、２斑時間反
応を継続させた。２畑時間後に反応生成物を採取し、炭
水化物組成の測定のために高圧液体クロマトグラフィー
分析を行ない、以下の結果を得た。

炭水化物組成 フルクトース ２．４％デ
キストロース ３２．８％ＤＰ
２ １０．６
％ＤＰ３ ２２
．９％ＤＰ４十
３１．３％塩化マグネシウムを残余の反応混合物（即ち
二次基質）に加え、５ミリモルの濃度とし、希水酸化ナ
トリウムを用いてｐＨを８．４に調整した。

Ｂ 二次基質の連続異性化 ストレプトマイセスオリボクロモゲネス （Ｓ○ｅｐｔｏｍｙｃｅＳ ｏｌｉｖｏＣｈｒｏｍ
ｏｇｅｎｅＳ ）ＡＴＣＣ２１７１５（米国再発行
持許２９１５２号明細書参照）から誘導されたグルコー
スィソメラーゼを以下の方法に従って多孔性アルミナ（
Ｃｏｍｉｎｇ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋに所在するＣｏｍｉｎ
ｇＧｌａｓｓＣｏにより製造されたコントロールポアァ
ルミナ、例えば米国特許３９９２３２ｙ号明細書参照）
上に固定化した。

１ 担体を水で２回洗浄する。

２ 担体を凝洋下０．１Ｍくえん酸ナトリウムを用いて
１時間インキュベーションする。

３ 洗浄溶液の伝導度が１０００ミクロモーとなる迄担
体を洗浄してくえん酸ナトリウムを洗い出す。

４ 坦体を０．０９Ｍマグネシウムを用いて１時間イン
キユベーシヨンし、デカンテーシヨンにより塩化マグネ
シウム溶液を除去する。

５ 所定体積の０．０９ Ｍ塩化マグネシウムを加えて
、最終酵素濃度を４０■筆位ノの‘とする。

６ ィソメラーゼ酵素濃縮物を１４００方単位／立方フ
ィートのレベルとなるように坦体に加える。

７ 担体と酵素を２２−２岬時間接触させ、次いで蒸留
水により未結合酵素を担体から洗い流し除去する。

原料供給容器に連結されたポンプを備えたジャケット付
ガラスカラム（３伽×１８肌）に上述の如くして調製さ
れた固定化酵素を充填した。

充填後のカラム床体積は４５柵である。このカラムは、
６０℃で全ての異性化反応について操作された。充填カ
ラムを５ミリモルの塩化マグネシウムを含有し、ｐＨ８
．４に調整されたデキストロースシロツプ（５０％Ｗ／
Ｗ濃度）について操作させると、カラムが活性を有して
いることが判明した。カラム流速は、２９２の‘′ｈｒ
に調整された。カラムは次いで充填床のレベルに排出さ
れた。２０の‘の流出液が集まる迄二次基質の導入を手
で行ない、次いで二次基質の流速を２９２の‘′ｈｒに
調整した。

集められたシロップの最初のｌ００似を基質の変化を考
慮して捨て去った。次いで残りの二次基質（約８５０の
‘）がカラム内を通過された。１時間後流速は５７０地
／ｈｒに増加した。

操作終了時において流速は、３００の‘／ｈｒに調整保
持された。二次基質に関する操作の完了後カラムはデキ
ストロースにスイッチバックされると、ィソメラーゼ活
性が残存していることが判明した。下表は、出発二次基
質及び異性化カラムから得られた最終生成物の高圧液体
クロマトグラフィー分析を示すものである。

二次基質（Ａ）最終生成物（Ｂ） フルクトース ２．４ １５．７デ
キストロース ３２．８ １８．９ＤＰ
２ １０．６ １１．０ＤＰ３
２２．９ ２２．９ＤＰ４十
３１．３ ３１．５上記結果より、二
次基質中の遊離デキストロースの４２．３８％がカラム
内でフルクトースに異性化されていることが明らかとな
った。

又、二次基質中に存在するフルクトースポリマーは、デ
キストロースのフルクトースへの異性化に対して影響を
与えることもなく、又影響を受けることもないことも判
明した。総モノサッカラィド分布が約４５％のフルクト
ースと約５５％のデキストロースから成ることは注目す
べきことである。以下の実施例においては、二次基質及
び二次基質の異性化生成物中に存在するポリサッカラィ
ドを開裂させるために２つの方法が採用されている。

この２つの方法とは、１つが酵素的方法であり、他が緩
やかな条件の酸加水分解法である。実施例 ７加水分解
による高フルクトース舎量のシロップの製造例Ａ 酵素
的加水分解法実施例６の生成物ＢＩＯ０机【にカンディ
タ、１ュティリス（Ｃａｎｄｉ雌ｕｔｉｌｉｓ）から誘
導された精製インベルターゼ１０の９を加え、混合物（
トルェンで保護されている。

）を外気温下一晩反応こせ、その後試料を採取して高圧
液体クロマトグラフィーによる分析を行なった。残余の
生成物Ｂは、更に６日間反応を継続させ、その後試料を
採取して上と同様に分析した。結果は、下表に示した。
Ｂ亭王＋ｉ毒≧…髪÷圭三多合議 用いられたィンベルターゼは、１２３単位／の９の活性
度を有する酵素調剤（Ｓｊｅｋａｇａｋｕｋｏ期ｏＣｏ
．、Ｌｔｄ．、Ｔｏｋｙｏ、Ｊａｐａｎ）である。

ここに１単位のインベルターゼは、特定の条件下にシュ
クロースを開裂し、毎分１マイクロモルのグルコースと
１マイクロモルのフルクトースを形成する。Ｂ 生成物
Ｂの酸加水分解法 実施例６の生成物Ｂの酸加水分解は、生成物Ｂに０．０
５規定の濃度になるように硫酸を加え、７５一８０００
に加熱することにより行なわれた。

１時間及び２時間加水分解した後試料を採取し、高圧液
体クロマトグラフィーにより分析した。

結果は、以下の如くであった。Ａの酵素的加水分解法の
結果は、フルクトース収率が優先的に増加し、グルコー
ス収率がフルクトース収率には及ばないが増加し、これ
に対応してＤＰ２、ＤＰ３及びＤＰ４十フラクションが
減少することを示しており、フルクトースポリマ−の存
在を証明している。

又、Ｂの酸加水分解法の結果は、Ａの酵素的加水分解法
の結果と一致しており、同様にフルクトースポリマーが
開裂していることが証明された。

上述の議論は、出発シュクロースの乾燥物質舎量が与え
られた反応条件下において飽和点を超えない場合におけ
る一次基質を用いるトランスフルクトシレーションに関
するものであるが、以下の実施例は、過飽和の初期シュ
クロース濃度を有し、フルクトシルトランスフアラーゼ
の作用に付された時に高レベルのＤＰ３（即ちフルクト
シル−シュクロース）と低濃度のＤＰ４十を含有する生
成物を生ずる一次基質の使用例を示すものである。又、
二次基質の乾燥物質濃度（Ｗ′Ｗ）がフルクトシルトラ
ンスフアラーゼ酵素を作用させなかった場合に得られた
乾燥物質濃度よりも増加していることも示している。更
に一次基質の乾燥物質濃度が増加すると、二次基質中の
フルクトースポリマーの重合度が減少し、ＤＰ４十物質
が少量存在していることも証明している。このことは、
飽和以下のシュクロース基質を用いた前述の実施例にお
いて得られた結果と好対照である。前述の実施例におい
てＤＰ４十物質は、一次生成物である。実施例 ８過飽
和のシュクローススラリーからの二次基質の製造例２０
０夕の食品用グレードのシュクロースをスクリューキャ
ップ付の１パィントの容器に入れた。

対照として５０叫の水を１つの容器に入れ、他の複数の
容器には下表に示すように漸増量のフルクトシルトラン
スフアラーゼ酵素−セラィト調剤（実施例１により製造
されたもの）を含有する水５０の‘を加えた。各容器に
栓をし、容器を５４−５ず０にセットされた振とう式水
浴中に置いた。時々手で混合しながらフラスコを２岬時
間振とうした。上燈試料を各容器から採取し、酵素を不
活性化するために沸騰水浴中のスクリューキャップ付試
験管中に入れた。これらの試料は、次いで高圧液体クロ
マトグラフィー分析に付され、又、上燈の乾燥物質量も
Ｋ．フィッシャー（Ｆｉｓｃｈｅｒ）法により測定され
た。結果は以下の如くであった。（１）５０微の水中の
フルクトシルトランスファラーゼ酵素の総単位数上の実
施例において、外気温（約２５ｑｏ）に冷却された時に
対照試料は結晶化するのに対し、酵素的に製造された二
次基質は、溶液中に残存し、結晶化することなく極めて
優れたシェルフラィフ安定性を示すことは注目すべきで
ある。

実施例８においては水５０の【当り２００夕のシュクロ
ースを用いた（８０％Ｗ′Ｗ）けれどもシユクロース出
発物質の乾燥物質濃度は増加させることもできる。

本発明の新規二次基質は、極めて安定で且つ非結晶性の
シロップとして食品分野で使用され、又病原菌汚染及び
着色物形成に対して抵抗性を有する極めて乾燥物質含量
の高い組成物を与える。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １ プルラリアプルランス（ＰｕｌｌｕｌａｒｉａＰｕ
   ｌｌｕｌａｎｓ）から誘導されるフルクトシルトランス
   フアラーゼ酵素調剤の有効量をシユクロースに作用させ
   、フルクトースポリサツカライド−このフルクトースポ
   リサツカライドは少なくとも６６重量％のフルクトシル
   モイエテイを含有する−及びデキストロースを含有する
   反応生成物を得ることを特徴とする、シユクロースの酵
   素的なトランスフルクトシレーシヨン法。 ２ 酵素の作用を受けるシユクロースが少なくとも約２
   ０％の濃度にある、特許請求の範囲第１項記載の方法。 ３ 温度を約２５℃〜約６５℃とし、ｐＨを約４．５〜
   ６．５とし、初期シユクロース濃度を少なくとも１０％
   （Ｗ／Ｖ）として、フルクトシルトランスフアラーゼ酵
   素調剤をシユクロースに作用させる、特許請求の範囲第
   １項記載の方法。