NO145641B - Fremgangsmaate for fremstilling av et fruktoseholdig produkt - Google Patents

Description

Foreliggende oppfinnelse gjelder generelt enzymatisk transfruktosylering av sukrose. Mer spesielt gjelder oppfinnelsen en enestående fremgangsmåte for fremstilling av fruktose fra sukrose via et fruktose-polymer-holdig substrat.

Denne fremgangsmåte er en ny enzymatisk metode for fremstill-

ing av siruper med et fruktoseinnhold som er betydelig høyere enn det som for tiden kan oppnås ved glukose-isomerisering av stivelsehydrolysater, uten at det er nødvendig med noen fysisk separering av det oppnådde fruktose-slutt-produkt. Fremgangsmåten er spesielt egnet for fremstilling av fruktose-siruper som inneholder 55 % fruktose eller mer. Oppfinnelsen benytter seg av et transfruktosylase-enzym fra kulturer av gjæren Pullularia pullulans, som er funnet å være anvendbart ved

slik fremstilling. „

Ved hjelp av fremgangsmåten i henhold til oppfinnel-

sen kan man oppnå en rekke produkter. Disse omfatter den fer-

dige fruktose eller en sirup med høyt fruktoseinnhold, såvel som forskjellige mellomprodukter, som for eksempel fruktose-polymeren, opprinnelig fruktosepolymer- (eller polysakkarid-)holdig substrat, substrat som polymeren er fjernet fra, og substrat

(med eller uten polymeren) etter isomerisering. Hvert av disse produkter er direkte anvendbart i og for seg.

Hvert av disse produkter har liknende egenskaper som konvensjonelle sukkere og siruper og kan anvendes der slike vanligvis brukes. Dette omfatter eksempelvis anvendelse som søtningsmidler for næringsmidler og som råmaterialer for fremstilling av farmasøytiske stoffer. I tillegg kan produktene inn-gå i vanlige industrielle anvendelser av sukkere og siruper.

De kan således anvendes ved fremstilling av adhesiver, fukte-midler, glasspapir, garvemidler, elektriske isolatorer, binde-midler for støpekjerner, insekticider, farvestoffer og lignende, eller mer generelt som mykningsmidler eller fortykningsmidler.

De er således anvendbare innen det brede spektrum av felter hvor analoge produkter allerede er i bruk.

Fordi mange uttrykk er i bruk på fagområdet skal følgende definisjoner av uttrykkene gis: Uttrykkene "glukose" og "dekstrose" anvendes om hverandre for å omfatte dette monosakkarid i enhver form i løsning eller i tørr form.

Uttrykket "sukrose" refererer til dette disakkarid enten i raffinert eller rå form, i løsning eller tørt, fra enhver sukroseråmaterialkilde, for eksempel sukker-rør eller sukker-roer. Ved utførelsen av oppfinnelsen anvendes typisk sukrose-startmaterialet i vandig medium.

Uttrykkene "fruktose" og "levulose" anvendes generelt om hverandre på fagområdet for å referere til isomeren av dekstrose som er søtere enn dekstrose. Fruktose finnes i honning og i invert-sukker sammen med dekstrose og er verdi-full på grunn av sin søthet. Uttrykkene levulose og fruktose vil bli brukt om hverandre i foreliggende beskrivelse for å referere til dette monosakkarid i enhver form, i løsning eller i tørr form.

Uttrykket "enzympreparat" anvendes her for å referere til enhver substans som oppviser den ønskede enzymatiske aktivitet. Uttrykket brukes for eksempelvis å referere til levende, hele celler, tørre celler, celleekstrakter, raffinerte og konsentrerte preparater fremstilt fra cellene og fra kultur-væsker. Enzympreparatene kan enten brukes som en løsning eller i en immobilisert form ved utførelsen av oppfinnelsen.

Ethvert enzympreparat som isomeriserer dekstrose til levulose refereres det her til som et "isomerase-enzym". Disse enzymer er velkjent på fagområdet og er omtalt som dekstrose-isomerase, xylose-isomerase og glukose-isomerase. Slike enzymer kan oppnås fra forskjellige egnede mikro-organismer. Eksempler på slike mikro-organismer omfatter dem som tilhører slektene Streptomyces, Bacillus, Arthrobacter, Actinoplanes, Curto-bacterium og andre.

Et foretrukket isomerase-enzym som er.anvendbart ved utførelsen av foreliggende oppfinnelse oppnås fra Streptomyces olivochromogenes ATCC nr. 21.713, ATCC nr. 21.714 eller ATCC nr. 21.715 (av hvilke den siste er et enke-ltkoloni-isolat av ATCC nr. 21.713) slik det beskrives i U.S.-patent~skrifter nr.

3.813.318 og 3.95 7.587, spesielt når de er fremstilt ved hjelp av den fremgangsmåte som er beskrevet i U.S.-patentskrifter nr.. 3.770.589 og 3.813.318.

Nylig er man på fagområdet blitt oppmerksom på fremgangsmåter hvor isomerase-enzymet er immobilisert på en vann-uløselig, inert bærer. Det immobiliserte enzym er da egnet for anvendelse ved kontinuerlig omdannelse av glukose til en sirup med høyt fruktoseinnhold. Eksempler på slike fremgangsmåter er beskrevet i U.S.-patentskrifter nr. 3.708.397, 3.788.945, 3.850.751, 3.868.304 og 3.960.663 (belgisk patentskrift nr. 810.480) og belgisk patentskrift nr. 819.859.

"Isomerase-enhet" defineres som den mengde enzymaktivitet som kreves for å fremstille et mikromol levulose pr. minutt under de isomeringsbetingelser som skal beskrives nedenfor under overskriften "Prøve på isomerase-aktivitet".

Uttrykket "prøve på isomerase-aktivitet" slik det brukes her refererer til den prøvemetode som omfatter en spektro-fotometrisk bestemmelse av den ketose som fremstilles fra en glukoseløsning under standardiserte betingelser.

En forrådsløsning lages på følgende måte:

Forrådsløsning for prøve

Tilsett destillert vann til et totalvolum på 7,5 ml

Det enzympreparat som skal prøves fortynnes først

slik at det inneholder fra 1 til 6 isomerase-enheter pr. ml.

Det utføres en enzymatisk isomerisering ved å tilsette 1 ml av enzympreparatet til 3 ml av forrådsløsningen og inkubere i 30 minutter ved 60°C. Ved slutten av inkuberirigsperioden uttas en alikvot på 1 ml, og den avkjøles i 9 ml 0,5 n perklor-syre. Den bråkjølte alikvot fortynnes så til et totalvolum på 250 ml. Som kontroll, for sammenlikningsformål, kjøres også en blindprøve ved å erstatte 1 ml enzymløsning med 1 ml vann ved begynnelsen av inkuberingsperioden.

Ketose bestemmes så ved hjelp av en cystein-svovelsyre-metode. For formålene med denne prøve defineres en isomerase-enhet som mengden av enzymaktivitet som kreves for å fremstille et mikromol levulose pr. minutt under de isomeriseringsbetingel-ser som er beskrevet.

Uttrykket "transfruktosylering" slik det brukes her refererer til overføringen av en fruktosyl-del fra giveren, for eksempel sukrose, til mottakeren, for eksempel et polysakkarid.

Uttrykket "fruktosyl-transferase-enzym" slik det brukes her refererer til ethvert enzym som katalyserer transfruktosylering og omfatter enzympreparater oppnådd fra Pullularia pullulans ATCC 9348 (synonymt med Aureobasidium pullulans)..

Uttrykket "fruktosyl-transferase-enhet" slik det brukes her defineres som den mengde enzymaktivitet som er nødvendig for å fremstille et mikromol reduserende sukker, beregnet som glukose, pr. minutt under følgende betingelser: a) pH 5,5, b) temperatur 55°C og c) substratkonsentrasjon på 60 g sukker av spisekvalitet pr. 100 ml vandig reaksjonsblanding.

Bestemmelser av reduserende sukker (beregnet som glukose) utføres ved bruk av en "Technicon Autoanalyzer II" (Technicon, Inc., Tarrytown, New York). Analyse utføres ved hjelp av en konvensjonell alkalisk ferricyanid-metode, Analytical Biochemistry 45, nr.

2, sidene 517-524 (1972), tilpasset for bruk i "Autoanalyzer II". Om ikke annet er angitt utføres enzymaktivitetsbestemmelser ved kontinuerlig bruk av en reaksjonsblanding bestående av følgende ingredienser: 7,5 ml 80 % (vekt/volum) vandig sukroseløsning av spisekvalitet 2,3 ml 0,1 m citrat-puffer, pH 5,5

0,2 ml enzymprøve inneholdende den mengde fruktosyl-transferase-enzym som vil gi 5. - 25 mikrogram reduserende sukker (beregnet som glukose) pr. minutt pr. ml reaksjonsblanding.

Uttrykket "primært substrat" slik det brukes her refererer til de sakkarider som er i en form som er egnet for og som har en fruktosyl-del som er tilgjengelig for deltagelse i transfruktosylering, som eksempelvis vandige aukroseløsninger.

Uttrykket "sekundært substrat" slik det brukes her er reaksjonsproduktet som oppnås ved å utsette det primære substratet for innvirkning av et fruktosyl-transferase-enzympreparat,

slik det er definert her.

I foreliggende beskrivelse er alle deler angitt som vekt-deler og alle prosenter angitt som vekt/volum (vekt/vol) dersom ikke annet uttrykkelig er angitt.

Uttrykket "høytrykks-væskekromatografi-prøve" slik det brukes her definerer den fremgangsmåte ifølge hvilken sirupene fremstilt som beskrevet analyseres ved hjelp av høytrykks-væskekromatografi overensstemmende med følgende teknikk. Bestand-delene kromatograferes ved eluering med vann fra en kationebytte-harpiks i kalsiumform. Eluerte bestanddeler påvises ved hjelp av et differensial-refraktometer. Ikke-dekstrosé-karbohydrater kvantifiseres ved bruk av en elektronisk integrator og dekstrose oppnås som differanse. Den generelle metode er den som er beskrevet i "Analysis of Carbohydrate Mixtures by Liquid Chromatography", Am. Soc. Brew. Chem.Proc, 1973, sidene 43-46. Den harpiks som brukes er "Aminex Q" 15-5 i kalsiumformen, Bio-Rad Laboratories, Richmond, California.

Ifølge oppfinnelsen er det tilveiebrakt en fremgangsmåte for fremstilling av et fruktoseholdig produkt som omfatter å utsette sukrose for innvirkning av et fruktosyl-transferase-enzym som omdanner sukrose til et polysakkarid inneholdende fruktosyl-andeler forbundet ved (2 1)-3-bindinger. Et slikt produkt ut-gjør et sekundært substrat. Polysakkaridene i det sekundære substrat omfatter alle fruktoseholdige polymerer (andre enn sukrose) med to eller flere monosakkaridandeler. Fremgangsmåten i henhold til oppfinnelsen er karakterisert ved at sukrose utsettes for innvirkning av det nevnte enzympreparat slik at den omdannes til et produkt som omfatter dekstrose, fruktose og polysakkarider som inneholder minst 66 vekt% fruktosyl-andeler forbundet ved (2 -*■ 1)-p-bindinger. Deretter isomeriseres dekstrosen (ved innvirkning av isomerase-enzym) til fruktose i nærvær av nevnte polysakkarider, fulgt av hydrolyse av nevnte polysakkarider i fravær av aktivt isomerase-enzym. Hydrolysen kan utføres enzymatisk ved å bruke invertase eller ved syrehydrolyse under milde betingelser.

Som beskrevet nedenfor kan polysakkarider som oppstår under visse transfruktosyleringsbetingelser i hovedsak ligge in-nenfor et på forhån! bestemt område. Således kan eksempelvis sekundært substrat fremstilles hvori det meste (for eksempel minst 60 % i molforhold) av polysakkaridet er oligomerer med fra 2 til 10 (dvs. DP 2-lo), mer normalt 3 til 6 (dvs. DP 3-6), monosakkarid-deler.

I et ytterligere fremgangsmåtetrinn kan polysakkaridene skilles fra dekstrosen og fruktosen og deretter hydrolyseres som tidligere beskrevet, slik at det oppnås en ultrahøy-fruktosesirup, for eksempel med et fruktoseinnhold på over 66 vekt% og fortrinnsvis over 90 vekt%, direkte fra det sekundære substrat uten nødvendighet av å isomerisere dekstrosen i nevnte substrat. Slik separasjon kan hensiktsmessig utføres ved konvensjonelle fysikalske separasjonsteknikker basert på mo-lekylstørrelse, som eksempelvis konvensjonell membran-teknologi (f.eks. ultrafiltrering, dialyse), løsningsmiddelutfelling, kar-bonabsorpsjon og liknende. Eksempler på slik membranteknologi er beskrevet i US-patentskrifter nr. 3 173 867, Re. 26097, 3 541 006 og 3 691 068.

Ved hjelp av den her beskrevne fremgangsmåte kan det fremstilles siruper med høyt fruktoseinnhold ved å utsette sukrose for innvirkning av et fruktosyl-transferase-enzympreparat,

som f.eks. det som oppnås fra Pullularia pullulans som f.eks. ATCC 9348, ATCC 12535, NRRL 1673, NRRL Y2311, NRRL YB3892, NRRL YB 3861 og NRRL 3937. Det resulterende produkt eller sekundære substrat utsettes for innvirkning av isomerase-enzym. Deretter hydrolyseres det isomeriserte produkt i fravær av aktivt isomera-ase-enzym.

Det sekundære substrat som fremstilles ved fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen antas å være nytt. Dette substrat er fremragende egnet for isomerisering og etterfølgende hydrolyse slik at det oppnås en sirup med mer enn 55 % fruktose, og fremstilles ved å utsette fruktose for innvirkning av et fruktosyl-transf erase-enzympreparat. Ved fremgangsmåten i henhold til oppfinnelsen fremkommer derfor substrater egnet for enzymatisk isomerisering og etterfølgende hydrolyse til siruper inneholdende mer enn 55 % fruktosesirup, omfattende 1) fra ca. 20 til ca. 60 vekt% monosakkarider, inneholdende en større mengde dekstrose og en mindre mengde fruktose, og 2) fra ca. 70 til ca. 40 % polysakkarider inneholdende mer enn 66 vekt% fruktosyl-andeler.

Spesielt foretrukket er sekundære substrater oppnådd fra sukrose ved transfruktosylering i nærvær av en effektiv mengde av et fruktosyl-transferase-enzympreparat oppnådd fra en stamme av Pullularia pullulans ATCC 9348, ved en temperatur i området fra 25 til 65°C,og fortrinnsvis fra 50 til 60°C, og ved pH vari-erende fra 4,5 til 6,5, og fortrinnsvis fra 5,4 til 5,6. De anvendte start-sukrosekonsentrasjoner kan ligge så lavt som 10 g pr. 100 ml vann. Det foretrekkes imidlertid å anvende så høy tørr-stoffkonsentrasjon som mulig, fortrinnsvis i området fra 30 til 60 g pr. 100 ml (for maksimal reaksjonshastighet), opp til metningspunktet for sukrose (og høyere, som beskrevet mer fullstendig senere).

Et minimum på 0,5 enhet fruktosyl-transferase pr. gram sukrose kan anvendes ved fremgangsmåten

ifølge oppfinnelsen. Generelt vil mengden av enzym som brukes ikke overstige 50 enheter pr. gram sukrose av økonomiske grunner. Spesielt foretrukket for å oppnå det ønskede sekundære substrat på kommersielt akseptabel tid og innen de ovenfor beskrevne fremgangsmåteparametre, er et område på fra ca. 2 til ca. 30 enheter pr. gram sukrose.

De foranstående og andre utføreIsesformer ifølge oppfinnelsen er mer fullstendig beskrevet i det følgende.

Fremgangsmåten for fremstilling av det nye fruktosyl-transferase-ensympreparat kan utnytte konvensjonelle fermenteringsteknikker, se for eksempel U.S.-patentskrifter nr. 3.565.756, 3.806.419, 3.535.123 og S. Ueda et al.: Applied Microbiology, 11, 211-215 (1963). Fortrinnsvis utnyttes visse nye separerings- eller rensningstrekk, som skal beskrives mer detaljert senere. Følgende eksempel er en typisk fermenteringsmetode for fremstilling av enzymet fra Pullularia pullulans ATCC 9348.

Eksempel 1

Fremstilling av fruktosyl-transferase-enzym-

preparat - " Celit<e>"- bærer

A. Fermenteringsmetode for fremstilling av enzymet

Det medium som ble brukt for utvikling av inokulum og fermentering for fremstilling av enzymet er som følger:

0,5 % dibasisk kaliumfosfat

0,1 % natriumklorid

0,02 % magnesiumsulfat-heptahydrat

0,06 % diammoniumsulfat

0,3 % gjærekstrakt (Difco Laboratories)

7,5 % sukrose (næringsmiddelkvalitet)

pH i mediet justert til 6,8

Dyrkingskolbene, 500 ml Erlenmeyer inneholdende 100 ml sterilt medium, inokuleres fra en skråkultur av gjæren Pullularia pullulans. Den spesielle stamme av gjæren som brukes betegnes i katalogen til American Type Culture Cbllection (Rockville, Mary-land) med ATCC 9348. Kimkolbene anvendes, etter utvikling på

en frem- og tilbakegående rystemaskin i 48 timer ved 32°C, for inokulering av én liters Erlenmeyer fermenteringskolber, hver inneholdende 200 ml av det tidligere definerte medium. Inokulum-

konsentrasjonen som brukes er 0,5 % vekt/vol. Fermenteringen utføres på en frem- og tilbakegående rystemaskin ved 32°C i 7 dager.

B. Utvinning av enzymet fra fermenteringsvæsken

Fermenteringsvæskene fra førti 1-liters rystekolber samles og kolbene skylles med vann som også tilsettes til den samlede væske. Sluttvolumet av væsken er etter fortynning 12 liter. Originalvolumet av væsken er omtrent 8 liter. De 12 liter fermenteringsvæske kjøres gjennom en kontinuerlig Sharples-centrifuge for å fjerne gjærceller og celle-debris. Den overstående væske, som er en svart, viskøs løsning, tilsettes så kalsiumklorid til en konsentrasjon på 0,5 % vekt/vol., og pH

i den resulterende løsning justeres til 7,0 med natriumhydroksyd. Løsningen kjøres så for annen gang gjennom Sharples-sentrifugen for å frembringe en viskøs overstående væske som har lite farve. Den avfarvede løsnings pH justeres til 5,5 med saltsyre, fulgt

av tilsetning av 1000 enheter (som definert i U.S.-patentskrift nr. 3.806.419) pullulanase. Den resulterende væske konserveres med toluen (tilsatt til metning), og pullulanasen får reagere ved omgivelsestemperatur natten over. Etter digerering med pullulanase natten over, oppslemmes Grefco 503 "Celite" (Johns-Manville Products Corporation, Lompoc, California) i 1 %ig konsentrasjon

i væsken fulgt av tilsetning av 2 volumdeler (24 liter) aceton.

Et bunnfall dannes og oppsamles ved filtrering, filterkaken vaskes med aceton og tørkes ved omgivelsestemperatur. Den opp-samlede filterkaken inneholder det uløselige fruktosyltransferase-enzymet.

Til eksempel 1 skal det bemerkes at tilsetning av kalsiumklorid til fermenteringsvæsken, med justering av væskens pH, resulterer i fjerning av det svarte pigmentet og de tilstede-værende sure polysakkarider. (For diskusjon angående disse sure polysakkarider, se Acta. Chem. Scand. 16, 615-622 (1962)). Det ferdige enzymprodukt fås derved i form av et relativt rent, farve-løst preparat. Denne raffineringsmetode tillater bruk av enkle raffineringsmetoder, dvs. sentrifugering, filtrering eller ut-felling for å oppnå sluttproduktet. Således tilveiebringes en fremgangsmåte for separering av sure polysakkarider og svart-farvede biprodukter fra slutt-fermenteringsvæsken av gjæren Pullularia pullulans. Denne metode gir et ferdig enzympreparat som er fritt for uønskede biprodukter i form av pigment og sure polysakkarider, som dannes under fermenteringen. Disse biprodukter utfelles sammen med enzymet ved tilsetning av løsningsmiddel til fermenteringsvæsken dersom de ikke fjernes.

Som en ytterligere rensing for oppnåelse av renset enzympreparat er det ønskelig å fjerne pullulan-polysakkaridet som er til stede i fermenteringsvæsken, fordi også dette vil fal-le ut sammen med fruktosyl-transferase-enzymet ved løsningsmiddel-tilsetning til fermenteringsvæsken. Derfor kan den overstående væske som oppnås ved kalsiumkloridbehandlingen og pH-justeringen, behandles videre med det velkjente hydrolyse-enzym pullulanase. Pullulanase-enzymet hydrolyserer pullulanet tilfeldig og gir en polymer med lavere molekylvekt, hvorved en medutfelling og derav følgende forurensning av fruktosyl-transferase-enzympreparatet under løsningsmiddelbehandlingen (f.eks. med aceton eller alkohol) unngås.

Fruktosyl-transferase-enzympreparater som her beskrevet kan anvendes uten å fjerne pullulanet. Oppfinnelsen kan således nyttiggjøres uten at pullulanet hydrolyseres av pullulanase, i hvilket tilfelle pullulan tjener som bærer for fruktosyl-transferase-enzymet.

Følgende eksempel demonstrerer bruk av pullulan som bærer.

Eksempel 2

Fremstilling av sekundært substrat ved bruk av fruktosyl- transferase- enzym på pullulan som bærer En 20 %ig sukroseløsning pufret med 0,05 m citrat-puffer med pH 5,5 tilsettes tørt pullulan fremstilt ifølge fremgangsmåten fra eksempel 1 til en 1 %ig konsentrasjon, bortsett fra at pullulanet ikke er hydrolysert med pullulanase og derfor tjener som bærer, og at det ikke anvendes "Celite". Fruktosyl-transferase-enzym-aktivitet er 677 enheter/gram pullulan. Reaksjonen utføres ved omgivelsestemperatur inntil blandingen blir uklar. En prøve av dette materiale analyseres ved høytrykks-væskekromato-grafi med følgende resultater:

Følgende eksempler karakteriserer ytterligere det

enzym som er fremstilt i eksempel 1.

Eksempel 3

Produkter fra enzymatisk innvirkning og varmestabilitet for enzymer

Til reaksjonskolber utstyrt med skru-korker tilsettes

60 g sukrose av næringsmiddelkvalitet og et fruktosyl-transferase-enzympreparat . Enzympreparatet oppnås fra enzymproduktet i eksempel 1 ved å dispergere egnede alikvoter av det faste "Celite"-enzymprodukt i utmålte mengder vann slik at det oppnås passende konsentrasjoner i enzymløsningen. "Celite" fjernes så ved filtrering. Filtratet brukes for å gi reaksjonsblandingene 10, 20 og 30 enheter enzym pr. gram sukrosesubstrat. Disse blandinger fortynnes så hver til et sluttvolum på 100 ml med vann. Omdannelser utføres i 66 timer ved pH 5,5 og 55 eller 60°C, repsektive. Prøver uttas etter 24, 43 og 66 timer for bestemmelser av reduserende sukker for å fastslå tilstedeværelse av enzymatisk aktivitet. Etter at bestemmelser av reduserende sukker er ut-ført på prøvene fryses gjenværende reaksjonsblandinger for å stanse enzymvirkningen og prøver underkastes bestemmelser av karbohydratsammensetning ved hjelp av høytrykks-væskekromato-grafi. Følgende resultater ble oppnådd:

Eksempel 3 viser varmestabiliteten i nærvær av enzym-substratet ved 55°C og 60°C under en 66 timers periode ved pH 5,5, og demonstrerer således enzymets kommersielle potensial. Ennvidere demonstreres at det sekundære substratet fremstilt

ved enzymatisk omdannelse av sukrose med det nye fruktosyl-transferase-enzympreparatet viser seg, ved hjelp av karbohydratanalysen, å være et potensielt verdifullt produkt egnet for fremstilling av fruktosesiruper med høyt fruktoseinnhold fra sukrose, fordi hovedbestanddelene er påvist å være dekstrose og polymerer som ved påfølgende hydrolyse gir fruktose som dominerende monosakkarid. Dette eksempel demonstrerer også at det nye enzym som er beskrevet, er effektivt ved en sukrosekonsentrasjon på 60 % (vekt/vol). Funksjonaliteten til enzymet 1 nærvær av høye glukosekonsentrasjoner er også påvist.

Eksempel 4

Virkning av temperatur på enzymaktiviteten

Virkningen av temperatur på reaksjonshastigheten for fruktosyl-transferase-enzymet bestemmes ved bruk av "Technicon Autoanalyzer II" som følger:

Reaksjonsblandingen består av 7,5 ml 80 %ig (vekt/vol) sukroseløsning, 2,3 ml 0,1 m citratpuffer med pH 5,5 og 0,2 ml 2 %ig (vekt/vol) pullulan-enzymløsning (enzympreparat fra eksempel 2). Endelig sukrosekonsentrasjon er 60 % (vekt/vol). Prøvene holdes ved de følgende temperaturer og undersøkes i 10 minutter på "Technicon Autoanalyzer II". Resultatene viser at enzymatisk reaksjonshastighet er 1,89 ganger større ved 40 enn 30°C, ved 50°C er den 1,29 ganger større enn ved 40°C og ved 60°C er den 1,48 ganger større enn ved 50°C. Dette viser at reaksjonshastigheten øker med økende temperatur.

Eksempel 5

<p>åvisning av Michaelis-Menten-konstanten (Km) for

fruktosyl- transferase- enzymet

Km for et enzym angir den substratkonsentrasjon ved hvilken hastigheten for produktdannelse er halvparten av Vmakg Følgende fremgangsmåte ble brukt for å oppnå for fruktosyl-transferase-enzymet .

Ved bruk av en 90 %ig (vekt/vol) sukrose-forrådsløsning justert til pH 5,5 med 0,1 m citratpuffer ble de riktige konsen-trasjonene av sukrose i 9,8 ml alikvoter fremstilt slik at det ble oppnådd 5, 10, 30, 40, 50, 60 og 70 % konsentrasjoner av sukrose ved et sluttvolum på 10 ml. En enzymløsning på 0,2 ml inneholdende 1,1 enheter fruktosyl-transferase-enzym tilsettes til de tempererte prøver. Prøvene blir straks undersøkt ved 55°C på "Technicon Autoanalyzer II" som tidligere beskrevet (se fruktosyl-transferase-enhet). En glukosestandard (kalibrert i yug/ml) anvendes som kontroll.

I det følgende angis hastigheten for glukosedannelse uttrykt som ^ug/ml ved de forskjellige substratkonsentrasjoner og bruk av en konstant dose (1,1 enheter) av fruktosyl-transf erase-enzympreparatet fra eksempel 1. a) Undersøkt på nytt neste dag fra en 60 %ig sukrose-forrådsløsning. 1^ er 0,27 molar sukrosekonsentrasjon. Maksimal reaksjonshastighet opptrådte ved en substratkonsentrasjon på 1,374 mol sukrose ved pH 5,5 og.55°C.

Eksempel 6

Sekundært substrat fra sukrose

A. Fremstilling av sekundært substrat

600 g sukrose av næringsmiddelkvalitet oppløses i vann

til et volum på 800 ml. Denne løsnings pH justeres til 5,5 ved hjelp av fortynnet saltsyre. Et tørt "Celite"-enzympreparat,

11 g med en aktivitet på 550 enheter/g, fremstilt som i eksempel 1, oppslemmes i 100 ml vann. Oppslemmingen filtreres under vakuum på Whatman nr. 1 filtrerpapir i en Btichner-trakt. Filterkaken vaskes med ytterligere 100 ml vann. Filtratet på 200 ml tilsettes så til sukroseløsningen som er plassert i en 1,85 liters kolbe utstyrt med skrukork. Kolben plasseres så i et vannbad på 58°C, og reaksjonen får fortsette i 20 timer, hvoretter en prøve av reaksjonsproduktet undersøkes ved hjelp av høytrykks-væske-kromatografi for bestemmelse av karbohydratsammensetningen med følgende resultater:

Magnesiumklorid tilsettes til det gjenværende reaksjons-produkt (dvs. sekundært substrat) til en konsentrasjon på 5 millimol, og pH justeres til 8,4 med fortynnet natriumhydroksyd.

B. Kontinuerlig isomerisering av sekundært substrat

Glukose-isomerase oppnådd fra Streptomyces olivochromogene ATCC 21.715 (se U.S.-patent Re. 29.152) immobiliseres på porøst aluminiumoksyd (en regulert pore-bærer fremstilt av Corning Glass Co., Corning, New York, se for eksempel U.S.-patent 3.992.329) som følger:

1. Bæreren vaskes to ganger med vann,

2. Bæreren inkuberes med 0,1 m natriumcitrat i 1 time med omrøring, 3. ' Natriumcitratet vaskes fra bæreren inntil lednings-evnen for vaskeløsningen er 1000 mikromhos, 4. Bæreren inkuberes med 0,05 m magnesiumklorid i 1 time, og magnesiumklorid-løsningen dekanteres, 5. Et volum på 0,05 m magnesiumklorid tilsettes for å gi en slutt-enzymkonsentrasjon på 400 enheter/ml, 6. Isomerase-enzymkonsentratet tilsettes til bæreren i en mengde av 0,5 million enheter/dm , 7. Bæreren og enzymet bringes i kontakt i 22-24 timer, og så vaskes ubundet enzym fra bæreren med destillert vann.

En glasskolonne med kjølekappe (3 cm x 18 cm) utstyrt med en pumpe forbundet med et matetilførselsforråd påføres så

det således preparerte immobiliserte enzym. Sjiktvolumet i kolonnen etter påføringen er 45 ml. Kolonnen opereres ved 60°C for alle isomeriseringer. Den fylte kolonnen startes med en dekstrosesirup (50 % vekt/vektkonsentrasjon) med 5 millimol magnesiumklorid og justeres til pH 8,4 for å påvise at kolonnen er aktiv. Kolonnens strømningshastighet justeres til 292 ml/time. Kolonnen tømmes så til sjiktnivået. Innføring av det sekundære substrat utføres manuelt inntil 20 ml utstrømmende væske er opp-

samlet, og så justeres strømningshastigheten for det sekundære substrat til 292 ml/time. De første 100 ml sirup som oppsamles kastes for å muliggjøre forandring av substrat. Det gjenværende sekundære substrat (ca. 850 ml) kjøres så gjennom kolonnen, Etter én times forløp øker strømningshastigheten til 570 ml/time. Strømningshastigheten justeres og holdes ved 300 ml/time, til slutten av forsøket. Etter at det sekundære substrat er ferdig kjørt, forandres kolonnen tilbake til dekstrose for å påvise at isomerase-aktivitet fortsatt foreligger. Følgende tabell sammenT likner høytrykks-væskekromatografi-analysene for det startende sekundære substrat og sluttproduktet fra isomeriseringskolonnen:

Disse resultater indikerer at 42,38 % av den frie dekstrose i det sekundære substrat er isomerisert til fruktose i kolonnen. De fruktosepolymerer som foreligger i det sekundære substrat synes heller ikke å være påvirket av eller påvirke isomeriseringen av dekstrose til fruktose. Det skal bemerkes at den totale monosakkaridfordeling består av ca. 45 % fruktose og 55 % dekstrose.

I følgende eksempel anvendes to metoder for spaltning av de polysakkarider som foreligger i det sekundære substrat og også isameriseringsproduktet derfra. -Én metode er enzymatisk, og den annen anvender mild syrehydrolyse.

Eksempel 7

Fremstilling av sirup med høyt fruktoseinnhold ved hydrolyse

A. Enzymatisk hydrolyse

100 ml av produkt B fra eksempel 6 tilsettes 10 mg renset invertase oppnådd fra Candida utilis. Denne blanding (konservert med toluen) får reagere natten over ved omgivelsestemperatur, hvoretter en prøve uttas og analyseres med høytrykks „væske-kromatografi. Det gjenværende produkt B får fortsette å reagere i ytterligere 6 dager, og så undersøkes en annen prøve ved samme fremgangsmåte og med følgende resultater:

Den anvendte invertase er et enzympreparat fremstilt

av Siekagaku Kogyo Co., Ltd., Tokyo, Japan, med en aktivitet på 123 enh/mg hvor en enhet invertase katalyserer spaltning av sukrose for dannelse av 1 mikromol glukose og 1 mikromol fruktose pr. minutt under spesifiserte betingelser.

B. Syrehydrolyse av produkt B

Syrehydrolyse av en prøve fra produkt B fra eksempel 6 b!< utført ved tilsetning av svovelsyre til en konsentrasjon av 0,05 n

>og oppvarmning til 75-80°C. Prøver uttas etter én og to timers hydrolyse og analyseres med høytrykks-væskekromatografi. Resultatene er som følger:

De ovenstående resultater i trinn A viser at-en dominerende økning av fruktose- og en mindre økning av glukose-utbytte opptrådte med en tilsvarende nedgang i DI>2~' DP3~ 0<3 DP^+-fraksjonene, hvilket angir nærvær av en fruktosepolymer.

Resultatene fra syrehydrolysen i trinn B stemmer overens med dem som ble oppnådd i trinn A, hvilket også angir spaltning av fruktosepolymerer.

Den foranstående diskusjon er rettet mot transfruktosylering ved bruk av et primært substrat hvor tørrsubstansinnholdet av startsukrose ikke overstiger metningspunktet under gitte reaksjonsbetingelser. Følgende eksempel viser bruk av et primært substrat med en start-sukrosekonsentrasjon over metning og som, når den underkastes virkningen av fruktosyl-transferase-enzymet, resulterer i et produkt som inneholder økede mengder DP^-materiale (dvs. fruktosyl-sukrose) og en nedsatt konsentrasjon av DP^+-produkter. Det vises også en økning av tørrsubstans-konsentra-sjonen (vekt/vekt) av det sekundære substrat sammenliknet med tørrstoffkonsentrasjonen som oppnås i fravær av innvirkning av fruktosyl-transferase-enzymet. Videre vises det at når tørrstoff-konsentrasjonen i det primære substrat øker, avtar polymerisasjons-graden for fruktosepolymeren i det sekundære substrat, og DP4+_ materialet foreligger i mindre mengder.

Dette er merkbart i kontrast til de resultater som oppnåddes i de tidligere eksempler hvor det ble brukt sukrosekonsentrasjoner som var mindre enn metningskonsentrasjonen. I

de tidligere eks mpler er DP4+-materialet hovedproduktet.

Eksempel 8

Fremstilling av sekundært substrat fra sukroseoppslemminger med sukrose over metningskonsentrasjonen

Sukrose av næringsmiddelkvalitet plasseres som 200 g alikvoter i 0,473 dm 3krukker med skru-lokk. Som kontroll tilsettes 50 ml vann til en krukke, og hver av de andre mottar 50

ml vann inneholdende økende mengder fruktosyl-transferase-enzym-"Celite"-preparat (fremstilt ifølge eksempel 1), som vist i følgende tabell. Hver krukke lukkes og plasseres i et ryste-vannbad ved 54-55°C. Krukkene rystes i 24 timer med manuell blanding av og til. En prøve av overstående væske uttas fra hver kolbe og plasseres i et reagensrør med skrukork i et kokende vannbad for å inaktivere enzymet. Disse prøver analyseres så med høytrykks-væskekromatografi og overstående tørrstoffbestemmelser utføres (K. Fischers metode) med følgende resultater:

Det skal bemerkes at kontrollen i ovenstående eksempel krystalliserte når den ble avkjølt til omgivelsestemperatur (ca. 25°C), mens de enzymatisk fremstilte sekundære substrater forble i løsning og oppviste utmerket stabilitet uten krystallisasjon.

Selv om det i eksempel 8 anvendes 200 g sukrose pr.

50 ml vann, dvs. 80 % vekt/vekt, kan tørrstoffkonsentrasjonen i sukrose-startmaterialet økes.

Det nye sekundære substrat fra denne utførelsesform kan anvendes som en meget stabil, ikke-krystalliserende sirup for næringsmiddelformål. Det skaffer også et enestående preparat med høyt tørrsubstansinnhold, motstandskraftig mot mikrobiell forurensning og farvestoffdannelse, som kan anvendes for skip-ning og/eller lagring av sukker i konsentrasjoner som hittil ikke er oppnådd i en form som har de ovenfor beskrevne egenskaper. Videre kan det nye sekundære substrat med høyt tørrstoffinnhold underkastes hydrolyse som vist i eksempel' 7 slik at det oppnås en invertsukkerblanding med ønskelig søthetsnivå. Det nye sekundære substrat ifølge denne utførelsesform har et tørrstoff-innhold (vekt/vekt) i området fra ca. 70 til ca. 82 % og inneholder en monosakkaridfraksjon bestående i hovedsak av dekstrose og polysakkaridpolymerer, i overskudd over DP2, bestående i hovedsak av DPg-produkt. En mindre mengde (4,1 % og lavere) av DP^+-polymerer er også til stede.

Selv om transfruktosyleringstrinnet i foreliggende oppfinnelse er vist i form av satsvise operasjoner, vil det være selvsagt for fagmannen at en kontinuerlig fremgangsmåte likeledes kan anvendes. Ved utførelse av en slik kontinuerlig transfruktosylering immobiliseres transfruktosylase-enzymet hensiktsmessig ved bruk av de teknikker som er.diskutert foran under defini-sjonen av immobiliserte enzymer og den kontinuerlige metode som er beskrevet der.

Claims (6)

1. Fremgangsmåte for fremstilling av et fruktoseholdig produkt ved å utsette sukrose for innvirkning av et fruktosyl-transferase-enzym som omdanner sukrose til et polysakkarid som inneholder fruktosylandeler forbundet ved (2-1)-B-bindinger, karakterisert ved å utsette sukrose for innvirkning av et enzympreparat som i alt vesentlig består av fruktosyl-transferase-enzym slik at sukrosen omdannes til et produkt som omfatter dekstrose, fruktose og polysakkarider som inneholder minst 6 6 vekt% fruktosylandeler hvor fruktosylande-lene er forbundet ved (2-*l) -B-bindinger, å isomerisere nevnte dekstrose til fruktose ved innvirkning av isomerase-enzym i nærvær av de nevnte polysakkarider, og hydrolysere de nevnte polysakkarider i fravær av aktivt isomerase-enzym.

2. Fremgangsmåte som angitt i krav 1, karakterisert ved at sukrosen utsettes for innvirkning av enzymet ved en start-konsentrasjon på minst 20 vekt/volum%.

3. Fremgangsmåte som angitt i krav 1, karakterisert ved at sukrosen utsettes for innvirkning av fruktosyl-transferase-enzym ved en temperatur på 25-65°C, en pH-verdi på fra 4,5 til 6,5 og en start-sukrosekonsentrasjon på minst 10 vekt/volum%.

4. Fremgangsmåte som angitt i krav 1, karakterisert ved at isomeriseringen utføres under anvendelse av et immobilisert glukose-isomerase-enzym.

5. Fremgangsmåte som angitt i hvilket som helst av kra-vene 1 til 4, karakterisert ved at polysakkaridet separeres fysisk fra dekstrosen.

6. Fremgangsmåte som angitt i krav 5, karakterisert ved at polysakkaridet hydrolyseres etter fysisk separering fra dekstrosen.