DE2826111A1

DE2826111A1 - Verfahren zur herstellung eines hochfructosehaltigen sirups aus saccharose

Info

Publication number: DE2826111A1
Application number: DE19782826111
Authority: DE
Inventors: Robert E Heady
Original assignee: Unilever Bestfoods North America
Current assignee: Unilever Bestfoods North America
Priority date: 1977-06-16
Filing date: 1978-06-14
Publication date: 1978-12-21
Also published as: FR2394253A1; SE439928B; PT68167A; CA1117047A; RO78764B; PL121700B1; NO782083L; RO78764A; JPS548737A; ATA435878A; YU142478A; IL54857A0; FI64642B; OA05986A; NO145641B; FI781911A; SU1230469A3; ES470766A1; IT7824618A0; BR7803835A

Description

MÜXLER-BORE · DBFIii L · SCIIÖJi ·

DR. WOLFGANG (PATENTANWALTVON 1927-t97S) DR. PAUL DEUFEL, DIPL.-CHEM. DR. ALFRED SCHÖN. DIPL.-CHEM. WERNER HERTEL. DIPL.-PHYS.

C 3037

CPC INTERNATIONAL INC., International Plaza, ' Englewood Cliffs, New Jersey O7632 / USA

Verfahren zur Herstellung eines hochfructosehaltigen Sirups aus Saccharose

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8 MÖNCHEN 8β · SIJBBEKTSTR. 4 · POSTFACH 860720 · KABEL: 3IUEBOPAT ' TEL·. (089) 47400S · TELEX 0-24283

Die Erfindung betrifft allgemein die enzymatisch« Transfructosylierung von Saccharose. Insbesondere bezieht sich die Erfindung auf ein neuartiges Verfahren zur Herstellung von Fructose aus Saccharose mittels eines ein Fructosepolymer bzw. —polysaccha— rid enthaltenden Substrats. Dieses Verfahren eröffnet einen neuen enzymatischen Weg für die Herstellung von hoch—fructose— haltigen Sirupen mit einem Fructosegehalt, der signifikant höher als derjenige ist, den man derzeit durch Glucoseiso— merisierung von Stärkehydrolysaten erzielen kann, ohne daß dabei das erhaltene Fructoseendprodukt stofflich aufgetrennt zu werden braucht. Das Verfahren läßt sich insbesondere zur Herstellung von fructosehaltigen Sirupen benutzen, die über 55 fo und mehr Fructose enthalten. Die Erfindung stellt außerdem ein neues Transfructοsylaseenzym aus K_ulturen der Hefe Pullularia pullulans zur Verfügung, das, wie gefunden wurde, sich in vorteilhafter Weise bei der Herstellung derartiger Sirupe verwenden läßt.

Die Erfindung schafft eine Reihe von Produkten bzw. stellt eine Reihe von Produkten zur Verfügung, und zwar unter anderem sowohl Fructose oder einen hoch-fructosehaltigen Sirup als Endprodukt, als auch verschiedene Zwischenprodukte, wie das Fructosepolymer, ursprüngliches, Fructosepolymer (bzw. -poly—

. Substrat , .

saccharid) enthaltendes Substrat,/aus dem das(Fructose—)

Polymer abgetrennt wurde, und (mit oder ohne das Polymer) isomerisiertes Substrat. Jedes dieser Produkte ist direkt und für sich mit Vorteil gewerblich verwertbar.

Jedes dieser Produkte weist die Eigenschaften herkömmlicher Zucker und Sirupe auf und kann für deren übliche Anwendungszwecke eingesetzt werden. Derartige herkömmliche Anwendungszwecke sind u.a. beispielsweise die Verwendung als Süßungsmittel für Nahrungsmittel und als Rohstoffe für die Herstellung von Pharmazeutika. Außerdem können diese Produkte der Erfindung auf den für Zucker und Sirupe üblichen industriellen Anwendungsgebieten eingesetzt werden. So kann man sie

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beispielsweise bei der Herstellung von Klebstoffen, Feuchthaltemitteln, Pergaminpapier, Gerbmitteln, elektrischen Isolatoren, Gießereikernbindemitteln, Insektiziden, Farbstoffen und dergl. oder, allgemeiner als ¥eichmacher, Verdickungsmittel usw. einsetzen. Kurz gesagt, sind diese Produkte auf dem ganzen breiten Spektrum von Anwendungsgebieten wertsoll, auf dem analoge Produkte bereits Anwendung gefunden haben.

Definitionen

¥egen der zahlreichen und meist nicht einheitlich und exakt definierten Fachausdrücke, die auf dem Gebiet der Sohleniiydratchemie und Zuckertechnologie im allgemeinen Gebrauch stehen, werden nachstehend folgende Definitionen gegeben, die den Bedeutungsinhalt klar festlegen sollen, der diesen Ausdrücken in der vorliegenden Beschreibung und den Ansprüchen zukommen soll;

Glucose und Dextrose

Die Ausdrücke "Glucose¹¹ und "Dextrose" werden in der Beschreibung und den Ansprüchen als austauschbare Synonyme gebraucht und sollen jeweils dieses Monosaccharid in jeder beliebigen Form, gelöst oder trocken, bezeichnen.

Saccharose

Die Bezeichnung "Saccharose" bezieht sich auf das fragliche Disaccharid in raffinierter oder roher Form, in Lösung oder trocken und unabhängig davon, aus welcher Saccharose-Rohmaterialquelle,z.B. Zuckerrohr oder Zuckerrüben, es stammt. In der praktischen Ausführung der Erfindung wird die als Ausgangsmaterial verwendete Saccharose typischerweise in Form einer Dispersion in einem wäßrigen Medium eingesetzt.

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Fructose und Lävulose

Die Angaben "Fructose" und "Lävulose" werden vom Fachmann in der Regel als austauschbare Synonyme wahlweise zur Bezeichnung des Isomeren der Dextrose benutzt, das süßer als Dextrose ist. Fructose kommt im Honig und in Invertzucker, zusammen mit Dextrose, vor und ist wegen ihrer Süßkraft wertvoll. Die Ausdrücke "Lävulose" und "Fructose" werden in der Beschreibung und den Ansprüchen wahlweise als austauschbare Synonyme zur Bezeichnung des fraglichen Monosaccharide in jeder beliebigen Form, in Lösung oder trocken, benutzt.

Enzympräparat

Der Ausdruck "Enzympräparat" wird in der Beschreibung und den Ansprüchen zur Bezeichnung jedes beliebigen Stoffes bzw. Produkts benutzt, das die jeweils gewünschte enzymatische Aktivität aufweist. Beispielsweise wird dieser Ausdruck zur Bezeichnung von lebenden ganzen Zellen, trockenen Zellen, Zellextrakten und gereinigten und konzentrierten Präparaten aus den Zellen und Kulturflüssigkeiten benutzt. Die Enzympräparate können für die Zwecke der Erfindung entweder als Lösung oder ir» immobilisierter Form verwendet werden.

Isomeraseenzym

Jedes beliebige Enzympräparat, das Dextrose zu Lävulose isomerisiert, wird in der Beschreibung und den Ansprüchen als "Isomeraseenzym" bezeichnet. Diese Enzyme sind dem Fachmann wohlbekannt und wurden als Dextroseisomerase, Xyloseisomerase und Glucoseisomerase bezeichnet. Solche Enzyme können aus einer Vielzahl verschiedener geeigneter Mikroorganismen gewonnen werden. Beispiele derartiger Mikroorganismen sind u.a. die Gattungen Stigptomyces, Bacillus, Arthrobacter, Actinoplanes, Curtobacterium und andere.

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Ein bevorzugtes, für die Zwecke der Erfindung verwendbares Isomeraseenzym erhält man aus Stasptomyces olivochromogenea ATCC Nr. 21 713, ATCC Nr. 21 714 oder ATCC Nr. 21 715 (beim letztgenannten Stamm handelt es sich um ein "Einzelkolonieisolat" aus dem Stamm ATCC Nr. 21 713), wie beispielsweise in der US-PS 3 813 318 und der US-PS 3 957 587, wobei nach dem aus den US-Patenten 3 770 589 oder 3 813 bekannten Verfahren hergestellte Isomeraseenzyme besonders zweckmäßig und bevorzugt sind.

Seit kurzer Zeit haben auf dem Fachgebiet Verfahren Beachtung gefunden, bei denen das Isomeraseenzym auf bzw. an einem wasserunlöslichen inerten Träger immobilisiert wird. Das immobilisierte Enzym kann dann in kontinuierlichen Verfahren zur Umwandlung von Glucose in hoch-fructosehaltige Sirupe Verwendung finden. Beispiele derartiger Verfahren sind in den US-Patentschriften 3 708 397, 3 788 9^5, 3 85O 751, 3 868 und der belgischen Patentschrift 819 859 sowie der US-PS 3 960 663 (entsprechend dem. belgischen Patent Nr'. 810 480) beschrieben.

Isomeraseeinheit

Die "Isomeraseeinheit" ist als diejenige (Menge) Enzymaktivität definiert, die erforderlich ist, um unter den nachfolgend unter der Überschrift "Bestimmung der Isomeraseaktivität" beschriebenen Isomerisierungsbedingungen ein Mikromol Lävulose pro Minute zu erzeugen.

Bestimmung der Isomeraseaktivität

Diese Angabe bezeichnet in der Beschreibung ein Testverfahren, bei dem die aus einer Glueoselösung unter standardisierten Bedingungen erzeugte Ketose spektrophotometrisch bestimmt wird.

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Zunächst wird eine Stammlösung nach folgender Rezeptur hergestellt:

Stammlösung Komponente Menge

0,1 m MgSO₂^TH₂O (Lösung) 1 ml

0,001 m CoC1₂*6H₂0 (Lösung) 1 ml

1 m Natriumphosphatpufferlösung (pH 7»5) 0,5 ml
Wasserfreie D-Glucose 1,hk g

Mit destilliertem ¥asser auf 7,5 ml ergänze.

Das zu prüfende Enzympräparat wird zunächst so verdünnt, daß
es pro ml 1 bis 6 Isomeraseeinheiten enthält.

Dann wird eine enzymatische Isomerisierung durchgeführt, indem man 3 ml der Stammlösung mit 1 ml des Enzympräparats versetzt und das Gemisch 30 Minuten bei 60 C bebrütet. Am Ende der Inkubationszeit wird eine 1 ml-Probe entnommen und durch Eingabe in 9 ml 0,5 η Perchlorsäure "abgeschreckt" bzw.—gestoppt,
Die gestoppte Probe wird dann auf ein Gesamtvolumen von 250 ml verdünnt. Als Kontrolle wird zu Vergleichszwecken eine "Glucose—Blind probe" bzw. ein Blindversuch auf analoge Weise durchgeführt, wobei jedoch am Beginn der Inkubationszeit statt 1 ml Enzympräparat-Lösung 1 ml Wasser zugesetzt wird.

Der Ketosegehalt der Probe wird dann nach einer Cystein-Schwe— feisäure-Methode bestimmt. Für die Zwecke dieser Bestimmung
ist eine Isomeraseeinheit als diejenige Enzymaktivitätsmenge
definiert, die erforderlich ist, um unter den angegebenen Iso— merisierungsbedingungen pro Minute ein Mikromol Lävuloae zu
erzeugen.

Transfructosylierung
Dieser Ausdruck wird in der Beschreibung und den Ansprüchen

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zur Bezeichnung einer Reaktion benutzt, bei der eine Fructosyl— gruppe bzw. -einheit von einem Donor, z.B. Saccharose, auf einen Akzeptor, z.B. ein Polysaccharid, übertragen wird.

Fructosyl tr ansf erase-Enzyia

Dieser Ausdruck wird in der Beschreibung und den Ansprüchen zur Bezeichnung jedes Enzyms benutzt, das die Transfructosylierung katalysiert und umfaßt u.a. auch das aus PulIuIaria pullulans ATCC 93^8 (Synonym mit Aureobasidium pullulan^) gevonnene Enzympräparat.

Fructosyltransferaseeinheit

In der Beschreibung und den Ansprüchen ist die Angabe "Fructosyltransferaseeinheit" so definiert, daß eine Fructosyltransferaseeinheit die Enzymaktivitätsmenge darstellt, die erforderlich ist, um unter folgenden Bedingungen pro Minute ein Mikromol reduzierende Zucker, berechnet als Glucose, zu erzeugen:

a) pH 5,5;

b) Temperatur 55 C
und

c) Substratkonzentration 60 g Saccharose mit Lebensmittelqualität bzw. —reinheit pro 100 ml wäßriges Reaktionsgemisch.

Die
/Bestimmung der reduzierenden Zucker (berechnet als Glucose) wird unter Verwendung eines "Technicon Autoanalyzer II" (Technicon, Inc., Tarrytown, New York) durchgeführt. Die Analysendurchführung erfolgt nach einer herkömmlichen Alkaliferricyanidmethode (vgl. Analytical Biochemistry k5, Nr. 2, Seiten 517 bis 524 (197²))> die der Verwendung des "Autoanalyzer II" angepaßt ist. Soweit nichts anderes angegeben ist, werden die Enzymaktivitätsbestimmungen durch kontinuierliche Überwachung eines wie folgt zusammengesetzten Reaktionsgemisches durchgeführt;

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- 1O--

7,5 n»l einer 80^±gen (Gew./Vol.) wäßrigen Lösung von Saccharose mit Lebensmittelreinheit}

2,3 ml einer 0,1 m Citratpufferlösung mit pH 5,5;

0,2 ml Enzymprobe, die Fructosyltransferaseenzym in einer Menge enthält, die pro Minute und ml Reaktionsgemisch 5 bis 25 Mikrogramm reduzierenden Zucker (berechnet als Glucose) erzeugt.

Primär—Substrat

Der Ausdruck "Primär-Substrat" wird in der Beschreibung und den Ansprüchen all derjenigen Saccharide benutzt, die, wie beispielsweise wäßrige Saccharoselösungen, in einer Form, in der sie für eine Transfructosylierung geeignet sind, vorliegen und eine für die Teilnahme an einer Transfructosylierung verfügbare Fructosylgruppe enthalten.

Sekundär-Substrat

Der Ausdruck 'Sekundär—Substrat" wird in der Beschreibung und den Ansprüchen zur Bezeichnung des Reaktionsprodukts benutzt, das man erhält, wenn man (entsprechend den vorstehei^an Definitionen) das Priraär-Substrat der Einwirkung eines Fructosyltransferase—Enzympräparats unterwirft.

Teile und Prozentsätze

Soweit nicht ausdrücklich im Einzelfall etwas anderes angegeben ist, beziehen sich in der Beschreibung und den Ansprüchen Angaben in Teilen stets auf das Gewicht und Prozentsätze stets auf Gewicht pro Volumen (Gew./Vol, bzw. w/v).

Hochdruck-Flüssigkeitschromatographie (Analyse)

Dieser Ausdruck bezeichnet in der Beschreibung und den Ansprüchen ein Verfahren, durch das die Sirupe der Erfindung mit Hilfe der

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4h

Hochdruck-Flüssigkeitschromatographie nach, folgender Methode analysiert werden:

Die Komponenten werden durch Eluieren mit Wasser aus einem Kationenaustauscherharz in der Calciumform Chromatograph!ert. Die eluierten Komponenten werden mittels eines Differenzial— refraktoraeters bestimmt* Nicht—Dextrosekohlenhydrate werden unter Verwendung eines elektronischen Integrators quantifiziert bzw. quantitativ bestimmt, während man die Dextrose bzw. den Dextrosegehalt durch Differenzrechnung erhält. Die allgemeine Arbeitsweise entspricht der in "Analysis of Carbohydrate Mixtures by Liquid Chromatography·¹, Am. Soc. Brew. Chem. Proc., 1973 j Seiten ^3 bis 46 beschriebenen. Als Harz wird "Aminex Q" 15-5 in der Calciumform (Produkt der Pa. Bio-Rad Laboratories, Richmond, California) verwendet.

Erfindungsgemäß wird ein Verfahren zur Herstellung von Sirupen zur Verfugung gestellt, bei dem ein primäres Substrat, z.B. Saccharose, der Einwirkung eines Fructosyltransferase-Enzympräparat s unterworfen wird, das dazu befähigt ist, die Saccharose in ein Produkt umzuwandeln, das im wesentlichen aus einer Monosaccharidfraktion, die eine größere Menge Glucose und eine geringere Menge Fructose enthält, und Polysacchariden besteht, die mindestens 66 Gew.— 96 Fructosylgruppen bzw. —einheit en enthalten.

Dieses Produkt stellt somit ein erfindungsgemäßes Sekundär-Substrat dar. Gegenstand der Erfindung ist daher insbesondere ein Verfahren zur Herstellung eines Sirups, das dadurch gekennzeichnet ist, daß man ein Fructosepolysaccharid(e) und Dextrose enthaltendes Reaktionsprodukt (Sekundär—Substrat) erzeugt, indem man auf ein Primär—Substrat, insbesondere Saccharose, eine wirksame Menge eines Fructosyltransferase— Enzympräparats einwirken läßt.

Die vorstehend erwähnten, die Sekundär-Substrate der Erfindung kennzeichnenden Fructosepolysaccharide umfassen alle Fructose

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enthaltenden Polymeren mit Ausnahme von Saccharose, die 2 oder mehr Monosaccharideinheiten enthalten. Diese Polymeren können weiterhin als Polysaccharide charakterisiert werden, die durch (2 -^1)-beta-Bindungen verknüpfte Fructosylgruppen enthalten. ¥ie nachfolgend beschrieben werden wird, können die unter bestimmten Transfructosylierungsbedingungen anfallenden Polysaccharide vorwiegend in einem vorherbestimmten Bereich liegen. So kann erfindungsgemäß ein Sekundär-Sübstrat hergestellt werden,in dem die meisten der darin enthaltenen Fructosepolysacchar.ide, z.B. mindestens 60 Mol-ji, Oligomere mit 2 bis 10.(d.h. "DP 2-10"), und, üblicher, 3 bis 6 (d.h. "DP 3-6") Monosaccharideinheiten sind.

Nach der Transfructasylierung wird vorzugsweise die dabei gebildete Glucose durch Einwirkung von Isomerasenzym zu Fructose in Gegenwart der Fructosepolysaccharide isomerisiert, die, gemäß einer besonders bevorzugten Ausführungsform der Erfindung, nachfolgend in Abwesenheit von aktivem Isomeraseenzym hydrolysiert werden. Die Hydrolyse der Fructosepolysaccharide kann enzymatisch unter Verwendung von Invertase oder durch Säurehydrolyse unter milden Bedingungen durchgeführt werden.

Gemäß einer weiteren Ausführungsform der Erfindung 10t vorgesehen, die Fructosepolysaccharide von der Glucose und der Fructose abzutrennen und danach, wie weiter oben beschrieben, zu hydrolysieren, wobei man aus dem Sekundär-Sübstrat der Erfindung direkt einen extrem fructosereichen Sirup, z.B. einen Sirup mit einem Fructosegehalt von mehr als 66 und vorzugsweise mehr als 90 Gew.-^ erhält, ohne die in dem Sekundär-Sübstrat enthaltene Dextrose isomerisieren zu müssen» Die fragliche Abtrennung kann unschwer nach herkömmlichen Stofftrennmethoden durchgeführt werden, die auf Unterschieden in der Molekulargröße beruhen, wie beispielsweise herkömmliche Membrantrennverfahren, z.B. Ultrafiltration und Dialyse, Lösungsmittelfällung, Aktivkohleabsorption und dergl,. Beispiele derartiger, für die Zwecke der Erfindung geeigneter Membrantrennverfahren sind in den US-Patentschriften 3 173 867, Re 26 097,

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006 und 3 691 Ο68 beschrieben.

Eine bevorzugte Ausführungsform der Erfindung stellt ein Verfahren zur Herstellung hoch-fructosehaltiger Sirupe dar, bei dem man Saccharose der Einwirkung eines Fructosyltransferase-Enzympräparats, wie beispielsweise einem aus Pullularia pullulans, insbesondere dem Stamm ATCC 9348, ATCC 12 535, NRRL I673, NRRL Y2311, NRLL YB3892, NRRL YB3861, NRRL 3937 und ATCC 15223, dieser Mikroorganisrnenart gewonnenen Enzyrnpräparat,mterwirft:. Das dabei erhaltene Produkt bzw. Sekundär-Substrat wird vorzugsweise der Einwirkung eines Isomeraseenzyras unterworfen. Danach wird das isomerisierte Produkt in Abwesenheit von aktivem Isomerase— enzym hydrolysiert.

Es wird angenommen, daß das nach dem Verfahren der Erfindung erzeugte Sekundär-Substrat ein neues Produkt ist. Dieses Sekundär-Substrat eignet sich in hervorragender ¥eise zur Isomerisierung und nachfolgenden Hydrolyse, um dadurch einen Sirup zu erzeugen, der mehr als 55 ^c/> Fructose enthält, und wird hergestellt, indem man Saccharose der Einwirkung eines Fructosysltransferase-Enzympräparats unterwirft. Eine weitere Ausführungsform bzw. ein weiterer Gegenstand der Erfindung sind daher für die enzymatisch^ Isomerisierung und nachfolgende Hydrolyse zu Sirupen mit einem Fructosegehalt von mehr als 55 °/° geeignete Substrate, die etwa

1) 20 bis 60 Gew. -fo Monosaccharide, wobei das Mono sac char idge—

misch einen größeren Anteil an Glucose und einen kleineren

Anteil an Fructose enthält)

und

2) etwa 70 bis kO °fo mehr als 66 Gew.-$ Fruc t ο sy I gruppen bzw. -einheiten enthaltende Polysaccharide .

enthalten.

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Besonders bevorzugt sind Sekundär—Substrate, die aus Saccharose durch Tr ans fr uc to sy Ii er en in Gegenwart einer wirksamen Menge eines vom Mikroorganismenstamm Pullularia pullulans ATCC 93*t8 stammenden Fructosyltransferase-Enzympräparats, bei einer Temperatur im Bereich von etwa 25 bis 65⁰C und vorzugsweise etwa 50 bis 60 C und bei einem pH im Bereich von etwa 4,5 bis 6,5 und vorzugsweise etwa 5*** bis 516 gewonnen werden. Die dabei angewandten Saccharoseanfangskonzentrationen können zwar relativ niedrig liegen und beispielsweise nur etwa 10 g/1 00 ml Wasser betragen, jedoch, wendet man vorzugsweise eine möglichst hohe Trockensubstanzkonzentration an, und zwar insbesondere eine Konzentration in einem Bereich von etwa 30 bis 60 g/100 ml, um eine maximale Reaktionsgeschwindigkeit zu erzielen, bis hinauf zum Sättigungspunkt der Saccharose (und gegebenenfalls sogar noch höher, wie weiter unten noch eingehend beschrieben werden wird). Zur Erzeugung der neuen Sekundär-Substrate der Erfindung kann man die Fructosyltransferase in einer Mindest— menge von 0,5 Einheiten/g Saccharose anwenden. Aus wirtschaftlichen Überlegungen wird die angewandte Enzymmenge 50 Einheiten/g Saccharose nicht übersteigen. Um das gewünschte Sekun— där-Substrat in einer wirtschaftlich akzeptablen Zeit und unter Einhaltung der vorstehend beschriebenen Verfahrenspara— meter zu erhalten, ist es besonders bevorzugt, das Cazym in einer in einem Bereich von etwa 2 bis 30 Einheiten/g Saccharose liegenden Menge anzuwenden.

Nachfolgend werden die vorstehenden und weitere Ausführungsformen der Erfindung eingehender beschrieben.

Beim Verfahren zur Herstellung der neuen Fructosyltransferase der Erfindung kann man herkömmliche Fermentationsmethoden anwenden, vgl. z.B. die US-Patente 3 565 756, 3 8O6 4i9.und 3 535 123, sowie S. Ueda und Mitarb., Applied Microbiology, I1, Seiten 211 bis 215 (1903)· Vorzugsweise wendet man dabei bestimmte neue Trenn— und Reinigungsmethoden an, die nachfolgend im einzelnen beschrieben werden. Das nachstehende Beispiel gibt ein typisches Fermentationsverfahren zur Erzeugung des Enzyms

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Al,

aus Pullularia pulIuIans ATCC 9348 wieder.

Beispiel 1

Herstellung von Fructosyltransferase-Enzympräparat (Celite-Träger

A. Zur Erzeugung des Enzyms angewandtes Fermentationsverfahren

Zur Impfkulturentwicklung und für die Fermentation zur Produktion des Enzyms wird ein wie folgt zusammengesetztes Medium verwendet:

0,5 /£ Dibasisch.es Kaliumphosphat j 0,1 ^c/o Natriumchlorid; 0,02 io Magnesiumsulfatheptahydrat; 0,06 $> Diammoniumsulfatj 0,3 io Hefeextrakt (Difco Laboratories) J 7,5 fo Saccharose (Lebensmittelqualität); pH des Mediums eingestellt auf 6,8.

Die Saat— bzw. Impfkulturkolben, 500 ml fassende Erlenmeyer— Kolben, die jeweils 100 ml steriles Medium enthalten, werden mit einer Elattenkultur der sogenannten"schwarzen Hefe", Pullularia pullulans, beimpft. Der hierzu verwendete Hefestamm ist im Katalog der American Type Culture Collection (Rockville, Maryland) als ATCC 9348 bezeichnet. Der Inhalt der Saatkulturkolben wird nach 48-stündiger Entwicklung bei 32°C auf einem Rütteltisch zum Beimpfen von jeweils 1 Ltr. fassenden Erlenmeyer-Fermentationskolben benutzt, in denen jeweils 200 ml des vorstehend definierten Mediums vorgelegt sind. Die angewendete Impfkulturkonzentration beträgt 0,5 $ (^w/^v)· ^D^^e Fermentation

wird auf einem Rütteltisch 7 Tage bei 32°C durchgeführt.

B. Gewinnung des Enzyms aus der Kulturbrühe

Die Kulturbrühen aus 40 1-Ltr.-Schüttelkolben werden vereinigt, worauf die Kolben mit Wasser gespült werden, das ebenfalls den

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vereinigten Kulturbrühen zugeschlagen wird. Das Endvolumen der Kulturbrühen nach Verdünnung beträgt 12 Ltr. Das ursprüngliche Gesamtvolumen der Kulturbrühe beträgt etwa 8 Ltr. Zur Abtrennung der Hefezellen, sowie von Zellbruchstücken läßt man die 12 Ltr. Kulturbrühe durch eine kontinuierliche Zentrifuge der Fa. Sharpiess laufen. Der Überstand, eine schwarze, viskose Lösung, wird dann mit Calciumchlorid bis zu einer Konzentration von 0,5 ^r/o (w/v) versetzt, worauf man den pH—Wert der dabei erhaltenen Lösung mit Natriumhydroxyd auf 7»0 einstellt. Dann läßt man das Gemisch ein zweites Mal durch die Zentrifuge, laufen, wobei man einen viskosen Überstand erhält, der nur wenig gefärbt ist. Der pH—Wert des entfärbten Über— stands wird mit Salzsäure auf 5,5 eingestellt, worauf man 1000 Einheiten (entsprechend der Definition im US-Patent 3 806 419) Pullulanase zudosiert. Die dabei erhaltene Brühe wird mit Toluol konserviert, das bis zur Sättigung zugesetzt wird, worauf man die Pullulanase bei Umgebungstemperatur über Nacht reagieren läßt. Nach dem Abbau mit Pullulanase (über Nacht) wird Grefco Nr. 503 Celite (Produkt der Johns-Manville Products Corporation, Lompoc, California) in einer einer Konzentration von 1 ^c/o entsprechenden Menge in der Brühe auf ge schlämmt, worauf man 2 Volumina (24 Ltr.) Aceton zusetzt. Es bildet sich ein Niederschlag, der abfiltriert wird, worauf man den filterkuchen mit Aceton wäscht und bei Raumtemperatur trocknet. Der gesammelte Filterkuchen enthält das unlöslich gemachte bzw. immobilisierte Fructosyltransferase-Enzym.

Zu Beispiel 1 ist darauf hinzuweisen, daß das Versetzen der Kulturbrühe mit Calciumchlorid und die Einstellung des pH-Werts der Brühe zu einer Entfernung der schwarzen Pigmentstoffe und der vorhandenen sauren Polysaccharide führt, (zur Erörterung bzw. Erläuterung dieser sauren Polysaccharide vgl. Acta. Chem. Scand. JIO₁, Seiten 615 - 622 (1962)). Dadurch erreicht man, daß das fertige Enzymprodukt in Form eines verhältnismäßig reinen, farblosen Präparats anfällt. Diese Reinigungsmethode stellt eine bevorzugte Ausführungsform der Erfindung dar und ermöglicht

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es, das Endprodukt mittels einfacher Reinigungsoperationen, d.h. Zentrifugieren, Filtrieren oder Ausfällung, zu erhalten. Gemäß dieser Ausführungsform wird erfindungsgemäß somit ein Verfahren zur Abtrennung saurer Polysaccharide und schwarzer Pigment-Nebenprodukte von den Endfermentationsbrühen der schwarzen Hefe, Pullularia pullulans , zur Verfügung gestellt. Dieses Verfahren macht das fertige Enzympräparat frei von unerwünschten Pigment- und sauren Polysaccharid-Nebenprodukten, die sich während des Fermentationsverfahrens bilden. Diese Nebenprodukte fallen, wenn sie nicht entfernt werden, beim Versetzen der Kulturbrühe mit Lösungsmittel zusammen mit dem Enzym aus. Als weitere Reinigung empfiehlt es sich, zur Gewinnung erfindungsgemäßer, gereinigter Enzympräparate das in der Kulturbrühe unvermeidlich bzw. zwangsläufig vorhandene Pullulanpolysaccharid abzutrennen, weil es nach dem Versetzen der Kulturbrühe mit Lösungsmittel ebenfalls zusammen mit dem Fructosyltransferase-Enzyra ausfallen würde. Hierzu kann und soll daher der bei der Behandlung mit Calciumchlorid und pH—Einstellung erhaltene Überstand mit dem an sich bekannten hydrolysierenden Enzym Pullulanase weiterbehandelt werden, Pullulanase-Enzym hydrolysiert das Pullulan wahllos, wobei ein Polymer mit niedrigerem Molekulargewicht entsteht, so daß dadurch die Mitfällung und die sich daraus ergebende Verunreinigung des Fructosyltransferase-Enzympräparats während der Lösungsmittelbehandlung, z.B. mit Aceton, Alkohol und dergl., vermieden wird. Diese Art der Reinigung des gewünschten Fructosyltransferase-Enzyms stellt eine weitere neue Ausführungsform der Erfindung dar.

Die erfindungsgemäßen Fructοsyltransferase-Enzympräparate können auch ohne Abtrennung des Pullulans angewendet werden. Die Erfindung kann somit auch ohne Hydrolyse des Pullulans durch Pullulanase durchgeführt werden, wobei das Pullulan dann als Träger für das Fructosyltransferase-Enzym dient.

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Das nachfolgende Beispiel erläutert die Verwendung von Pullulan als Träger.

Beispiel 2

Herstellung von Sekundär-Substrat unter Verwendung von Fructosyltransferase-Enzym auf Pullulan als Träger

Eine mit 0,05 m Citratpuffer auf pH 5,5 abgepufferte, 20#ige Saccharoselösung wird mit nach dem Verfahren von Beispiel 1, wobei jedoch abweichend davon das Pullulan nicht mit Pullulanase hydrolysiert und kein Celite verwendet wird, so daß das Pullulan als Träger dient, hergestelltem trockenem Pullulan in einer einer Konzentration von 1 $ trockenem Pullulan entsprechenden Menge versetzt. Die Fructosyltransferase-Äktivität beträgt 677 Einheiten/g Pullulan. Die Umsetzung wird bei Umgebungstemperatur durchgeführt, bis sich das Gemisch trübt. Eine Probe dieses Materials wird durch Hochdruck-Flüssigkeitschromatographie analysiert, wobei man folgende Ergebnisse erhält:

Saccharidverteilung« bestimmt durch HPLC-Analyse

Fructose Dextrose DP₀

6,9 40,6 6,2 11,1 35,2

Die nachfolgenden Beispiele charakterisieren und erläutern das nach Beispiel 1 hergestellte Enzym weiter.

Beispiel 3

Produkte der Einwirkung des Enzyms und thermische Stabilität des Enzyms

Mit Schraubkappenverschlüssen ausgerüstete Reaktionsflaschen bzw.-kolben werden jeweils mit 60 g Saccharose mit Nahrungs—

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mittelqualität und einem Fructosyltransferase—Enzympräparat beschickt. Das Enzympräparat wird aus dem Enzymprodukt von Beispiel 1 durch Dispergieren entsprechender Mengen dee festen Celite-Enzymprodukts in abgemessenen Wassermengen zur Erzeugung einer geeigneten Konzentration einer Enzymlösung gewonnen. Das Celite wird dann durch Filtrieren abgetrennt. Das Filtrat wird dazu verwendet, um Reaktionsgemische herzustellen, die pro g Saccharosesubstrat 10, 20 bzw. 30 Enzym— einheiten enthalten. Diese Mischungen werden dann jeweils mit Wasser auf ein Endvolumen von 100 ml verdünnt. Die Umsetzungen werden jeweils 66 Stunden bei pH 5»5 und einer Temperatur von 55 bzw. 60 C durchgeführt. Nach 24, 43 und 66 Stunden werden jeweils Proben entnommen, in denen der Gehalt an reduzierenden Zuckern bestimmt wird, um die enzymatisch^ Aktivität festzustellen. Nach der Durchführung der Bestimmungen des Gehalts an reduzierenden Zuckern in den Proben, wird der Rest des Reaktionsgemisches jeweils eingefroren, um die Enzym— einwirkung zu unterbrechen, worauf man Proben einer Bestimmung der Zusammensetzung der darin enthaltenen Kohlenhydrate durch Hochdruck—Flüssigkeitschromatographie unterwirft. Dabei erhält man folgende Ergebnisse:

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Bestimmung der reduzierenden Zucker

1)

X<3mp. Enzym— _p\ Reduzierende / C__7 einheit en ' Zucker /mg/mlj

Reduzierende
pH Zucker /mg/mlj

Reduzierende
pH Zucker ]_ ing/ml/

24 Stunden

Stunden

10 20 30

0 10 20 30

	5,80	—.	5,80	—
191	5,4ο	231	5,25	268
192	5,4ο	270	5,25	301
246	5,35	334	5,15	390
0,7	5,75	1,5	5,80	2,1
200	5,10	243	4,70	270
219	5,15	288	4,90	346
282	5,20	360	4,95	420

¹'Methode wie in der Definition des Begriffs "Fructosyltransferase-Einheit" angegeben.

2}
'Enzymeinheiten pro Gramm Saccharose.

Kohlenh-ydrat-Zusammensetzung,bestimmt durch. HPLC-Analyse Reaktionstemperatur 55 0

Enzymdosierung Reaktionszeit, Dextrose Lävulose DP_p DP„ DPik

(Einheiten/g Saccharose) (Stunden) (</o) (</i) / < ⁺

Zk 31,7 2,3 10,0 25,0 31,0

10 43 34,5 3,2 9,4 17,9 35,0

06 3JLiI li_9 8,6 15,0 35.8

24 33,9 2,8 8,8 19,7 34,8

co 20 43 37,4 4,2 7,9 12,1 38,4

co §J=> 40,5 4^ I₂Ji 10,8 36,4

5 24 37,4 4,0 7,1 12,5 39,0

^ 30 43 41,8 5,9 6,8 11,4 34,1

ο 66 4JLi 7,5 7,0 11,5 27,9

Reaktionstemperatur 60 C

24 32,2 2,8 6,1 24,3 30,6

10 43 35,0 4,0 9,8 18,2 33,0

66 36,7 liit 9,4 i6,0 32.5

24 35,5 3,8 8,4 17,1 35,2

20 43 38,4 5,0 8,0 12,3 36,3

66 41.3 6^6 7,9 11,1 33.1 ^

24 39,0 5,5 7,1 12,1 36,3 °o

30 43 43,7 7,1 7,3 11,0 30,9 ^

66 47,8 9,2 7,4 11,1 24,5 -*

Beispiel 3 zeigt die thermische Stabilität des Enzyms in Gegenwart des Substrats bei 55 und 60 C während einer Reaktionszeit von 66 Stunden bei pH 5»5 und macht somit das wirtschaftliche Potential bzw. den industriellen Wert des Enzyms deutlich. Außerdem läßt das Ergebnis der Kohlenhydratanalyse "erkennen, daß das durch die enzymatische Umwandlung von Saccharose mit dem neuen, erfindungsgemäßen Fructosyltransferase—Präparat
erzeugte Sekundär-Substrat der Erfindung ein wertvolles und wirtschaftlich verwertbares Produkt darstellt, das sich zur Herstellung von hoch-fructosehaltigen Sirupen aus Saccharose eignet, weil die vorherrschenden Bestandteile, wie gezeigt
wird, Dextrose und Polymere sind, die nach anschließender
bzw. nachfolgender Hydrolyse Fructose als vorherrschendes
bzv. hauptsächliches Monosaccharid liefern. Dieses Beispiel zeigt weiterhin, daß das neue Enzym der Erfindung bei einer Saccharosekonzentration von 60 'fo (w/v) wirksam ist, und macht ferner deutlich, daß das Enzym seine Funktion auch in Gegenwart von Glucose in hoher Konzentration erfüllt.

Beispiel k Einfluß der Temperatur auf die Enzymaktivität

Der Einfluß der Temperatur auf die Reaktionsgeschwindigkeit des Fructosyltransferase-Enzyms wird unter Verwendung des "Tech-

nicon Autoanalyzer II" wie folgt bestimmt:

Das Reaktionsgemisch besteht aus 7»5 ml einer 80^igen (w/v) Saccharoselösung, 2,3 nil einer 0,1m Citratpufferlösung mit
einem pH von 5»5 und 0,2 ml einer 2°/o±gen (w/v) Pullulanenzymlösung (Enzympräparat von Beispiel 2). Die Saccharoseendkonzen— tration beträgt somit 60 °/o (w/v). Die Proben werden jeweils 10 Minuten bei den nachstehend angegebenen Temperaturen gehalten und mit dem "Technicon Autoanalyzer II" untersucht. Die dabei erhaltenen Ergebnisse zeigen, daß die .Geschwindigkeit

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der enzymatischen Reaktion bei kO C 1,89mal so hoch wie bei 30⁰C, bei 50⁰C 1,29mal so hoch wie bei 40°C und bei 60°C 1,48mal so hoch wie bei 50 C ist. Diese Ergebnisse zeigen also, daß die Reaktionsgeschwindigkeit mit steigender Temperatur zunimmt.

Beispiel 5

Darstellung der Michaelis-Menten-Konstante (K ) des Fruc'tosyltransf eras e-Bnzyms _: ________________________

Die K eines Enzyms gibt diejenige Substratkonzentration an, m

bei der die Produktbildungsgeschwindigkeit halb so hoch wie

die V ist« Zur Ermittlung der K des FructosyltransferasemaXi m

Enzyms wird die nachstehende Methode angewandt.

Unter Verwendung einer mit 0,1 m Citratpufferlösung auf pH 5»5 eingestellten Saccharosestammlösung mit einem Saccharosegehalt von 90 °/o (v/v) werden Saccharoselösungsproben von jeweils 9,8 ml hergestellt * deren Saccharosegehalt jeweils so gewählt ist, daß die Proben bei einem Endvolumen von 10 ml Saccharosegehalte von 5, 10, 30, 40, 50, 60 bzw.709ε besitzen. Dann werden die auf Temperatur gebrachten Proben j-w-ails mit 0,2 ml einer Enzymlösung versetzt, die in der genannten Menge jeweils 1,1 Einheiten Fructοsyltransferase-Enzym enthält, worauf die Proben sofort in der weiter oben angegebenen Weise (vgl. "Fructosyl— transferase-Sinheit") bei 55°C auf dem "Technicon Autoanalyzer II" geprüft werden. Als Vergleich wird ein (in ug/ml geeichter) Glucosestandard mitgeprüft.

Die bei diesen Tests ermittelten Glucosebildungsgeschwindigkeiten in ug/ml/Minute für die verschiedenen Substratkonzentrationen bei einem konstanten Gehalt an Fructosyltransferase— Enzympräparat von Beispiel 1 (jeweils 1,1 Einheiten) sind aus der nachstehenden Tabelle zu ersehen.

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Substratkonzentration, °fo ug/ml/Min. ug/ml/Min.^a'

10 20 30 ko 50 60 70

a)
^! Parallelversuch am folgenden Tag unter Verwendung einer

60%igen Saccharosestammlösung.

Die K X3i 0,27 (molare Sac chains ekonzentr at ion) . Die maximale Reaktionsgeschwindigkeit, V ι tritt bei einer Substratkon-

8,0	8,0
11 ,8	11,6
15,7	15,2
18,0	17,6
18,6	18,2
19,2	17,2
17,8	18,2
15,6

zentration von 1,374 Mol Saccharose bei pH 5,5 und 55°C auf.

Beispiel 6

Herstellung und Isomerisierung von Sekundär-Substrat aus Saccha rose

a) Herstellung des Sekundär—Substrats

600 g Saccharose ("lebensmittelrein") werden in Wasser zu einem Volumen von 800 ml gelöst. Der pH dieser Lösung wird mit verdünnter Salzsäure auf 5,5 eingestellt. 11g eines gemäß Beispiel 1 hergestellten, trockenen Celite-Enzympräparats mit einer Aktivität von 550 Einheiten pro Gramm werden in 100 ml Wasser aufgeschlämmt. Die Aufschlämmung wird unter vermindertem Druck auf einem Papierfilter (Whatman Nr. 1) in einem Buchner-Trichter filtriert. Der Filterkuchen wird mit weiteren 100 ml Wasser gewaschen. Die dabei erhaltenen 200 ml Filtrat werden dann der in einer mit einem Schraubkappenverschluß ausgerüsteten, 1,893 Ltr. (0,5 gallon) fassenden Flasche vorgelegten Saccharoselösung zugesetzt» Die Flasche wird dann in ein 58 C warmes Wasserbad gesetzt, worauf man die Reaktion 20 Stunden weiter-

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laufen läßt und dann eine Probe des Reaktionsproduktes zur Bestimmung der Kohlenhydratzusammensetzung durch Hochdruck— Flüssigkeitschromatographie analysiert. Dabei erhält man folgende Ergebni s s e:

Kohlenhydrat-Zusammensetzung

Fructose 2,4 $

Dextrose 32,8 ?6

DP₂ 10,6 io

DP₃ 22,9 ^c/o

DP₄₊ 31,3 $

Das restliche ßsaktionsprodukt, d.h., das Sekundär-Substrat wird dann mit Magnesiumchlorid in einer eine Konzentration von 5 Millimol ergebenden Menge versetzt und mit verdünnter Natronlauge auf pH 8,4 eingestellt.

Β) Kontinuierliche Isomerisierung des Sekundär—Substrats

Aus Streptorayces oliyochromogenes ATCC 21 715 gewonnene Glucoseisomerase (vgl. US—PS Re: 29 152) wird auf bzw. an porösem AluminiuEioxyd (ein von der Fa. Corning Class Co., Corning, New York hergestellter Träger mit geregelter Porosität, vgl. z.B. US-PS 3 992 329) wie folgt immobilisiert:

1. Der Träger wird zweimal mit Wasser gewaschen;

2. Der Träger wird unterRühren eine Stunde mit bzw. in 0,1 m Natriumeitratlösung inkubiert}

3. Das Natriumeitrat wird aus dem Träger ausgewaschen, bis die Leitfähigkeit der Waschlösung 1000 Mikromhos beträgt;

4. Der Träger wird mit bzw. in 0,05 m Magnesiumchlorid— lösung eine Stunde inkubiert, worauf die Magnesiurachloridlösung abdekantiert wird;

5. Es wird 0,05 m Magnesiumchloridlösung in einer VoIumenmenge zugegeben, die so gewählt ist, daß die Enzym-

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endkonzentration 400 Einheiten/ml entspricht}

6. Der Träger wird mit dem Enzymkonzentrat in einer 14 Mill. Einheiten/28,3 Ltr, entsprechenden Menge versetzt;

7. Man läßt den Träger und das Enzym 22 bis 24 Stunden miteinander in Kontakt stehen, worauf dann das nichtgebundene Enzym aus dem Träger mit destilliertem Wasser ausgewaschen wird.

Dann wird eine Mantel—Glassäule (3 χ 18 cm), die mit einer Pumpe ausgerüstet ist, die ihrerseits mit einem Beschickungsvorrat sb ehält er in Verbindung steht, mit dem so hergestellten immobil!alerten Enzym befüllt. Das Bettvolumen der Säule beträgt nach dem Beladen 45 ml. Die Säule wird bei allen Isomerisierungsversuchen bei einer Temperatur von 60 C betrieben. Die beladene Kolonne wird, um zu zeigen, daß sie aktiv ist, mit einem auf pH 8,4 eingestellten, Magnesiumchlorid enthaltenden (5 Millimol) , 5Oj4igen (w/w) Dextrosesirup angefahren. Die Durchsatzgeschwindigkeit bzw. Fließrate wird auf 292 ml/Std. eingestellt. Danach läßt man die Säule bis zum Bettniveau auslaufen. Die Einspeisung des Sekundär-Substrats wird manuell gesteuert, bis 20 ml Ausfluß aufgefangen sind, worauf die Fließgeschwindigkeit des Sekundär-Substrats c».u.f 292 ml/Std. eingestellt wird. Die ersten 100 ml des aufgefangenen Sirups werden verworfen, um dem Substratwechsel Rechnung zu tragen. Dann wird das restliche Sekundär-Substrat (etwa 85O ml) durch die Kolonne geführt. Nach einer Stunde steigt die Fließgeschwindigkeit auf 57O ml/std..Dann wird die Fließgeschwindigkeit auf 3OO ml/std. eingestellt und bis zum Ende des Versuchs bei diesem Vert gehalten. Nach Beendigung des Versuchs mit Sekundär— Substrat wird die Säule wieder auf Dextrose umgeschaltet, um zu zeigen, daß noch Isomeraseaktivität vorhanden ist. In der nachstehenden Tabelle sind die bei der Hochdruck-Flüssigkeitschromatographie des eingesetzten Sekundär-Substrats und des aus der Isomerisierungssäule erhaltenen Endprodukts erhaltenen Analysenwerte einander gegenübergestellt:

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Sekundär-Substrat (A) Endprdukt (b)

Fructose Dextrose

2,4	15,7
32,8	18,9
10,6	11,0
22,9	22,9
. 31,3	31,5

^DP4₊

Diese Werte lassen erkennen, daß in der Säule 42,38 io der freien Dextrose im Sekundär-Substrat zu Fructose isomerisiert werden. Weiterhin ist aus diesen Werten zu ersehen, daß die im Sekundär— Substrat enthaltenen Fructosepolymeren bzw. -polysaccharide anscheinend weder angegriffen werden, noch ihrerseits die Isomerisierung der Dextrose zu Fructose beeinträchtigen. Es ist bemerkenswert, daß die gesamte Monosaccharidverteilung aus etwa 45 io Fructose und 55 f° Dextrose besteht.

Im nachfolgenden Beispiel werden die im Sekundär-Substrat und auch dem daraus erhaltenen Isomerisierungsprodukt vorhandenen Polysaccharide nach zwei verschiedenen Methoden, nämlich einmal enzymatisch und zum anderen mittels einer milden Säurehydrolyse, gespalten.

Beispiel 7

Herstellung von hoch-fructosehaltigem Sirup durch Hydrolyse Α) Enzymatische Hydrolyse

100 ml des Produkts B von Beispiel 6 werden mit 10 mg einer aus Candida utilis gewonnenen, gereinigten Invertase versetzt. Dieses Gemisch (mit Toluol konserviert bzw. stabilisiert) läßt man über Nacfafc bei Raumtemperatur reagieren, worauf eine Probe entnommen und durch Hochdruck-Flüssigkeitschromatographie analysiert wird. Das restliche Produkt B läßt man dann weitere 6 Tage reagieren, worauf eine zweite Probe auf die gleiche Weise

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untersucht wird. Die dabei erhaltenen Ergebnisse sind aus der nachfolgenden Tabelle zu ersehen:

Ausgangsmaterial	Nach Invertase-	Nach weiteren
(Produkt B)	einwirkung	6 Ta^en
15,7 $	41 ,9 io	62,4 #
18,9 56	29,4 %	36,2 io
1 1 ,0 io	1,9 #	0
22,9 io	12,9 io	0,5 #
31,5 #	13,9 56	0,9 i>

Fructose Dextrose DP₂

Als Invertase -wird ein von der Fa. Siekagaku Kogyo Od., Ltd,, Tokyo, Japan hergestelltes Enzympräparat verwendet, das eine Aktivität von 123 Einheiten/mg besitzt, wobei eine Invertaseeinheit die Spaltung von Saccharose unter Bildung von jeweils 1 Mikromol Glucose und Fructose pro Minute unter bestimmten Bedingungen katalysiert.

B) Säurehydrolyse von Produkt B

Eine Probe des Produkts B von Beispiel 6 wird mit Säure hydrolysiert, indem man die Probe mit Schwefelsäure bis zu einer Konzentration von 0,05 η versetzt und das Gemisch auf 75 bis 80°C erhitzt. Aus dem Reaktionsgemisch wird nach einer Hydrolysedauer von einer und zwei Stunden jeweils eine Probe entnommen und durch Hochdruck-Flüssigkeitschromatographie analysiert. Die dabei erhaltenen Ergebnisse sind aus der nachfolgenden Tabelle zu ersehen,:

Ausgangsmaterial 1 Stunde 2 Stunden (Produkt B)

Fructose	15,7	60,3	59,1
Dextrose	18,9	38,7	37,9
DP₂	11,0	1,9	2,6
DP₃	22,9	0,4	0,3
DP,,.	31,5	0	0,2

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Die vorstehenden, beim Versuch A erhaltenen Analysendaten zeigen, daß eine stärkere Zunahme des Fructosegehalts und eine geringere Zunahme des Glucosegehalts sowie eine entsprechende Abnahme der Gehalte an DP_?~, DP - und DP. -Komponenten bzw. -Fraktionen auftritt und belegen somit die Anwesenheit eines Fructosepolymers bzw. -polysaccharide.

Die bei der Säurehydrolyse von Versuch B erhaltenen Ergebnisse stimmen mit den beim Versuch A erhaltenen überein und belegen somit das Stattfinden einer Spaltung von Fructosepolymeren bzw. -polysacchariden.

Die vorstehenden Ausführungen betreffen Transfructosylierungen unter Verwendung eines Primär—Substrats, in dem der Anfangs— gehalt an Saccharose-Trockensubstanz den Sättigungspunkt unter den gegebenen Reaktionsbedingungen nicht übersteigt. Das nachfolgende Beispiel erläutert die Verwendung eines Primär-Substrats mit einer Anfangssaccharosekonzentration, die über der Sätti— gungskonzentration liegt und zeigt, daß man, wenn man darauf Fructosyltransferase-Enzym einwirken läßt, ein Produkt mit höherem Gehalt an DP„-Material (d.h. Fructosylsaccharose und einem geringeren Gehalt an DP^ -Produkten) erhält. Weiterhin ist eine Zunahme des Trockensubstanzgeh.td.ts (w/w) des Sekundär—Substrats im Vergleich zur Trockensubstanz-Konzentration, die ohne Einwirkung des Fructosyltransferase-Enzyms erhalten wird, zu erkennen. Veiterhin wird gezeigt, daß der Polymeri— sationsgrad des Fructosepolymers bzw. -polysaccharide Im Sekun— där-Substrat abnimmt und das ΏΡ, —Material nur noch in untergeordneten Mengen vorhanden ist, wenn der Trockensubstanzge— halt des Primär-Substrats zunimmt.

Dies steht in ausgesprochenem Gegensatz zu den vorhergehenden Beispielen, bei denen Primär-Substrate mit unter der Sättigungskonzentration liegenden Saccharosegehalten verwendet wurden. Bei diesen Beispielen stellt das DPl -Material das Hauptprodukt dar.

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Beispiel 8

Herstellung von Sekundär—Substrat aus Saccharose-Aufschlämmungen mit einem über der Sättigungskonzentration liegenden Saccharose— gehalt. .

In mit Schratibkappenverschlüssen ausgerüsteten, jeweils 0,^731 Ltr. fassenden Flaschen bzw. Kolben werden jeweils 200 g Saccharose (Lebensmittelqualität) vorgelegt. In einen, als Vergleichsprobe dienenden Kolben werden 50 ml reines Wasser gegeben, während man in die anderen Kolben, wie aus der nachfolgenden Tabelle ersichtlich, jeweils 50 ml Wasser gibt, das mit nach Beispiel 1 hergestelltem Fructosyltransferase-(Celite)-Snzympriiparat in steigenden Mengen versetzt ist. Dann werden

ein _o

die Kolben jeweils verschlossen und in/bei 5k bis 55 C gehaltenes Rüttel-Wasserbad gesetzt. Die Kolben werden unter gelegentlichem Durchmischen "von Hand 2k Std. geschüttelt. Hierauf wird aus jedem Kolben eine Probe des Überstands entnommen und jeweils in ein Proberohr mit Schraubkappenverschluß gegeben, das in ein siedendes Wasserbad gestellt wird, um das Enzym zu inaktivieren. Diese Proben werden dann durch Hochdruck-Flüssigkeitschromatographie analysiert. Außerdem wird jeweils der Trockensubstanzgehalt im Überstand räch der Methode von K. Fischer bestimmt. Bei den Analysen erhält man folgende Ergebnisse;

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Flasche Nr. Saccharose (g) Enzym- Trockensubstanz Kohlenhydrat-Zusamraensetzung in

einheiten im Überstand der Lösung, best, durch HPLC-Ana-(Gew.-^; w/w) lyse, (#)

100 74,5

200 75,6

300 76,3

400 77,1

500 77,7

600 78,1

800 80,0

900 79,0

1000 79,6

72,7

Gesamt- Fructosyltransferase-Enzymeinheiten in 50 ml Wasser ND = Nicht bestimmt

	1	200
	2	200
	3	200
	4	200
00
O	5	200
CD 00	6	200
cn	7	200
	8	200
O
CO	9	200
CO	10	200
	Vergleichsprobe	200

Fruc.	Dax.	DP₂	DP	^DIV
0,6	9,6	80,9	8,9	ND²
0,7	12,7	72,2	13,7	0,7
1,0	14,5	66,8	16,6	1,1
0,9	15,7	62,6	19,0	1,8
1,1	17,3	58,5	21,0	2,1
1,3	18,0	56,0	21,9	2,8
1,1	18,8	53,9	23,1	3,0
1,0	19,3	52,2	24,1	3,4
1,3	19,9	50,0	25,0	3,7
1,3	20,6	48,6	25,4	4,1
0,3	ND²	99,7	ND²	ND²

An dem vorstehenden Beispiel ist bemerkenswert, daß die Ver— gleichsprobe beim Abkühlen auf Raumtemperatur (etwa 25 C) kristallisiert, während die enzymatisch erzeugten Sekundär— Substrate in Lösung bleiben und eine hervorragende Lagerungs— Stabilität ohne Kristallisation aufweisen.

Nach Beispiel 8 werden auf 50 ml Wasser zwar (nur) 200 g Saccharose, d.h. 80 Ga/.-°/o_t eingesetzt, jedoch kann, worauf hingewiesen sei, die Trockensubstanzkonzentration des Saccharose-Ausgangsmaterials gewünschtenfalls höher gewählt werden.

Das neue Sekundär-Substrat stellt eine Ausführungsform der Erfindung dar und kann als hoch-stabiler, nicht-kristallisierender Sirup für Nahrungsmittelzwecke eingesetzt werden. Es stellt weiterhin ein Produkt mit einzigartig hohem Trocken— substanzgehalt dar, das gegen mikrobiologischen Verderb und Farbbildung beständig ist und dazu benutzt werden kann, den Zucker in Konzentrationen, die bei einer Konfektionierungsform mit den vorstehend beschriebenen Eigenschaften bislang nicht erreichbar war, zu transportieren und/oder zu lagern. Außerdem läßt sich dieses neue Sekundär-Substrat mit hohem Trockensubstanzgehalt, wie in Beispiel 7 gezeigt, hydrolysieren, wobei man ein Invertzuckergemisch mit wünschenswert hoher Süßigkeit erhält. Das neue Sekundär—Substrat dieser Ausführungsform der Erfindung weist einen Trockensubstanzgehalt von etwa 70 bis 82 fo (w/w) auf und enthält eine Monosaccharidfraktion, die im wesentlichen aus Dextrose besteht, sowie Polysaccharid— polymere, im Überschuß über DP₂* ^^e *-^m "wesen-tücken aus DPq""Produkt bestehen. Weiterhin ist auch eine untergeordnete Menge (4 $ und weniger) an DP. —Polymeren vorhanden.

Die erfindungsgemäße Transfructosylierung wurde zwar vorstehend anhand von absatzweise durchgeführten Versuchen erläutert, jedoch liegt es für den Fachmann auf der Hand, daß wahlweise auch eine kontinuierliche Arbeitsweise angewendet werden kann. Zur Durchführung einer solchen kontinuierlichen .Transfructosylierung wird das Transfructosylase-Enzym

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zweckmäßig nach den weiter oben bei der Definition des "immobilisierten Enzyms" und nach den dort beschriebenen kontinuierlichen Aufarbeitungsmethoden immobilisiert.

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Claims

Pat ent ansprüche

1. Verfahren zur Herstellung eines Sirups, dadurch gekennzeichnet, daß man ein Fructosepolysaccharidfe) und Dextrose enthaltendes Reaktionsprodukt (Sekundär-Substrat) erzeugt, indem man auf ein Primär—Substrat, insbesondere Saccharose, eine wirksame Menge eines Fructosyltransferase-Enzympräparats einwirken läßt.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man ein von Pullularia pullulans stammendes Fructosyltransferase-Enzympräparat verwendet.

3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß man die Saccharose der Einwirkung des Fructosyltrans— ferase-Enzyms bei einer Temperatur von etwa 25 bis 65 C, einem pH von etwa 4,5 bis 6,5 und einer Anfangs—Saccharose— konzentration von mindestens 10 56 (Gew»/Vol.) unterwirft.

h. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3» dadurch gekennzeichnet, daß die der Einwirkung des Enzyms ausgesetzte Saccharose in einer Konzentration von mindestens ^atwa 20 $ vorliegt.

5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis k_t dadurch gekennzeichnet, daß man die Dextrose des Sekundär-Substrat3 unter Bildung von Fructose isomerisiert,

6. Verfahren nach Anspruch 5» dadurch gekennzeichnet, daß die Isomerisierung unter Verwendung eines immobilisierten Glucoseisomeraseenzyms durchgeführt wird.

7· Verfahren nach Anspruch 5 oder 6, dadurch gekennzeichnet, daß man die Isomerisierung in Gegenwart des Fructosepolysaccharids durchführt.

809851 /0994 original inspected

8. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch, gekennzeichnet, daß man das ' Fructosepolysaccharid von der Dextrose abtrennt.

9. Verfahren nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, daß die Abtrennung durch Ultrafiltration erfolgt.

10. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 9» dadurch gekennzeichnet, daß das Fructosepolysaccharid des Sekundär—Substrats unter Bildung von Fructose hydrolysiert wird.

11. Verfahren nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, daß das Fructosepolysaccharid . in Abwesenheit von aktivem Isomeraseenzym hydrolysiert wird.

12. Verfahren nach Anspruch 10 oder 11, dadurch gekennzeichnet, daß das .Fructosepolysaccharid vor der Hydrolyse von der Dextrose abgetrennt wird.

13· Sekundär—Substrat, dadurch gekennzeichnet, daß es nach dem Verfahren eines der Anspiüche 1 bis k hergestellt und

zur enzymatischen Isomerisierung und Hydrolyse zu mehr als 55 $ Fructose enthaltenen Sirupen geeignet ist, und, bezogen auf sein Gewicht,

(1) etwa 20 bis 60 $ Monosaccharid(e), die vorherrschend aus Dextrose und Fructose bestehen

und

(2) etwa 70 bis 40 96 vorherrschend aus Fructosyleinheiten bestehende(s) ' Fructosepolysaccharidfe)

enthält.

14. Sekundär-Substrat nach Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, daß das (die) darin enthaltene(n) " Fructosepolysacchai*id(e) mindestens 66 Gew.-$ Fructosyleinheiten enthält (-halten).

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15. Sekundär-Substrat, hergestellt nach dem Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß es einen Trockensubstanzgehalt von etwa 70 bis 82 Gew.-^ (w/w)

besitzt

eine vorherrschend aus Dextrose bestehende Monosaccharid-

fraktion sowie

eine aus mindestens einem anderen Fructosepolysaccharid als Saccharose bestehende . Fructosepolysaccharidfraktion,

die vorherrschend aus DP„-Produkt(en) besteht, enthält.

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