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Die
vorliegende Erfindung bezieht sich auf ein säurebeständiges Lävansucraseenzym, auf Mikroorganismen,
die es produzieren, ein Verfahren zur Herstellung dieses säurebeständigen Lävansucraseenzyms
und auf Zusammensetzungen, die es enthalten.
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Lävansucraseenzyme
katalysieren den Transfer von Fructose. Genauer ausgedrückt katalysieren
Lävansucraseenzyme
(E.C.2.4.1.10) den Übergang
von Fructosylresten aus Sucrose, Raffinose oder Stachyose auf ein
geeignetes Cosubstrat, wobei Polymere hergestellt werden, allgemein
als Lävane
bezeichnet, die verschiedene Mengen an Fructosylresten enthalten,
die aus β2→6 Verbindungen
bestehen. Lävane
finden ein breites Anwendungsgebiet in der chemischen Industrie
und Lebensmittelindustrie sowie in Medizin und Forschung.
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Lävansucraseenzyme
wurden von einer Vielzahl von mikrobiellen Ausgangsquellen isoliert,
Mikroorganismen wie z.B. Acetobacter suboxydans, Actinomyces viscosus,
Aerobacter levanicum, Bacillus amyloliquefaciens, Bacillus licheniformis,
Bacillus mesentericus, Bacillus subtilis, Glucobacter oxydans, Streptococcus
mutans, Streptococcus salivarius, Streptomyces griseus, Zymomonas
mobilis. In den meisten Fällen
liegt das Enzym extrazellulär
vor und ist hitzelabil. Eines der wichtigsten Kennzeichen bei der
Herstellung von Lävansucraseenzymen
ist die Tatsache, daß mindestens
5% Sucrose zu dem Wachstumsmedium hinzugefügt werden müssen, um die Synthese des Enzyms
anzuregen bei der Verwendung von bekannten, Lävansucraseenzyme produzierenden
Mikroorganismen.
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Dadurch
wird es schwierig, das Lävansucraseenzym
von dem Nährmedium
abzutrennen, da die Viskosität
des Nährmediums
zunimmt, wenn das Lävan
bei der Fermentation hergestellt wird. Daher wird ständig nach
Mikroorganismen gesucht, bei denen ein niedriger Gehalt an Sucrose
oder überhaupt
keine Sucrose zur Herstellung von Lävansucrase benötigt ist.
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In
der japanischen Patentanmeldung JP-A-52-82781 wird ein Verfahren
offenbart zur Herstellung eines extrazellulären Lävansucraseenzyms in Anwesenheit
geringer Konzentrationen von Sucrose (0,3 Gewicht-%/Volumen) unter
Verwendung von Bacillus licheniformis Stamm AJ 3982 (Institute of
Microbial Engineering Hinterlegungsnr. 3373). Bei diesem Enzym wird
jedoch noch immer Sucrose benötigt,
um induziert und produziert zu werden. Darüberhinaus entwickelt dieses
Lävansucraseenzym
keine enzymatische Aktivität
bei einem pH-Wert
von 4,0, wenn es bei einer Temperatur von 55°C gehalten wird. Bei besagter
Temperatur entwickelt es nur 50% seiner maximalen Aktivität bei einem
pH-Wert von etwa 5,2 und etwa 80% seiner maximalen Aktivität bei einem
pH-Wert von etwa 6 bis etwa 7,8. Dieser enge pH-Bereich beschränkt das
Anwendungsgebiet dieses Lävansucraseenzyms.
Darüberhinaus
ist Säurebeständigkeit
sehr wichtig für
ein breites kommerzielles Anwendungsgebiet des Enzyms.
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Die
vorliegende Erfindung beabsichtigt, ein Lävansucraseenzym bereitzustellen,
das eine enzymatische Aktivität
in einem breiterem pH-Bereich entwickelt als die bekannten Enzyme
und das bei sauren pH-Werten beständig ist, bei denen die bekannten
Enzyme nicht mehr beständig
sind.
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Zu
diesem Zweck stellt die vorliegende Erfindung ein säurebeständiges Lävansucraseenzym
bereit, das von Bacillus licheniformis APMC 84, hinterlegt unter
der Nummer NRRL B-18962,
oder von einer Mutante davon abgeleitet ist, und das bei einer Temperatur
von etwa 55°C
und bei einem pH-Wert von 4,0 eine enzymatische Aktivität von mindestens
50% der maximalen, bei 55°C
gemessenen Aktivität
entwickelt.
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Das
Lävansucraseenzym
gemäß der Erfindung
entwickelt darüberhinaus
eine nennenswerte enzymatische Aktivität in einem breiten pH-Bereich
in Anwesenheit eines Substrats wie z.B. Sucrose. Es entwickelt darüberhinaus
bei einem pH-Wert im Bereich von etwa 5,5 bis etwa 6,3 eine maximale,
bei etwa 55°C
gemessene enzymatische Aktivität.
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Genauer
ausgedrückt
entwickelt es bei einer Temperatur von etwa 55°C und bei einem pH-Wert im Bereich
von etwa 4,0 bis etwa 8,4 eine enzymatische Aktivität von mindestens
50% der maximalen, bei 55°C gemessenen
Aktivität.
Es entwickelt bei besagter Temperatur von etwa 55°C und bei
einem pH-Wert im Bereich von etwa 4,2 bis etwa 8,0 eine enzymatische
Aktivität
von mindestens 70% der maximalen, bei 55°C gemessenen Aktivität. Es entwickelt
bei besagter Temperatur und bei einem pH-Wert im Bereich von etwa
4,5 bis etwa 7,8 eine enzymatische Aktivität von mindestens 80% der maximalen,
bei 55°C
gemessenen Aktivität.
Es entwickelt bei etwa 55°C
und bei einem pH-Wert im Bereich von etwa 4,7 bis etwa 7,2 eine
enzymatische Aktivität
von mindestens 90% der maximalen, bei 55°C gemessenen Aktivität.
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Das
Lävansucraseenzym
gemäß der Erfindung
hat eine nennenswerte Wärmebeständigkeit
in Anwesenheit eines Substrats wie Sucrose. Es entwickelt darüberhinaus
bei einer Temperatur im Bereich von etwa 55°C bis etwa 64°C eine maximale,
bei einem pH-wert von 5,5 gemessene enzymatische Aktivität.
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Genauer
ausgedrückt
entwickelt es darüberhinaus
bei einem pH-Wert
von etwa 5,5 und bei einer Temperatur im Bereich von etwa 35°C bis etwa
75°C eine
enzymatische Aktivität
von mindestens 50% der maximalen, bei einem pH-Wert von 5,5 gemessenen
Aktivität.
Es entwickelt bei besagtem pH-Wert von etwa 5,5 und bei einer Temperatur
im Bereich von etwa 45°C
bis etwa 68°C
eine enzymatische Aktivität
von mindestens 80% der maximalen, bei einem pH-Wert von 5,5 gemessenen
Aktivität.
Es entwickelt bei besagtem pH-Wert von etwa 5,5 und bei einer Temperatur
im Bereich von etwa 50°C
bis etwa 67°C
eine enzymatische Aktivität von
mindestens 90% der maximalen, bei einem pH-Wert von 5,5 gemessenen
Aktivität.
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Das
Lävansucraseenzym
gemäß der Erfindung
ist ein zellgebundenes Enzym. Es hat eine Fructosyl-Transferase-Aktivität und kann
somit Fructosylpolymere von Sucrose bilden, die aus β-D(2→6) verbundener
Fructose bestehen und die zur "Lävan"-Familie gehören.
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Das
Lävansucraseenzym
gemäß der Erfindung
ist kein Sucroseinduzierbares Enzym, d.h. es benötigt nicht Sucrose, um induziert
und produziert zu werden.
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Die
vorliegende Erfindung stellt auch ein Verfahren bereit zur Herstellung
eines säurebeständigen Lävansucraseenzyms
unter Verwendung eines Mikroorganismuses, nähmlich Bacillus licheniformis
APMC 84, ohne Zugabe von Sucrose zum Nährmedium.
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Das
Verfahren gemäß der Erfindung
zur Herstellung eines säurebeständigen Lävansucraseenzyms umfaßt die folgenden
Schritte:
- (i) Züchten eines Mikroorganismuses,
der zum Genus Bacillus gehört,
in einem geeigneten Nährmedium durch
Bildung einer Fermentationsbrühe,
die eine Biomasse umfaßt
und
- (ii) Gewinnung des Lävansucraseenzyms
aus besagter Fermentationsbrühe,
wobei
der Mikroorganismus in Abwesenheit von Sucrose gezüchtet wird,
wobei der Mikroorganismus Bacillus licheniformis NRRL B-18962 oder eine Mutante
davon, die ein Lävansucraseenzym
nach Anspruch 1 produzieren kann, ist.
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Die
vorliegende Erfindung beabsichtigt auch, einen neuen Mikroorganismus
bereitzustellen, der zum Genus Bacillus gehört, der ein säurebeständiges Lävansucraseenzym
in Abwesenheit von Sucrose im Nährmedium
produziert.
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Zu
diesem Zweck stell die vorliegende Erfindung einen neuen Mikroorganismus,
nähmlich
Bacillus licheniformis APMC 84 bereit, der ein säurebeständiges Lävansucraseenzym in Abwesenheit
von Sucrose im Nährmedium
produziert. Der bevorzugte Mikroorganismus, nähmlich Bacillus licheniformis
APMC 84 wurde bei der Agricultural Research Culture Collection (NRRL)
Peoria, Illinois, gemäß dem Budapester
Vertrag hinterlegt. Die Hinterlegungsnummer ist NRRL B-18962.
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Natürliche und
künstliche
Mutanten und Derivate, die durch natürliche oder genetische Modifikationen des
Mikroorganismuses der Spezies Bacillus licheniformis APMC 84 entstehen,
sind auch in der vorliegenden Erfindung eingeschlossen.
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Das
Lävansucraseenzym
der vorliegenden Erfindung kann nicht nur vom Stamm Bacillus licheniformis NRRL
B-18962 produziert werden, sondern auch von natürlichen oder künstlichen
Mutanten und anderen Derivaten dieses Mikroorganismuses. Solche
Mutanten können
durch allgemein bekannte Verfahren erhalten werden, wie z.B. Röntgenstrahlung,
ultraviolette Bestrahlung, chemische Mutagene und Gentechnologie.
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Das
gemäß dem Verfahren
der Erfindung hergestellte Lävansucraseenzym
wird hergestellt durch Züchten
von Bacillus licheniformis NRRL B-18962 oder einer Mutante davon
in einem Nährmedium,
das Kohlenstoff, Stickstoff und anorganische Salze enthält, unter
aeroben Bedingungen in Abwesenheit von Sucrose und durch anschließendes Gewinnen
des Lävansucraseenzyms
daraus.
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Die
Bedingungen der Züchtung
dieser Mikroorganismen, wie z.B. Bestandteile des Nährmediums,
Parameter, Temperatur, pH-Wert, Bewegung, Belüftung, sind für den Fachmann
offensichtlich. Geeignete Kohlenstoffquellen umfassen Glucose, Fructose,
Maltodextrine, Glycerol, Stärkezuckersirup
aus Mais, Stärke,
hydrolysierte Stärke
oder Mischungen von zwei oder mehr dieser Kohlenstoffquellen. Bevorzugte
Kohlenstoffquellen sind Stärkezuckersirup
aus Mais und hydrolysierte Stärke.
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Stickstoffquellen,
die verwendet werden können,
umfassen Sojabohnenmehl, Getreideeinweichflüssigkeit, Kartoffelmehl, Baumwollkernmehl,
Fischmehl, Hefe, Hefeextrakt oder Mischungen von zwei oder mehr dieser
Stickstoffquellen. Bevorzugte Stickstoffquellen sind Sojabohnenmehl,
Baumwollkernmehl, Hefeextrakt und eine Mischung aus Sojabohnenmehl
und Hefeextrakt.
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Geeignete
Salze umfassen Kaliumsulfat, Mangansulfat, Ammoniumsulfat, Ammoniumcitrat,
Kaliumphosphat, Natriummonohydrogenphosphat, Natriumdihydrogenphosphat,
Calciumchlorid, Natriumcitrat oder Mischungen von zwei oder mehr
dieser Salze. Bevorzugte Salze umfassen eine Mischung aus Natriummonohydrogenphosphat,
Natriumdihydrogenphosphat, Calciumchlorid und Natriumcitrat.
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Das
Medium, das die oben angegebenen Bestandteile enthält, wird
auf eine übliche
Weise sterilisiert und mit dem geeigneten Mikroorganismusstamm beimpft,
nähmlich
mit dem Stamm B. licheniformis APMC 84.
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Die
Anzucht wird aerob durchgeführt
durch Schütteln
oder Bewegung mit Belüftung, üblicherweise
bei einer Temperatur zwischen etwa 25 und 46°C für etwa 6 bis 40 Stunden und
bei einem pH-Wert zwischen etwa 5,0 und etwa 8,5. Vorzugsweise wird
die Anzucht durchgeführt
bei einer Temperatur zwischen etwa 30 und 42°C für etwa 12 bis 30 Stunden und
bei einem pH-Wert
zwischen etwa 6,0 und 8,0. Gute Ergebnisse werden erzielt, wenn
die Anzucht bei einer Temperatur zwischen etwa 36 und 40°C bei einem
pH-Wert zwischen etwa 6,5 und 8,5 durchgeführt wird.
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Nach
der Kultivierung entsteht eine Fermentationsbrühe, die eine Biomasse umfaßt. Diese
Biomasse, die die Zellen der Mikroorganismen mit dem zellgebundenen
Lävansucraseenzym
enthält,
wird abgetrennt und aus dem Kulturfiltrat gewonnen unter Verwendung
von üblichen
Verfahren, wie z.B. Zentrifugation, Aussalzung, Ausfällen, Filtration,
Ultrafiltration, Filtration, Mikrofiltration, Zentrifugation gefolgt
von Ultrafiltration oder Filtration gefolgt von Mikrofiltration.
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Die
abgetrennte und gewonnene Biomasse wird anschließend gewaschen, vorzugsweise
mehrere Male mit Wasser, noch bevorzugter mit entionisiertem, destilliertem
Wasser, und homogenisiert. Wiederholtes Waschen der Biomasse hat
keine Auswirkung auf die Aktivität
des zellgebundenen Lävansucraseenzyms,
was zu dem Schluß führt, daß das Enzym
fest an die Zelle gebunden ist.
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Das
Lävansucraseenzym
kann, falls notwendig und gemäß den geplanten
Anwendungen, zusätzlich gereinigt
werden. Solubilisierung des zellgebundenen Enzyms kann erreicht
werden in Anwesenheit eines ionischen Detergens, wie z.B. Natriumcholat
oder Natriumdodecylsulfat (0,25% bis 2,5%) oder Salzlösungen, wie
z.B. Mg++ Lösung. Das Enzym kann auch durch
Ammoniumsulfat im Bereich von 65-95% der Sättigung bei einer Temperatur
von etwa 0°C
ausgefällt
werden. Falls notwendig kann auch ein Beschallungsverfahren verwendet
werden, um das Lävansucraseenzym
von den Zellen abzutrennen.
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Das
Lävansucraseenzym
kann zu Zusammensetzungen zubereitet werden, die das in verschiedenen Industrien
verwendbare Lävansucraseenzym
enthalten, insbesondere in der Lebensmittelindustrie, pharmazeutischen
Industrie und chemischen Industrie.
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Das
Lävansucraseenzym
wird gemäß seinen
geplanten Anwendungen zubereitet. Gewöhnlich werden auch Stabilisatoren
und Konservierungsmittel zu den Enzymzusammensetzungen hinzugefügt. Zum
Beispiel kann das Enzym stabilisiert werden durch Zugabe von Glycerol
(50 Volumen-%), Ammoniumsulfat (3,2 Mol/l) oder Natriumchlorid (3
Mol/l) zu der wäßrigen Lösung des
Enzyms.
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Für Anwendungen
im Bereich der Medizin kann das Enzym vorzugsweise in gefriergetrockneter
Form verwendet werden.
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Für Anwendungen
in Lebensmitteln kann das Enzym immobilisiert verwendet werden durch
physikalische oder chemische Kopplung des Enzyms mit im wesentlichen
unlöslichen
reaktionsträgen
Trägersubstanzen,
die deren Verwendung in Durchlaufreaktoren erleichtern. Gewöhnlich ist
das Enzym an den Träger
gebunden. Materialien, die als Träger verwendet werden, umfassen
organische und anorganische Substanzen, wie z.B. poröse granulierte
Diatomeenerde, die mit einer Lösung
aus Polyamin und Glutaraldehyd behandelt wurde, granulierte Aktivkohle,
oberflächenaktive
Materialien wie Aluminiumoxid, Kohlenstoff, Ton, Zirconiumdioxid,
Titandioxid, Ionen-Austauscherharze, Cellulose oder Glas, chemisch
aktivierte Trägersubstanzen
wie Cellulose, Agarose, synthetische Polymere, Gele von zum Beispiel
Polyacrylamiden, Siliciumdioxid und Stärke, wobei das Enzym in einer
Polymermatrix festgehalten ist. Vorzugsweise können ganze Bacillus-Zellen,
die das Lävansucraseenzym
umfassen, direkt im Immobilisierungsprozeß ohne Isolierung und Reinigung
des Enzyms verwendet werden.
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Die
Zusammensetzungen, die das Lävansucraseenzym
der vorliegenden Erfindung enthalten, können entweder in fester oder
flüssiger
Form verwendet werden. Diese Zusammensetzungen können zu einem Endprodukt verarbeitet
werden, das entweder eine flüssige
Lösung,
fest, granuliert, ein Pulver oder ein Brei ist.
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Die
Zusammensetzungen gemäß der Erfindung
können
zur Herstellung von Lävanen
aus Zuckern verwendet werden, die Fructosylreste enthalten, wie
z.B. Sucrose, Raffinose oder Stachyose. Diese Zucker können aus
Rohstoffen gewonnen werden, wie z.B. rohe Zuckerrüben, gereinigter
Saft aus zerdrückten
oder zerschnitzelten Zuckerrüben,
Melasse, Rohrzucker, Rübenzucker,
Pflanzenzucker.
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Die
entstehenden Lävane
können
Lävane
mit hohem Molekulargewicht, Lävane
mit niedrigem Molekulargewicht (Fructooligosaccharide) und Fructosylpolymere
sein.
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Die
vorliegende Erfindung wird anhand der folgenden Beispiele zusätzlich veranschaulicht.
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Beispiel 1
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Ein
Anzuchtmedium, das zur Entwicklung der Impfkultur verwendet wird,
wird aus den folgenden Bestandteilen hergestellt: Calciumchlorid
0,02 Gewicht-%/Volumen, Natriumcitrat 0,3%, hydrolysierte Stärke 2,6%,
verkauft unter dem Warenzeichen MALTRIN 100 (GPC), Baumwollkernmehl
4,6%, verkauft unter dem Warenzeichen PHARMAMEDIA (TRADERS PROTEIN),
Natriummonohydrogenphosphat 0,21% und Natriumdihydrogenphosphat
0,54%. Dieses Anzuchtmedium wird bei 125°C für 30 Minuten in Anzuchtkolben
sterilisiert, welche 250 ml fassende Erlenmeyer-Kolben mit drei
Ablenkflächen
sind, die 50 ml des Anzuchtmediums enthalten. Dann werden sie aus
einer gefrorenen Glycerolkultur des Stammes von B. licheniformis
APMC 84 beimpft.
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Die
Anzucht dieses Stammes wird bei 37°C 24 Stunden lang mit einer
Rotationsschüttelmaschine
bereitet, bevor sie als Quelle der Impfkultur für die Produktionskolben verwendet
wird.
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Das
zur Herstellung des Lävansucraseenzyms
verwendete Medium wird aus den folgenden Bestandteilen hergestellt:
Stärkezuckersirup
aus Mais 10,3 Gewicht-%/Volumen, verkauft unter dem Warenzeichen STALEY
200 Stärkezuckersirup
aus Mais (A.E. STALEY), Sojabohnenmehl 5,5%, verkauft unter dem
Warenzeichen PROMOSOY 100 (CENTRAL SOYA), Hefeextrakt (von UNIVERSAL
FOODS CORP) 0,32%, Natriummonohydrogenphosphat 0,7% und Natriumdihydrogenphosphat
0,7%.
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Dieses
Produktionsmedium wird bei 125°C
für 30
Minuten in Produktionskolben sterilisiert, welche 250 ml fassende
Erlenmeyer-Kolben mit drei Ablenkflächen sind, die 50 ml des Produktionsmediums
enthalten.
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Die
Menge der Impfkultur beträgt
2 Volumen-%/Volumen. Die beimpften Produktionskolben werden auf
einer Rotationsschüttelmaschine
bei einer Temperatur von 37°C
für 16
bis 20 Stunden inkubiert.
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Eine
Zunahme der Viskosität
wird nicht beobachtet, wenn Lävan
in der Fermentationsbrühe
hergestellt wird.
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Das
hergestellte Enzym kann leicht fast ohne Kleben isoliert werden.
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Die
Biomasse aus den Kolben wird von der Fermentationsbrühe durch
Zentrifugation abgetrennt, woraufhin die Zellen mit entionisiertem,
destilliertem Wasser zweimal gewaschen und homogenisiert werden.
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Das
Lävansucraseenzym
gemäß der Erfindung
wird gewonnen. Lävansucraseenzymeinheit
(Levan sucrase enzyme unit, LSU) ist als die Menge der Enzymaktivität definiert,
die erforderlich ist, um ein Mikromol Glucose pro Minute unter den
Bedingungen des Versuchs herzustellen.
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Die
Enzymaktivität
wurde unter Verwendung von Sucrose als Substrat gemessen. Zu einem
Milliliter einer Enzymteilmenge wurden 7,5 ml eines 0,01 M Citratpuffers
hinzugefügt,
pH-Wert 5,5, der 60 Gewicht-%/Gewicht Sucrose enthält. Dann
wurde das Volumen des Reaktionsgemisches unter Verwendung von destilliertem
Wasser auf 10 ml angeglichen und bei 55°C eine Stunde inkubiert. Nach
der vorgegebenen Zeit wurde die Enzymreaktion durch Wärmezufuhr
bei 95°C
für 10
Minuten beendet. Der Glucosegehalt der Reaktionsprodukte wurde durch
Hochleistungsflüssigchromatographie
festgestellt (High performance liquid chromatographic analysis,
HPLC) (K.M. Brobst und H.D. Schobell, 1982, Starch/Stärke, 34,
117-121).
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Die
Bewertung der Auswirkung des pH-Werts auf die Aktivität des Lävansucraseenzyms
wurde festgestellt, indem die enzymatische Transfructosylationsreaktion
nach Inkubation bei 55°C
für eine
Stunde bei verschiedenen pH-Werten durchgeführt wurde, d.h. bei 4,0, 4,5,
5,0, 5,5, 6,0, 6,5, 7,0, 7,5 und 8,0 unter Verwendung eines geeigneten
Phosphatpuffers (0,01 M). Der Gehalt der gebildeten Glucose wurde
durch Hochleistungsflüssigchromatographie
(HPLC) festgestellt. Die Aktivität
wurde berechnet.
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Bei
55°C entwickelt
sich eine maximale Aktivität
bei einem pH-Wert um etwa 5,5-6,0. 1 stellt
die Auswirkung des pH-Werts auf die Aktivität des Enzyms bei einer Temperatur
von 55°C
dar. In dieser Figur zeigt die X-Achse den pH-Wert und die Y-Achse
die Aktivität
ausgedrückt
in Prozent der maximalen Aktivität,
die sich bei einem pH-Wert von 5,5 und einer Temperatur von 55°C entwickelt.
Das Zeichen 0 stellt die Meßwerte für das Enzym
gemäß der Erfindung
dar und zu Vergleichszwecken stellt das Zeichen # die Meßwerte der
japanischen Patentanmeldung JP-A-52-82781 dar.
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Das
Enzym der vorliegenden Erfindung ist im sauren pH-Bereich stabiler
als das Enzym, das in besagter früherer japanischer Patentanmeldung
offenbart wurde.
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Das
Enzym der vorliegenden Erfindung weist bei 55°C und bei einem pH-Wert von
4,0 über
50% seiner maximalen, bei 55°C
gemessenen Aktivität
auf, während
das Enzym des Standes der Technik bei einem pH-Wert von 4,0 und
bei besagter Temperatur keine Aktivität zeigte.
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1 zeigt, daß das Lävansucraseenzym gemäß der Erfindung
eine nennenswerte enzymatische Aktivität in einem breiten pH-Bereich in Anwesenheit
von Sucrose entwickelt. Es entwickelt bei einem pH-Wert im Bereich
von etwa 5, 5 bis etwa 6, 3 eine maximale, bei 55°C gemessene
enzymatische Aktivität.
Genauer ausgedrückt
entwickelt es bei einer Temperatur von etwa 55°C und bei einem pH-Wert im Bereich
von etwa 4,0 bis etwa 8,4 eine enzymatische Aktivität von mindestens
50% der maximalen, bei 55°C
gemessenen Aktivität.
Es entwickelt bei besagter Temperatur von etwa 55°C und bei
einem pH-Wert im Bereich von etwa 4,2 bis etwa 8,0 eine enzymatische
Aktivität
von mindestens 70% der maximalen, bei 55°C gemessenen Aktivität. Es entwickelt
bei besagter Temperatur und bei einem pH-Wert im Bereich von etwa
4,5 bis etwa 7,8 eine enzymatische Aktivität von mindestens 80% der maximalen,
bei 55°C
gemessenen Aktivität.
Es entwickelt bei etwa 55°C
und bei einem pH-Wert im Bereich von etwa 4,7 bis etwa 7,2 eine
enzymatische Aktivität
von mindestens 90% der maximalen, bei 55°C gemessenen Aktivität.
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Die
Bewertung der Auswirkung der Temperatur auf die Aktivität des Lävansucraseenzyms
wurde festgestellt, indem die Enzymreaktion bei einem pH-Wert von
5,5 nach Inkubation für
eine Stunde bei verschiedenen Temperaturen durchgeführt wurde,
d.h. bei 40°C,
50°C, 55°C, 60°C, 70°C und 80°C.
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Das
Reaktionsgemisch bestand aus 7,5 ml einer 60% (Gewicht/Volumen)
Sucroselösung
in 0,01 M Citratphosphatpuffer bei einem pH-Wert von 5,5 und 1,0
ml gewaschener Biomasse, die 30 LSU/ml Enzymaktivität enthält.
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Bei
einem pH-Wert von 5,5 entwickelt sich eine maximale Aktivität bei einer
Temperatur von etwa 60°C.
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Die
Auswirkung der Temperatur auf die Aktivität des Lävansucraseenzyms wird in 2 gezeigt. In dieser Figur zeigt die X-Achse
die Reaktionstemperatur in °C
und die Y-Achse
die Aktivität
ausgedrückt
in Prozent der maximalen Aktivität,
die sich bei 60°C
und bei einem pH-Wert von 5,5 entwickelt. Das Zeichen 0 stellt die
Meßwerte
für das
Enzym gemäß der Erfindung
dar und zu Vergleichszwecken stellt das Zeichen # die Meßwerte der
japanischen Patentanmeldung JP-A-52-82781
dar.
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2 zeigt, daß das Lävansucraseenzym gemäß der Erfindung
eine nennenswerte Wärmebeständigkeit
in Anwesenheit von Sucrose aufweist.
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Es
entwickelt bei einer Temperatur im Bereich von etwa 55°C bis etwa
64°C eine
maximale, bei einem pH-Wert von etwa 5,5 gemessene enzymatische
Aktivität.
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Genauer
ausgedrückt
entwickelt es bei einem pH-Wert von etwa 5,5 und bei einer Temperatur
im Bereich von etwa 35°C
bis etwa 75°C
eine enzymatische Aktivität
von mindestens 50% der maximalen, bei einem pH-Wert von 5,5 gemessenen
Aktivität.
Es entwickelt bei besagtem pH-Wert von etwa 5,5 und bei einer Temperatur
im Bereich von etwa 45°C
bis etwa 68°C
eine enzymatische Aktivität
von mindestens 80% der maximalen, bei einem pH-Wert von 5,5 gemessenen
Aktivität.
Es entwickelt bei besagtem pH-Wert von etwa 5,5 und bei einer Temperatur
im Bereich von etwa 50°C
bis etwa 67°C
eine enzymatische Aktivität
von mindestens 90% der maximalen, bei einem pH-Wert von 5,5 gemessenen
Aktivität.
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Beispiel 2
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Die
Auswirkung der Konzentration des Lävansucraseenzyms (LSU/g Sucrose)
auf die Zusammensetzung der Reaktionsprodukte wurde in verschiedenen
Zeitabschnitten bei einer Temperatur von 55°C bei einem pH-Wert von 5,5
gemessen.
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In
einem typischen Versuch wurden 4,5 g Sucrose in 9,5 ml Wasser mit
einer 0,5 ml Teilmenge von Biomasse inkubiert, die verschiedene
Anteile des Lävansucraseenzyms
enthält,
d.h. 4,5, 9,0 und 22,5 LSU bei einer Temperatur von 50°C. In verschiedenen
Zeitabschnitten wurden Proben entnommen und die Reaktion wurde durch
Erwärmung
auf 90°C
für 10
Minuten beendet.
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Die
Zusammensetzung der Produkte wurde durch Hochleistungsflüssigchromatographie
bestimmt (Tabelle 1). TABELLE
1 Auswirkung
der Lävansucraseenzymkonzentration
(LSU/g Sucrose) auf die Zusammensetzung der Reaktionsprodukte
- [Std] stellt die Einheit der Stunde dar.
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Die
Bildungsgeschwindigkeit von Glucose aus Sucrose durch das Lävansucraseenzym
stieg mit zunehmender Konzentration des Enzyms an. Ein Gehalt von
35% Lävan
wurde in allen Fällen
hergestellt. Ein Gehalt von 45% Glucose wurde in allen Fällen hergestellt.
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Beispiel 3
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Die
Wärmebeständigkeit
des Enzyms in Anwesenheit eines Substrats ist sehr wichtig für eine weitverbreitete
kommerzielle Anwendung des Enzyms. Die Auswirkung der Temperatur
auf die Zusammensetzung der Reaktionsprodukte wurde bei Temperaturen
von 40°C,
50°C und
60°C festgestellt.
Das Reaktionsgemisch bestand aus 7,5 ml einer 60% (Gewicht/Gewicht)
Sucroselösung
in 0,01 M Citratphosphatpuffer bei einem pH-Wert von 5,5 und 2,5
ml einer Enzymlösung,
die 40 Einheiten LSU enthält.
In verschiedenen Zeitabschnitten wurden Proben entnommen und die
Reaktion wurde durch Erwärmung
auf 90°C
für 10
Minuten beendet.
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Die
Produktzusammensetzung wurde durch Hochleistungsflüssigchromatographie
bestimmt (Tabelle 2).
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TABELLE
2 Auswirkung
der Temperatur auf die Zusammensetzung der Reaktionsprodukte
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Die
Meßwerte
in Tabelle 2 zeigen, daß das
Enzym der vorliegenden Erfindung eine gute Wärmebeständigkeit in Anwesenheit eines
Substrats zwischen 50 und 65°C
bei einem pH-Wert von 5,5 aufweist.
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Beispiel 4
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Eine
hohe Substratkonzentration ist für
den kommerziellen Erfolg jeder Umsetzung immer bevorzugt wegen der
hohen Energiekosten bei der Verdampfung der Reaktionsprodukte.
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Die
Auswirkung der Sucrosekonzentration auf die Zusammensetzung der
Reaktionsprodukte wurde in verschiedenen Zeitabschnitten während der
Inkubation der Sucrose mit dem Enzym bei einer Temperatur von 55°C und bei
einem pH-Wert von 5,5 untersucht.
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Ein
Acetatpuffer (0,1 M) wurde bei einem pH-Wert von 5,5 hergestellt,
der verschiedene Anteile Sucrose enthält. Geeignete Anteile des Enzyms
wurden zu einer Endkonzentration von 10 LSU/g Sucrose hinzugefügt und bei
55°C inkubiert.
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In
verschiedenen Zeitabschnitten wurden Proben entnommen und die Enzymreaktion
wurde durch Erwärmung
auf 90°C
für 10
Minuten beendet.
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Die
Zusammensetzung der Reaktionsprodukte wurde dann durch Hochleistungsflüssigchromatographie
bestimmt (Tabelle 3).
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TABELLE
3 Auswirkung
der Sucrosekonzentration auf die Zusammensetzung der Reaktionsprodukte
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Die
in Tabelle 3 angeführten
Ergebnisse zeigen, daß die
Transfructosylation mit zunehmender Sucrosekonzentration anstieg.
Das Verhältnis
des gebildeten Lävans
zu freier Fructose war in jedem Zeitabschnitt bei höherer Substratkonzentration
höher verglichen
mit dem Verhältnis
bei niedrigerer Substratkonzentration. Zum Beispiel liegt das Verhältnis des
Lävans
zu freier Fructose zwischen 1,4 und 2,2 bei 30% Sucrosekonzentration,
während
das Verhältnis
4,5 – 5,0
bei 75% Sucrosekonzentration beträgt. Das deutet sehr darauf
hin, daß die
niedrige Wasseraktivität
die Lävanherstellung
begünstigt.