DK176108B1 - Levansaccharase-enzym, fremgangsmåde og mikroorganismer til fremstilling heraf og sammensætninger indeholdende dette - Google Patents

Description

DK 176108 B1

Den foreliggende opfindelse angår et syrestabilt levansaccharase-enzym, mikroorganismer til fremstilling heraf, fremgangsmåde til fremstilling af dette syrestabile levansaccharase-enzym, sammensætninger, der indeholder dette og anvendelse deraf.

5

Levansaccharase-enzymer katalyserer omdannelsen af fructose. Nærmere bestemt katalyserer levansaccharase-enzymer (E.C.2.4.1.10) omdannelse af fructosylrester fra saccharose, raffinose eller stachyose til et passende co-substrat ved dannelse af polymere, der alment betegnes levaner, og som 10 indeholder forskellige mængder fructosylrester bestående af β(2->6)-bindinger. Levaner finder udbredt anvendelse inden for den kemiske industri og fødevareindustrien såvel som inden for medicin og forskning.

Levansaccharase-enzymer er blevet isoleret fra et stort antal mikrobielle kil-15 der, såsom mikroorganismerne Acetobacter suboxydans, Actinomyces viscosus, Aerobacter levanicum, Bacillus amyloliquefaciens, Bacillus licheni-formis, Bacillus mesentericus, Bacillus subtilis, Glucobacter oxydans, Streptococcus mutans, Streptococcus salivarius, Streptomyces griseus, Zymomo-nas mobilis.

20 I de fleste tilfælde er enzymet ekstracellulært og varmeustabilt. Et af de væsentligste elementer ved fremstillingen af levansaccharase-enzymer er, at der mindst skal tilføres 5% saccharose til vækstmediet for at inducere enzymsyntesen, når der anvendes kendte mikroorganismer til fremstillingen af 25 levansaccharase-enzymer.

Som følge heraf er det vanskeligt at separere levansaccharase-enzymet fra næringsvæsken, fordi næringsvæskens viskositet forøges, når der fremstilles levan under fermenteringen. Der søges derfor til stadighed efter mikroorga-30 nismer, der kræver ingen eller kun små mængder saccharose for at fremstille levansaccharase.

2 DK 176108 B1 I den japanske patentansøgning JP-A-52-82781 beskrives en fremgangsmåde til fremstilling af et ekstracellulært levansaccharase-enzym i nærvær af lave saccharosekoncentrationer (0,3 vægt/rumfangs-%) ved anvendelse af Bacillus licheniformis stamme AJ 3982 (Institute of Microbial Engineering de-5 poneringsnr. 3373). Dette enzym behøver dog stadig saccharose for at induceres og fremstilles. Endvidere udviser dette levansaccharase-enzym ingen enzymatisk aktivitet ved en pH-værdi på 4,0, når det holdes ved en temperatur på 55 *C. Ved denne temperatur udviser det kun 50% af dets maksimale aktivitet ved en pH-værdi på ca. 5,2 og kun ca. 80% af dets maksimale aktivi-10 tet ved pH-værdier i området ca. 6-7,8. Dette snævre pH-interval begrænser anvendelsesmulighederne for dette levansaccharase-enzym. Levansaccha-rase-enzymets syrestabilitet er meget vigtig, for at enzymet kan opnå udbredt kommerciel anvendelse.

15 Den foreliggende opfindelse har det formål at tilvejebringe et levansaccharase-enzym, der udviser enzymatisk aktivitet i et bredere pH-interval end kendte enzymer, og som i modsætning til kendte enzymer er stabilt ved sure pH-værdier.

20 Med dette formål tilvejebringer den foreliggende opfindelse et syrestabilt levansaccharase-enzym fremstillet ved hjælp af en mikroorganisme, der tilhører arten Bacillus, og som ved en temperatur på ca. 55 °C og en pH-værdi på 4,0 udviser en enzymatisk aktivitet på mindst 50% af den maksimale aktivitet, der er målt ved 55 °C og pH 5,5 - 6,3, og at enzymet kan opnås fra Bacillus 25 licheniformis-stammen NRRL-18962.

Levansaccharase-enzymet ifølge den foreliggende opfindelse udviser endvidere en væsentlig enzymatisk aktivitet i et bredt pH-interval i nærvær af et substrat, såsom saccharose. Endvidere udviser det ved pH-værdier i interval-30 let ca. 5,5-6,3 den maksimale enzymatiske aktivitet målt ved ca. 55 “C.

Mere præcist udviser det ved en temperatur på 55 °C og pH-værdier i intervallet ca. 4,0-8,4 en enzymatisk aktivitet på mindst 50% af den maksimale 3 DK 176108 B1 aktivitet målt ved 55 °C. Ved en temperatur på 55 'C og pH-værdier i intervallet ca. 4,2-8,0 udviser det en enzymatisk aktivitet på mindst 70% af den maksimale aktivitet målt ved 55 °C. Ved en temperatur på 55 °C og pH-værdier i intervallet ca. 4,5-7,8 udviser det en enzymatisk aktivitet på mindst 5 80% af den maksimale aktivitet målt ved 55 °C. Ved en temperatur på ca. 55 'C og pH-:værdier i intervallet ca. 4,7-7,2 udviser det en aktivitet på mindst 90% af den maksimale aktivitet målt ved 55 ’C.

Levansaccharase-enzymet ifølge den foreliggende opfindelse udviser en 10 væsentlig termisk stabilitet i nærvær af et substrat, såsom saccharose. Endvidere udviser det ved temperaturer i intervallet ca. 55-64 ‘C maksimal enzymatisk aktivitet ved en pH-værdi på 5,5.

Mere præcist udviser det ved en pH-værdi på ca. 5,5 og ved temperaturer i 15 intervallet ca. 35-75 ‘C en enzymatisk aktivitet på mindst 50% af den maksimale aktivitet ved en pH-værdi på 5,5. Ved en pH-værdi på 5,5 og temperatu- i rer i intervallet ca. 45-68 °C udviser det en enzymatisk aktivitet på mindst 80% af den maksimale aktivitet målt ved en pH-værdi på 5,5. Ved en pH-værdi på ca. 5,5 og temperaturer i intervallet ca. 50-67 'C udviser det en en-20 zymatisk aktivitet på mindst 90% af den maksimale aktivitet målt ved en pH-værdi på 5,5.

Levansaccharase-enzym ifølge den foreliggende opfindelse er et cellebundet enzym. Det besidder fructosyltransferase-aktivitet og er således i stand til at 25 fremstille fructosylpolymere fra saccharose bestående af p-D(2->6)-bundet fructose, der tilhører ''levan-familien".

Levansaccharase-enzymet ifølge den foreliggende opfindelse er ikke et sac-charoseinducerbart enzym, dvs. at det ikke behøver saccharose for at indu-30 ceres og fremstilles.

4 DK 176108 B1

Ifølge den foreliggende opfindelse tilvejebringes endvidere en fremgangsmåde til fremstilling af et syrestabilt levansaccharase-enzym ved anvendelse af en mikroorganisme i fravær af tilførsel af saccharose til næringsmediet.

5 Fremgangsmåden ifølge den foreliggende opfindelse til fremstilling af et syrestabilt levansaccharase-enzym omfatter følgende trin: (i) en mikroorganisme af slægten Bacillus dyrkes i et passende næringsmedium ved at danne en fermenteringsvæske, der omfatter 10 en biomasse, og (ii) levansaccharase-enzymet indvindes fra fermenteringsvæsken, hvori mikroorganismen er dyrket i fravær af saccharose.

15 Den foreliggende opfindelse har endvidere det formål at tilvejebringe en ny mikroorganisme af slægten Bacillus, der kan fremstille et syrestabilt levansaccharase-enzym i fravær af saccharose i næringsmediet.

Opfindelsen angår således en ikke tidligere kendt mikroorganisme af arten 20 Bacillus licheniformis, nærmere bestemt af arten Bacillus licheniformis APMC 84, der kan fremstille et syrestabilt levansaccharase-enzym i fravær af saccharose i næringsmediet. Mikroorganismen er i overensstemmelse med Bu-dapesttraktaten blevet deponeret ved Agricultural Research Culture Collection (NRRL) Peoria, Illinois.

25

Deponeringsnummeret er NRRL B-18962.

Levansaccharase-enzymet ifølge den foreliggende opfindelse kan fremstilles ikke alene ved hjælp af stammen Bacillus licheniformis NRRL B-18962, men 30 også ved hjælp af naturlige eller kunstige mutanter og andre derivater af denne mikroorganisme. Sådanne mutanter kan opnås ved hjælp af kendte teknikker, såsom røntgenstråling, ultraviolet bestråling, kemiske mutagener og genmanipulation.

___—---------- - - - _ . - ______— 5 DK 176108 B1

Levansaccharase-enzymet fremstillet ved fremgangsmåden ifølge den foreliggende opfindelse dannes ved at dyrke mikroorganismen af arten Bacillus i et næringsmedium indeholdende carbon, nitrogen og uorganiske salte under aerobe betingelser i fravær af saccharose, og derefter at indvinde levansac-5 charase-enzymet derfra.

Dyrkningsbetingelserne for disse mikroorganismer, såsom bestanddelene af næringsmediet og valg af parametre for dette, herunder temperatur, pH, omrøring og gennemluftning, er indlysende for fagmænd.

10

Egnede carbonkilder omfatter glucose, fructose, maltodextriner, glycerol, majssirup, stivelse, hydrolyseret stivelse og blandinger af to eller flere af disse carbonkilder. Foretrukne carbonkilder er majssirup og hydrolyseret stivelse.

15

Anvendelige nitrogenkilder omfatter sojabønnemel, majsudvandingsvæske, kartoffelmel, bomuldsfrømel, fiskemel, gær, gærekstrakt eller blandinger af to eller flere af disse nitrogenkilder. Foretrukne nitrogenkilder er sojabønnemel, bomuldsfrømel, gærekstrakt og en blanding af sojabønnemel og gærekstrakt.

20

Egnede salte omfatter kaliumsulfat, mangansulfat, ammoniumsulfat, ammoniumcitrat, kaliumphosphat, natriummonohydrogenphosphat, natriumdi-hydrogenphosphat, calciumchlorid, natriumcitrat eller blandinger af to eller flere af disse salte. Foretrukne salte omfatter en blanding af natriummono-25 hydrogenphosphat, natriumdihydrogenphosphat, calciumchlorid og natriumcitrat.

Mediet indeholdende ovennævnte bestanddele steriliseres på konventionel vis og podes med den passende mikroorganismestamme, fortrinsvis med 30 stammen B. licheniformis, og især med stammen B. licheniformis APMC 84.

Dyrkning udøves aerobt, mens blanding foregår ved omrystning eller gennemluftning, typisk ved en temperatur mellem ca. 25 og 46 ‘C i ca. 6-40 timer 6 DK 176108 B1 og ved én pH-værdi mellem ca. 5,0 og 8,5. Dyrkning udøves fortrinsvis ved en temperatur mellem ca. 30 og 42 'C i ca. 12-30 timer og ved en pH-værdi mellem ca. 6,0 og 8,0. Der opnås gode resultater, når dyrkningen udøves ved en temperatur mellem ca. 36 og 40 *C og ved en pH-værdi mellem ca.

5 6,5 og 8,5.

Efter dyrkningen opnås en fermenteringsvæske indeholdende en biomasse.

Denne biomasse, der indeholder celler af mikroorganismerne med det celle-bundne levansaccharase-enzym, separeres og indvindes fra dyrkningsfiltra-10 tet ved anvendelse af konventionelle teknikker, såsom centrifugering, udsaltning, udfældning, filtrering, ultrafiltrering, mikrofiltrering, centrifugering efterfulgt af ultrafiltrering eller filtrering efterfulgt af mikrofiltrering.

Den separerede og indvundne biomasse bliver derefter vasket, fortrinsvis 15 flere gange med vand, især med afioniseret destilleret vand, og homogeniseret. Den gentagne vaskning af biomassen påvirker ikke aktiviteten af det cel-lebundne levansaccharase-enzym, hvilken fører til den konklusion, at enzymet ér stærkt bundet til cellen. Levansaccharase-enzymet kan, hvis det er nødvendigt, oprenses yderligere, afhængigt af til hvilket formål det skal an-20 vendes. Det cellebundne enzym kan opløses i nærvær af ioniske vaskemidler, såsom natriumcholat eller natriumdodecylsulfat (0,25-2,5%) eller saltopløsninger, såsom opløsninger indeholdende Mg2* . Enzymet kan også udfældes ved hjælp af ammoniumsulfat i en koncentration svarende til 65-95% mætning ved en temperatur på ca. 0 *C. Såfremt det er nødvendigt, kan der 25 endvidere anvendes en ultralydsteknik til at separere levansaccharase-enzymet og cellerne.

Levansaccharase-enzymet kan tilføres til sammensætninger, der er anvendelige inden for forskellige former for industri, såsom i særdeleshed fødeva-30 reindustrien, den farmaceutiske og den kemiske industri.

Levansaccharase-enzymet formuleres i overensstemmelse med til hvilket formål, det skal anvendes. Normalt tilsættes der endvidere stabilisatorer og 7 DK 176108 B1 konserveringsmidler til enzymsammensætningerne. F.eks. kan enzymet stabiliseres ved at tilsætte glycerol (50 rumfangs-%), ammoniumsulfat (3,2 mol/l) eller natriumchlorid (3 mol/l) til den vandige enzymopløsning.

5 Ved medicinske anvendelser anvendes enzymet fortrinsvis på lyofiliseret é form.

Ved anvendelser i fødevarer kan enzymet anvendes på immobiliserét form, hvor enzymet er blevet koblet til i det væsentlige uopløselige inerte bærerma-10 terialer, hvilket letter anvendelsen af disse enzymer i gennemstrømningsreaktorer. Normalt er enzymet fastgjort til bærermaterialet. Anvendelige bærermaterialer omfatter organiske og uorganiske materialer, såsom porøst dia-toméjordgranulat behandlet med en opløsning af polyamin og glutaraldehyd, aktivt carbongranulat, overfladeaktive materialer, såsom aluminiumoxid, car- -15 bon, ler, zirkoniumoxid, titaniumoxid, ionbytningsharpikser, cellulose eller glas, kemisk aktiverede bærermaterialer, såsom cellulose, agarose, syntetiske polymere, geler af f.eks. polyacrylamider, siliciumdioxid og stivelse, hvor enzymet indkapsles i en polymermatrix. Fortrinsvis anvendes hele Bacillus-celler indeholdende ievansaccharase-enzym direkte ved immobiliseringen 20 uden forudgående isolation og oprensning af enzymet. Sammensætningerne, der indeholder levansaccharase-enzymet ifølge den foreliggende opfindelse, kan anvendes enten på flydende eller fast form. Disse sammensætninger kan omdannes til et færdigt produkt, der enten er en flydende opløsning, et fast stof, et granulat, et pulver eller en opslæmning.

25

Sammensætningerne ifølge den foreliggende opfindelse kan anvendes til fremstilling af levaner fra sukkerarter indeholdende fructosylrester, såsom saccharose, raffinose eller stachyose. Disse sukkerarter kan indvindes fra råmaterialer, såsom rå sukkerroer, oprenset saft fra knuste eller findelte suk-30 kerroer, melasser, rørsukkerarter, roesukkerarter, plantesukkerarter.

De opnåede levaner kan være højmolekylære levaner, lavmolekylære levaner (fructooligosaccharider) og fructosylpolymere.

8 DK 176108 B1

Den foreliggende opfindelse skal yderligere illustreres ved hjælp af følgende eksempler: 5 EKSEMPEL 1 i

Et podningsmedium anvendt til podestofudvikling fremstilles ud fra følgende bestanddele (i vægt/rumfangs-%): calciumchlorid 0,02%, natriumcitrat 0,3%, hydrolyseret stivelse forhandlet under varemærket Maltrin 100 (GPC) 2,6%, 10 bomuldsfrømel forhandlet under varemærket PHARMAMEDIA (Traders Protein) 4,6%, natriummonohydrogenphosphat 0,21% og natriumdihydrogen-phosphat 0,54%. Dette podningsmedium steriliseres ved at varmebehandle podningskolber, nærmere betegnet 250 ml Erlenmeyer-kolber forsynet med tre skvulpeplader, indeholdende 50 ml podningsmedium ved 125 ?C i 30 mi-15 nutter. Derefter blev de podet med en frossen glycerolkultur af stammen B. licheniformis APMC 84.

|

Podningen af denne stamme udvikles på en roteromryster ved 37 ‘C i 24 timer før anvendelsen af dette som podestof til produktionskolbeme.

20

Mediet, der anvendes ved fremstilling af levansaccharase-enzym, fremstilles ud fra følgende bestanddele (i vægt/rumfangs-%): majssirup forhandlet under varemærket Staley 200 majssirup (A.E. Staley) 10,3%, sojabønnemel forhandlet under varemærket Promosoy 100 (Central Soya) 5,5%, gærekstrakt 25 (forhandlet af Universal Food Corp.) 0,32%, natriummonohydrogenphosphat 0,7% og natriumdihydrogenphosphat 0,7%.

Dette produktionsmedium steriliseres ved opvarmning af podningskolber, nærmere betegnet 250 ml Erlenmeyer-kolber forsynet med tre skvulpeplader, 30 indeholdende 50 ml produktionsmedium ved 125 eC i 30 minutter.

Podestofmængdén er på 2 rumfang/rumfangs-%. De podede produktionskolber inkuberes på en roteromryster ved en temperatur på 37 *C i 16-20 timer.

9 DK 176108 B1

Der observeres ingen forøgelse af viskositeten ved dannelse af levan i fermenteringsvæsken.

5 Det fremstillede enzym isoleres let, næsten uden problemer som følge af væskens klæbrig hed.

Biomassen indeholdt i kolberne separeres fra fermenteringsvæsken ved hjælp af centrifugering, hvorefter cellerne vaskes to gange med afioniseret 10 destilleret vand og homogeniseres.

Levansaccharase-enzymet ifølge den foreliggende opfindelse indvindes.

En levansaccharase-enzym-enhed (LSU) defineres som den enzymaktivitet, 15 der kræves for at fremstille et mikromol glucose pr. minut under analysebetingelser.

Enzymaktiviteten blev målt ved anvendelse af saccharose som substrat.

20 Til en milliliter enzym blev der tilført 7,5 ml 0,01 M citratbuffer, pH % 5,5, indeholdende 60 vægt/vægt-% saccharose. Derefter blev rumfanget af reaktionsblandingen justeret til 10 ml ved anvendelse af destilleret vand og inkuberet i 1 time ved 55 ’C. Efter det specificerede tidsrum blev den enzymatiske reaktion afbrudt ved at opvarme til 95 "C i 10 minutter. Reaktionsprodukter-25 nes glucoseindhold blev bestemt ved HPLC (High Performance Liquid Chromatography)-analyse (K.M. Brobst og H.D. Schobel, 1982, Starch/starke, 34,117-121).

pH-værdiens indflydelse på levansaccharase-enzymets aktivitet blev bestemt 30 ved at udføre den enzymatiske transfructosylationsreaktion, efter inkubation ved 55 ‘C i 1 time, ved forskellige pH-værdier, dvs. pH = 4,0, 4,5, 5,0, 5,5, 6,0, 6,5, 7,0, 7,5 og 8,0, ved anvendelse af en passende phosphatbuffer 10 DK 176108 B1 (0,01 M). Den dannede mængde glucose blev bestemt ved HPLC (High Performance Liquid Chromatography)-analyse. Heraf blev aktiviteten beregnet.

Ved 55 "C udvistes der maksimal aktivitet ved pH-værdier i området 5,5-6,0.

5

Fig. 1 illustrerer pH-værdiens indflydelse på enzymaktiviteten ved temperaturen 55 'C. I denne figur repræsenterer abeissen pH-værdien og ordinaten aktiviteten udtrykt i procent af den maksimale aktivitet, der udvises ved pH = 5,5 og en temperatur på 55 °C. Datapunkterne for enzymet ifølge den forelig-10 gende,opfindelse er plottet med symbolet 0, og for sammenligningens skyld er datapunkterne fra det japanske patentskrift JP-A-52-82781 plottet med symbolet #, Enzymet ifølge den foreliggende opfindelse er mere stabilt i det sure pH-område end enzymet beskrevet i ovennævnte japanske patentskrift.

15 Enzymet ifølge den foreliggende opfindelse udviser ved 55 *C og pH = 4,0 over 50% af dets maksimale aktivitet målt ved 55 “C, hvorimod det kendte enzym ikke udviser nogen aktivitet ved pH = 4,0 og 55 °C.

Fig. 1 viser, at levansaccharase-enzymet ifølge den foreliggende opfindelse 20 udviser betydelig enzymatisk aktivitet i et bredt pH-interval i nærvær af saccharose. Det udviser ved pH-værdier i intervallet ca. 5,5-6,3 den maksimale aktivitet ved 55 °C. Mere præcist udviser det ved en temperatur på 55 'C og pH-værdier i intervallet ca. 4,0-8,4 en enzymatisk aktivitet på mindst 50% af den maksimale aktivitet målt ved 55 *C. Ved en temperatur på 55 'C og pH-25 værdier i intervallet ca. 4,2-8,0 udviser det en enzymatisk aktivitet på mindst 70% af den maksimale aktivitet målt ved 55 ’C. Ved en temperatur på 55 ‘C og pH-værdier i intervallet ca. 4,5-7,8 udviser det en enzymatisk aktivitet på mindst 80% af den maksimale aktivitet målt ved 55 °C. Ved en temperatur på ca. 55 °C og pH-værdier i intervallet ca. 4,7-7,2 udviser det en aktivitet på 30 mindst 90% af den maksimale aktivitet målt ved 55 "C.

Temperaturens indflydelse på levansaccharase-enzymets aktivitet blev bestemt ved at udføre den enzymatiske reaktion ved pH = 5,5, efter 1 times 11 DK 176108 B1 inkubation, ved forskellige temperaturer, dvs. ved temperaturerne 40, 50, 55, 60, 70 og 80 *C.

Reaktionsblandingen bestod af 7,5 ml 60 vægt/rumfangs-% saccharo-5 seopløsning i 0,01 M citrat/phosphatbuffer med pH = 5,5 og 1,0 ml vasket biomasse med en enzymaktivitet på30 LSU/ml.

Ved pH-værdien 5,5 udvistes der maksimal aktivitet ved en temperatur på ca.

60 “C.

10

Temperaturens indflydelse på levansaccharase-enzymaktiviteten vises i fig.

2. I denne figur repræsenterer abeissen reaktionstemperaturen i °C og ordinaten aktiviteten udtrykt i procent af den maksimale aktivitet, der udvises ved 60 'C og pH = 5,5. Datapunkterne for enzymet ifølge den foreliggende opfin-15 delse er plottet med symbolet 0, og for sammenligningens skyld er datapunk-teme fra det japanske patentskrift JP-A-52-82781 plottet med symbolet #.

Figur 2 viser, at levansaccharase-enzymet ifølge den foreliggende opfindelse har en betydelig termisk stabilitet i nærvær af saccharose.

20

Ved temperaturer i intervallet ca. 55-64 °C opnås der maksimal enzymatisk aktivitet ved en pH-værdi på ca. 5,5.

Mere præcist udviser det ved en pH-værdi på ca. 5,5 og ved temperaturer i 25 intervallet ca. 35-75 °C en enzymatisk aktivitet på mindst 50% af den maksimale aktivitet ved en pH-værdi på 5,5. Ved en pH-værdi på 5,5 og temperaturer i intervallet ca. 45-68 ‘C udviser det en enzymatisk aktivitet på mindst 80% af den maksimale aktivitet målt ved en pH-værdi på 5,5. Ved en pH-værdi på ca. 5,5 og temperaturer i intervallet ca. 50-67 °C udviser det en en-30 zymatisk aktivitet på mindst 90% af den maksimale aktivitet målt ved en pH-værdi på 5,5.

12 DK 176108 B1 EKSEMPEL 2

Levansaccharase-enzym-koncentrationens (LSU/g saccharose) indflydelse på reaktionsproduktemes sammensætning til forskellige tidspunkter blev målt 5 ved en temperatur på 55 °C og en pH-værdi på 5,5.

I et typisk eksperiment blev 4,5 g saccharose i 9,5 ml vand inkuberet med 0,5 ml biomasse, der indeholdt forskellige mængder levansaccharase-enzym, dvs. 4,5, 9,0 og 22,5 LSU ved en temperatur på 50 "C. Prøver blev udtaget til 10 forskellige tidspunkter og reaktionen blev afbrudt ved at opvarme til 90 °C i 10 minutter.

Produktets bestanddele blev bestemt ved hjælp af High Performance Liquid Chromatography (Tabel 1).

DK 176108 B1 13 TABEL 1

Levansaccharase-enzym-koncentrationens (LSU/g saccharose) indflydelse på réaktionsproduktemes sammensætning ' 5

Reaktionsprodukternes sammensætning (%)

Enzymkon- ---- centration Tid Saccha- LSU/g saccharose [timer] Fructose Glucose rose Levan 1 LSU/g 2 2,48 4,93 86,82 5,77 4 4,13 9,63 76,24 10,00 6 5,50 41,06 66,74 13,70 8 6,94 18,41 58,54 16,56 12 7,49 23,60 47,30 21,61 16 8,60 28,95 37,90 24,55 24 9,79 36,35 23,14 30,71 .

36 10,90 41,57 13,40 34,14 44 11,24 42,91 10,55 35,29 2 LSU/g 2 3,99 10,10 76,55 9,36 4 6,41 18,59 58,28 16,72 6 7,87 26,09 43,09 22,95 8 9,03 32,33 31,59 27,08 12 10,22 39,27 17,74 32,77 16 10,93 42,93 11,11 35,02 24 11,76 45,25 6,90 36,08 5 LSU/g 2 7,19 23,94 48,02 20,35 4 9,76 38,61 19,23 32,39 6 10,98 44,28 8,71 36,02 8 11,41 45,65 6,48 36,46 12 12,34 45,32 6,43 35,91 16 13,01 45,46 6,06 35,47 14 DK 176108 B1

Hastigheden, hvormed levansaccharase-enzymet danner glucose ud fra saccharose, forøges, når enzymkoncentrationen forøges. I alle tilfælde blev der fremstillet 35% levan og 45% glucose.

5 EKSEMPEL 3

Den termiske stabilitet af enzymet i nærvær af substratet er meget vigtig, hvis enzymet skal finde udbredt kommerciel anvendelse. Temperaturens indflydelse på reaktionsprodukternes sammensætning blev bestemt ved tempera-10 turerne 40, 50 og 60 °C. Reaktionsblandingen bestod af 7,5 ml 60 vægt/vægt-% saccharoseopløsning i 0,01 M citrat/phosphat-buffer, pH = 5,5 og 2,5 ml enzymopløsning indeholdende 40 LSU-enheder. Prøver blev udtaget til forskellige tidspunkter, og reaktionen blev afbrudt ved at opvarme til 90 'C i 10 minutter.

15

Produktsammensætningen blev bestemt ved High Performance Liquid Chromatography (Tabel 2).

TABEL 2 15 DK 176108 B1

Temperaturens indflydelse på reaktionsprodukternes sammensætning 5 --- J Reaktionsprodukternes sammensætning (%)

Reaktions- Tid Saccha- , temperatur [timer] Fructose Glucose rose Levan 50 "C 4 7,50 23,31 47,33 21,86 10 8 9,15 35,54 24,16 31,15 14 11,28 47,30 7,27 34,15 24 11,09 43,32 10,58 35,01 55 °C 4 7,92 24,32 45,26 22,50 8 10,63 35,58 23,39 30,41 14 13,80 46,07 9,07 30,93 24 14,43 46,77 6,20 32,61 Ί5------- 60 °C 4 8,65 23,66 46,35 21,34 8 11,51 32,14 29,98 26,36 14 15,11 42,87 18,09 23,93 24 14,55 40,36 14,74 30,36 20 De i tabel 2 angivne data viser, at enzymet ifølge den foreliggende opfindelse har en god termisk stabilitet i nærvær af substrat ved temperaturer mellem 50 og 65 'C og en pH-værdi på 5,5.

EKSEMPEL 4 25

Grundet de store energimæssige omkostninger forbundet med afdampning af reaktionsprodukteme, foretrækkes der altid, for at opnå en kommerciel succes, anvendelse af høje substratkoncentrationer.

30 Saccharosekoncentrationens indflydelse på reaktionsprodukternes sammensætning blev undersøgt til forskellige tidspunkter under den enzymatiske inkubation af saccharose ved en temperatur på 55 'C og ved pH-værdien 5,5.

16 DK 176108 B1

En acetatbuffer (0,1 M) med en pH-værdi på 5,5 indeholdende forskellige mængder saccharose blev fremstillet. Passende mængder enzym blev tilført, indtil der blev opnået en endelig koncentration på 10 LSU/g saccharose, hvorefter inkubationen blev udøvet ved 55 *C.

5

Prøver blev udtaget til forskellige tidspunkter, og den enzymatiske reaktion blev afbrudt ved at opvarme til 90 'C i 10 minutter.

Reaktionsprodukternes sammensætning blev derefter bestemt ved HPLC 10 (tabel 3).

TABEL 3 17 DK 176108 B1

Saccharosekoncentrationernes indflydelse på reaktionsproduktemes sammensætning 5 __ ,__

Forhol-

Saccha- det rosekon- Sammensætning (%) mellem centra- ---- Levan tion Tid Saccha- og frit g/100 ml [timer] Fructose Glucose rose Levan fructose 10 30 5 9,75 25,69 43,88 21,57 2,21 8 12,47 32,78 30,09 24,67 1,98 12 16,14 43,04 17,75 23,08 1,43 24 17,67 45,35 6,66 30,33 1,73 45 5 8,99 29,44 36,84 24,72 2,75 8 10,71 36,40 22,75 30,13 2,81 12 13,66 44,31 11,03 31,00 2,27 1ΰ 24 13,56 42,75 10,20 33,46 2,46 60 5 6,93 29,47 34,12 29,49 4,26 8 8,46 39,93 20,55 34,05 4,02 12 11,12 44,98 8,78 34,12 3,16 24 14,03 44,98 5,37 35,62 2,54 9n 75 5 6,25 29,15 33,34 31,27 5,00 8 7,57 37,30 19,00 36,12 4,77 12 9,45 44,26 8,93 37,34 3,95 24 10,76 43,31 4,96 41,12 3,82

Resultaterne angivet i tabel 3 viser, at transfructosylationen forøgedes, når saccharosekoncentrationen blev forøget. Forholdet mellem mængden af 25 fremstillet levan og frit fructose var til ethvert tidspunkt større ved højere end ved lavere substratkoncentrationer. F.eks. ligger levan/frit fructose-forholdet mellem 1,4 og 2,2 ved en saccharosekoncentration på 30% og forholdet er 4,5-5,0 ved en saccharosekoncentration på 75%. Herved antydes det kraftigt, at lav vandaktivitet begunstiger dannelse af levan.

Claims (18)

1. Syrestabilt levansaccharase-enzym fremstillet af en mikroorganisme af arten Bacillus, kendetegnet ved, at det ved en temperatur på ca. 55 5 ’C og en pH-værdi på 4,0 udviser en enzymatisk aktivitet, der mindst er lig med 50% af den maksimale aktivitet målt ved 55 “C og pH 5,5-6,3, og at enzymet kan opnås fra Bacillus licheniformis-stammen NRRL-18962.

2. Syrestabilt levansaccharase-enzym ifølge krav 1, kendetegnet ved, 10 at det endvidere ved en pH-værdi i intervallet ca. 5,5-6,3 udviser den maksimale enzymatiske aktivitet ved ca. 55 “C.

3. Levansaccharase-enzym ifølge krav 1 eller 2, kendetegnet ved, at det endvidere ved ca. 55 °C og en pH-værdi i intervallet ca. 4,0-8,4 udviser 15 en enzymatisk aktivitet, der mindst er lig med 50% af den maksimale aktivitet målt ved 55 °C.

4. Levansaccharase-enzym ifølge krav 3, kendetegnet ved, at det endvidere ved en temperatur på ca. 55 *C og en pH-værdi i intervallet ca. 20 4,5-7,8 udviser en enzymatisk aktivitet, der mindst er lig med 80% af den maksimale aktivitet målt ved 55 'C.

5 B-18962, og indeholdende levansaccharase-enzymet er immobiliserede.

5. Levansaccharase-enzym ifølge krav 1 eller 2, kendetegnet ved, at det endvidere ved en pH-værdi på ca. 5,5 og temperaturer i intervallet ca. 35- 25 75 "C udviser en enzymatisk aktivitet, der mindst er lig med 50% af den mak simale aktivitet målt ved en pH-værdi på 5,5.

6. Fremgangsmåde til fremstilling af et syrestabilt levansaccharase-enzym ifølge krav 1, kendetegnet ved, at den omfatter følgende trin: 30 DK 176108 B1 (i) en mikroorganisme af slægten Bacillus dyrkes i et passende næ ringsmedium ved at danne en fermenteringsvæske indeholdende en biomasse, og 5 (ii) levansaccharase-enzymet indvindes fra fermenteringsvæsken, hvori mikroorganismen er dyrket i fravær af saccharose.

7. Fremgangsmåde ifølge krav 6, kendetegnet ved, at mikroorganismen er af arten Bacillus licheniformis. 10

8. Fremgangsmåde ifølge krav 7, kendetegnet ved, at mikroorganismen er Bacillus licheniformis NRRL B-18962.

9. Fremgangsmåde ifølge krav 6, kendetegnet ved, at trinnet (ii) 15 endvidere omfatter: l (a) biomassen indeholdende mikroorganismecellerne med levan saccharase-enzymet separeres fra dyrkningsfiltratet, og 20 (b) den derfra separerede biomasse vaskes.

10. Bacillus licheniformis APMC 84, der er deponeret under nummeret NRRL B-18962.

11. Bacillus licheniformis ifølge krav 10, kendetegnet ved, at den fremstiller et syrestabilt levansaccharase-enzym i fravær af saccharose i næringsmediet.

12. Sammensætning til anvendelse i kemisk industri, kendetegnet 30 ved, at den indeholder det syrestabile levansaccharase-enzym ifølge krav 1.

13. Sammensætning ifølge krav 12 i form af en væskeopløsning. DK 176108 B1

14. Sammensætning ifølge krav 12 i form af et fast stof.

15. Sammensætning ifølge krav 12, kendetegnet ved, at levansac-charase-enzymet eller de hele Bacillusceller, som er deponeret under NRLL

16. Sammensætning ifølge krav 12 til fremstilling af levaner.

17. Anvendelse af et enzym ifølge ethvert af kravene 1-5 til fremstilling af 10 levaner.

18. Anvendelse af et enzym ifølge ethvert af kravene 1-5 i den kemiske industri eller i levnedsmiddelindustrien. 15