CN113462573A - 农用芽孢杆菌液态菌剂的保存方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种农用芽孢杆菌液态菌剂的保存方法，该方法是将芽孢杆菌液态菌剂调节pH值至中性后，加入保护剂，密封，室温储存；其中，每体积份农用芽孢杆菌液态菌剂加入由0.8‑1重量份山梨酸钾、0.5‑0.7重量份甘油、2‑3重量份葡萄糖及3‑5重量份磷酸二氢钾组成的保护剂，体积与重量的对应关系为g与L。本发明通过限制芽孢杆菌液态菌剂芽孢形成率及pH值、调整保护剂配比，用于农用芽孢杆菌液态菌剂的保存，显著提高保存效果、菌体死亡率均不高于18.5%、降低成本。

Description

农用芽孢杆菌液态菌剂的保存方法
技术领域
本发明属于液态菌剂存储技术领域，涉及一种液态菌剂的保存方法，具体地说是农用芽孢杆菌液态菌剂的保存方法。
背景技术
农用微生物菌剂是指目标功能菌经过发酵扩繁后加工制成的一种活菌制剂。施用农用微生物菌剂可以增强土壤生物活性、改善土壤结构、增强土壤保水保肥能力、减少土传病害、促进作物生长、提高作物产量和质量。农用微生物菌剂可直接作为微生物肥料，也可用于生物有机肥的生产。芽孢杆菌是一类重要的生物防治菌，具有繁殖快、抗逆性强和存活时间长等特点，同时还能够产生抗菌物质或促生物质，有些芽孢杆菌还具有固氮、溶磷和解钾的能力，是农用微生物菌剂中最常使用的微生物种类。
按照剂型，农用微生物菌剂可分为固态和液态两种类型。目前国内外的农用微生物菌剂市场上以固态菌剂为主，然而，相比于固态菌剂，液态菌剂具有制备工艺简单、生产成本更低，使用更方便等优势，具有较大应用前景；但液态菌剂在常温的储存、运输及销售过程中，由于营养贫乏、温度胁迫和低氧等不利的环境条件造成菌剂活菌数快速降低、保质期短，尤其，枯草芽孢杆菌剂在室温下储存2个月，菌体死亡率高达31％，严重影响了其在农业生产上的应用。
申请号为201410551199.7、201510617246.8和201710641676.2的中国专利申请均提供了提高液态菌剂稳定性及保藏效果的方法，但上述方法操作复杂、生产成本高且保存过程中菌体死亡率及保质期皆不理想，有很大的提升空间。
发明内容
本发明的目的，是提供一种农用芽孢杆菌液态菌剂的保存方法，通过限制芽孢杆菌液态菌剂芽孢形成率及pH值、调整保护剂配比，实现提高农用芽孢杆菌液态菌剂的保存效果、降低成本的目的。
为实现上述目的，本发明所采用的技术方案如下：
农用芽孢杆菌液态菌剂的保存方法，它是将芽孢杆菌液态菌剂调节pH值至中性后，加入保护剂，混匀，密封，室温储存；
其中，每体积份农用芽孢杆菌液态菌剂加入由0.8-1重量份山梨酸钾、0.5-0.7重量份甘油、2-3重量份葡萄糖及3-5重量份磷酸二氢钾组成的保护剂，体积与重量的对应关系为g与L。
因此，1L芽孢杆菌液态菌剂加入保护剂后，保护剂组分的终浓度为山梨酸钾0.8-1g/L、甘油0.5-0.7g/L、葡萄糖2-3g/L及磷酸二氢钾3-5g/L。
作为本发明的一种限定，所述芽孢杆菌液态菌剂是将芽孢杆菌发酵至芽孢形成率≥90％，pH为4.8-6.3，收集发酵液，即得芽孢杆菌液态菌剂。
其中，本发明对芽孢杆菌的发酵培养基及发酵条件没有特定的要求，所得芽孢杆菌液态菌剂均可通过本发明的方法进行保存。
作为本发明的另一种限定，所述调节pH值至中性是通过添加0.1-0.3mol/L的氢氧化钠溶液调节。
作为本发明的第三种限定，所述混匀后密封前经灌装处理，把芽孢杆菌液态菌剂灌装到塑料桶或罐中，密封，防止杂物或蚊虫进入。
作为本发明的第四种限定，所述室温储存，为于16-26℃避光储存，于阴凉处避免阳光直射。
作为本发明的第五种限定，所述芽孢杆菌为解淀粉芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、多粘类芽孢杆菌或蜡状芽孢杆菌。
本发明提供农用芽孢杆菌液态菌剂的保存方法，所保存的芽孢杆菌菌体均为可用作农用微生物菌剂的可被公众获取的、已公开芽孢杆菌。
由于采用了上述的技术方案，本发明与现有技术相比，所取得的技术进步在于：
本发明的农用芽孢杆菌液态菌剂的保存方法，通过选择发酵结束时芽孢形成率≥90％的芽孢杆菌液态菌剂，减少保存期间菌体死亡率；将芽孢杆菌液态菌剂pH调整至中性，有效减少酸碱环境对菌体造成的胁迫作用，提高菌体存活率；
本发明的保存方法，使芽孢杆菌处于含0.8-1g/L山梨酸钾、0.5-0.7g/L甘油、2-3g/L葡萄糖和3-5g/L磷酸二氢钾的液体环境，经12个月储存，菌剂的菌体死亡率≤18.5％；
本发明添加的山梨酸钾抑制菌体生长，使菌体处于休眠状态；甘油保护芽孢杆菌细胞；添加的葡萄糖和磷酸二氢钾为休眠状态的菌体提供碳源和磷源，减少储存期间的菌体死亡；若同时提供碳源和氮源，菌体会处于生长状态，随着保存时间的增加，菌液中的营养逐渐被消耗，在随后的储存过程中会造成大量菌体死亡，而添加磷酸二氢钾可使菌体处于长时间的高活性休眠状态。
本发明的方法操作简便、成本低廉，适于工业生产，适用于农用芽孢杆菌液态菌剂的保存。
下面结合附图及具体实施例对本发明作更进一步详细说明。
附图说明
图1为实施例7中芽孢杆菌液态菌剂pH值对保存效果的影响实验结果图。
具体实施方式
实施例1一种农用芽孢杆菌液态菌剂的保存方法
S1.芽孢杆菌液态菌剂制备：
①菌种
枯草芽孢杆菌枯草亚种(Bacillus subtilis subsp.subtilis)，已保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏编号：CGMCC 1.3358，可被公众获取，并在申请号为201910454183.7的专利文件中已公开。
②发酵培养
种子培养基：葡萄糖20.0g/L、酵母浸粉5.0g/L、蛋白胨10.0g/L、磷酸二氢钾4.5g/L、硫酸铵2.5g/L、碳酸钙2.0g/L。
发酵培养基：麸皮20.0g/L、蛋白胨5.0g/L、硫酸锰0.3g/L、碳酸钙3.0g/L，pH值8.0。
挑取3环斜面保藏的菌种接种至装有10L种子培养基的25L培养瓶中，30℃、200r/min摇床振荡培养14h，即为芽孢杆菌种子液。以3％的接种量将种子液接种到装有15L发酵培养基的25L培养瓶中，于30℃、200r/min摇床振荡发酵培养3天；
检测发酵液活菌数、芽孢形成率及pH值；
当活菌数为4.81×109CFU/mL，芽孢形成率为99.2％，pH值为6.3时，收集发酵液，即获得芽孢杆菌液态菌剂。
S2.pH值调整：
使用0.1mol/L氢氧化钠溶液将芽孢杆菌液态菌剂的pH值调整至pH＝7。
S3.加入保护剂：
取1L芽孢杆菌液态菌剂，加入由0.8g山梨酸钾、0.6g甘油、2.5g葡萄糖及3g磷酸二氢钾组成的保护剂，搅拌混匀，得混合液。
S4.灌装处理、密封及储存：将混合液灌装入塑料桶，密封，于20℃避光保存。
S5.检测：
保存12个月后，抽取样品检测活菌数，计算菌体死亡率。
活菌数的测定：采用平板菌落计数法测定液态菌剂的活菌数(CFU/mL)；
菌体存活率计算公式如下：
w＝m1/m2×100％
式中：w-菌体存活率，％；m1-保存后活菌数；m2-保存前活菌数。
经检测，12个月后，菌体死亡率为14.8％，表明采用本发明的农用芽孢杆菌液态菌剂的保存方法，能有效保证芽孢杆菌菌体低死亡率，有助于农用芽孢杆菌液态菌剂的推广应用。
实施例2-6农用芽孢杆菌液态菌剂的保存方法
实施例2-6分别为一种农用芽孢杆菌液态菌剂的保存方法，它们的步骤与实施例1基本相同，不同之处仅在于工艺参数及检测结果的不同，其它均参数相同，具体不同工艺参数详见表1：
表1实施例2-6农用芽孢杆菌液态菌剂的保存方法工艺参数表
Figure BDA0003157692330000051
经检测，12个月后，各实施例菌体死亡率均不高于18.5％，表明采用本发明的农用芽孢杆菌液态菌剂的保存方法，能有效保证芽孢杆菌菌体低死亡率，有助于农用芽孢杆菌液态菌剂的推广应用。
实施例7芽孢杆菌液态菌剂pH值对保存效果的影响实验
采用实施例1的方法制得芽孢杆菌液态菌剂后取30mL等分成6组，每组5mL，记录活菌数；
随机抽取5组，采用0.1mol/L氢氧化钠溶液分别处理各组，使芽孢杆菌液态菌剂pH值分别为4、5、6、7及8；
未采用0.1mol/L氢氧化钠溶液处理的1组作为对照组，经检测，pH值为6.3；
经上述处理后，将6组芽孢杆菌液态菌剂，密封，于20℃避光保存60天，于第61天取样检测活菌数，计算菌体存活率，结果如图1所示。
当菌剂pH值为4-7时，随着pH值的升高，芽孢杆菌存活率随之增加；当菌剂pH值为7时，芽孢杆菌存活率最高，达到70％；当菌剂pH值增加为8.0时，芽孢杆菌存活率下降为65.1％；表明无论是酸性环境，还是碱性环境，均对菌体有一定环境胁迫作用，不利于菌体的存活，因此，菌剂适宜的pH值为7。
需要说明的是，以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照上述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域技术人员来说，其依然可以对上述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明权利要求保护的范围之内。

Claims (6)

1.一种农用芽孢杆菌液态菌剂的保存方法，其特征在于，它是将芽孢杆菌液态菌剂调节pH值至中性后，加入保护剂，密封，室温储存；
其中，每体积份农用芽孢杆菌液态菌剂加入由0.8-1重量份山梨酸钾、0.5-0.7重量份甘油、2-3重量份葡萄糖及3-5重量份磷酸二氢钾组成的保护剂，体积与重量的对应关系为g与 L。
2.根据权利要求1所述的农用芽孢杆菌液态菌剂的保存方法，其特征在于，所述芽孢杆菌液态菌剂是将芽孢杆菌发酵至芽孢形成率≥90%，pH为4.8-6.3，收集发酵液，即得芽孢杆菌液态菌剂。
3.根据权利要求1所述的农用芽孢杆菌液态菌剂的保存方法，其特征在于，所述调节pH值至中性是通过添加0.1-0.3mol/L的氢氧化钠溶液调节。
4.根据权利要求1所述的农用芽孢杆菌液态菌剂的保存方法，其特征在于，所述混匀后密封前经灌装处理。
5.根据权利要求1所述的农用芽孢杆菌液态菌剂的保存方法，其特征在于，所述室温储存，为于16-26℃避光储存。
6.根据权利要求1-5中任一项所述的农用芽孢杆菌液态菌剂的保存方法，其特征在于，所述芽孢杆菌为解淀粉芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、多粘类芽孢杆菌或蜡状芽孢杆菌。
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