CN105062891A - 一种提高液态菌剂稳定性的含酶组合物及方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种提高液态菌剂稳定性的含酶组合物及方法。该含酶组合物含有以下成分：葡萄糖氧化酶、过氧化氢酶、糖化酶、蔗糖酶、海藻糖、壳聚糖、纳他霉素、山梨酸钾和没食子酸丙酯。提高液态菌剂稳定性的方法为：芽孢杆菌类微生物发酵结束后，向发酵液中加入盐酸酸化至pH5.0～5.5；然后加入上述含酶组合物，再将发酵液于40-45℃保温6h左右；降至室温后加入EDTA，混匀，灌装。本发明可以降低以糖质原料为碳源采用液态发酵工艺生产的液体菌剂中的残糖含量，抑制微生物的代谢活性，同时对微生物细胞具有保护作用，可降低产品贮存过程中的胀瓶(袋)率和微生物死亡率，提高贮存稳定性，延长保质期。

Description

一种提高液态菌剂稳定性的含酶组合物及方法

技术领域

本发明涉及一种提高液态菌剂稳定性的含酶组合物及方法，属于农业生物技术领域。

背景技术

微生物肥料是指含有活性微生物的生物制品，具有促进植物生长、减轻病害、改良土壤、提高农产品品质的作用，是国家优先发展的新型肥料之一，具有广阔的发展前景。市售微生物肥料主要有固体和液体两种剂型。其中液体菌剂可由发酵液直接调配而成，无固液分离与干燥等生产环节，工艺简单、成本低，而且易于与水混溶，使用方便。但与固体菌剂相比，液体菌剂贮存稳定性较差，贮存过程中微生物有一定的代谢活性，死亡速率较快，且会缓慢产气，出现胀瓶(袋)现象等。

液态菌剂出现胀瓶(袋)与活菌数下降速度快等现象的原因是：发酵结束后，发酵液中仍残存一定浓度的碳源，主要是葡萄糖、淀粉、糊精等残糖，在产品贮存过程中可被微生物缓慢代谢，释放二氧化碳等气体，产生胀瓶(袋)现象，同时微生物死亡率升高。因此，降低发酵液中的残糖浓度，可有效降低微生物在贮存过程中的代谢活性，从而减少胀瓶(袋)率与微生物死亡率。

目前，提高液体菌剂贮存稳定性的常用方法有：1、发酵结束后，发酵液预贮数日后再进行调配、包装，其目的是通过微生物自身的代谢作用降低发酵液中的残糖浓度。但预贮过程中，微生物代谢活性强，发酵液活菌数大幅下降，芽孢生成率降低，杂菌率提高。2、向液体菌剂中加入苯甲酸钠、山梨酸钾等防腐剂。这种方法的缺点是常规用量的防腐剂不足以完全抑制微生物的代谢作用，应用效果欠佳，高浓度的防腐剂又会导致微生物死亡率升高，产品质量下降。

发明内容

针对上述问题，本发明提供了一种提高液态菌剂稳定性的含酶组合物及方法。该含酶组合物包含酶制剂、抗氧化剂、细胞保护剂、抗菌剂和防腐剂等成分。该含酶组合物结合具体的方法可有效降低液体菌剂贮存过程中的胀瓶(袋)率和微生物死亡率，提高贮存稳定性，延长保质期。本发明适用于枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌与巨大芽孢杆菌等芽孢杆菌类微生物以淀粉、葡萄糖、蔗糖、糖蜜等糖质原料为碳源采用液态发酵工艺生产的液体菌剂。

本发明的目的是提供一种提高液态菌剂稳定性的含酶组合物，其特征是，每1g含有以下成分：葡萄糖氧化酶25000～30000U，过氧化氢酶800～1000U，糖化酶8000～10000U，蔗糖酶1800～2000U，海藻糖0.08～0.12g，壳聚糖0.04～0.06g，纳他霉素0.008～0.012g，山梨酸钾0.08～0.12g，没食子酸丙酯0.04～0.06g。如果上述原料的总质量不足1g，可以选择加入部分载体。

本发明的另一个目的是提供一种提高液态菌剂稳定性的方法，其特征是，

1)微生物发酵结束后，向发酵液中加入盐酸酸化至pH5.0～5.5；

2)向酸化后的发酵液中加入其质量0.2～0.3％的上述含酶组合物，搅拌均匀；

3)然后发酵液于40-45℃保温5-8h，优选于42℃保温6h；

4)降温至室温，然后加入发酵液质量0.05-0.1％的EDTA，混匀，灌装，即为液体菌剂产品。

上述的液态菌剂为以枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌与巨大芽孢杆菌等芽孢杆菌类微生物以淀粉、葡萄糖、蔗糖、糖蜜等糖质原料为碳源采用液态发酵工艺生产的液体菌剂。

本发明以葡萄糖氧化酶、过氧化氢酶、糖化酶、蔗糖酶、海藻糖、壳聚糖、纳他霉素、山梨酸钾和没食子酸丙酯组方。其中葡萄糖氧化酶、过氧化氢酶、糖化酶、蔗糖酶组合，降低以淀粉、葡萄糖、蔗糖与糖蜜等糖质原料为碳源采用液态发酵工艺生产的液体菌剂中的残糖含量。海藻糖作为细胞保护剂对微生物细胞具有保护作用。壳聚糖作为抗菌剂，没食子酸丙酯作为抗氧化剂，纳他霉素和山梨酸钾作为防腐剂，上述四种原料结合抑制微生物的代谢作用。上述各原料共同作用，降低产品贮存过程中的胀瓶(袋)率和微生物死亡率。

本发明的有益效果是：本发明可以降低以淀粉、葡萄糖、蔗糖与糖蜜等糖质原料为碳源采用液态发酵工艺生产的液体菌剂中的残糖含量，抑制微生物的代谢活性，同时对微生物细胞具有保护作用，可降低产品贮存过程中的胀瓶(袋)率(胀瓶率﹤3％)和微生物死亡率(死亡率﹤10％)，提高贮存稳定性，延长保质期。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步说明。

实施例1：含酶组合物的配制

本发明所述含酶组合物的配制方法，包括以下步骤：

1)酶制剂的准备：配制所述含酶组合物所用的酶制剂除蔗糖酶外均购自泰安信得利生物科技有限公司，葡萄糖氧化酶的酶活力为100000U/g，所执行的产品标准为DB13/T1444-2011《饲料添加剂葡萄糖氧化酶》；过氧化氢酶的酶活力为10000U/g，所执行的产品标准为QB/T4614-2013《工业用过氧化氢酶制剂》；糖化酶的酶活力为50000U/g，所执行的产品标准为GB8276-2006《食品添加剂糖化酶制剂》。蔗糖酶购自诺维信(中国)生物技术有限公司，产品规格为20000U/g。

2)其它原料的准备：海藻糖为山东天力药业有限公司生产，有效成分含量≥99％；壳聚糖由济南海得贝海洋生物工程公司生产，脱乙酰度≥90％；纳他霉素由山东福瑞达生物科技有限公司生产，有效成分含量≥95％；山梨酸钾由郑州华安食品添加剂有限公司生产，有效成分含量≥99％；没食子酸丙酯由河北百味生物科技有限公司生产，有效成分含量99.8％。

将上述原料按照下述重量份混合均匀：葡萄糖氧化酶30份，过氧化氢酶10份，糖化酶20份，蔗糖酶10份，海藻糖10份，壳聚糖5份，纳他霉素1份，山梨酸钾9份，没食子酸丙酯5份，共100份。

按上述比例配制的含酶复合物中，每1g含有以下成分：葡萄糖氧化酶30000U，过氧化氢酶1000U，糖化酶10000U，蔗糖酶2000U，海藻糖0.10g，壳聚糖0.05g，纳他霉素0.01g，山梨酸钾0.09g，没食子酸丙酯0.05g。

实施例2：在枯草芽孢杆菌液体菌剂生产中的应用。

1)菌种活化：将枯草芽孢杆菌转接入NA培养基试管斜面，于35℃培养24h进行活化。所述NA培养基的配方为：牛肉膏3g、蛋白胨10g、NaCl5g、琼脂20g、水1000ml，pH7.0。

2)三角瓶种子制备：用接种环刮取活化后的枯草芽孢杆菌，接种于NB培养基中，35℃培养24h。所述NB培养基即营养肉汤培养基，其配方为牛肉膏3g、蛋白胨10g、NaCl5g、水1000ml，pH7.0。

3)种子罐菌种制备：将三角瓶种子以2％的接种量转接入装有6LNB培养基的10L种子罐中，于35℃培养20h，全程搅拌转速200rpm，0-6h通风量为3L/min，6-20h通风比为6L/min。

4)发酵培养：将种子罐菌种以2％的接种量转接入500L的发酵罐。发酵罐内装发酵培养基中300L，35℃培养24h，即为枯草芽孢杆菌的发酵液。所述发酵培养基的配方为：豆粕粉15g、淀粉10g、葡萄糖10g、磷酸二氢钾1.0g、硫酸镁1.5g、硫酸锰0.1g、水1000mL。全程搅拌转速为180rpm，0-6h通风量为200L/min，6-28h通风量为300L/min。

5)发酵结束后，向发酵液中加入盐酸酸化至pH5.0～5.5；

6)向酸化后的发酵液中加入其质量0.25％的实施例1所述的含酶组合物，搅拌均匀，然后于42℃保温6h；

7)冷却至室温，然后加入发酵液质量0.08％的EDTA，搅拌均匀后进行灌装，即为液体菌剂产品。

应用效果检验方法：按上述方法生产的枯草芽孢杆菌液体制剂于25℃恒温箱中放置3个月，然后测定胀瓶(袋)率和枯草芽孢杆菌死亡率。设两组对照实验，对照实验CK1为枯草芽孢杆菌发酵液直接灌装，然后于25℃恒温箱箱中放置3个月；对照实验CK2为枯草芽孢杆菌发酵液按常规生产方法处理，即添加0.2％山梨酸钾，灌装后于25℃恒温箱中放置3个月。

实验结果如下：添加本发明所述含酶组合物的枯草芽孢杆菌液体制剂于25℃恒温箱中放置3个月，胀袋或胀瓶率﹤3％(平均为2.0％)，死亡率﹤10％(平均为5.3％)，而对照实验CK1的胀袋或胀瓶率＞50％，死亡率＞60％，对照实验CK2的胀袋或胀瓶率＞15％，死亡率＞30％。这表明本发明在枯草芽孢杆菌液体制剂生产中有良好的应用效果。

实施例3：含酶组合物的配制

原料准备同实施例1。

将上述原料按照下述重量份混合均匀：葡萄糖氧化酶29份，过氧化氢酶9份，糖化酶19份，蔗糖酶9份，海藻糖12份，壳聚糖6份，纳他霉素1份，山梨酸钾10份，没食子酸丙酯5份，共100份。

按上述比例配制的含酶复合物中，每1g含有以下成分：葡萄糖氧化酶29000U，过氧化氢酶900U，糖化酶9500U，蔗糖酶1800U，海藻糖0.12g，壳聚糖0.06g，纳他霉素0.01g，山梨酸钾0.10g，没食子酸丙酯0.05g。

实施例4：含酶组合物的配制

原料准备同实施例1。

将上述原料按照下述重量份混合均匀：葡萄糖氧化酶28份，过氧化氢酶9.5份，糖化酶19份，蔗糖酶9.5份，海藻糖11份，壳聚糖6份，纳他霉素1份，山梨酸钾10份，没食子酸丙酯6份，共100份。

按上述比例配制的含酶复合物中，每1g含有以下成分：葡萄糖氧化酶28000U，过氧化氢酶950U，糖化酶9500U，蔗糖酶1900U，海藻糖0.11g，壳聚糖0.06g，纳他霉素0.01g，山梨酸钾0.10g，没食子酸丙酯0.06g。

实施例5：在解淀粉芽孢杆菌液体菌剂生产中的应用

1)菌种活化：将解淀粉芽孢杆菌转接入NA培养基试管斜面，于35℃培养24h进行活化；

2)三角瓶种子制备：用接种环刮取活化后的解淀粉芽孢杆菌菌苔，接种于NB培养基中，35℃培养24h；

3)种子罐菌种制备：将三角瓶种子以2％的接种量转接入装有6LNB培养基的10L种子罐中，于35℃培养20h，全程搅拌转速200rpm，0-6h通风量为3L/min，6-20h通风量为6L/min；

4)发酵培养：将种子罐菌种以2％的接种量转接入500L的发酵罐。发酵罐内装发酵培养基中300L，35℃培养28h，得到解淀粉芽孢杆菌的发酵液。全程搅拌转速为180rpm，0-6h通风量为200L/min，6-28h通风量为300L/min。

发酵培养基的配方为：棉粕粉20g、淀粉10g、葡萄糖10g、磷酸二氢钾1.0g、硫酸镁1.5g、硫酸锰0.1g、蒸馏水1000mL，初始pH8.5。

5)发酵结束后，向发酵液中加入盐酸酸化至pH5.0～5.5；

6)向酸化后的发酵液中加入其质量0.3％的实施例3所述的含酶组合物，搅拌均匀，然后于42℃保温6h；

7)冷却至室温，然后加入发酵液质量0.07％的EDTA，搅拌均匀后进行灌装，即为液体菌剂产品。

实验结果如下：添加本发明所述含酶组合物的枯草芽孢杆菌液体制剂于25℃恒温箱中放置3个月，胀袋或胀瓶率﹤3％，死亡率﹤10％。

Claims (4)

1.一种提高液态菌剂稳定性的含酶组合物，其特征是，每1g含有以下成分：葡萄糖氧化酶25000～30000U，过氧化氢酶800～1000U，糖化酶8000～10000U，蔗糖酶1800～2000U，海藻糖0.08～0.12g，壳聚糖0.04～0.06g，纳他霉素0.008～0.012g，山梨酸钾0.08～0.12g，没食子酸丙酯0.04～0.06g；所述液态菌剂为以糖质原料碳源采用液态发酵工艺生产的液体菌剂。

2.如权利要求1所述的一种提高液态菌剂稳定性的含酶组合物，其特征是，所述液态菌剂为芽孢杆菌类微生物以糖质原料碳源采用液态发酵工艺生产的液体菌剂。

3.一种提高液态菌剂稳定性的方法，其特征是，

1)微生物发酵结束后，向发酵液中加入盐酸酸化至pH5.0～5.5；

2)向酸化后的发酵液中加入其质量0.2～0.3％的权利要求1或2所述的含酶组合物，搅拌均匀；

3)然后发酵液于40-45℃保温5-8h；

4)降温至室温，然后加入发酵液质量0.05-0.1％的EDTA，混匀，灌装，即为液体菌剂产品。

4.如权利要求3所述的一种提高液态菌剂稳定性的方法，其特征是，所述步骤3)将发酵液于42℃保温6h。