CN107653200B - 一种促进死猪尸体好氧堆肥的微生物菌剂及应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种促进死猪尸体好氧堆肥的微生物菌剂及应用，所述的微生物菌剂地衣芽孢杆菌ZR‑1、枯草芽孢杆菌dcy‑1、甲基营养型芽孢杆菌F7和解淀粉芽孢杆菌YZ‑0001；该菌剂有利于有机质的降解，通过堆肥初期接种微生物菌剂，提高堆体最高温度以及延长高温期，灭活病原微生物，加快尸体腐熟，促进植物毒性降解，提高种子发芽指数；本菌剂成本低、构成简单，制备方便，便于推广及应用；本发明的死猪尸体好氧堆肥微生物菌剂，能产生稳定的腐殖质，可以作为有机肥料用于农作物种植，抑制植物病原菌，减少化肥的使用，具有良好的发展前景。

Description

一种促进死猪尸体好氧堆肥的微生物菌剂及应用
技术领域
本发明属于病死畜禽无害化处理技术领域，具体涉及一种促进死猪尸体好氧堆肥的微生 物菌剂及应用。
背景技术
现代集约化养殖在提高综合生产力的同时也产生了畜禽粪便、污水以及病死畜禽残体等 大量的污染物。据统计，2016年我国生猪出栏量约6.80亿头，一般情况下，我国每年因各 类疾病引起猪的死亡率约为8％～12％，也就是说，我国每年将不可避免地会产生的大量动 物尸体，这些病死猪只携带大量的致病微生物，如果处理不当，将会致使病原菌扩散，引起 重大的疫病传播，严重威胁着生态环境和人类公共卫生安全。目前病死猪无害化处理的方法 主要有填埋、焚烧、化制和堆肥法。填埋存在污染地表和地下水的风险，欧盟已禁用；焚烧 释放二恶英和呋喃等致癌物质危害动物和人类健康；化制投入成本高且无法杀灭朊病毒等， 存在一定的生物风险。堆肥是在适宜条件下利用自然界微生物对堆料中的有机尸体进行生物 降解的过程，经济实用、环境友好且能产生稳定高效植物肥料成为病死猪无害化处理的重要 方式。
但是，传统的堆肥方法效率低、质量不理想，使有机肥利用受到限制。研究表明堆肥过 程中添加一定种类的微生物可缩短发酵周期，加快腐熟，提高堆肥质量。目前，市场上关于 无害化处理和资源化利用的微生物菌剂主要集中在畜禽粪便、农作物秸秆等方面，而对染疫 动物尸体处理方面报道较少，且受发酵周期长、降解不彻底的影响无法得到推广。如何解决 其发酵周期长、降解不彻底的问题困扰着猪尸体菌剂的发展。
发明内容
本发明的目的是提供一种促进死猪尸体好氧堆肥的微生物菌剂，包括地衣芽孢杆菌 ZR-1、枯草芽孢杆菌dcy-1、甲基营养型芽孢杆菌F7和解淀粉芽孢杆菌YZ-0001。该微生物 菌剂可提高堆肥温度、延长高温持续时间、加快堆肥腐熟、提高种子发芽指数。
本发明还有一个目目的在于提供了一种地衣芽孢杆菌，所述的地衣芽孢杆菌为地衣芽孢 杆菌Bacillus licheniformis ZR-1，保藏编号为：CCTCC NO：M2017384。
本发明的另一个目的是提供一种促进死猪尸体好氧堆肥的微生物菌剂的应用，可用于制 备促进尸体降解的微生物发酵菌剂。
为了达到上述目的，本发明采取以下技术措施：
地衣芽孢杆菌ZR-1的获得：
申请人从死猪尸体自然堆肥样品中分离、筛选、鉴定，得到一株地衣芽孢杆菌，所述菌 株已于2017年6月26日送至中国典型培养物保藏中心保藏，分类命名：地衣芽孢杆菌Bacillus licheniformis ZR-1，保藏编号为：CCTCC NO：M2017384，地址：中国武汉武汉 大学。
将本发明分离的菌株ZR-1的16S rDNA序列与已知地衣芽孢杆菌序列的同源性达到 99％，经鉴定，确定该菌株为地衣芽孢杆菌ZR-1。
上述菌株的菌落型态为在细菌牛肉膏蛋白胨上培养，37℃，培养24小时，菌落圆形， 呈波浪形边缘，表面粗糙，不透明，细胞呈杆状，革兰氏染色阳性。水解酪素、淀粉，过氧化氢酶阳性。
一种促进死猪尸体好氧堆肥的微生物菌剂，包括地衣芽孢杆菌ZR-1、枯草芽孢杆菌 dcy-1、甲基营养型芽孢杆菌F7和解淀粉芽孢杆菌YZ-0001。
以上所述的菌剂中，优选的，所述的地衣芽孢杆菌ZR-1、枯草芽孢杆菌dcy-1、甲基营 养型芽孢杆菌F7、解淀粉芽孢杆菌YZ-0001有效菌浓度配比为3:(2.5-3.0):(2.0-2.5):(1.0-0.5)。
以上所述的菌剂，优选的，菌剂的有效活菌数为1×109-6.9×109cfu/mL。
一种促进死猪尸体好氧堆肥的微生物菌剂的制备方法，包括下述步骤。
将地衣芽孢杆菌ZR-1、枯草芽孢杆菌dcy-1、甲基营养型芽孢杆菌F7、解淀粉芽孢杆 菌YZ-0001分别接种至培养基，培养至菌体浓度为OD600＝1-1.5，然后将菌液按3:(2.5-3.0): (2.0-2.5):(1.0-0.5)的体积比混合发酵，温度35-38℃，通气比在l：0.3-0.5，搅拌速率为 150-250r/min，即得。
所述培养基的配方包括：牛肉膏3.00g/L，蛋白胨10.00g/L，NaCl 5.00g/L，pH7.4-7.6。
发酵时所用的发酵培养基的配方包括：葡萄糖20.00g/L，蛋白胨5.00g/L，磷酸氢二钾 0.15g/L，磷酸二氢钾0.20g/L，硫酸铵2.50g/L，酵母粉1.00g/L，硫酸镁0.20g/L，硫酸锰0.20g/L，pH 7.0-7.2。
以上所述的方法，是将菌体浓度均为OD600＝1的地衣芽孢杆菌ZR-1、枯草芽孢杆菌dcy-1、 甲基营养型芽孢杆菌F7、解淀粉芽孢杆菌YZ-0001按3:3:2:1的体积比混合发酵，温度37℃， 通气比为l：0.5，搅拌速率为220r/min，即得。
一种促进死猪尸体好氧堆肥的微生物菌剂，包括直接利用该菌剂作为死猪尸体的好氧堆 肥菌剂，或是与其他有效成分配比进行使用。
与现有技术相比，本发明具有以下优点：
1、本发明所使用的地衣芽孢杆菌ZR-1(CCTCC NO：M2017384)，耐高温，具有降解脂肪、蛋白质、淀粉的能力。枯草芽孢杆菌dcy-1(CCTCC NO：M 208122)，能提高猪场 发酵床的发酵温度，有效杀死致病微生物，且成功用于猪场猪粪堆肥生产。甲基营养型芽孢 杆菌F7(CGMCC NO.12124)，既能产生蛋白酶、纤维素酶和氨，又能有效抑制多种植物病 原菌，促进植物生长。解淀粉芽孢杆菌YZ-0001(CGMCC NO.12052)，具有较强的降解有 机物的能力，除臭效果好，将上述各菌种之间进行配比合理，有效活菌数达到6.9×109cfu/mL， 能够实现病死猪无害化处理；
2、本发明提供的死猪尸体好氧堆肥微生物菌剂，有利于有机质的降解，通过堆肥初期 接种微生物菌剂，提高堆体最高温度以及延长高温期，灭活病原微生物，加快尸体腐熟，促 进植物毒性降解，提高种子发芽指数；
3、本菌剂成本低、构成简单，制备方便，便于推广及应用；
4、本发明的死猪尸体好氧堆肥微生物菌剂，能产生稳定的腐殖质，可以作为有机肥料 用于农作物种植，抑制植物病原菌，减少化肥的使用，具有良好的发展前景。
附图说明
图1是地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)ZR-1的降解蛋白试验结果图。
图2是地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)ZR-1的降解淀粉试验结果图。
图3为死猪自然堆肥和接种混合菌剂堆肥过程中温度变化曲线图。
图4为死猪自然堆肥和接种混合菌剂堆肥过程中发芽指数变化曲线图。
图5为死猪自然堆肥和接种微生物菌剂死猪降解图。
图6为地衣芽孢杆菌ZR-1耐高温试验示意图。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施方式对本发明作进一步详细说明。
本发明技术所述试剂，如果未做特殊说明，均购自生化商店，所述技术未做特殊说明， 均为本领域的常规技术。
实施例1：
地衣芽孢杆菌ZR-1的分离和鉴定：
申请人从死猪尸体自然堆肥样品中分离、筛选、鉴定得到一株地衣芽孢杆菌，所述菌 株已于2017年6月26日送至中国典型培养物保藏中心保藏，分类命名：地衣芽孢杆菌Bacillus licheniformis ZR-1，保藏编号为：CCTCC NO：M2017384。
地衣芽孢杆菌ZR-1菌株的16S rDNA基因序列与GenBank中序列进行比对，发现本发明分离的菌株ZR-1的16S rDNA序列与已知序列的同源性达到99％，经鉴定，确定该菌 株为地衣芽孢杆菌，所述菌株已于2017年6月26日送至中国典型培养物保藏中心保藏，分 类命名：地衣芽孢杆菌Bacillus licheniformis ZR-1，保藏编号为：CCTCC NO：M2017384。
地衣芽孢杆菌菌落圆形，呈波浪形边缘，表面粗糙，不透明，细胞呈杆状，革兰氏染色阳性。水解酪素、淀粉，过氧化氢酶阳性。
该菌株按照常规甘油管保藏方法保藏。
实施例2：
地衣芽孢杆菌Bacillus licheniformis ZR-1产酶能力检测：
脂肪酶测定：
将地衣芽孢杆菌Bacillus licheniformis ZR-1放于油脂液体培养基中24h后，取1mL菌 液(OD600＝1)分别加入对锥形瓶。另取一只锥形瓶做对照。分别向所有锥形瓶中加入4mL 底物溶液和5mL磷酸盐缓冲溶液。立即混匀计时，水浴10min。然后向所有锥形瓶中加入15mL 95％乙醇终止反应。向所有锥形瓶中加入3～5滴酚酞试剂，用0.05mol/L NaOH标准溶液滴定。
计算结果，脂肪酶酶活力单位定义为：在一定条件下，每分钟释放出1umol脂肪酸的 酶量定义为1个脂肪酶活力单位(U)。按以下公式计算酶活：X＝(B-A)×5，式中：X为 样品的酶活力(U/mL)；B为滴定样品消耗的NaOH标准溶液体积(mL)；A为滴定空白消 耗的NaOH标准溶液体积(mL)。
地衣芽孢杆菌Bacillus licheniformis ZR-1的发酵液中脂肪酶酶活性为12.36U/mL。
蛋白酶、淀粉酶筛选：
将地衣芽孢杆菌Bacillus licheniformis ZR-1分别点种到酪素培养基平板和淀粉酶平板， 每个菌株作3个重复，37℃培养24～48h。测量菌落和透明圈的直径，取其平均值，计算出 透明圈直径和菌落直径之比，具体结果见表1。
Figure BDA0001377712900000051
菌株地衣芽孢杆菌Bacillus licheniformis ZR-1在酪素培养基平板和淀粉酶平板上均有水 解圈产生，表明菌株地衣芽孢杆菌Bacillus licheniformis ZR-1均能产生蛋白酶、淀粉酶。这 些降解酶能够促进蛋白、淀粉的降解，缩短猪尸体堆肥发酵时间。
pH测定
将保存在斜面培养基上的地衣芽孢杆菌接种到LB培养基中，富集16h作为种子液。利用1mol/L的盐酸溶液或1mol/L的氢氧化钠溶液将LB培养基的pH分别调整至6.0,6.5,7.0， 7.5,8.0，每个pH梯度3个重复，将种子液按4％的接种量接种于LB培养基中，37℃培养18h，每隔2h取一次样品，在600nm处测定其OD值，绘制生长曲线。
结果显示，该菌株在pH为7.0的培养基中生长趋势好于其它pH梯度下的生长趋势。
Figure BDA0001377712900000052
温度测定
将保存在斜面培养基上的地衣芽孢杆菌接种到LB培养基中，富集16h作为种子液。将 种子液按4％的接种量接种于LB培养基(pH 7.0)中，分别在30℃，37℃，40℃，45℃，50℃，55℃，60℃，65℃培养18h，每隔2h取一次样品，在600nm处测定其OD值，绘制 生长曲线。
结果显示，该菌株在37℃中生长速度最快，同时也可以在65℃保持生长。
Figure BDA0001377712900000061
耐高温试验
用接种环从地衣芽孢杆菌的斜面培养基中取一环菌，置于LB液体培养基中富集12小 时，将菌液涂布于LB固体培养基上，作为未高温处理组，即对照组，之后将菌液置于70℃， 80℃以及90℃恒温水浴锅中分别处理半小时，处理后的菌液同样涂布与LB固体培养基上， 将对照组和实验组的固体培养基放在37℃培养箱中培养至长出菌落，结果显示，该菌株在 70℃高温处理前和处理后生长量无明显差异，在80℃及90℃温度下也可存活(图6)。
实施例3：
一种促进死猪尸体好氧堆肥的微生物菌剂，制备方法包括下述步骤：
地衣芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、甲基营养型芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌种子液的制备：
种子培养基：牛肉膏蛋白胨培养基(牛肉膏3.00g/L，蛋白胨10.00g/L，NaCl5.00g/L， pH 7.4-7.6)。培养条件为37℃，转速220rpm，培养12-16h。
微生物菌剂的制备：将地衣芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、甲基营养型芽孢杆菌、解淀粉芽 孢杆菌培养至菌体浓度为OD600＝1的种子液按照3:3:2:1的体积比混合发酵，以发酵培养基 作为混合菌培养基发酵培养基，装液量为60％，加入食品级消泡剂植物油和泡敌。操作步 骤如下：将密封的装有发酵培养基的发酵罐在70L灭菌锅121℃灭菌20分钟，然后取出降 温至发酵温度37℃，通气比l：0.5。按照3:3:2:1的体积比混合发酵，接种量为5％，搅拌速 率为200r/min，培养16h后放罐，放罐总浓度OD600＝4.67，有效活菌数达到6.9×109cfu/mL， 用于以下实施例。
所述的发酵培养基的配方包括：葡萄糖20.00g/L，蛋白胨5.00g/L，磷酸氢二钾0.15g/L， 磷酸二氢钾0.20g/L，硫酸铵2.50g/L，酵母粉1.00g/L，硫酸镁0.20g/L，硫酸锰0.20g/L， pH 7.0-7.2。
实施例4：
一种用于死猪尸体好氧堆肥的微生物菌剂的应用:：
1.将木屑控制含水量在60％，控制堆体底部木屑厚度35cm，将两头死猪分割成块状， 切割大小18-22Kg左右放于底部木屑中间，向底部木屑及尸体上喷洒混合菌剂进行堆肥发 酵，液态微生物菌剂添加量为摆放尸体重量的2％(质量比)，顶部覆盖厚度45cm木屑，堆 成梯形发酵堆进行堆肥发酵。分别设置试验组(添加微生物菌剂)和对照组(添加水)，堆制时间为6个月，按照常规检验方法检测本发明菌剂的应用效果。
2.添加微生物菌剂发酵分析与评估
通过对堆肥过程中温度、种子发芽指数的变化及猪尸体降解程度进行分析和评判。
具体实验结果如下：
2.1堆肥过程中温度的变化
图3为不同处理堆体的温度变化，添加微生物菌剂组最高温度为58℃，比自然堆肥高6℃， 且高温期较自然堆肥延长了5d，50℃以上共维持了15天，促进了堆肥腐熟，有效杀灭堆料 中所含的致病微生物。
2.2种子发芽指数(GI值)
图4为堆肥过程中添加微生物菌剂组与自然堆肥组GI变化，经过6个月的发酵，添加 微生物菌剂组和自然堆肥组的GI分别为97.3％和40.5％。添加微生物菌剂组较自然堆肥组 提高了56.8％。说明在猪尸体好氧堆肥中添加微生物菌剂可加速堆肥中植物毒害物质的降解， 促进堆肥腐熟。
2.3猪尸体降解
图5为添加微生物菌剂组和自然堆肥组猪尸体降解图，添加微生物菌剂组较自然堆肥组 周围木屑松散、猪骨头呈现明显且颜色较浅，降解更彻底。说明添加复合菌剂的堆体比自然 堆肥腐熟的更快，降解的更彻底。

Claims (3)

1.一种复合微生物菌剂在促进死猪尸体好氧堆肥中的应用，所述的复合微生物菌剂为：地衣芽孢杆菌ZR-1、枯草芽孢杆菌dcy-1、甲基营养型芽孢杆菌F7、解淀粉芽孢杆菌YZ-0001的混合物，其有效菌浓度配比为3:(2.5-3.0):(2.0-2.5):(1.0-0.5)；所述的地衣芽孢杆菌ZR-1的保藏编号为CCTCC NO：M2017384、枯草芽孢杆菌dcy-1的保藏编号为CCTCC NO：M208122、甲基营养型芽孢杆菌F7的保藏编号为CGMCC NO：12124、解淀粉芽孢杆菌YZ-0001的保藏编号为CGMCC NO：12052。
2.根据权利要求1所述的应用，所述的复合微生物菌剂的制备方法，包括：将菌体浓度为OD600＝1-1.5的地衣芽孢杆菌ZR-1、枯草芽孢杆菌dcy-1、甲基营养型芽孢杆菌F7、解淀粉芽孢杆菌YZ-0001按3:(2.5-3.0):(2.0-2.5):(1.0-0.5)的体积比混合发酵，温度35-38℃，通气比在l：0.3-0.5，搅拌速率为150-250r/min，即得。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于：是将菌体浓度均为OD600＝1的地衣芽孢杆菌ZR-1、枯草芽孢杆菌dcy-1、甲基营养型芽孢杆菌F7、解淀粉芽孢杆菌YZ-0001按3:3:2:1的体积比混合发酵，温度37℃，通气比为l：0.5，搅拌速率为220r/min，即得。
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