CN111778184B

CN111778184B - 一种适用于工厂化大型堆肥的微生物菌剂及应用

Info

Publication number: CN111778184B
Application number: CN202010616986.0A
Authority: CN
Inventors: 吴健; 曹蕊; 莫尚昆; 彭彦; 张雨薇; 黄钦林; 伏超兰; 任竹青
Original assignee: Huazhong Agricultural University
Current assignee: Huazhong Agricultural University
Priority date: 2020-06-30
Filing date: 2020-06-30
Publication date: 2022-04-08
Anticipated expiration: 2040-06-30
Also published as: CN111778184A

Abstract

本发明属于微生物及其应用领域，其具体公开了一种适用于工厂化大型堆肥的微生物菌剂及应用，所述的复合菌剂可用于畜禽粪便堆肥发酵，其包括如下组分：枯草芽孢杆菌（BS1）、解淀粉芽孢杆菌（Ba）、地衣芽孢杆菌（L3）、酵母菌（Y2）。其中，Ba菌株已在中国典型培养物保藏中心进行了保藏，保藏号为：CCTCC M 2020098。本发明的复合菌剂能够在堆肥发酵中提高堆肥温度、加快有机物质的降解、促进氮转化进程，缩短堆肥周期、固氮、提高有机肥肥效。

Description

一种适用于工厂化大型堆肥的微生物菌剂及应用

技术领域

本发明属于微生物及其应用领域，具体涉及了一种复合菌剂及应用；该复合菌剂可用于畜禽粪便堆肥发酵。

背景技术

随着我国畜禽养殖总量的不断扩大，畜禽粪污治理成为一大难题。据行业统计，全国每年约产生38亿吨畜禽粪污，其中，畜禽直接排泄的粪便约18亿吨。畜禽粪便排放数量大、治理难度高，已经成为农业面源污染的源头之一，不但严重影响畜禽健康和生产性能的发挥，而且对周围水体、生态环境造成巨大压力，成为制约畜牧业可持续发展的瓶颈。尽管近几年来在全国范围内实施了畜禽粪污资源化利用整县推进方案，鼓励生产有机肥替代化肥等措施，但畜禽废弃物资源化利用率仍不到60％，有机肥产品依然存在功能弱、效果差，农民使用积极性低和推广难等问题。

好氧堆肥是目前畜禽粪便处理应用最广且最有效的处理方式之一，仍存在升温缓慢，发酵时间较长、堆肥品质不高、氮素损失严重、腐殖化程度低以及氨气和温室气体排放显著等问题。特别是臭气污染严重，氮损失严重，在堆肥过程中氮损失高达33％-60％，导致有机肥产品肥效低。如何优化堆肥工艺，强化堆肥过程，提高有机肥生产效率和产品品质，提高农民使用积极性，加快有机肥替代化肥是当今畜禽粪便资源化利用急需解决的问题。长久以来，研究者们围绕这些问题展开了大量研究，如堆肥参数与工艺的优化，添加疏松剂、起爆剂、调理剂和微生物接种剂等来固氮除臭、提高堆肥效率和品质。其中，以接种微生物的报道最多，但是接种的应用效果不一。

堆肥的实质是微生物在适宜条件下的代谢作用，堆肥工艺优化的过程实际上是堆肥过程中微生物代谢最优化的过程。添加外源微生物菌剂的初衷有：①提高堆肥初期的微生物群体，增强微生物的降解活性；②缩短达到高温的时间；③接种分解有机物质能力强的菌株。有研究表明，添加外源菌剂可提高堆肥初期堆体中微生物数量，达到加速堆肥反应进程，使畜禽粪便得到快速处理(Nakasaki et al.,2013)。尤其是堆肥过程中接种特定功能的纤维素降解菌群，可加速堆料中纤维素类有机物的分解，提高堆肥成品腐殖化程度和总微生物量(Z eng et al.,2010；黄丹莲，2011；林敏，2015；吴庆珊，2018)。Mao等(2018)用实验室规模的玻璃瓶反应器进行堆肥发现，添加复合细菌粉末改善了堆肥中的氮储存和微生物群落。徐佳琦(2019)研究发现，以牛粪与甘蔗叶进行为期45天的实验室堆肥(每10天翻堆一次) 中加入芽孢杆菌复合菌剂能够显著降低堆肥过程中氮素损失，并促进有机质的降解。Guo等(2020)利用实验室规模的堆肥反应器(有效容积为130L)进行了43天的猪粪堆肥试验，发现添加巨大芽孢杆菌能够促进堆肥中氨氧化过程，降低氨氮的排放。Li等(2020)发现添加菌株P-8和LP-10混合的植物乳杆菌能提高羊粪堆肥的效率和最终产品的质量，但整个堆肥周期仍需要56天。

尽管研究人员已经对堆肥微生物菌剂开展了大量研究，但这些研究多停留在实验室规模，且堆肥周期较长，不同的研究中堆肥原料和过程控制存在较大差异，这些微生物菌剂也仅对某些个别堆肥指标有一定强化作用，其商业应用效果有限。因此，开发应用效果显著的微生物菌剂产品是改进堆肥工艺，强化堆肥过程，促进其在商业有机肥生产中推广和应用的关键。

工厂化大型有机肥生产过程中，目前采用较为普遍的堆肥化系统主要有三种：条垛式堆肥系统、机械强化槽式堆肥系统和密闭仓式堆肥系统。其中，根据国家《畜禽粪便堆肥技术规程NY/T 2018》规定，条垛式堆肥发酵周期在30天左右，发酵温度在55℃维持15天以上，成品含水率<45％，温度<35℃，无臭味，发芽指数>70％。但在有机肥生产中，由于堆肥原料和辅料配比不当、含水率过高、翻耙机翻耙深度和次数不够或者受外界低温的影响等原因，往往存在堆肥起温较慢、堆肥周期过长及有机肥肥效低等情况。

申请人瞄准行业需求，旨在解决有机肥生产效率和品质技术瓶颈背后的核心问题，在多年研究基础上研制复合菌剂，通过实验室小型堆肥和有机肥厂中试试验验证其应用效果，并与市场售卖菌剂进行对比试验，本发明开发的复合菌剂能够在堆肥发酵中提高堆肥温度，显著缩短堆肥周期，提高有机肥肥效。

发明内容

针对上述现有存在的技术，本发明的目的在于提供了一种适用于工厂化大型堆肥的微生物菌剂，所述的菌剂包括枯草芽孢杆菌BS1(CCTCC NO：M2019185)、解淀粉芽孢杆菌Ba、地衣芽孢杆菌L3和酿酒酵母菌Y2，所述的解淀粉芽孢杆菌Ba的保藏编号为CCTCC N O：M2020098。

本发明的另一个目的在于提供了一种适用于工厂化大型堆肥的微生物菌剂的应用，该菌剂可用于畜禽粪便堆肥，可缩短堆肥周期、提高堆肥效率、保氮固氮、提高有机肥的肥效。

为实现上述目的，本发明采用如下的技术措施：

申请人自畜禽粪便、堆肥、土壤等不同生境中分离的现有菌株，通过菌株产酶活性分析、抗生素敏感性试验、体外抑菌试验以及对不同氮源的利用能力分析等筛选功能菌株。最终筛选出解淀粉芽孢杆菌Ba，该菌株已于2020年4月29日送至中国典型培养物保藏中心保藏，分类命名：解淀粉芽孢杆菌Bacillus amyloliquefaciens Ba，保藏编号为：CCTCCNO：M2 020098，地址：中国武汉武汉大学。

一种适用于工厂化大型堆肥的微生物菌剂，所述的菌剂包括枯草芽孢杆菌BS1(CCTC C NO：M2019185)、解淀粉芽孢杆菌Ba、地衣芽孢杆菌L3和酿酒酵母菌Y2，所述的解淀粉芽孢杆菌Ba的保藏编号为CCTCC NO：M2020098。

所述复合菌剂活性成分的主要特征如下：

以上所述的复合菌剂，是枯草芽孢杆菌BS1(CCTCC NO：M2019185)、解淀粉芽孢杆菌Ba、地衣芽孢杆菌L3和酿酒酵母菌Y2菌液，按照3L:1-2L:3-4L:4-5L混合后获得。

上述复合菌剂混合前，所述的枯草芽孢杆菌有效菌浓度为(6.1～8.2)x10⁸CFU/mL，解淀粉芽孢杆菌有效菌浓度(2.6～3.07)x10⁸CFU/mL，地衣芽孢杆菌有效菌浓度为(1.17～1. 7)x10⁸CFU/mL，酵母菌有效菌浓度(4.8～6.2)x10⁷CFU/mL；

一种适用于工厂化大型堆肥的微生物菌剂的应用，包括利用该复合菌剂用于畜禽粪便堆肥，特别适合堆体大于等于12吨的堆肥体量。

与现有技术相比，本发明的优点和效果如下：

(1)显著缩短堆肥周期，提高堆肥效率；

(2)保氮固氮，提高肥效。

(3)促进堆肥发酵升温。

(4)本发明的复合菌剂特别适合工厂化的大型发酵。

附图说明

图1为本发明各菌株对不同氮源的利用能力分析图。

图2为本发明复合菌剂中各菌株体外抑菌试验结果图。

图3为复合菌剂对实验室小型堆肥堆体温度的影响图。

图4为复合菌剂对实验室小型堆肥堆体硝态氮、铵态氮、总氮含量变化图。

图5为复合菌剂对堆肥过程中固氮酶基因的影响图。

图6为微生物菌剂在有机肥厂应用中对堆肥温度的影响图。

图7为微生物菌剂在有机肥厂应用中对堆肥总氮、总碳、C/N含量的影响图。

具体实施方式

以下的实例便于更好的理解本发明，但并不限于本发明。下述实施案例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。所述试剂或材料，如未特别说明，均购自于商业渠道。

实施例1：

功能菌株解淀粉芽孢杆菌Ba的筛选：

申请人自粪便、堆肥、土壤等不同生境中分离的现有菌株，通过菌株产酶活性分析、抗生素敏感性试验、体外抑菌试验以及对不同氮源的利用能力分析等筛选功能菌株。

(1)菌株产酶活性分析

将待测菌株分别接种于酪素培养基、固体淀粉培养基、刚果红纤维素培养基平板上，通过比较培养基平板上透明圈与菌落直径的比值的大小来初步评价，比值越大说明淀粉酶活性越高，再结合各菌株菌液的酶活性进行比较。最终测得的菌株Ba结果如表1、表2和表3 所示，所述的BS1的保藏编号为CCTCC NO：M2019185。

表1菌株蛋白酶活性

表2菌株淀粉酶活性

表3菌株纤维素酶活性

(2)抗生素敏感性试验

选取四环素、氯霉素、红霉素、诺氟沙星、卡那霉素、复方新诺明等抗菌药敏片，通过纸片扩散法(K-B法)进行药敏试验。在抗生素敏感性试验中，抑菌圈直径＞15mm表示菌株对抗生素高度敏感，抑菌直径为10～15mm，表示菌株对抗生素中度敏感，抑菌圈＜10mm 表明菌株对抗生素低度敏感，没有出现抑菌圈表示菌株为耐药菌株。如表4所示(数字代表抑菌圈直径，单位cm)，除BL1对红霉素低度敏感、BS5-21对四环素中度敏感、BL1 对红霉素中度敏感外，其余菌株对常用的抗生素均表现高度敏感，表明这些菌株不携带抗性基因(ARGs)，在耐药性方面具有良好的安全性。

表4菌株抗生素敏感性试验

(3)菌株对不同氮源的利用能力分析

如图1所示，SC对NH₃·H₂O、KNO₃、NaNO₂的利用相对较高，说明SC具有除臭能力；Ba对所有氮源均有较强的利用能力，其中，利用NH₄Cl进行硝化作用最为突出；BL1 主要以KNO₃为氮源利用；BM对(NH₄)₂SO₄、NH₃·H₂O利用最好。

(4)菌株体外抑菌试验

将大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、沙门氏菌分别涂于LB固体培养基上，平板底部画十字交叉线，用打孔器打孔后封孔，在孔内加入等体积的菌液，37℃恒温培养下，培养16-24小时观察抑菌圈，利用打孔法探究复合菌剂中各菌株对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、沙门氏菌体外抑菌试验(1、CK；2、BS2；3、Ba；4、BL1；5、SC)，如图2所示Ba对大肠杆菌(1 2.4mm)、金黄色葡萄球菌(20.0mm)、沙门氏菌(14.3mm)均有明显的抑菌作用。

通过以上各菌株的功能筛选，最终选择解淀粉芽孢杆菌Ba。该菌株已于2020年4月2 9日送至中国典型培养物保藏中心保藏，分类命名：解淀粉芽孢杆菌Bacillusamyloliquefac iens Ba，保藏编号为：CCTCC NO：M2020098，地址：中国武汉武汉大学。

实施例2：

适用于工厂化大型堆肥的微生物复合菌剂的制备：

以枯草芽孢杆菌BS1(CCTCC NO：M2019185)、解淀粉芽孢杆菌Ba、地衣芽孢杆菌L 3(赵国纬，2009)和酿酒酵母菌Y2(贾丽艳,2019)的菌液以体积比3:1:3:4混合后既得。

混合前，枯草芽孢杆菌有效菌浓度为(6.1～8.2)x10⁸CFU/mL，解淀粉芽孢杆菌有效菌浓度(2.6～3.07)x10⁸CFU/mL，地衣芽孢杆菌有效菌浓度为(1.17～1.7)x10⁸CFU/mL，酿酒酵母菌有效菌浓度(4.8～6.2)x10⁷CFU/mL。

混合后复合菌剂的活菌数为7.60×10⁸CFU/mL，用于以下实施例。

实施例3：

复合菌剂在养殖场畜禽粪便小型堆肥中的应用，应用过程如下：

本发明实施例所使用的堆肥方法为：

为保持堆体温度，堆肥试验装置为高280mm、长540mm、宽400mm，容积60L，厚度 3mm的EPS泡沫箱。泡沫箱底部铺满3cm左右的锯末作为缓冲层，侧面开一个小孔以便温度的测定，通风装置定时通风，保证均匀的通风量。

堆体总体积为50L，根据堆体温度采集样品，同时检测堆体的温度、C/N含量、硝态氮、铵态氮、固氮酶基因的变化情况。

试验分组如下：

鸡粪对照组(CM+CK)：鸡粪+锯末(鸡粪与锯末质量比5:1、湿重，以下同，添加500mL无菌水；实验前鸡粪湿重17kg。

鸡粪试验组(CM+AB)：鸡粪+锯末+复合菌剂(鸡粪与锯末质量比5:1，复合菌剂添加量500mL，以堆体总体积比的1％接种添加)

猪粪对照组(PM+CK)：猪粪+锯末(猪粪与锯末质量比7:1，添加500mL无菌水，猪粪湿重17kg

猪粪试验组(PM+AB)：猪粪+锯末+复合菌剂(猪粪与锯末质量比7:1，复合菌剂添加量500mL，以堆体总体积比的1％接种添加)

本研究中使用的堆肥试验装置属于反应器堆肥模式。根据国家《畜禽粪便堆肥技术规程 NY/T 2018》规定的反应器堆肥工艺参数，反应器堆肥发酵周期在5-10天，成品含水率<4 5％，温度<35℃，无臭味。堆体温度变化结果如图3所示，添加复合菌剂AB组升温速度高于CK组，且优先达到高温期。猪粪堆肥AB组最高温度可达61.9，CK组最高温度60.4。鸡粪堆肥第6天降至35℃，而猪粪组第10天降至35℃。鸡粪组高温期持续时间短，降温速度快，堆肥周期显著短于猪粪组。

堆体总氮、硝态氮、铵态氮含量变化如图4所示，堆肥第2d高温期时，在NH₄ ⁺的利用率相似的情况下，AB组铵态氮和硝态氮均高于对照CK组，说明接种复合菌剂能够加快有机物质的降解，促进氮转化进程。降温期NH₄ ⁺被微生物利用或转化为其他形式的氮源而迅速下降，且AB组的下降速度高于CK组。堆肥结束时，AB组铵态氮、硝态氮、总氮均高于CK组，氮源以较稳定的形态存在于堆体中，说明添加复合菌剂具有固氮作用。添加复合菌剂鸡粪组的铵态氮和硝态氮均显著高于猪粪组。

堆体硝态氮变化(g/kg)

堆体铵态氮变化(g/kg)

堆体全N变化(g/kg)

氮的循环转化是分析堆肥保氮固氮的重要组成部分，氮循环转化主要包括氨氧化作用、硝化作用、反硝化作用以及固氮作用。固氮酶nifH基因可以将氮气固定形成有机氮。采用绝对荧光定量PCR检测nifH基因的表达水平，引物如下所示：nifH：F：5’-TGCGAYCCSAARGCBGACTC-3’，R：5’-ATSGCCATCATYTCRCCGGA-3’。nifH基因的表达变化如图5所示，堆肥过程中固氮酶基因的变化呈现升高-降低的趋势，降温期nifH丰度明显降低。 AB组固氮酶nifH基因高于CK组，且对鸡粪的固氮效果比猪粪明显。

实施例4：

复合菌剂在有机肥厂的中试应用效果研究：

堆肥发酵物料比及分组：

将鸡粪和辅料按鸡粪：壳糠：菌菇渣＝7:2:1(质量比，湿重)用搅拌机充分混合均匀后，设置5个组别，分别是：

空白组CK组(12吨混合物料+5升水)

复合菌剂组T1组(12吨混合物料+5升浓缩复合菌液(浓缩菌液的有效菌浓度是1.52×10⁹cfu/mL))，

市场液体菌剂T2组(12吨物料+5L液体菌剂)

市场菌粉T3组(12吨物料+13斤菌粉+5升水)

市场菌粉T4组(12吨物料+24斤菌粉+5升水)

市场菌剂按说明书指示确定添加量。其中，市场菌剂T2产品说明书显示能够除臭，促进堆肥腐熟。菌剂T3产品主要成分为地衣芽孢杆菌，含菌数达100亿/克，能够升温，促进堆肥腐熟。菌剂T4产品名称为有机物料腐熟剂，含菌数达40亿/克，配方中含有枯草芽孢杆菌、酵母菌等复合菌，能够促进堆肥升温，物料腐熟。

将各组进行条垛式堆肥，堆体高度1.2米左右，宽约3米，长约8米，利用翻耙机翻耙1-2 次/天，直到鸡粪堆肥发酵彻底腐熟。

堆体温度变化如图6所示，通过温度监测，堆肥第1天，T1菌剂添加组可达50℃以上，起温较快，显著高于对照组；第三天可达国家规定的高温期55℃；T1组在第19天开始降温，27天已到腐熟期温度，而其它各组在第38天开始降温，41天接近腐熟。和对照组相比，T1组添加复合菌剂能显著缩短堆肥周期。

堆体水分变化表5所示，根据各辅料的含水率及碳氮比，调节堆肥起始含水量。堆肥2 7天时T1组的含水率稳定在33.27％，显著低于其它组，同时也达到了堆肥腐熟样品含水率的要求。而CK组直到41天时，才降到29.95％。

表5堆体水分变化

种子发芽率是评价堆肥腐熟度的指标。堆肥27天时样品种子发芽率如下表6所示，T1 组种子发芽率明显高于空白对照组和其它市场菌剂组，并达到了国家规定的腐熟和无害化水平。堆肥41天时，CK组才达到腐熟，堆肥样品种子发芽率达到76.22％，其它市场菌剂组均达到腐熟标准。

表6第27天堆肥样品小白菜种子发芽指数

注：CK:对照组，T1:复合菌剂添加组，T2、T3、T4分别为不同来源的市场售卖菌剂添加组。

表7第41天堆肥样品小白菜种子发芽指数

堆体C/N、TN的变化如图7所示，对堆体0d、2d、27d和41d的样品进行检测，全氮含量先降低后增加，主要因为升温、高温期氮以氨气的形式损失，堆肥结束，氮的相对含量增加了，且T1氮含量显著高于CK组，说明复合菌剂起到固氮的作用。堆肥过程中碳氮比的变化整体呈现先上升后下降的趋势，堆肥27天时，T1组碳氮比为12.53，CK组碳氮比为16.21，T1先达到腐熟，而CK组和其它市场菌剂添加组41天时才下降到腐熟值范围，表明接种复合菌剂可以促进有机物质的降解，缩短堆肥周期，并达到固氮的效果。

堆体C/N变化

堆体含N量变化

Claims

1.一种适用于工厂化大型堆肥的微生物菌剂在工厂化大型堆肥中的应用；

所述的微生物菌剂由枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）BS1、解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）Ba、地衣芽孢杆菌（Bacillus licheniformis）L3和酿酒酵母菌（Saccharomyces cerevisiae）Y2的菌液按照3L:1-2L:3-4L:4-5L混合而成；混合前，所述枯草芽孢杆菌BS1的有效菌浓度为6.1~8.2×10⁸CFU/mL，解淀粉芽孢杆菌Ba的有效菌浓度为2.6～3.07×10⁸CFU/mL，地衣芽孢杆菌L3的有效菌浓度为1.17~1.7×10⁸CFU/mL，酿酒酵母菌Y2的有效菌浓度为4.8~6.2×10⁷CFU/mL；所述枯草芽孢杆菌BS1的保藏编号为CCTCCNO：M2019185，所述解淀粉芽孢杆菌Ba的保藏编号为CCTCC NO：M2020098，所述堆肥的规模大于等于12吨。