CN110184218A - 一种基于枯草芽孢杆菌bs1的复合菌剂及应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于微生物及其应用领域，其具体公开了一种基于枯草芽孢杆菌BS1的复合菌剂及应用，所述的枯草芽孢杆菌已在中国典型培养物保藏中心进行了保藏，保藏编号为：CCTCC NO：M 2019185。该菌株与酿酒酵母菌，巨大芽孢杆菌和地衣芽孢杆菌制备的复合菌剂可用于畜禽粪便堆肥。本发明的复合菌剂能够在堆肥中提高堆肥温度、缩短达到高温的时间、除臭固氮、对堆肥中各类抗生素抗性基因和致病菌都有显著的消减作用。

Description

一种基于枯草芽孢杆菌BS1的复合菌剂及应用

技术领域

本发明属于微生物及其应用领域，具体涉及了一种基于枯草芽孢杆菌BS1的复合菌剂及应用；该复合菌剂可用于畜禽粪便堆肥。

背景技术

随着我国养殖业的迅速发展，畜禽粪便污染已经成为农业面源污染的源头之一。畜禽粪便排放数量大、治理难度高等问题不但严重影响了畜禽健康和生产性能的发挥，而且对周围水体、土壤等生态环境造成了巨大压力。同时，畜禽粪便携带的抗生素抗性基因(Antibiotic resistance genes，ARGs)作为一种新型污染物，可以在环境中传播，很难控制和消除。这些因素成为了制约畜牧业可持续发展的瓶颈，更对人类健康也造成极大的威胁。

枯草芽孢杆菌对环境的适应力很强，在极端的条件下，可以诱导产生内源孢子，孢子状态下对外界不良刺激的抵抗力很强，耐挤压、抗氧化，可以长期承受60℃的高温；具较强的蛋白酶，脂肪酶，淀粉酶的能力，同时还能降解如木聚糖，第一聚糖，果胶，羧甲基纤维素，多聚半乳糖醛酸以及其他一些复杂的植物性碳水化合物；固氮。巨大芽孢杆菌可以用来生产解磷固钾肥，巨大芽孢杆菌具有很好的降解土壤中有机磷、固氮保钾等功效，是生产生物有机肥的常用菌种。巨大芽孢杆菌制剂可以减少氨气释放量。

好氧堆肥是实现畜禽粪便无害化和资源化处理最有效的途径之一，其实质是微生物分解有机物的过程。根据堆肥过程温度变化，可以分为升温期、高温期、降温期和腐熟期。

其高温阶段可以最大限度地杀灭病原菌，快速降解有机物，是现有有机固体废弃物处理技术中应用最广，从经济和环境效益方面最有效的管理手段。但传统的好氧堆肥法仍存在升温缓慢，发酵时间较长、堆肥品质不高、氮素损失严重、腐殖化程度低以及氨气和温室气体排放显著等问题。

目前针对堆肥微生物菌剂的研究更多地集中在功能菌株的筛选以及对堆肥应用效果的研究。但由于堆肥原料和过程控制的差异及缺乏相应的机理研究，使功能菌剂的使用效果不一，缺乏功能全面、强大的菌剂产品。芽孢杆菌是堆肥中的优势菌群，本发明从堆肥中分离获得的枯草芽孢杆菌，具有较强的蛋白酶、淀粉酶和纤维素酶活性，对多种抗生素敏感，并对铵态氮有较强的利用能力，筛选其用于堆肥复合菌剂的研制，获得较好的应用效果，尤其是对堆肥中抗生素抗性基因以及病原菌均有一定的消减作用，目前对这方面的研究还未见报道。

发明内容

针对上述现有存在的技术，本发明的目的在于提供了一种基于枯草芽孢杆菌BS1的复合菌剂，所述的菌剂包括枯草芽孢杆菌BS1、地衣芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌和酿酒酵母菌，所述的枯草芽孢杆菌BS1的保藏编号为CCTCC NO：M 2019185。

本发明的另一个目的在于提供了一种基于枯草芽孢杆菌BS1的复合菌剂的应用，该菌剂可用于畜禽粪便堆肥，可提高堆肥效率同时消除堆肥过程中的消极影响。

为实现上述目的，本发明采用如下的技术措施：

申请人自猪粪堆肥中分离纯化出一株枯草芽孢杆菌，该菌株已于2019年3月21日在中国典型培养物保藏中心进行了保藏，保藏号编为：CCTCC NO：M 2019185，分类命名：Bacillus subtilis BS1，地址：中国武汉武汉大学。

所述枯草芽孢杆菌的主要特征如下：

1、菌落形态特征：

圆或者不规则形态，表面粗糙不透明，呈污白色。

2、培养特征：

枯草芽孢杆菌在基础培养基LB(氯化钠、胰蛋白胨、酵母提取物，用5mol/LNaOH调pH至7.0，121℃，灭菌20min)中就可以生存，其最适生长的温度30℃-37℃。菌落生长比较迅速。在0-6h为生长调整期，6-14h为生长对数期，14h后进入稳定期。

该枯草芽孢杆菌具有较强的淀粉酶、蛋白酶和纤维素酶活性，并对多种抗生素敏感，具有较强的铵态氮利用能力。

一种基于枯草芽孢杆菌BS1的复合菌剂，所述的菌剂包括枯草芽孢杆菌BS1、地衣芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌和酿酒酵母菌；所述的枯草芽孢杆菌BS1的保藏编号为CCTCC NO：M2019185，其余用市售的菌剂即可完成本发明。

以上所述的复合菌剂，优选的，所述的菌剂是以枯草芽孢杆菌BS1、地衣芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌和酿酒酵母菌的菌液，按照1L:1L:1L:2L混合后，离心，再重悬于0.5L灭菌的LB液体培养基制得；

混合前，所述的枯草芽孢杆菌BS1的有效菌浓度为(5.7～8)x10⁸CFU/mL，地衣芽孢杆菌有效菌浓度为(1.17～1.7)x10⁸CFU/mL，巨大芽孢杆菌有效菌浓度(1～1.18)x10⁸CFU/mL，酿酒酵母菌有效菌浓度(4.8～6.2)x10⁷CFU/mL；

以上所述的复合菌剂，优选的，所述的地衣芽孢杆菌为地衣芽孢杆菌L3；巨大芽孢杆菌为巨大芽孢杆菌C2；酿酒酵母菌为酿酒酵母Y2。

一种基于枯草芽孢杆菌BS1的复合菌剂的应用，所述的应用包括用于畜禽粪便堆肥，制备成堆肥中的微生物添加剂；所述的符合菌剂可用于提高堆体温度；延长高温期持续时间；提高腐熟效果；除臭固氮；消除堆体中的四环素类、大环内酯类、磺胺类、β-内酰胺类抗性基因；消除堆体中的致病菌。

与现有技术相比，本发明的优点和效果如下：

(1)接种分解有机物质能力强的菌株，在堆肥开始时提高优势微生物含量，增强微生物的降解活性；

(2)提高堆肥温度，缩短达到高温的时间；

(3)减少氨气释放量，除臭固氮；其氨气去除率达到34.04％。

(4)对堆肥中抗生素抗性基因和致病菌有明显的消减作用。

附图说明

图1为本发明中芽孢杆菌的菌落形态图。

图2为本发明的芽孢杆菌的生长曲线图。

图3为复合菌剂对堆肥堆体温度的影响图。

图4为复合菌剂对堆肥堆体水分的影响图。

图5为复合菌剂对堆肥堆体C/N含量的影响图。

图6位复合菌剂对堆肥过程中固氮酶基因的影响图。

图7为复合菌剂对堆肥过程中四环素类抗性基因的影响图。

图8为复合菌剂对堆肥过程中大环内酯类抗性基因的影响图。

图9为复合菌剂对堆肥过程中磺胺类抗性基因的影响图。

图10为复合菌剂对堆肥过程中β-内酰胺类抗性基因的影响图。

图11为复合菌剂对堆肥过程中致病菌的影响图。

具体实施方式

以下的实例便于更好的理解本发明，但并不限于本发明。下述实施案例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。所述试剂或材料，如未特别说明，均购自于商业渠道。

实施例1：

枯草芽孢杆菌BS1的获得：

从猪粪堆肥中分离纯化获得，根据其生理生化指标和序列分析鉴定为枯草芽孢杆菌，该菌株具有淀粉酶、蛋白酶和纤维素酶活性；对多种不同种类抗生素敏感，敏感的抗生素包括：四环素、氯霉素、红霉素、诺氟沙星、卡那霉素、复方新诺明；以及可利用多种氮源，包括(NH₄)₂SO₄、CO(NH₂)₂、NH₄Cl、KNO₃、NaNO₂、NH₃·H₂O。

(1)菌落形态特征：

圆或者不规则形态，表面粗糙不透明，呈污白色(图1)。

(2)培养特征

枯草芽孢杆菌在基础培养基LB(氯化钠、胰蛋白胨、酵母提取物，用5mol/LNaOH调pH至7.0，121℃，灭菌20min)中就可以生存，其最适生长的温度30℃-37℃。菌落生长比较迅速。在0-6h为生长调整期，6-14h为生长对数期，14h后进入稳定期。其生长曲线如图2所示。

(3)菌株鉴定

根据芽孢杆菌和相关菌株的16SrRNA和ITS测序构建出的系统发育树，最终确定为枯草芽孢杆菌。

该菌株已于2019年3月21日在中国典型培养物保藏中心进行了保藏，保藏号编为：CCTCC NO：M 2019185，分类命名：Bacillus subtilis BS1，地址：中国武汉武汉大学。

实施例2：

枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)BS1的生物特性：

利用三种方式(纸片、单菌落点接、打孔)探究BS1对沙门氏菌、巴氏杆菌、链球菌体外抑菌试验，均没有发现抑菌圈，BS1繁殖速度快、菌落较大，可能通过对营养物质、生态位点的争夺等方式为自己赢得发展空间，挤压病原微生物的生存环境，从而达到消减病原菌的目的。BS1菌株对抗生素的敏感性试验显示，抑菌圈直径均大于15mm，对多个抗生素敏感，表明该菌株不携带抗生素抗性基因，不会增加抗性基因的基因水平转移。

通过酶活试验研究发现，BS1的蛋白酶活性、淀粉酶活性和纤维素酶活性较高。

将BS1添加到堆肥小型试验中，结果表明BS1对物料有较高的降解能力，可以有效降低堆肥的生物毒性，提高发芽指数，让堆肥快速达到腐熟状态。同时探究混合菌株除臭能力，CK组平均氨气释放量为1.88±0.10mol，复合菌剂组平均氨气释放量为1.24±0.20mol，试验表明复合菌剂除氨率达34.04％。

实施例3：

一种复合菌剂，以枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌和酿酒酵母菌以体积比1L:1L:1L:2L混合后，离心，再重悬于0.5L灭菌的LB液体培养基制得；用于以下实施例；

混合前，所述的枯草芽孢杆菌的有效菌浓度为8x10⁸CFU/mL，地衣芽孢杆菌有效菌浓度为1.7x10⁸CFU/mL；巨大芽孢杆菌有效菌浓度1.18x10⁸CFU/mL；酿酒酵母菌有效菌浓度为6.2x10⁷CFU/mL；

所述的枯草芽孢杆菌为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)BS1，保藏号编为：CCTCC NO：M 2019185；地衣芽孢杆菌为地衣芽孢杆菌L3；巨大芽孢杆菌为巨大芽孢杆菌C2；酿酒酵母菌为酿酒酵母Y2。

实施例4：

复合菌剂在处理畜禽粪便中的应用，应用过程如下：

本发明实施例所使用的堆肥方法为：

堆肥试验装置主要由2个高280mm、长540mm、宽400mm，容积60L，厚度3mm的EPS泡沫箱组成，以保持堆体温度，装置底部留有小孔，供给空气从底部进入。底部铺满3cm左右的锯末作为缓冲层，通风装置定时通风，保证通气量均匀，上层留有直径2cm的小孔作为出风口。

根据所测猪粪和锯末的水分含量，全碳含量和全氮含量，调节堆体碳氮比为20，将猪粪(湿重)和锯末(湿重)以质量比6:1进行混合搅拌均匀(计算时已去除物料中水分含量)，堆体总体积约50L，装填进装置内进行堆肥试验。同时检测堆体的温度、水分、C/N含量、固氮酶、抗性基因以及致病菌的变化情况。

实验分组如下：

CK组为：猪粪+锯末(猪粪与锯末质量比6:1，添加500mL无菌水)

AB组为：猪粪+锯末+复合菌剂(猪粪与锯末质量比6:1，复合菌剂添加量500mL，以堆体总体积比的1％接种添加)

堆体温度变化结果如图3所示，图中RT(Room temperature)代表堆肥过程在室内温度变化。在第一天，AB组的堆肥温度就升到了55℃以上，达到了高温期，CK组在第一天也达到了高温期，但添加的复合菌剂大大缩短了AB组达到高温期的时间。AB组在第2天达到了最高温度62.1℃，CK组最高温度是60.9℃，AB组和CK组堆肥在55℃以上都持续了3天以上，达到了堆肥无害化处理的标准。到第4天的时候温度开始下降进入了降温期，第7天堆肥进入低温腐熟期。图中可以看出这个阶段堆体温度略高于环境温度，到第22天的时候，堆体温度基本和环境温度接近。实验组和对照组温度变化差异不显著。

堆体水分变化结果如图4所示，堆肥初期各组均调节含水率在65％左右，堆肥第5天，AB组含水率下降到55％，而CK组下降到58％，说明相对于CK组，AB组的微生物活动更加剧烈，并且由于AB组的高温期温度更高，持续的时间更长，所以水分蒸发也更多。从第5天到第12天这个阶段水分下降较为缓慢，可能是因为堆体进入降温期，微生物活动有所减弱，消耗的水分减少。在堆肥到第12天的时候，进行了一次翻堆，将堆体内未完全分解的物料重新翻堆，在这个阶段水分损失加快，直到堆肥结束时，AB组的含水率稳定在44％，CK组含水率稳定在46％左右。

堆体C/N含量的变化结果如图5所示，整个堆肥过程全碳含量呈下降趋势，其中AB组在高温期碳含量急速下降，这可能是堆肥初期微生物活动强烈，将有机物转化成二氧化碳或矿物质，到后期含量又慢慢上升，最终两组全碳含量稳定在38％左右。堆肥过程中全氮含量的变化整体呈现先下降后上升的趋势，主要是因为堆肥初期有机态氮被不断分解转变成铵态氮，导致了氮素的损失，但总体上，最终的氮含量有所上升，这是因为有机物不断被分解导致堆体体积减少，物料的重量减轻了，氮的相对含量增加了。并且堆肥后期AB组氮含量高于CK组，这可能是添加的复合菌剂起到了一定的保氮作用。堆肥过程中碳氮比的变化整体呈现先上升后下降的趋势，初始碳氮比调节到20左右，初期AB组碳氮比升高较快，这可能是因为AB组温度较高，高温持续时间长导致氮素损失较多，因此碳氮比升高较快。堆肥结束时，AB组碳氮比为13.15，CK组碳氮比为15.08，两组堆肥均达到了腐熟状态。

固氮酶基因的变化如图6所示，利用绝对荧光定量PCR检测，引物如下所示：nifH：F：5’-TGCGAYCCSAARGCBGACTC-3’，R：5’-ATSGCCATCATYTCRCCGGA-3’。对堆肥过程中固氮酶基因的变化检测，显示呈现升高-降低的趋势，降温期升高幅度较大，AB组固氮作用相对于CK组效果明显；N₂在固氮酶的作用下还原成氨，N₂O在氧化亚氮还原酶的作用下还原成氮气，堆体降温之后N2释放量增加，CK组释放N₂量较AB组高，但CK组固氮作用相对较弱。

抗生素抗性基因(Antibiotic resistance genes，ARGs)的变化情况：

1)四环素类抗性基因变化，结果如图7所示。

利用绝对荧光定量PCR对不同时期不同高度层堆肥样品中四环素类ARGs丰度变化和空间分布情况检测。四环素类基因定量PCR引物如下所示：

tetA：F：5’-GCTACTCCTGCTTGCCTTC-3’，R：5’-CATAGATCGCCGTGAAGAGG-3’；

tetC：F：5’-GCGGGATATCGTCCATTCCG-3’，R：5’-GCGTAGAGGATCCACAGGACG-3’；

tetG：F：5’-GCAGAGCAGGTCGCTGG-3’，R：5’-CCTGCAAGAGAAGCCAGAAG-3’；

tetH：F：5’-CAACCCATTACGGTGTGCTA-3’，R：5’-AAGTGTGGTTGAGAATGCCA-3’；

tetL：F：5’-TCGTTAGCGTGCTGTCATTC-3’，R：5’-GTATCCCACCAATGTAGCCG-3’；

tetM：F：5’-ACAGAAAGCTTATTATATAAC-3’，R：5’-TGGCGTGTCTATGATGTTCAC-3’；

tetO：F：5’-GATGGCATACAGGCACAGACC-3’，R：5’-GCCCAACCTTTTGCTTCACTA-3’；

tetQ：F：5’-AGAATCTGCTGTTTGCCAGTG-3’，R：5’-CGGAGTGTCAATGATATTGCA-3’；

tetW：F：5’-GAGAGCCTGCTATATGCCAGC-3’，R：5’-GGGCGTATCCACAATGTTAAC-3’。

四环素类ARGs的初始含量范围为0.000045～0.072copies/16S rDNA，其中tetW的基因丰度最高，tetQ丰度次之，tetG丰度最低，和前期堆肥试验检测结果一致。抗性基因的增殖和削减情况如表1所示，从CK组和AB组的分析来看：堆肥结束时，AB组对tetH、tetL、tetM的削减显著高于CK组，而tetO、tetQ无显著差异。总体来看，ARGs的去除率为中层>上层>下层。tetA、tetC、tetG呈现增殖现象，但不同高度层增殖情况有所不同，中层和下层的tetA、tetC、tetG基因CK组显著高于AB组，而上层的tetA、tetG基因AB组显著高于CK组。以上结果可能是因为添加外源菌剂提高了堆肥的温度和高温持续时间所致，并且不同高度层的环境条件有差异，导致菌群结构有所不同。

表1不同高度层四环素类ARGs变化情况

注：表中“倍”表示增殖的ARGs增加的倍数；“％”表示削减的ARG被削减的百分数

2)大环内酯类抗性基因的变化，结果如图8所示。

利用绝对荧光定量PCR对堆肥过程中大环内酯类ARGs的变化检测，大环内酯类基因定量PCR引物如下所示：

ermA：F：5’-AAGCGGTAAACCCCTCTGA-3’，R：5’-TTCGCAAATCCCTTCTCAAC-3’；

ermB：F：5’-AAAACTTACCCGCCATACCA-3’，R：5’-TTTGGCGTGTTTCATTGCTT-3’；

ermC：F：5’-GAAATCGGCTCAGGAAAAGG-3’，R：5’-TAGCAAACCCGTATTCCACG-3’；

ermF：F：5’-TCGTTTTACGGGTCAGCACTT-3’，R：5’-CAACCAAAGCTGTGTCGTTT-3’；

ermQ：F：5’-CACCAACTGATATGTGGCTAG-3’，R：5’-CTAGGCATGGGATGGAAGTC-3’。

ARGs初始含量范围为0.000033～0.079copies/16S rDNA。其中，ermB丰度最高，ermF次之，ermC的丰度最低。堆肥结束时，ermB、ermQ被削减，ermB基因在上层和中层差异不显著，下层AB组的削减显著高于CK组。对于ermQ基因，上层CK组削减效果高于AB组，中层差异不明显，下层AB组削减效果高于CK组。第5天时AB组削减效果显著高于CK组，结果说明堆肥对ARGs的影响在不同高度层效果不同。堆肥中ermA、ermC、ermF出现增殖现象，在中层和下层CK组ermA、ermC的增殖显著高于AB组，上层与之相反。

3)磺胺类抗性基因的变化，结果如图9所示。

利用绝对荧光定量pcr对添加复合菌剂进行堆肥过程中磺胺类抗性基因的变化情况检测，磺胺类基因定量PCR引物如下所示：

sul1：F：5’-CACCGGAAACATCGCTGCA-3’，R：5’-AAGTTCCGCCGCAAGGCT-3’；

sul2：F：5’-GCGCTCAAGGCAGATGGCATT-3’，R：5’-GCGTTTGATACCGGCACCCGT-3’。

堆体中sul1初始含量为：0.00033copies/16S rDNA；sul2为0.0011copies/16SrDNA。两种磺胺类抗性基因均呈出现增殖的现象，与第一次堆肥试验结果一致。其中，对于sul1基因，CK组样品上层、中层、下层分别增加了179.65、331.57、365.39倍；AB组样品上层、中层、下层分别增加了471.02、201.27、242.89倍。对于suL2基因，CK组样品上层、中层、下层分别增加了268.65、200、223.97倍；AB组样品上层、中层、下层分别增加了259.21、270.77、159.54倍。从图中可以看出，sul1基因：上层样品中AB组增殖显著高于CK组，中层和下层CK组增殖显著高于AB组。sul2基因在上层和中层的变化无差异，下层CK组增殖显著高于AB组。

4)β-内酰胺类抗性基因的变化，结果如图10所示。

利用绝对荧光定量pcr对堆肥过程中β-内酰胺类抗性基因的变化情况检测，磺胺类基因定量PCR引物如下所示：

blaCTX：F：5’-CTATGGCACCACCAACGATA-3’，R：5’-ACGGCTTTCTGCCTTAGGTT-3’；

blaTEM：F：5’-TCGGGGAAATGTGCG-3’，R：5’-GGAATAAGGGCGACA-3’。

blaCTX的初始含量为：2.4982E-06copies/16S rDNA；blaTEM的初始含量为：0.0046copies/16S rDNA。两种β-内酰胺类抗性基因均被削减，其中，对于blaCTX基因，CK组上、中、下层分别削减了51.82％、77.89％、73.65％；AB组样品上、中、下层分别削减了30.15％、82.41％、22.76％。对于blaTEM基因，CK组样品上层、中层、下层分别削减了96.4％、96.3％、89.8％；AB组样品上层，中层，下层分别削减了65.72％、91.13％、90.95％。从图中可以看出，blaCTX、blaTEM在第一天显著增殖，到第2天又显著下降，这可能是因为携带该类基因的宿主菌是噬温菌，在升温期出现增殖，高温之后被大量削减导致的。由于检测到的β-内酰胺类基因含量较低，到堆肥结束时含量与初始含量较为接近。

堆肥过程中致病菌的变化

利用荧光定量PCR对堆肥过程中致病菌相对丰度变化的检测。结果如图11所示。在堆肥的初始阶段共发现了10种致病菌，包括有unclassified_c_Bacilli(未分类的杆菌属)，Acinetobacter(不动杆菌属)，Streptococcus(链球菌属)，Mycobacterlum(分支杆菌属)，Clostridium_sensu_stricto_1(狭义梭菌属)，Pseudomonas(假单胞菌属)，Escherichia-Shigella(大肠埃希菌志贺菌属)，Brucella(布氏杆菌属)，Listeria(李斯特菌属)，Mycoolasma(支原体)等(图11)。

在堆肥第2天高温期致病菌丰度急剧下降，CK组丰度下降到34.3％，AB组下降到29.86％。到堆肥结束时，CK组的致病菌相对丰度为17.39％，下降了78.16％，AB组致病菌相对丰度为10.29％，下降了86.77％。并且在堆肥结束时两组堆肥病原菌组成差别较大，CK组主要有假单胞菌属(4.14％)和布鲁菌属(3.27％)，而AB组主要是分支杆菌属(4.39％)。

Claims (7)

1.一种基于枯草芽孢杆菌BS1的复合菌剂，所述的菌剂包括枯草芽孢杆菌BS1、地衣芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌和酿酒酵母菌；所述的枯草芽孢杆菌BS1的保藏编号为CCTCC NO：M2019185。

2.根据权利要求1所述的复合菌剂，所述的复合菌剂是以枯草芽孢杆菌BS1、地衣芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌和酿酒酵母菌的菌液，按照1L:1L:1L:2L混合后，离心，再重悬于0.5L灭菌的LB液体培养基制得；

混合前，所述的枯草芽孢杆菌BS1的有效菌浓度为（5.7~8）x10⁸CFU/mL，地衣芽孢杆菌有效菌浓度为（1.17~1.7）x10⁸CFU/mL，巨大芽孢杆菌有效菌浓度（1~1.18）x10⁸CFU/mL，酿酒酵母菌有效菌浓度（4.8~6.2）x10⁷CFU/mL。

3.根据权利要求1或2所述的复合菌剂，所述的地衣芽孢杆菌为地衣芽孢杆菌L3；巨大芽孢杆菌为巨大芽孢杆菌C2；酿酒酵母菌为酿酒酵母Y2。

4.权利要求1所述的复合菌剂在畜禽粪便堆肥中的应用。

5.根据权利要求4所述的应用，所述的复合菌剂在消除堆体中的四环素类、大环内酯类、磺胺类、β-内酰胺类抗性基因中的应用。

6.根据权利要求4所述的应用，所述的复合菌剂在同时提高堆体温度；延长高温期持续时间、提高腐熟效果和除臭固氮中的应用。

7.根据权利要求4所述的应用，所述的复合菌剂在消除堆体中的致病菌中的应用。