CN107314980A - 一种动物源性食品中多种抗生素残留检测试剂盒及检测方法 - Google Patents

一种动物源性食品中多种抗生素残留检测试剂盒及检测方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供一种动物源性食品中多种抗生素残留检测试剂盒及检测方法。所述检测培养基中含有不影响吸光度检测的凝固剂、抗生素增效剂、对低浓度抗生素敏感的菌株。将供试样品置于所述检测培养基上培养后，每间隔一定时间检测其吸光度值；应用统计学方法比较在相同时间间隔内，供试样品吸光度值的变化量与空白对照吸光度值的变化量是否有显著性差别；由此判断待测样品是否含有抗生素。与现有微生物法检测抗生素残留的产品相比，本发明方法检测时间更短，检出限更低，可检测的抗生素种类更多，检测结果客观准确。

Description

一种动物源性食品中多种抗生素残留检测试剂盒及检测方法
技术领域
本发明涉及抗生素残留检测技术理由，具体涉及一种动物源性食品中多种抗生素残留检测试剂盒及检测方法。
背景技术
在现代畜禽和水产的养殖过程中，养殖户为了预防或治疗某些疾病，常常会使用抗生素，并以此来保持较高的产投比。因为缺乏科学的指导，不少养殖户会过量使用抗生素，造成畜禽及水产品在屠宰后体内残留抗生素超标，不仅降低了产品质量还影响了产品的二次加工。更重要的是，这些抗生素残留超标的动物性产品进入市场后，会使消费者体内的菌株产生抗性，扰乱体内环境平衡等一系列健康问题。因此开发一种动物源性食品中多种抗生素残留检测试剂盒及检测方法是很有必要的。
目前检测动物源性食品中抗生素残留的方法主要有色谱法、酶联免疫法和微生物法。高效液相色谱法是目前最为普遍的方法，其优点在于检出限低，检测结果稳定，但检测成本高，样品前处理费时费力、检测目标单一和检测时间长等问题使得色谱法不能应用于大批量样品筛查中。酶联免疫法通过与抗生素产生特异性结合的抗体进行检测，具有检出限低，操作较简单等特点，但每次只能检测单一抗生素且检测成本较高等问题使得酶联免疫法与色谱法一样很难应用于大批量样品筛查中。微生物法是基于抗生素残留对微生物生长的抑制作用，抗生素浓度越高，微生物生长受抑制的程度越大。传统微生物法将浸有样品的纸片放于涂满特定菌株的培养皿上，培养24-48小时，通过测量抑菌圈的大小从而判断抗生素残留是否超标。这种方法虽然可以同时对多种抗生素进行筛查但检测时间过长。近些年，科学家们在传统微生物法的基础上开发了试管扩散法，将酸碱指示剂或氧化还原指示剂加入到培养基中，作为反映菌株生长情况的指标，当体系中没有抗生素存在，菌株迅速生长产酸，改变环境的pH值，使指示剂变色，反之指示剂不变色。但这种方法存在着一些弊端，例如，首先菌株产酸需要积累到一定程度才可以使指示剂变色，因此，指示剂并不是一个敏感的反映菌株生长情况的指标。其次使用指示剂作为指标，只能反映是否存在抗生素残留超标问题，即是个定性检测方法，不能定量。第三，检测结果需要通过人眼主观判断颜色是否发生了变化，而且每个人的眼睛对颜色变化的敏感程度也不一样，从而增加了主观误判的几率。
因此，为了在现有微生物法检测抗生素的基础上进一步降低抗生素的检出限并缩短检出时间，更客观地判定检测结果，进一步保障我国动物源性食品的食用安全性，开发动物源性食品中多种抗生素残留检测试剂盒及检测方法，具有十分重要的意义。
发明内容
本发明目的是提供一种动物源性食品中多种抗生素残留检测试剂盒及检测方法。
本发明技术方案如下
一种动物源性食品中多种抗生素残留的检测方法，包括以下步骤：
1)供试样品制备
2)取适量供试样品置于含有检测培养基的容器中，静置(室温)一定时间，使供试样品中的抗生素充分扩散至检测培养基中；然后去除容器中的供试样品(例如用去离子水洗净，并吸干水分)；封口(防止水分挥发)；恒温培养(培养温度一般可为20-80℃，优选55-75℃)，每间隔一段时间(例如1-10分钟)检测一次各孔检测培养基的吸光度值(检测波长一般可为1×102-1×105nm；优选为450-600nm)；
置于55-75℃恒温培养，每间隔一段时间检测一次检测培养基在450-600nm处的吸光度值；
另取与供试样品相同体积的纯水(或无菌水)置于另一含有检测培养基的容器中，同法处理，做为空白对照；
3)应用统计学方法(例如F检验)比较在相同时间间隔内，步骤2)中供试样品吸光度值的变化量与空白对照吸光度值的变化量是否有显著性差别；如果在相同时间间隔内供试样品吸光度值的变化量显著小于(P＜0.05)空白对照吸光度值的变化量，则判定样品中含有浓度高于检出限的抗生素；如果在相同时间间隔内供试样品吸光度值的变化量不显著小于(P≥0.05)空白对照吸光度值的变化量则判定样品中不含抗生素或含有浓度小于检出限的抗生素。
本发明方法检测原理见图1。
如果待测样品为液态可直接做为供试样品；如果待测样品为固态，则可取其汁液(压榨或反复冻融)或水浸提液或或萃取液或酶解液做为供试样品。只要获得待测样品中可能含有的抗生素的液体样品即可。
一般地，对于肉类及其制品(含动物脏器)、水生动物产品等待测样品，可将其剪成2cm3左右大小，放于压蒜器内榨取样品的汁液，或通过将样品冷冻后再解冻以及将样品置于有机试剂中的方式获取样品汁液。
步骤2)中，以mL/g计，供试样品与所述检测培养基的比例以1:1-1:5为佳，更优选为1:2-1:3。
步骤2)检测吸光度前要去除容器中残留的水分，防止水对吸光度值检测的影响
步骤2)中，一般于55-75℃条件下恒温培养60-180min，即可进行吸光度值检测。
所述检测培养基中含有不影响吸光度检测的凝固剂、抗生素增效剂、对低浓度抗生素敏感的菌株。
所述检测培养基只要能使所述对低浓度抗生素敏感的菌株(芽胞或营养体)能够快速萌发生长即可；可以胰蛋白胨大豆肉汤(Tryptic Soy Broth)培养基、脑心浸液肉汤培养基(Brain Heart Infusion Broth)、营养肉汤培养基(Nutrient Broth)等中的一种或几种为基础培养基；优选以胰蛋白胨大豆肉汤培养基为基础培养基。
所述不影响吸光度检测的凝固剂为琼脂糖、琼脂、明胶、卡拉胶、瓜尔胶、黄原胶、海藻酸钠、果胶等中的一种或几种，优选为琼脂糖；所述不影响吸光度检测的凝固剂在所述检测培养基中的质量分数一般为0.01％-10％。
所述抗生素增效剂为可以提高菌株对抗生素敏感性的物质，包括甲氧苄氨嘧啶(trimethoprim)、核苷类的腺苷(adenosine)、抗叶酸素类的四氧普林(tetroxoprim)和甲藜嘧胺(ormethoprim)、草酸盐(salts of oxalic acid)、氢氟酸(hydrofluoric acid)等中的一种或几种。所述抗生素增效剂在所述检测培养基中的浓度优选为1-1000ug/kg。
所述对低浓度抗生素敏感的菌株可根据实际需要按常规方法筛选而得。可选用一种或两种或两种以上的菌株。
所述菌株以芽胞或营养体形式悬浮于所述检测培养基中，菌株浓度以1×105-1×1010CFU/g检测培养基为佳。
常用的较佳的菌株是嗜热脂肪地芽胞杆菌(Geobacillus stearothermophilus)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)。
具体地，所述检测培养基以胰蛋白胨大豆肉汤培养基为基础培养基；所述检测培养基中还含有浓度1×105-1×1010CFU/g的嗜热脂肪地芽胞杆菌(Geobacillusstearothermophilus)，质量分数为0.2-2％的琼脂糖，浓度为5-100ug/kg的甲氧苄氨嘧啶(trimethoprim)；所述嗜热脂肪地芽胞杆菌以芽胞或营养体形式悬浮于所述检测培养基中。
本发明所述检测培养基可按本领域常规方法制备。
本发明所述动物源性食品包括全部可食用的动物组织以及蛋和奶，包括肉类及其制品(含动物脏器)、水生动物产品等。
本发明方法可检测的抗生素种类包括β-内酰胺类、头孢菌素类、大环内酯类、四环素类、氨基糖苷类、喹诺酮类、多肽类、氟甲砜霉素、磺胺类、林可酰胺类等。
本发明还提供一种含有上述检测培养基的多种抗生素残留检测试剂盒。进一步地，所述检测培养基装载于任何可用于吸光度检测的器皿中，包括多孔酶标板或多孔细胞培养板或比色皿。
本发明还包括上述检测培养基以及上述检测培养基或试剂盒在动物源性食品中多种抗生素残留检测上的应用。
具体地，上述动物源性食品中多种抗生素残留的检测方法，包括以下步骤：
1)供试样品制备
2)向含有所述检测培养基的多孔透明酶标板每孔中加入供试样品汁液100-300μL；每孔中含所述检测培养基200-600mg；室温静置(10-60min)，使供试样品中的抗生素充分扩散至检测培养基中；然后用去离子水润洗多孔透明酶标板，去除每孔中的供试样品，并吸干水分；封口(防止水分挥发)；置于55-75℃恒温培养，每间隔一段时间(例如1-10分钟)检测一次检测培养基在450-600nm处的吸光度值；
另取与供试样品相同体积的纯水(或无菌水)做为空白对照，同法处理；
3)应用统计学方法(例如F检验)比较在相同时间间隔内，步骤2)中供试样品吸光度值的变化量与空白对照吸光度值的变化量是否有显著性差别；如果在相同时间间隔内供试样品吸光度值的变化量显著小于(P＜0.05)空白对照吸光度值的变化量，则判定样品中含有浓度高于检出限的抗生素；如果在相同时间间隔内供试样品吸光度值的变化量不显著小于(P≥0.05)空白对照吸光度值的变化量则判定样品中不含抗生素或含有浓度小于检出限的抗生素。
与现有微生物法检测抗生素残留的产品相比，本发明方法检测时间更短，检出限更低，可检测的抗生素种类更多，检测结果客观准确。
附图说明
图1为本发明检测方法原理图。
图2为实施例1检测试剂盒的样品图。
图3为实施例2中含有不同浓度的头孢噻夫样品和空白在600nm吸光度值的曲线图。
图4为实施例2中含有不同浓度的杆菌肽样品和空白在600nm吸光度值的曲线图。
图5为实施例2中含有不同浓度的青霉素样品和空白在600nm吸光度值的曲线图。
图6为实施例2中含有不同浓度的四环素样品和空白在600nm吸光度值的曲线图。
具体实施方式
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件，或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可通过正规渠道商购买得到的常规产品。
实施例1
如图2所示，一种动物源性食品中多种抗生素残留检测试剂盒，其包括含有检测培养基的可拆卸的96孔透明酶标板；所述检测培养基以胰蛋白胨大豆肉汤培养基为基础培养基；所述检测培养基中还含有浓度1×105-1×1010CFU/g的嗜热脂肪地芽胞杆菌(Geobacillus stearothermophilus)，质量分数为0.2-2％的琼脂糖，浓度为5-100ug/kg的甲氧苄氨嘧啶(trimethoprim)；所述嗜热脂肪地芽胞杆菌以芽胞形式悬浮于所述检测培养基中。
实施例2应用动物源性食品中多种抗生素残留检测试剂盒和检测方法检测鲜奶样品
应用实施例1中的动物源性食品中多种抗生素残留检测试剂盒对掺有不同种类和不同浓度抗生素的鲜奶样品进行检测，结果如图3、4、5和6所示。具体方法如下：
1)制备供试样品
2)向含有所述检测培养基的多孔透明酶标板每孔中加入供试样品汁液100-300μL；每孔中含所述检测培养基200-600mg；室温静置10-60min，使供试样品中的抗生素充分扩散至检测培养基中；然后用去离子水润洗多孔透明酶标板，去除每孔中的供试样品，并吸干水分；封口；置于55-75℃恒温培养，每间隔1-10分钟检测一次各孔检测培养基在450-600nm处的吸光度值；
另取与供试样品相同体积的纯水(或无菌水)做为空白对照，同法处理；
3)进行F检验，比较在相同时间间隔内，比较在相同时间间隔内，步骤2)中供试样品吸光度值的变化量与空白对照吸光度值的变化量是否有显著性差别。
经过一段时间的培养，含有抗生素的样品，其吸光度值的变化量显著小于(P＜0.05)不含有抗生素的空白样品，且抗生素浓度与样品吸光度值的变化量呈递减关系，说明应用本发明的试剂盒和检测方法可以在90-120min内定量检测出头孢噻夫、杆菌肽、青霉素和四环素类抗生素，检出限低于欧盟最大限量，检测时间小于现有微生物法检测试剂盒产品。
实施例3应用动物源性食品中多种抗生素残留检测试剂盒和检测方法对多种抗生素的检出限和检测时间
应用实施例1中的动物源性食品中多种抗生素残留检测试剂盒和实施例2检测方法对不同种类的抗生素的检出限和检测时间进行检测，结果见表1。可以看出，本发明方法可以在120min内对多种抗生素进行检测，检出限满足欧盟规定的最大残留量。
表1应用检测试剂盒和检测方法对多种抗生素的检出限和检测时间
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

Claims (10)

1.一种用于动物源性食品中多种抗生素残留检测用的检测培养基，其特征在于，所述检测培养基中含有不影响吸光度检测的凝固剂、抗生素增效剂、对低浓度抗生素敏感的菌株。
2.根据权利要求1所述的检测培养基，其特征在于，所述检测培养基以胰蛋白胨大豆肉汤培养基、脑心浸液肉汤培养基、营养肉汤培养基中的一种或几种为基础培养基；
和/或，所述不影响吸光度检测的凝固剂为琼脂糖、琼脂、明胶、卡拉胶、瓜尔胶、黄原胶、海藻酸钠、果胶中的一种或几种；其在所述检测培养基中的质量分数为0.01％-10％；
和/或，所述抗生素增效剂包括甲氧苄氨嘧啶、核苷类的腺苷、抗叶酸素类的四氧普林和甲藜嘧胺、草酸盐、氢氟酸中的一种或几种；优选所述抗生素增效剂在所述检测培养基中的浓度为1-1000ug/kg；
和/或，所述菌株以芽胞或营养体形式悬浮于所述检测培养基中，优选所述菌株浓度为1×105-1×1010CFU/g检测培养基。
3.根据权利要求1或2所述的检测培养基，其特征在于，所述对低浓度抗生素敏感的菌株为嗜热脂肪地芽胞杆菌(Geobacillus stearothermophilus)、枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)中的一种或两种。
4.根据权利要求1所述的检测培养基，其特征在于，所述检测培养基以胰蛋白胨大豆肉汤培养基为基础培养基；所述检测培养基中还含有浓度1×105-1×1010CFU/g的嗜热脂肪地芽胞杆菌(Geobacillus stearothermophilus)，质量分数为0.2-2％的琼脂糖，浓度为5-100ug/kg的甲氧苄氨嘧啶；所述嗜热脂肪地芽胞杆菌以芽胞或营养体形式悬浮于所述检测培养基中。
5.含有权利要求1-4任一项所述的检测培养基的多种抗生素残留检测试剂盒。
6.根据权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，所述检测培养基装载于可用于吸光度检测的器皿中，包括多孔酶标板、多孔细胞培养板、比色皿。
7.权利要求1-4任一项所述的检测培养基或权利要求5或6所述试剂盒在动物源性食品中多种抗生素残留检测上的应用。
8.一种动物源性食品中多种抗生素残留的检测方法，其特征在于，包括以下步骤：
1)供试样品制备
2)取适量供试样品置于含有检测培养基的容器中，静置一定时间，使供试样品中的抗生素充分扩散至权利要求1-4任一项所述的检测培养基中；然后去除容器中的供试样品；封口；恒温培养，每间隔一段时间检测一次所述检测培养基的吸光度值；
另取与供试样品相同体积的纯水或无菌水置于另一含有所述检测培养基的容器中，同法处理，做为空白对照；
3)应用统计学方法比较在相同时间间隔内，步骤2)中供试样品吸光度值的变化量与空白对照吸光度值的变化量是否有显著性差别；如果在相同时间间隔内供试样品吸光度值的变化量显著小于(P＜0.05)空白对照吸光度值的变化量，则判定样品中含有浓度高于检出限的抗生素；如果在相同时间间隔内供试样品吸光度值的变化量不显著小于(P≥0.05)空白对照吸光度值的变化量则判定样品中不含抗生素或含有浓度小于检出限的抗生素。
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述动物源性食品包括全部可食用的动物组织、蛋和奶其制品；
和/或，可检测的抗生素种类包括β-内酰胺类、头孢菌素类、大环内酯类、四环素类、氨基糖苷类、喹诺酮类、多肽类、氟甲砜霉素、磺胺类、林可酰胺类；
和/或，以mL/g计，供试样品与所述检测培养基的比例为1:1-1:5，优选为1:2-1:3；
和/或，所述统计学方法为F检验。
10.根据权利要求8或9所述的方法，其特征在于，所述恒温培养温度为20-80℃，优选为55-75℃；
和/或，检测吸光度值的时间间隔为1-10分钟；
和/或，检测吸光度值的波长为1×102-1×105nm；优选为450-600nm。
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