CN103013822B

CN103013822B - 一种水产弧菌快速药敏检测试剂盒

Info

Publication number: CN103013822B
Application number: CN201210568362.1A
Authority: CN
Inventors: 刁菁; 杨秀生; 叶海斌; 于晓清; 盖春蕾; 李天保; 薛莲
Original assignee: Shandong Marine Biology Institute
Current assignee: Shandong Marine Biology Institute
Priority date: 2012-12-24
Filing date: 2012-12-24
Publication date: 2014-07-16
Anticipated expiration: 2032-12-24
Also published as: CN103013822A

Abstract

本发明涉及一种能应用于水产养殖现场的弧菌快速药敏检测试剂盒，本发明的检测试剂盒，包括有检测板、菌体采集工具、增菌液、药敏检测培养基、比浊管、接种滴管及比色卡；其中检测板包含有用于药敏检测的、包被了含有药物和显色指示剂的检测孔，所述显色指示剂为阿尔玛蓝。本发明在MH培养基的基础上添加鱼肉蛋白胨、Ca²⁺和Mg²⁺，调整NaCl浓度，作为弧菌的增菌液，可有效促进弧菌的生长，使得增菌液在短时间内达到要求浓度，以缩短药敏检测的时间。同时利用一种对细胞安全、无毒的蓝色染料阿尔玛蓝，对细胞无毒害作用，直接将其包被在药敏检测板微孔内不会影响细菌的生长，从而使得检测操作更加简便、快速，可连续监测细菌增殖动态。

Description

一种水产弧菌快速药敏检测试剂盒

技术领域

本发明属于水产致病微生物体外诊断技术领域，具体涉及一种水产弧菌快速药敏检测试剂盒。

背景技术

近年来随着水产养殖业的快速发展，水产养殖动物病害问题也日益突出，其中细菌性疾病已在世界范围内对渔业经济造成了巨大的损失。弧菌是一大群菌体短小、极生鞭毛、能运动、无芽胞的短杆状弯曲成弧形的革兰氏阴性菌，隶属于弧菌科、弧菌属。弧菌广泛分布于自然界，以水体中分布居多。大量研究表明，多种弧菌可引起海水养殖鱼类、贝类及甲壳类等经济动物的流行性和暴发性死亡，主要包括副溶血弧菌、灿烂弧菌、鳗弧菌、溶藻弧菌、哈维氏弧菌等。弧菌病给水产养殖业造成巨大经济损失，并且该病还会导致野生海水鱼类、贝类及甲壳类的死亡，进而威胁海洋自然生物资源。因此，对该疾病的预防与控制研究一直备受国内外研究人员的关注，是海水养殖动物病害的主要研究领域之一。目前，在水产养殖生产过程中，抗生素的使用仍是解决水产养殖动物弧菌病的重要手段，它能在短期起到良好的治疗效果，极大地降低养殖业的经济损失，但由于抗生素在疾病防治上的广泛和长期使用，耐药性弧菌的种类及数量得到不断攀升。近年来，抗药性弧菌菌株也不断地被分离到，在这种情况下如果无选择地盲目使用抗生素，不但得不到理想的治疗效果，反应会使得菌株的耐药性进一步加剧，从而给水产养殖业甚至人类生命健康安全带来更为严重的危害。因此，为了有针对性地使用抗生素药物以达到理想的治疗效果，对病原微生物开展抗生素敏感试验，以获知菌株的耐药特性，对于指导临床科学、合理、准确用药，避免疾病的暴发流行及微生物耐药性加剧起着关键性的作用。

目前，在水产细菌病防治领域，药敏检测方法主要采用K-B纸片法与肉汤稀释法，其中K-B纸片法一般须在专业的微生物实验室条件下进行，需要具备专业知识的人员来操作完成，存在操作繁琐、工作量大、周期长等问题，而且无法获得药物的最小抑菌浓度（MIC）值。常规的肉汤稀释法虽然可以测定药物的MIC值，但有时需要专业的仪器设备辅助，实验周期长，且对结果判读不够直观。因此，以上两种方法都不适合在水产养殖生产中推广应用。

发明内容

本发明的目的是提供一种能应用于水产养殖现场的弧菌快速药敏检测试剂盒，从而弥补现有技术的不足。

本发明检测试剂盒，包括有检测板、菌体采集工具、增菌液、药敏检测培养基、比浊管、接种滴管及比色卡；其中检测板包含用于药敏检测的、包被含有不同浓度药物和显色指示剂的检测孔，所述显色指示剂为阿尔玛蓝。

所述的菌体采集工具为无菌接种环或无菌吸管；

所述的增菌液的，其组份及浓度如下：牛肉浸粉6 g/L、可溶性淀粉1.5 g/L、酪蛋白水解物17.5g/L、NaCl 15g/L、CaCl₂2.8 mg/L、MgCl₂4mg/L、鱼肉蛋白胨10g/L。

所述的药敏检测培养基的组成如下：牛肉浸粉6 g、可溶性淀粉1.5g、酪蛋白水解物17.5 g、NaCl 15g、2.8 mg CaCl₂、4 mg MgCl₂、蒸馏水1 L。

所述的包被了含有药物的显色指示剂的检测孔，是将溶解有药物的海藻糖水溶液与显色指示剂阿尔玛蓝混合，加入到检测孔中进行阴干制成。

检测板还包含有用做质量控制的检测孔和/或用作生长对照的检测孔。

其中质量控制的检测孔和生长对照的检测孔，是将海藻糖水溶液和显色指示剂阿尔玛蓝混合，加入到检测孔中进行阴干制成。

上述的一种检测板，包含有96个检测孔，呈8行×12列排列。

所述的药物为氨苄青霉素、氟苯尼考、阿米卡星、四环素、土霉素、强力霉素、多粘菌素B、复方新诺明、诺氟沙星、恩诺沙星或利福平。

利用本药敏检测试剂盒进行检测的方法按照以下步骤进行：

1）利用无菌接种环挑取待检弧菌单个菌落，置于增菌液管内搅动均匀，然后将增菌液管置于28 ℃培养箱内震荡培养，直至增菌液浊度与0.5麦度比浊管的浊度相当；

2）将用增菌液扩大培养后的菌液以药敏检测培养基将其稀释1500倍，然后利用接种滴管分别滴加于药敏检测和生长对照的检测孔内，每孔滴加100μl菌液；而质量控制的检测孔内加入100μl无菌的药敏检测培养基；

3）将检测板置于28 ℃培养箱内避光培养6-10h，取出检测板观察微孔内的颜色，对照药敏比色卡进行药敏结果判读，判读标准如下：

A、若质控区颜色呈蓝色，则试验有效，可以继续进行判读；若呈粉红色，则试验无效，需重新进行检测；

B、若生长对照区呈粉色，则可以继续进行MIC判读；若生长对照区呈蓝色则需将检测板置于28℃培养箱内继续培养，至颜色变为粉红色后，再进行MIC判读；

C、若质控区呈蓝色，生长对照区呈粉红色，则判读各列不同药物对菌体的MIC，其中每列与比色卡上细菌增殖阴性对照区内颜色相同微孔的最低药物包被浓度即为待测弧菌的MIC。

本发明在MH培养基的基础上添加鱼肉蛋白胨、Ca²⁺和Mg²⁺，调整了NaCl浓度，作为弧菌的增菌液，可有效促进弧菌的生长，使得增菌液在短时间内达到要求浓度，以缩短药敏检测的时间。同时本发明利用一种对细胞安全、无毒的蓝色染料阿尔玛蓝，基于氧化/还原反应原理，当细菌生长增殖时，由于细菌细胞内生化反应产生的还原力可将预先包被在检测孔内的阿尔玛蓝还原，从而使其颜色由氧化态下的蓝色转变为还原态下的粉红色，这一颜色变化可利用肉眼进行直接判断。由于阿尔玛蓝对细胞无毒害作用，直接将其包被在药敏检测板微孔内不会影响细菌的生长，从而使得检测操作更加简便、快速，而且可连续监测细菌的增殖动态，因此本发明是一种简便、快捷、敏感、高效的药敏检测方法。

附图说明

图1：本发明的一种检测板的不同药物种类及含量的包被示意图。

图2：本发明的比色卡的示意图。

图3：不同增菌液配方对副溶血弧菌生长的影响。

图4：不同增菌液配方对溶藻弧菌生长的影响。

图5：不同增菌液配方对灿烂弧菌生长的影响。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施方式对本发明进行详细说明。

本发明试剂盒所用到的组份如下:

1）药敏检测板为常规96孔细胞培养板，也可是其它类型的细胞培养板；

2）菌体采集工具为无菌接种环或一次性无菌塑料接种环

3）增菌液的一种配制方法如下：牛肉浸粉6 g、可溶性淀粉1.5 g、酪蛋白水解物17.5 g、NaCl 15 g、2.8 mg CaCl₂、4 mg MgCl₂、鱼肉蛋白胨10 g、蒸馏水1 L；

4）0.5麦氏比浊管，是以0.5ml的0.048M BaCl₂溶液与99.5ml的0.36M H₂SO₄ 溶液混合配制装于密闭的透明小管内；也可选用商品化的麦氏比浊管；

5）接种滴管为无菌细头塑料滴管；

6）比色卡其上划分有细菌增殖阳性对照区及细菌增殖阴性对照区（图2）,其中从细菌增殖阴性对照区到细菌增殖阳性对照区的颜色从蓝色（RGB44、19、185）至粉红色（RGB：255，143，218）渐变；

7）选用的药品粘附保护剂海藻糖为试剂级纯度大于99%，显色指示剂采用试剂级的阿尔玛蓝染料，该染料是一种对细胞安全、无毒的氧化/还原指示染料，当细菌生长增殖时，由于细菌细胞内生化反应产生的还原力可将阿尔玛蓝染料发生还原，从而使其颜色由氧化态下的蓝色转变为还原态下的粉红色，这一颜色变化可利用肉眼进行直接判断。

实施例1：水产弧菌药敏快速检测板的制备

1、药物的配置

依据水产常用药物种类和禁用药物目录，确定检测药物的种类为氨苄青霉素、氟苯尼考、阿米卡星、四环素、土霉素、强力霉素、多粘菌素B、复方新诺明、诺氟沙星、恩诺沙星、利福平，共11种。根据不同药物的特性分别采用不同的溶剂准确配制成浓度为5.12mg/ml、3.2mg/ml、10.24mg/ml、1.6mg/ml、1.6mg/ml、1.6mg/ml、2.56mg/ml、6.4mg/ml、6.4mg/ml、6.4mg/ml、6.4mg/ml的抗菌药物储液，其中氨苄青霉素、盐酸强力霉素、阿米卡星、盐酸土霉素、盐酸四环素、多粘菌素B用超纯水配制；氟苯尼考、利福平用甲醇溶解，超纯水稀释配制；诺氟沙星和恩诺沙星用0.1N的NaOH溶解，超纯水稀释配制；SMZ用0.1NNaOH溶解，超纯水稀释配制，TMP用0.1N的冰醋酸溶解，超纯水稀释配制，以SMZ:TMP=5:1的比例混合配制成复方新诺明。配制好的药物储液经0.22μm滤膜过滤后，置于-20℃保存。

2、药敏检测板的制备

水产弧菌药敏快速检测板选用96孔无菌微孔板，共有8行（A-H）12列（1-12），根据用途不同分为三个区域：药敏检测区（A1:H11）、生长指示区（A12:D12）、质控区（E12:H12），其中药敏检测区每一列微孔底部包被有不同种类浓度呈倍比稀释的抗菌药物。

首先，将包被药物稀释成以下不同浓度：

复方新诺明、诺氟沙星、恩诺沙星、利福平由高至低的稀释浓度分别为：0.064μg/μl、0.032μg/μl、0.016μg/μl、0.008μg/μl、0.004μg/μl、0.002μg/μl、0.001μg/μl、0.0005μg/μl；

四环素、土霉素、强力霉素由高至低的稀释浓度分别为：0.016μg/μl、0.008μg/μl、0.004μg/μl、0.002μg/μl、0.001μg/μl、0.0005μg/μl、0.00025μg/μl、0.000125μg/μl；

氟苯尼考由高至低的稀释浓度分别为：0.032μg/μl、0.016μg/μl、0.008μg/μl、0.004μg/μl、0.002μg/μl、0.001μg/μl、0.0005μg/μl、0.00025μg/μl；

多粘菌素B由高至低的稀释浓度分别为：0.256μg/μl、0.128μg/μl、0.064μg/μl、0.032μg/μl、0.016μg/μl、0.008μg/μl、0.004μg/μl、0.002μg/μl；

氨苄青霉素由高至低的稀释浓度分别为：0.512μg/μl、0.256μg/μl、0.128μg/μl、0.064μg/μl、0.032μg/μl、0.016μg/μl、0.008μg/μl、0.004μg/μl。

阿米卡星由高至低的稀释浓度分别为：1.024μg/μl、0.512μg/μl、0.256μg/μl、0.128μg/μl、0.064μg/μl、0.032μg/μl、0.016μg/μl、0.008μg/μl。

然后，用超纯水配置1mg/ml的海藻糖，用0.22μm滤膜过滤，将配置好的海藻糖溶液分别与以上不同稀释度的药物按1:1混合，分别取不同浓度的药物混合液20μl与10μl阿尔玛蓝混合均匀，对应地加入检测板的检测区内（A1:H11），作为包被了含有药物和显色指示剂的检测孔。在生长对照区（A12:D12）及质控区（E12:H12）内加入以无菌超纯水与海藻糖溶液1:1混合液20μl和10μl阿尔玛蓝。将微孔板置于无菌超净台内室温阴干，最终获得药敏检测微孔板，4℃保存备用。

然后将菌体采集工具、增菌液、药敏检测培养基、比浊管、接种滴管及比色卡包装在一起制成试剂盒。

实施例2：快速增菌液的优选

为实现弧菌快速生长以缩短药敏检测过程，在Mueller-Hinton(MH)培养基配方的基础上，对其进行改良以制成增菌液，改良配方为：MH0(牛肉浸粉6 g、可溶性淀粉1.5 g、酪蛋白水解物17.5 g、NaCl 15 g、2.8 mg CaCl₂、4 mg MgCl₂、蒸馏水1 L)、MH1(牛肉浸粉6 g、可溶性淀粉1.5 g、酪蛋白水解物17.5 g、NaCl 15 g、2.8 mg CaCl₂、4 mg MgCl₂、10%鱼汤、蒸馏水1 L)和MH2（牛肉浸粉6 g、可溶性淀粉1.5 g、酪蛋白水解物17.5 g、NaCl 15 g、2.8 mg CaCl₂、4 mg MgCl₂、鱼肉蛋白胨10 g、蒸馏水1 L）。为测定不同增菌液配方对副溶血弧菌、溶藻弧菌及灿烂弧菌的增殖效果，分别吸取1 ml过夜培养的三种菌液转入100 ml MH0、MH1和MH2中，混合均匀后分别取每种菌液5 mL混合液加入13支无菌试管中，置于28 ℃摇床180 rpm振荡培养，每隔2 h取样一次，于600 nm波长下测定O.D值，以培养基作为空白对照，绘制不同细菌在不同培养基中的生长曲线。

结果显示三种改良配方中，MH2培养基可以缩短三种不同弧菌的生长延滞期，使弧菌快速进入指数生长期，具有最好的细菌增殖效果，因此以下实施例均选用MH2培养基作为增菌液。

实施例3：应用水产弧菌药敏快速检测微孔板对副溶血弧菌进行药敏检测

1）从固体培养基平板上挑取副溶血弧菌VP-3（大菱鲆致病菌）单菌落，将其接种于增菌液MH2培养基中，置于28℃培养箱中震荡培养（转速：120rpm）至肉眼可见浑浊。

2）将增菌液用检测培养液调整浓度至0.5麦度，再稀释1500倍，使菌体浓度达到1×10⁵个/ml用于药敏检测使用。其中所述的检测培养液的配方为：牛肉浸粉6g、可溶性淀粉1.5g、酪蛋白水解物17.5g、NaCl15g、2.8 mg CaCl2、4 mg MgCl2、蒸馏水1L。

3）以接种滴管向质控区内的每个微孔里滴加2滴（100μl）检测培养液，将稀释好的菌液分别滴加于微孔检测板的药敏检测区及生长对照区，每孔滴加2滴。然后置于28℃培养箱中静置避光培养6-10h，取出药敏检测微孔板肉眼观察记录各微孔内的颜色变化情况。

4）同时，采用常规试管稀释法进行MIC测定。在试管中接种1ml浓度为10⁵个/mL菌液，分别在每个试管中加入以上11种8个浓度梯度的抗菌药物，终浓度与微孔检测法相同，每个药物浓度处理设置3个重复，置于28℃培养箱中静置培养，肉眼观察至试管出现明显浊度，且浊度不再变化，记录结果，以肉眼观察未出现浑浊的试管对应的最小药物浓度为MIC。

5）结果判读

（1）根据药敏检测微孔板内的颜色变化情况对药敏结果进行判读，判读标准如下：

a．若质控区颜色呈蓝色，则试验有效，可以继续进行判读；若呈粉红色，则试验无效，需重新进行检测。

b．若生长指示区呈粉色，则可以继续进行MIC判读；若生长指示区呈蓝色则需将检测板置于28℃培养箱内继续培养，至颜色变为粉红色后，再进行MIC判读。

c．若质控区呈蓝色，生长指示区呈粉红色，则判读各列不同药物对菌体的MIC，其中每列与比色卡上细菌增殖阴性对照区内颜色相同微孔的最低药物包被浓度即为待测弧菌的MIC。

最终药敏检测结果显示，利用显色指示剂的微孔检测板结果表明不同药物不同浓度对副溶血弧菌生长的抑制作用不同，以每列药物包被孔内颜色与比色卡上细菌增殖阴性对照区颜色相同测试孔的最低药物浓度即为MIC，结果显示，氨苄青霉素、氟苯尼考、阿米卡星、四环素、土霉素、强力霉素、多粘菌素B、复方新诺明、诺氟沙星、恩诺沙星、利福平对副溶血弧菌的MIC分别为3.2μg/ml、0.1μg/ml、12.8μg/ml、0.05μg/ml、0.05μg/ml、0.1μg/ml、3.2μg/ml、0.4μg/ml、0.2μg/ml、0.2μg/ml、0.1μg/ml。

（2）通过观察试管稀释法测定MIC的结果显示，各试管的浊度需要在28℃培养16h后才能趋于稳定，以肉眼无法观察到明显浑浊试管中不同药物的最低浓度判定为MIC，结果显示，氨苄青霉素、氟苯尼考、阿米卡星、四环素、土霉素、强力霉素、多粘菌素B、复方新诺明、诺氟沙星、恩诺沙星、利福平对副溶血弧菌的MIC分别为3.2μg/ml、0.1μg/ml、12.8μg/ml、0.05μg/ml、0.05μg/ml、0.1μg/ml、3.2μg/ml、0.4μg/ml、0.2μg/ml、0.2μg/ml、0.1μg/ml，结果与显色法完全吻合。

实施例4：应用水产弧菌药敏快速检测微孔板对溶藻弧菌进行药敏检测

按照实施例2的方法对溶藻弧菌菌株VA-1（牙鲆致病菌）进行药敏检测。

根据药敏检测微孔板内的颜色变化情况，以每列药物包被孔内颜色与比色卡上细菌增殖阴性对照区颜色相同测试孔的最低药物浓度判定为MIC，结果显示，氨苄青霉素、氟苯尼考、阿米卡星、四环素、土霉素、强力霉素、多粘菌素B、复方新诺明、诺氟沙星、恩诺沙星、利福平对溶藻弧菌的MIC分别为12.8μg/ml、0.2μg/ml、12.8μg/ml、0.05μg/ml、0.1μg/ml、0.05μg/ml、6.4μg/ml、0.4μg/ml、0.2μg/ml、0.2μg/ml、0.4μg/ml。

通过观察试管稀释法测定MIC的结果显示，各试管的浊度需要在28℃培养20h后才能趋于稳定，以肉眼无法观察到明显浑浊试管中不同药物的最低浓度判定为MIC，结果显示，氨苄青霉素、氟苯尼考、阿米卡星、四环素、土霉素、强力霉素、多粘菌素B、复方新诺明、诺氟沙星、恩诺沙星、利福平分别为12.8μg/ml、0.2μg/ml、12.8μg/ml、0.05μg/ml、0.1μg/ml、0.05μg/ml、6.4μg/ml、0.4μg/ml、0.2μg/ml、0.2μg/ml、0.4μg/ml，结果与显色法完全吻合。

实施例5：应用水产弧菌药敏快速检测微孔板对灿烂弧菌进行药敏检测

按照实施例2的方法对灿烂弧菌菌株VS-1（刺参致病菌）进行药敏检测。

根据药敏检测微孔板内的颜色变化情况，以每列药物包被孔内颜色与比色卡上细菌增殖阴性对照区颜色相同测试孔的最低药物浓度判定为MIC，结果显示，氨苄青霉素、氟苯尼考、阿米卡星、四环素、土霉素、强力霉素、多粘菌素B、复方新诺明、诺氟沙星、恩诺沙星、利福平对副溶血弧菌的MIC分别为1.6μg/ml、0.2μg/ml、25.6μg/ml、0.1μg/ml、0.1μg/ml、0.05μg/ml、0.8μg/ml、0.8μg/ml、0.4μg/ml、0.4μg/ml、0.8μg/ml。

通过观察试管稀释法测定MIC的结果显示，各试管的浊度需要在28℃培养24h后才能趋于稳定，以肉眼无法观察到明显浑浊试管中不同药物的最低浓度判定为MIC，氨苄青霉素、氟苯尼考、阿米卡星、四环素、土霉素、强力霉素、多粘菌素B、复方新诺明、诺氟沙星、恩诺沙星、利福平分别为1.6μg/ml、0.2μg/ml、25.6μg/ml、0.1μg/ml、0.1μg/ml、0.05μg/ml、0.8μg/ml、0.8μg/ml、0.4μg/ml、0.4μg/ml、0.8μg/ml，结果与显色法完全吻合。

综上所述，利用试管稀释法测定出的弧菌MIC与本发明检测试剂盒的结果一致。因此，本发明利用阿尔玛蓝作为显色指示剂制备的药敏检测微孔板可以准确有效地应用于水产弧菌的快速药敏检测。

Claims

1.一种水产弧菌快速药敏检测试剂盒，包括有检测板、菌体采集工具、增菌液、药敏检测培养基、比浊管、接种滴管及比色卡；其中检测板包含有用于药敏检测的、包被了含有不同浓度药物和显色指示剂的检测孔，所述显色指示剂为阿尔玛蓝；

所述的试剂盒的增菌液，其组份及浓度如下：牛肉浸粉6g/L、可溶性淀粉1.5g/L、酪蛋白水解物17.5g/L、NaCl15g/L、CaCl₂2.8mg/L、MgCl₂4mg/L、鱼肉蛋白胨10g/L；

所述的包被了含有药物和显色指示剂的检测孔，是将溶解有药物的海藻糖水溶液与显色指示剂阿尔玛蓝混合，加入到检测孔中进行阴干制成。

2.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于所述的菌体采集工具为无菌接种环或无菌吸管。

3.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于所述的药敏检测培养基的组成如下：牛肉浸粉6g、可溶性淀粉1.5g、酪蛋白水解物17.5g、NaCl15g、2.8mg CaCl₂、4mg MgCl₂、蒸馏水1L。

4.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于所述的检测板还包含有用做质量控制的检测孔和/或生长对照的检测孔。

5.如权利要求4所述的试剂盒，其特征在于所述的质量控制的检测孔和生长对照的检测孔，是将海藻糖水溶液和显色指示剂阿尔玛蓝混合，加入到检测孔中进行阴干制成。

6.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于所述的药物为氨苄青霉素、氟苯尼考、阿米卡星、四环素、土霉素、强力霉素、多粘菌素B、复方新诺明、诺氟沙星、恩诺沙星或利福平。