CN101481726A - 用于真菌药敏测定的微量试剂盒及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种用于真菌药敏测定的微量试剂盒，包括：上面具有多列凹孔的无菌孔板，每列凹孔用于盛装一种试剂；分别盛装在每列凹孔的多个凹孔内、依次用真菌肉汤倍比稀释的试剂，以及盖住所述的孔板的上部、用于封装孔板的孔板盖。另外，本发明还公开了该试剂盒的制备方法。本发明的用于真菌药敏测定的微量试剂盒，使用方便、节省原材料且可以根据体外诊断的最低抑菌浓度(MIC)值结合病人的血药浓度，指导临床用药。

Description

用于真菌药敏测定的微量试剂盒及其制备方法
技术领域
本发明涉及微生物技术领域，特别是涉及一种用于真菌药敏测定的微量试剂盒及其制备方法。
背景技术
各种致病菌对不同的抗菌药物的敏感性不同，目前最常用的测定方法有两种，即稀释法和扩散法。
扩散法即将浸有抗菌药物的纸片贴在涂有细菌的琼脂平板上，抗菌药物在琼脂内向四周扩散，其浓度呈梯度递减，因此在纸片周围一定距离内的细菌生长受到抑制，过夜培养后形成一个抑菌圈，其直径大小与药物浓度的对数成线性关系。扩散法的优点是一个接种病原菌的培养基平板上，同时可测多种抗菌药物，操作简单，价格低廉，适用于大多数诊断实验室，缺点是只能报告药物试验的定性结果，即病原菌对药物敏感或耐药，但不能提示敏感程度或耐药程度的数值，即：最低抑菌浓度值(MIC)。
目前使用的稀释法为试管稀释法，试管稀释法比较耗费原材料且操作繁琐，因此不宜临床推广。
发明内容
为了解决上述问题，本发明的目的在于提供一种可以用于测定MIC、节省原材料且操作简单的微量试剂盒及其制备方法。
本发明的目的是通过以下技术方案实现的：
一种用于真菌药敏测定的微量试剂盒，包括：上面具有多列凹孔的无菌孔板，每列凹孔用于盛装一种试剂；分别盛装在每列凹孔的多个凹孔内、依次用真菌肉汤倍比稀释的试剂，以及盖住所述的孔板的上部、用于封装孔板的孔板盖。
上述的无菌孔板的每一列具有12个凹孔。
上述的孔板和孔板盖由聚苯乙烯制成。
一种用于真菌药敏测定的微量试剂盒的制备方法，包括真菌肉汤的制备和抗真菌药物的溶解，其特征在于：用真菌肉汤分别对各种抗真菌药物进行多次倍比稀释，然后将倍比稀释后的每种抗真菌药物分别加入到具有多列孔的无菌孔板的每列孔中。
上述的倍比稀释的具体步骤为：
1)针对每种药物各取多个无菌离心管，分别编号为1、2、3……12，在每种药物的1号管中分别加入溶解后的相应的药物；
2)以药物的最高浓度计算用药量后，取真菌肉汤加入到1号离心管中，对药液进行20倍稀释并摇匀。在2～12号管中分别加入等量的无菌肉汤，其量相当于1号管中液体量的1/2；
3)从1号管中取出1/2真菌肉汤加到2号管内摇匀；从2号管中取出1/2真菌肉汤加入到3号管中摇匀；从3号管取出1/2真菌肉汤到4号管中摇匀……，依此类推一直稀释到第12号管，倍比稀释结束。
上述的真菌为酵母样真菌，上述的抗真菌药物为：二性霉素B、酮康唑、咪康唑、伊曲康唑、氟康唑、5-氟胞嘧啶、特比奈酚和伏力康唑，上述的孔板具有8列。
本发明的用于真菌药敏测定的微量试剂盒，使用方便、节省原材料且可以根据体外诊断的最低抑菌浓度(MIC)值结合病人的血药浓度，指导临床用药。另外，还可以针对真菌的耐药情况进行两种或两种以上药物的联合药敏试验，供临床上选用抗菌药物联合治疗时的参考。
附图说明
图1为本发明的用于真菌药敏测定的微量试剂盒的孔板的平面图。
具体实施方式
本发明的用于真菌药敏测定的微量试剂盒包括：上面具有多列凹孔的无菌孔板，每列凹孔用于盛装一种试剂；分别盛装在每列凹孔的多个凹孔内、依次用真菌肉汤倍比稀释的试剂，以及盖住所述的孔板的上部、用于封装孔板的孔板盖。
所述的无菌孔板如图1所示，在孔板1上设置有多列凹孔2，每一列具有12个凹孔。优选的为，孔板和孔板盖由聚苯乙烯制成。
下面以酵母样真菌为例对本发明的用于真菌药敏测定的微量试剂盒的制备方法进行详细说明。
1)真菌肉汤的制备。
根据酵母样真菌的生长条件，以下列组份制成的真菌肉汤作为培养基：
RPMI-1640(含谷氨酰胺，不含碳酸氢盐，用酚红作指示剂)  10.4g
MOPS            34.53g
葡萄糖          18g
蒸馏水          1000ml
首先将RPMI-1640、MOPS和葡萄糖溶于1000ml蒸馏水中，摇匀使之完全溶解。然后用1mol/l的NaOH调整溶液的pH值，每1000ml培养基中加入65ml，再借助酸度计调整pH为7.0±0.1。
采用孔径为0.22μm的滤膜用高压滤瓶、滤器进行负压抽滤。抽滤结束后，将真菌肉汤无菌分装到灭菌后的三角烧瓶中，在灭菌器内，在121℃±1℃下灭菌15分钟，待冷却后放置在冰箱中备用。
2)抗真菌药物的溶解。
选择二性霉素B、酮康唑、咪康唑、伊曲康唑、氟康唑、5-氟胞嘧啶、特比奈酚和伏力康唑为抗真菌药物并顺序编号为A、B、C、……H，按照表1中所列的方法分别制成溶液。
表1
 
编号 抗真菌药物 最高药物浓度 溶剂 溶解方法 药物来源
A 二性霉素B 3.2mg/10ml 二甲基亚砜蒸馏水或去离子水         先用1ml二甲基亚砜溶解完全，然后加入9ml水。               美国amresco进口药品   
B 酮康唑 3.2mg/10ml 二甲基亚砜蒸馏水或去离子水         首先用2ml二甲基亚砜溶解完全后，然后加入8ml水                 标准品
C 咪康唑 3.2mg/10ml 二甲基酰胺 ———— sigma
D 伊曲康唑 3.2mg/10ml 二甲基亚砜蒸馏水或去离子水         首先用1ml二甲基亚砜溶解完全后，然后加入9ml水                 Seebio生物
E 氟康唑 12.8mg/10ml 蒸馏水或去离子水         —— 标准品
F 5-氟胞嘧啶 12.92mg/10ml 蒸馏水或去离子水         —— sigma
G 特比奈酚 1.6mg/10ml 5％二甲基亚砜吐温80液      首先用2ml5％二甲基亚砜吐温80液溶解完全后，然后加入8ml水 化学对照品
H 伏力康唑 60.8mg/10ml 蒸馏水或去离子水         ———— 辉瑞爱尔兰制药有限公司  
3)抗真菌药物的倍比稀释。
a)针对每种药物各取12个规格为50ml的无菌离心管，分别编号为1、2、3……12，在每种药物的1号管中分别加入相应的药物。
b)以药物的最高浓度计算用药量后，取真菌肉汤加入到1号离心管中，对药液进行20倍稀释并摇匀。在2～12号管中分别加入等量的无菌肉汤，其量相当于1号管中液体量的1/2。
c)从1号管中取出1/2真菌肉汤加到2号管内摇匀；从2号管中取出1/2真菌肉汤加入到3号管中摇匀；从3号管取出1/2真菌肉汤到4号管中摇匀……，依此类推一直稀释到第12号管，倍比稀释结束。每种药物均以此法进行稀释，G、H两种药只需要11个管。
4)加样
图1所示为本发明的实施例中所使用的经过灭菌处理的孔板，其材质优选为聚苯乙烯。所示的孔板具有96个孔，这些孔分成12排，8列，各列依次按A、B、C……H编号。
用12孔加样器将每种药物的具有12个稀释度的真菌肉汤分别加入到上述聚苯乙烯孔板上的相应的孔内，每孔加入量为100μl。每个孔的药物浓度见表2。
表2：抗真菌药物浓度(μg/ml)
Figure A200810052034D00061
表中的A、B、C、D、E、F、G、H所代表的药物同上。
5)封装
将装有配制好的抗菌药物和培养基的孔板盖上聚苯乙烯孔板盖，贴好标签，然后在-20℃冻存备用。
本发明的用于真菌药敏测定的微量试剂盒的使用方法包括以下步骤：
1、接种
1)将调整好的0.5麦氏比浊浓度的菌液(1×106CFU/ml～5×106CFU/ml)用无菌滴管吸取10滴(约0.4ml)加入到接种池中，再将40ml 0.45％的无菌NaCl溶液倒入接种池中与之混匀。
2)用接种器轻轻反复搅动3—5次混匀，然后用接种器沾取上述菌液(3μl～7μl)，分别水平接种到已经预先取出放在室温下融化的微量试剂盒中(微量试剂盒中的空白对照孔不接种)，然后盖上无菌盖，接种过程完毕。接种后的各孔中菌含量要求达到5×102～2.5×103CFU/ml。
2、孵育
接种完毕后，将试剂盒置于垫有湿纱布的瓷方盘内，然后将盘放置在35℃温箱中，孵育24～72小时观察结果。
3、结果判断
除新生隐球菌需72小时观察结果外，其余酵母菌可分别在24、48小时观察结果；以不含药生长对照孔明显生长为准，观察结果前应将孔板振荡混匀，然后观察进行比较。
1)观察结果
二性霉素B：对二性霉素B而言，终点容易判定，其MIC值应读取生长被完全抑制的最低浓度孔，但如果有的孔只有极少菌生长也可忽略不计。
2)氟胞嘧啶和咪唑类药物：这些药物可能会出现拖尾现象，终点不十分明确，终点判断可用下列方法估计：
(1)以不含药生长对照孔为准，将不生长或生长不明显或明显少于生长对照孔的孔定为MIC终点。
(2)或将不含药物的对照生长孔中的20μl菌液加80μl培养基(可用空白对照孔中的培养基)稀释，制成标准对照，凡低于此浓度者可认为被抑制。
(3)观察结果时将试剂盒底部对准日光灯用肉眼观察真菌生长情况。

Claims (6)

1.一种用于真菌药敏测定的微量试剂盒，其特征在于包括：上面具有多列凹孔的无菌孔板，每列凹孔用于盛装一种试剂；分别盛装在每列凹孔的多个凹孔内、依次用真菌肉汤倍比稀释的试剂，以及盖住所述的孔板的上部、用于封装孔板的孔板盖。
2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于：所述的无菌孔板的每一列具有12个凹孔。
3.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于：所述的孔板和孔板盖由聚苯乙烯制成。
4.一种用于真菌药敏测定的微量试剂盒的制备方法，包括真菌肉汤的制备和抗真菌药物的溶解，其特征在于：用真菌肉汤分别对各种抗真菌药物进行多次倍比稀释，然后将倍比稀释后的每种抗真菌药物分别加入到具有多列孔的无菌孔板的每列孔中。
5.根据权利要求4所述的测定方法，其特征在于：所述的倍比稀释的具体步骤为：
1)针对每种药物各取多个无菌离心管，分别编号为1、2、3……12，在每种药物的1号管中分别加入溶解后的相应的药物；
2)以药物的最高浓度计算用药量后，取真菌肉汤加入到1号离心管中，对药液进行20倍稀释并摇匀。在2～12号管中分别加入等量的无菌肉汤，其量相当于1号管中液体的1/2；
3)从1号管中取出1/2真菌肉汤加到2号管内摇匀；从2号管中取出1/2真菌肉汤加入到3号管中摇匀；从3号管取出1/2真菌肉汤到4号管中摇匀……，依此类推一直稀释到第12号管，倍比稀释结束。
6.根据权利要求4或5所述的测定方法，其特征在于所述的真菌为酵母样真菌，所述的抗真菌药物为：二性霉素B、酮康唑、咪康唑、伊曲康唑、氟康唑、5-氟胞嘧啶、特比奈酚和伏力康唑，所述的孔板具有8列。
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