CN101413872A - 一种微生物活菌数快速检测方法 - Google Patents

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本发明涉及一种微生物活菌数快速检测方法。本发明微生物活菌数量检测是通过对样品的预处理去除杂质分离出微生物，进行浓缩、将浓缩后的定量的样品涂在载波片上，通过美兰染色，通过生物显微镜镜检涂有定量样品的载玻片上的被美兰染色且呈现空心状态的图像的个数来计数微生物数量。本发明方法适合各种生物学界、医药界、食品界以及各种物品中微生物大肠菌群的快速检测。

Description

一种微生物活菌数快速检测方法
技术领域
本发明涉及一种微生物活菌快速检测方法。本发明涉及一种通过美兰染色的方法，将微生物活菌与死菌加以区分，通过生物显微镜镜检的方法快速检测微生物活菌数量。本发明方法适合各种生物学、医药、食品以及其它各种物品中微生物活菌数量的快速检测。
背景技术
微生物活菌数的快速、准确的检测，是生物学界、医药界、食品界需要亟待解决的突出的问题。目前通用的微生物数的检测大都按国家食品卫生标准规定方法，采用标准平皿计数法检测菌落总数。
对于微生物数的检测国内外均有不少的检测方法，主要的和使用的最多的方法为标准平皿培养计数法，还有直接染色还原计数法、旋转平板计数方法、疏水性栅格滤膜法、测试片法、直接外荧光滤过技术、全平器计数法、最近似数测定法、微菌落技术、放射测量法、阻抗检测法、电位及电流分析法、ATP生物发光法、接触酶测量仪、微量量热法等。
按国家食品卫生标准方法规定，采用标准平皿计数法测定菌落总数，培养时间多采用48h，需要制备培养基、清洗消毒试验器材等大量的准备及收尾工作，操作繁琐费时。此法具有准确、可靠等优点。但是此法培养时间较长，因此这种通用的方法具有配制过程复杂，检测周期过长，成本高等缺点。
发明内容
本发明的目的在于提出一种微生物活菌数快速检测方法，以克服现有检测方法配制过程复杂，检测周期过长，成本高等缺点。
本发明的上述目的是通过以下技术方案实现的：
一种微生物活菌数快速检测方法，包括以下步骤：
a)样品的选择：检测样品分为固体样品和液体样品；
b)采样样品的制备：通过无菌操作取一定量溶液样品进行离心处理后，取上清液，再以更高的速度离心处理，弃去上清液，用移液器取出底部少量溶液；
c)微生物活菌数的检测：将移液器取出的底部溶液，涂在载玻片上，经干燥固定，用美兰染色，冲洗后用生物显微镜镜检，记录被美兰染色且呈现空心状态的图像的个数来计数微生物数量。
所述的固体样品，通过放于盛有生理盐水或/和蛋白胨水溶液的灭菌玻璃瓶内，瓶内预置玻璃珠，经充分振摇或研磨做成均匀溶液，然后，按与溶液样品同样的处理方式进行离心处理。
所述的溶液样品例行处理：以(500～3000)r/min的速度离心处理(1～5)min，取(80～90)％的上清液，再以(10000～14000)r/min的速度离心处理(3～8)min，弃去上清液，用移液器取出底部少量溶液。
所述的固体样品，以无菌操作取(20～30)g样品，放于含有(50～100)ml生理盐水的灭菌玻璃瓶内，瓶内预置玻璃珠，经充分振摇或研磨做成均匀溶液。
使用本发明方法可以快速检测样品中的维生物活菌数量。本发明微生物活菌数量检测是通过生物显微镜镜检定量样品中被美兰染色且呈现空心状态的微生物数量快速检测微生物活菌数量的。本发明微生物活菌数量检测是通过对样品的预处理去除杂质分离出微生物，进行浓缩、将浓缩后的定量的样品涂在载波片上，通过美兰染色，通过生物显微镜镜检涂有定量样品的载玻片上的被美兰染色且呈现空心状态的图像的个数来计数微生物数量。本发明方法适合各种生物学界、医药界、食品界以及其它各种物品中微生物大肠菌群的快速检测。
本发明涉及一种微生物活菌数快速检测方法，是采用离心或/和蛋白质沉淀的方法对样品进行预处理，去除杂质分离微生物，采用离心的方法将除杂后含有微生物样品进行浓缩，将浓缩后的定量的样品涂在载玻片上，待干进行美兰染色，小心清洗，通过生物显微镜镜检涂有定量样品的载玻片上的被美兰染色且呈现空心状态的图像个数来计数微生物数量。
采用本发明的一种微生物活菌数快速检测方法，通过生物显微镜镜检涂有定量样品的载玻片上的被美兰染色且呈现空心状态的图像个数来计数微生物数量，其原理如下：
美兰是一种弱氧化剂，氧化态呈蓝色，还原态呈无色。活的微生物细胞，因新陈代谢的不断进行，具有一定的还原能力，能将进入细胞的美兰还原，而细胞核不被染色，细胞膜呈现蓝色。因此，美兰染色后活菌呈现空心状态蓝色，而死菌呈现实心的蓝色，以此来区分微生物活菌和死菌。通过生物显微镜镜检计数被美兰染色且呈现空心状态的图像个数来计数微生物数量。
采用本发明的一种微生物活菌数快速检测方法，通过生物显微镜镜检涂有定量样品的载玻片上的被美兰染色且呈现空心状态的图像个数来计数微生物数量，其方法如下：
(1)样品的选择
检测样品分为固体样品和液体样品。
固态样品如糖果类、焙烤类、非发酵性豆制品类、膨化食品类、肉灌肠类。
液体样品如液态乳制品类、果蔬汁类、饮料类、饮用水类。
(2)采样样品的制备
①固体样品
以无菌操作取25g(ml)样品，放于含有55ml蛋白胨水溶液的灭菌玻璃瓶内(瓶内预置适当数量的玻璃珠)，经充分振摇或研磨做成均匀溶液。取溶液1ml，以500r/min～3000r/min的速度离心处理2min，取上清液0.8ml，再以10000r/min～14000r/min的速度离心处理5min，弃去上清液，用移液器取出底部5ul溶液。
②液体样品
以无菌操作取1ml样品，以500r/min～3000r/min的速度离心处理2min，取上清液0.8ml，再以10000r/min～14000r/min的速度离心处理5min，弃去上清液，用移液器取出底部5ul溶液。
③液态乳制品
以无菌操作取1ml样品，加入单宁等蛋白质沉淀剂，以500r/min～3000r/min的速度离心处理2min，取上清液0.8ml，再以10000r/min～14000r/min的速度离心处理5min，弃去上清液，用移液器取出底部5ul溶液。
(3)微生物活菌数的检测
将移液器取出的底部5ul溶液，涂在载玻片上，经干燥固定，用美兰染色2min，冲洗后用生物显微镜镜检。记录被美兰染色且呈现空心状态的图像的个数来计数微生物数量。
检测结果见表1。表1为本专利方法与平皿培养计数法检测结果比较。
                         表1
                                            本专利方法/平
     本专利方法检测结果  平皿培养计数法     皿培养计数法
1    1099921             785000             1.4012
2    139936              123000             1.1377
3    15722               12600              1.2478
4    3734                3000               1.2447
5    2139                1800               1.1883
6    543                 460                1.1804
7    493                 370                1.3324
8    139                 114                1.2193
9    90                  74                 1.2162
10   47                  39                 1.2051
11   30                  25                 1.2000
平均值                                      1.2339
附图说明
图1是显微镜镜检时被美兰染色呈现空心状态的微生物活菌图像；
图2是样本平皿培养计数法与本专利方法微生物活菌数检测结果的比较(曲线1为平培养计数法，曲线2为本专利方法)；
图3是微生物数从0到45000时的微生物检测结果(曲线1为平皿培养计数法，曲线2为本专利方法)；
图4是微生物数从0到14000时的微生物检测结果(曲线1为平皿培养计数法，曲线2为本专利方法)；
图5是对数坐标时微生物活菌数检测结果对比(曲线1为平皿培养计数法，曲线2为本专利方法)。
具体实施方式
以下通过实施例的具体描述对本发明作进一步详细说明。
实施例1
液态食品样品
以无菌操作分别取2个样本，每个样本取溶液1ml，以500r/min～3000r/min的速度离心处理2min，取上清液0.8ml，再以10000r/min～14000r/min的速度离心处理5min，弃去上清液，用移液器取出底部5ul溶液。
将用移液器取出的底部5ul溶液的2个样本，分别涂在2个载玻片上，经干燥固定，用美兰染色2min，冲洗后用生物显微镜镜检。记录被美兰染色且呈现空心状态的图像个数来计数微生物数量。将2个载波片上的样本记录的微生物数量相加得到液体样品微生物活菌总数。
实施例2
液态乳制品样品
以无菌操作取7个样本，每个样本取溶液1ml，加入单宁等蛋白沉淀剂，以500r/min～3000r/min的速度离心处理2min，取上清液0.8ml，再以10000r/min～14000r/min的速度离心处理5min，弃去上清液，用移液器取出底部5ul溶液。
将用移液器取出的底部5ul溶液的7个样本，分别涂在7个载玻片上，经于燥固定，用美兰染色2min，冲洗后用生物显微镜镜检。记录被美兰染色且呈现空心状态的图像个数来计数微生物数量。将7个载波片上的样本记录的微生物数量相加得到液态乳制品样品微生物活菌总数。
实施例3
固体类样品
以无菌操作取25g(ml)样品，放于含有55ml生理盐水的灭菌玻璃瓶内(瓶内预置适当数量的玻璃珠)，经充分振摇或研磨做成均匀溶液。在溶液中分别取10个样本，每个样本取溶液1ml，以500r/min～3000r/min的速度离心处理2min，取上清液0.8ml，再以10000r/min～14000r/min的速度离心处理5min，弃去上清液，用移液器取出底部5ul溶液。
将用移液器取出的底部5ul溶液的10个样本，分别涂在10个载玻片，经干燥固定，用美兰染色2min，冲洗后用生物显微镜镜检。记录被美兰染色且呈现空心状态的图像的个数来计数微生物数量。将10个载波片上的样本记录的微生物数量相加得到固体样品微生物活菌总数。

Claims (4)

1、一种微生物活菌数快速检测方法，其特征在于包括以下步骤：
a)样品的选择：检测样品分为固体样品和液体样品；
b)采样样品的制备：通过无菌操作取一定量溶液样品进行离心处理后，取上清液，再以更高的速度离心处理，弃去上清液，用移液器取出底部少量溶液；
c)微生物活菌数的检测：将移液器取出的底部溶液，涂在载玻片上，经干燥固定，用美兰染色，冲洗后用生物显微镜镜检，记录被美兰染色且呈现空心状态的图像的个数来计数微生物数量。
2、根据权利要求1所述的一种微生物活菌数快速检测方法，其特征在于所述的固体样品，通过放于盛有生理盐水或/和蛋白胨水溶液的灭菌玻璃瓶内，瓶内预置玻璃珠，经充分振摇或研磨做成均匀溶液，然后，按与溶液样品同样的处理方式进行离心处理。
3、根据权利要求1或2所述的一种微生物活菌数快速检测方法，其特征在于所述的溶液样品例行处理：以(500～3000)r/min的速度离心处理(1～5)min，取(80～90)％的上清液，再以(10000～14000)r/min的速度离心处理(3～8)min，弃去上清液，用移液器取出底部少量溶液。
4、根据权利要求1或2所述的一种微生物活菌数快速检测方法，其特征在于所述的固体样品，以无菌操作取(20～30)g样品，放于含有(50～100)ml生理盐水的灭菌玻璃瓶内，瓶内预置玻璃珠，经充分振摇或研磨做成均匀溶液。
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