CN1837357A

CN1837357A - 一种培养基及其用该培养基培养霍乱弧菌的微量培养法

Info

Publication number: CN1837357A
Application number: CN 200610067705
Authority: CN
Inventors: 刘捷; 高涛; 张明理
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 2006-03-09
Filing date: 2006-03-09
Publication date: 2006-09-27

Abstract

本发明公开了一种培养基及其用该培养基培养霍乱弧菌的微量培养法，培养基是由蛋白胨、牛肉膏、氯化钠、琼脂、酵母浸出膏、无水亚硫酸钠、柠檬酸钠、十二烷基硫酸钠、蔗糖、酚红、庆大霉素、多粘菌素、亚碲酸钾、新洁尔灭、蒸馏水为原料，混匀、溶化、加热，然后加入培养板上均布的凹坑内，待液体凝固后，将该培养板用塑料袋真空密封包装后放入冰箱，在2℃－6℃温度下保存，作细菌培养时，拿出培养板，打开包装，将待检标本取一环接种到培养板的凹坑内，在36±1℃温度下放置9－18小时，取出培养板观察结果，若有菌生长，且培养基变黄色，可直接作血清学试验。本发明检测敏感性好，观察结果直观，检测的特异性突出，培养板体积小，耗费培养基少，成本低，操作简便，易于基层检验人员使用。

Description

一种培养基及其用该培养基培养霍乱弧菌的微量培养法

技术领域

本发明属于霍乱弧菌培养基及其霍乱弧菌培养法，特别是一种培养基及其用该培养基培养霍乱弧菌的微量培养法。

背景技术

霍乱是由01血清群和0139血清群霍乱弧菌引起的急性肠道传染病，其发病急、传播快、波及范围广，不及时治疗病死率高，是能引起大流行为特征的国际传染病之一。

对霍乱防治的主要对策之一是实施疫情监测，及时确诊处理疫情，防止扩散。疫情的确定，主要是依赖于实验室的正确诊断。霍乱实验室的诊断原则是：以血清学性状为主，结合形态学和化学性状作出判定。

目前霍乱实验室的病原检验仍沿用培养皿为载体，以选择性培养基为基质的培养法，即常规培养法。常规培养法随着培养基的不断改进和成品化而日臻成熟，我国霍乱防治手册和霍乱诊断标准及处理原则GB15984-1995规定，常规方法采用的培养基为庆大霉素琼脂、4号琼脂、TCBS琼脂，将任一种琼脂培养基置于平皿中对样品进行分离培养。

由于霍乱现场检测标本的数量巨大，耗费大量的平皿器材和实验室空间，同时平皿需要进行反复的高压清洗，耗费人力和水电资源，因此多年来霍乱病源学工作者在不断地寻找研究特异、敏感、快速实用的检验方法。

近年来不断有新的检验方法推出，主要有以免疫学为基础的检验法如(1)免疫荧光菌球法；(2)SPA协同凝集试验法；(3)免疫增凝法；(4)免疫微菌落染色法等；和以基因诊断为基础的(5)免疫沾棒法以及(6)PCR法等。目前SPA协同凝集试验法和免疫增凝法已被淘汰，无人使用。免疫微菌落染色法是国家十年百项科技推广项目之一，和免疫荧光菌球法一样，观察结果均需在显微镜下完成。免疫沾棒法是近年来由国外引进的新的基因诊断法，操作简便，但敏感性较差。PCR法也是近年来各研究机构推荐的基因诊断法。

上述方法大多都有快速、敏感、特异的优点，但是他们或因方法繁琐、或因设备限制，或因观察结果操作不便，或因价格昂贵成本过高不易为基层所接受，而最大的缺点在于他们只能作为定性试验，都不能直接获得阳性培养物，并且不能排除假阳性和假阴性，因而不能取代常规方法，在霍乱防治手册中仅列为快速辅助诊断方法。

发明内容

本发明的目的在于提供一种培养基及其用该培养基培养霍乱弧菌的微量培养法，本发明克服了常规方法存在的上述问题，采用本发明的培养基和培养方法，检测敏感性好，观察结果直观，检测特异性突出，可直接作血清试验，采用的培养板体积小，容量大，耗费培养基少，成本低。

本发明的目的是这样实现的：一种培养基是由以下组分制成的：蛋白胨10g、牛肉膏2g、氯化钠5g、琼脂20g、蒸馏水1000ml、酵母浸出膏2-5g、无水亚硫酸钠2-5g、柠檬酸钠8-12g、十二烷基硫酸钠0.3-0.6g、蔗糖8-12g、百分比浓度为0.4％的酚红0.5-2ml、庆大霉素(500μ/ml)0.5-2ml、多粘菌素B(1000μ/ml)0.5-2ml、百分比浓度为1％的亚碲酸钾0.5-2ml、新洁尔灭0.5-2ml、PH值8.5-8.8。

制备本发明培养基的优选配比范围是：

蛋白胨10g、牛肉膏2g、氯化钠5g、琼脂20g、蒸馏水1000ml、酵母浸出膏2-4g、无水亚硫酸钠2-4g、柠檬酸钠9-11g、十二烷基硫酸钠0.4-0.6g、蔗糖9-11g、百分比浓度为0.4％的酚红0.5-1.5ml、庆大霉素(500μ/ml)0.5-1.5ml、多粘菌素B(1000μ/ml)0.5-1.5ml、百分比浓度为1％的亚碲酸钾0.5-1.5ml、新洁尔灭0.5-1.5ml、PH值8.5-8.7。

制备本发明培养基的最佳配比是：

蛋白胨10g、牛肉膏2g、氯化钠5g、琼脂20g、蒸馏水1000ml、酵母浸出膏3g、无水亚硫酸钠3g、柠檬酸钠10g、十二烷基硫酸钠0.5g、蔗糖10g、百分比浓度为0.4％的酚红1ml、庆大霉素(500μ/ml)1ml、多粘菌素B(1000μ/ml)1ml、百分比浓度为1％的亚碲酸钾1ml、新洁尔灭1ml、PH值8.6。

新洁尔灭又称新洁尔液酊，本品含新洁尔灭0.1％。性状：本品为橙色带荧光的澄明溶液。功能与主治：阳离子表面活性杀菌消毒剂，对非芽胞形革兰氏阳性及阴性致病菌，经几分钟接触均有杀灭作用。用法：外用，主用于皮肤消毒。生产厂家：上海市五四制药厂。

使用上述培养基进行霍乱弧菌的微量培养法其步骤是：

1、按本发明培养基的组份配方称取原料，混匀加热溶化，加热温度为95℃-110℃；

2、将加热后的液体加入细菌培养板上均布的凹坑内；

3、待凹坑内的液体凝固后，将该细菌培养板用塑料袋真空密封包装后，放入冰箱，在2℃-6℃的温度下保存；

4、作细菌培养时，从冰箱内拿出细菌培养板，打开密封包装，将待检标本用接种环取一环接种到培养板的凹坑内，在36±1℃的温度下放置9-18小时；

5、取出培养板观察结果，无菌生长或仅有粗糙菌苔或菌落，且培养基不变色者为阴性，若有菌生长，且培养基变黄色，可取少量菌苔或菌落与霍乱诊断血清作玻片凝集，凝集阳性者即可报告初步结果。

上述培养法中所述的待检标本为试验菌肉汤培养物或腹泻病人及监测人群粪便标本增菌液。

本发明使用的培养板为在长方形的薄板板面上均布着凹坑，培养板的尺寸为长6-14cm、宽4-10cm、厚2.5cm，凹坑的直径为1.5cm，深度为1-1.5cm，每只培养板面上均布有10-24个凹坑，每个凹坑可加1ml培养基，每个凹坑可做一份标本，每板24个凹坑，可接种24份样品。

培养板的尺寸为长8-13cm、宽5-8.5cm、厚2.5cm，在板面上均布10-16个凹坑。

常规培养法为平皿法，每平皿倾注15-20ml培养基，只能接种一份样品。本发明培养法使用的培养基仅是常规法的1/15-1/20。

本发明使用的培养板体积小，贮存运送方便，观察结果直观，培养板无需高压清洗，处理简便，易于基层检验人员使用。本发明使用培养基量少，成本低，培养板可回收多次使用，可大大节约防病经费。本发明便于质量控制，培养板在实验室制备好后用塑料袋真空密封包装，在冰箱内保存3个月，如有专业部门制备后基层可直接使用，便于霍乱检验工作的质量控制，实验室平时储备一定数量的培养板，可大大提高应对霍乱突发疫情的能力。

本发明培养法检测显示性强，结果直观。由于本发明培养法在培养基中加入了蔗糖和酚红指示剂，利用弧菌分解蔗糖的生化特性，如果标本中弧菌生长分解蔗糖产酸，培养基有红色转变为黄色，可视为检样中具有可疑培养物，即可作血清学试验，因此观察结果更为直观。

本发明培养物可直接作血清学试验。霍乱弧菌在培养板上和在常规法的培养基上一样，10小时后可生长出菌苔或菌落，直接可用特异诊断血清作凝集试验，作出诊断报告，因此不存在假阳性。

本发明培养法与常规法、免疫沾棒法的试验比较：

1、三种方法的最小检出浓度比较：

以实验室霍乱参考菌株2477和新疆地方株98005为试验菌，菌株种肉汤37℃培养2小时后做10倍倍比稀释，分别使用庆大霉素琼脂分离的常规法、胶体金滤纸条的免疫沾棒(一步)法和本发明培养法测定最小检出浓度，结果见表1。

表1 三种方法的最小检出浓度比较(CFU/ml)

菌株	常规法	免疫沾棒法	本发明培养法
菌株	常规法	免疫沾棒法	本发明培养法	2477(小川1b)	5.2×10²	5.2×10²
98005(小川1b)	2.2×10²6.9×10¹	2.2×10⁶6.9×10⁶	2.2×10¹6.9×10¹	2477(小川1b)	5.2×10²	5.2×10²

结果表明，二株菌株在10¹-10²cfu/ml使用常规法和本发明培养法均可检出，而免疫沾棒法的敏感性较差，只有菌量达到10⁶cfu/ml时才呈阳性反应。

本发明检测敏感性好，实验结果表明敏感性明显高于免疫沾棒法，而与常规培养法相当。

2、实验室模拟标本检验结果比较：

收集医院肠道门诊粪便标本，AP增菌后，用常规法和微量法同时分离弧菌。实验4次每次6-27份样品不等，共计51份，均为阴性。取检验阴性的AP增菌管菌液1ml，移入新的AP管内37℃增菌2小时，分别再投入01群EVC、0139群VC2小时培养物0.1～1ml不等，混合后作为试验模拟污染样品备检。第一次污染10份样品，庆大琼脂检出9份，微量法10份全部检出。

第二次污染17份，其中12份投01EVC(小川7份、稻叶5份)，5份投入0139VC，在染菌混合后。分别在即时和增菌4小时后以常规法、本发明培养法、免疫沾棒法三种方法进行检测(结果见表2)。

表2 三种方法检测模拟样品结果比较

检测时间	模拟样品数	常规法		免疫沾棒法		本发明培养法
		常规法		免疫沾棒法		本发明培养法		+	-	+	-	+	-
		染菌即时增菌4h	01EVC 120139VC 501EVC 120139VC 5	113124	1201	3*050	9075	+	-	+	-	+	-	112125	1300

*结果不明显

污染后即时检测，免疫沾棒法仅3份可疑阳性，庆大琼脂和本发明培养法分别由14和13份检出，在增菌4小时后，17份染菌样品用本发明培养法全部检出，庆大琼脂常规法16份阳性。免疫沾棒法仅查出6份01群菌株。但在报告结果时间方面，免疫沾棒法最快，在菌量足够多时，试验当时(10分钟内)即可读取结果，而常规法和本发明培养法均在接种后10小时才能生长出菌苔，可用菌苔作玻片凝集后报告初步结果，继续培养过夜后再作玻片凝集试验报告最后结果。二种培养方法比较，本发明培养法因为添有指示剂，在细菌生长过程中发酵蔗糖产酸致使培养基变黄，因而结果更容易观察。

3、现场考核试验结果：

现场考核试验分别在阿克苏市、巴音郭楞蒙古自治州(简称巴州)防疫站两个实验室用庆大霉素琼脂常规法和本发明培养法作对比试验。

阿克苏市于2002年7月29日-10月2日检查肠道门诊腹泻病人粪便标本253份，二种方法均从同一份标本查出氧化酶和粘丝均阳性的非01群霍乱弧菌菌株。其余标本均无菌生长，二种方法结果符合率100％。

巴州防疫站于2002年7月28日-8月11日检查腹泻病人和病人接触者粪便标本247份(表3)，两种方法各查出4份阳性，占1.6％，均为小川EVC非流行株，结果完全吻合。常规法庆大琼脂上224份样品无菌生长，抑菌率达90.7％，本发明培养法中205份无菌生长占83.0％，本发明培养法中无菌生长的样品在庆大琼脂上也不生长。除检出的4株01群EVC以外，本发明培养法中有38份检出菌株，这些菌株在微量板琼脂中产酸使培养基变黄，但不与01、0139血清凝集，庆大琼脂上有19份检出菌株。我们对这些菌株转种至营养琼脂上作氧化酶和粘丝试验(结果见表3)。本发明培养法中的38株菌二种试验阳性20株，应疑为弧菌属，氧化酶阳性、粘丝阴性9株应疑为弧菌科范畴，但还有9株菌二种试验阴性为其他细菌。庆大上的19株生长菌12株为弧菌属，5株为弧菌科，2株为其他菌。在庆大琼脂上检出的菌株，本发明法中全部检出，没有漏检，而本发明培养法检出的弧菌属、弧菌科菌株分别为8.1％和3.6％，合计为11.7％，明显比庆大琼脂(6.9％)的检出率要高。

表3 巴州247份样品两种方法检查结果

方法	样品数	01EVC	01群外其它菌	氧化酶+粘丝+	氧化酶+粘丝-	氧化酶-粘丝-
方法	样品数	01EVC	01群外其它菌	氧化酶+粘丝+	氧化酶+粘丝-	氧化酶-粘丝-	常规法	247	4	19	12	5	2
本发明培养法	247	4	38	20	9	9	常规法	247	4	19	12	5	2

表3的检查结果表明，本发明培养法检测的特异性比较突出，在01和0139群菌株的检出上和常规法相似，在其他弧菌的检出上明显高于常规法。

具体实施方式

一种培养基是由以下组分制成的：

使用上述培养基进行霍乱弧菌的微量培养法，其步骤是：

1、按上述组份配方称取原料，混匀加热溶化，加热温度为100℃；

2、将加热后的液体加入细菌培养板上均布的凹坑内；

3、待凹坑内的液体凝固后，将该细菌培养板用塑料袋真空密封包装后，放入冰箱，在4℃的温度下保存；

4、作细菌培养时，从冰箱内拿出细菌培养板，打开密封包装，将待检标本用接种环取一环接种到培养板的凹坑内，在37℃的温度下放置10小时；

Claims

1、一种培养基，包括蛋白胨10g、牛肉膏2g、氯化钠5g、琼脂20g、蒸馏水1000ml，其特征是还有以下组分制成：酵母浸出膏2-5g、无水亚硫酸钠2-5g、柠檬酸钠8-12g、十二烷基硫酸钠0.3-0.6g、蔗糖8-12g、百分比浓度为0.4％的酚红0.5-2ml、庆大霉素(500μ/ml)0.5-2ml、多粘菌素B(1000μ/ml)0.5-2ml、百分比浓度为1％的亚碲酸钾0.5-2ml、新洁尔灭0.5-2ml、PH值8.5-8.8。

2、根据权利要求1所述的培养基，其特征是：其中各原料的配比为：酵母浸出膏2-4g、无水亚硫酸钠2-4g、柠檬酸钠9-11g、十二烷基硫酸钠0.4-0.6g、蔗糖9-11g、百分比浓度为0.4％的酚红0.5-1.5ml、庆大霉素(500μ/ml)0.5-1.5ml、多粘菌素B(1000μ/ml)0.5-1.5ml、百分比浓度为1％的亚碲酸钾0.5-1.5ml、新洁尔灭0.5-1.5ml、PH值8.5-8.7。

3、根据权利要求1所述的培养基，其特征是：其中各原料的配比为：酵母浸出膏3g、无水亚硫酸钠3g、柠檬酸钠10g、十二烷基硫酸钠0.5g、蔗糖10g、百分比浓度为0.4％的酚红1ml、庆大霉素(500μ/ml)1ml、多粘菌素B(1000μ/ml)1ml、百分比浓度为1％的亚碲酸钾1ml、新洁尔灭1ml、PH值8.6。

4、根据权利要求1所述的培养基培养霍乱弧菌的微量培养法，其特征是：有以下步骤：(1)按本发明培养基的组份配方称取原料，混匀加热溶化，加热温度为95℃-110℃；(2)将加热后的液体加入细菌培养板上均布的凹坑内；(3)待凹坑内的液体凝固后，将该细菌培养板用塑料袋真空密封包装后，放入冰箱，在2℃-6℃的温度下保存；(4)作细菌培养时，从冰箱内拿出细菌培养板，打开密封包装，将待检标本用接种环取一环接种到培养板的凹坑内，在36±1℃的温度下放置9-18小时；(5)取出培养板观察结果，无菌生长或仅有粗糙菌苔或菌落，且培养基不变色者为阴性，若有菌生长，且培养基变黄色，可取少量菌苔或菌落与霍乱诊断血清作玻片凝集，凝集阳性者即可报告初步结果。

5、根据权利要求4所述的霍乱弧菌微量培养法，其特征是：培养板的尺寸为长6-14cm、宽4-10cm、厚2.5cm，在板面上均布10-24个凹坑，凹坑的直径为1.5cm，深度为1-1.5cm。

6、根据权利要求4或5所述的霍乱弧菌微量培养法，其特征是：培养板的尺寸为长8-13cm、宽5-8.5cm、厚2.5cm，在板面上均布10-16个凹坑。