CN105349610B - 一种霍乱弧菌鉴别的选择性培养基 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种霍乱弧菌鉴别的选择性培养基，在该技术方案中，发明人基于霍乱弧菌的营养代谢特点，优选了适宜其生长的营养成分，实验发现在该营养条件下大多数革兰氏阳性细菌生长受到明显抑制，从而缩小了对检测结果可能产生影响的微生物范围。在此基础上，本发明利用了霍乱弧菌可分解蛋白胨中色氨酸生成吲哚的特性，添加了适量的对二甲氨基苯甲醛作为选择性指示剂，该指示剂可与吲哚反应生成红色的玫瑰吲哚，从而作为霍乱弧菌阳性指标。本发明以创新性的技术改进实现了突出的技术效果，同时成本较低、易于实现，因此具有突出的推广前景。
Description
技术领域
本发明涉及微生物鉴别、检测技术领域，具体涉及一种霍乱弧菌鉴别的选择性培养基。
背景技术
霍乱作为一种古老且流行广泛的烈性传染病曾在世界上引起多次大流行，主要表现为剧烈的呕吐，腹泻，失水，死亡率甚高，属于国际检疫传染病。霍乱弧菌是人类霍乱的病原体，属于革兰氏阴性菌，菌体弯曲呈弧状或逗点状，菌体一端有单根鞭毛和菌毛，无荚膜与芽胞，经人工培养后，易失去弧形而呈杆状。由于霍乱传染性强、死亡率高，因此霍乱弧菌的检测技术对公共卫生安全至关重要。
该菌株对营养要求不高，在pH 8.8～9.0的碱性蛋白胨中生长良好，现有技术中通常利用该碱性环境用于执行霍乱弧菌与其他微生物的鉴别、检测。尽管该方法成本较低、易于实现，却可能因其他嗜碱菌的生长而影响检测结果。另一方面，通过基因测序的方式结果最为可靠，因此科研领域通常采用该方法，但由于该方法需要提取DNA、PCR扩增、测序等复杂操作，因此检测流程较长，鉴于其强烈的传染性，因此该方法存在较大的安全风险。针对上述情况，临床上用于霍乱弧菌的检测主要从选择性培养基的开发着手，但现有技术的选择性培养基仍存在着灵敏性不高、霍乱弧菌生长速度较慢的技术问题。
发明内容
本发明旨在针对现有技术的技术缺陷，提供一种霍乱弧菌鉴别的选择性培养基，以解决现有技术的霍乱弧菌检测方法灵敏性较低。
本发明要解决的另一技术问题是现有技术的霍乱弧菌检测方法检测时间较长。
为实现以上技术目的，本发明采用以下技术方案：
一种霍乱弧菌鉴别的选择性培养基，该培养基包括以下重量份的成分：蛋白胨8～10份，蚕蛹粉4～6份，茯苓粉2～3份，苜蓿草粉1～2份，核桃粉1～2份，黑大豆皮1～2份，乳糖1～2份，合欢米1～2份，桦菌芝1～2份，对二甲氨基苯甲醛1～2份。
优选地，还包括1～2重量份的琼脂。
优选地，还包括1～2重量份的明胶。
优选地，还包括1～2重量份的戊醇。
优选地，还包括1～2重量份的碳酸钠。
优选地，所述选择性培养基由以下重量份的成分组成：蛋白胨9份，蚕蛹粉5份，茯苓粉2.5份，苜蓿草粉1.5份，核桃粉1.5份，黑大豆皮1.5份，乳糖1.5份，合欢米1.5份，桦菌芝1.5份，对二甲氨基苯甲醛1.5份。
优选地，所述选择性培养基由以下重量份的成分组成：蛋白胨8.5份，蚕蛹粉5.5份，茯苓粉2.1份，苜蓿草粉1.3份，核桃粉1.7份，黑大豆皮1.6份，乳糖1.2份，合欢米1.1份，桦菌芝1.4份，对二甲氨基苯甲醛1.5份，琼脂1.4份，明胶1.1份，戊醇1.5份，碳酸钠1.8份。
在以上技术方案中，发明人基于霍乱弧菌的营养代谢特点，优选了适宜其生长的营养成分，实验发现在该营养条件下大多数革兰氏阳性细菌生长受到明显抑制，从而缩小了对检测结果可能产生影响的微生物范围。在此基础上，本发明利用了霍乱弧菌可分解蛋白胨中色氨酸生成吲哚的特性，添加了适量的对二甲氨基苯甲醛作为选择性指示剂，该指示剂可与吲哚反应生成红色的玫瑰吲哚，从而作为霍乱弧菌阳性指标。
在优选技术方案中，添加琼脂或明胶可赋予培养基固体形态，从而以菌落周围的显色圆圈作为判断依据，更加便于视觉判断；添加戊醇则有助于进一步提升霍乱弧菌的生长速度；而添加适量的碳酸钠则是为了赋予培养基8.5～9.5的pH范围，利用该碱性环境进一步降低其他微生物对检测结果的潜在影响。本发明以创新性的技术改进实现了突出的技术效果，同时成本较低、易于实现，因此具有突出的推广前景。
具体实施方式
以下将对本发明的具体实施方式进行详细描述。为了避免过多不必要的细节，在以下实施例中对属于公知的结构或功能将不进行详细描述。除有定义外，以下实施例中所用的技术和科学术语具有与本发明所属领域技术人员普遍理解的相同含义。
实施例1
一种霍乱弧菌鉴别的选择性培养基，由以下重量份的成分组成：蛋白胨8份，蚕蛹粉4份，茯苓粉2份，苜蓿草粉1份，核桃粉1份，黑大豆皮1份，乳糖1份，合欢米1份，桦菌芝1份，对二甲氨基苯甲醛1份。
实施例2
一种霍乱弧菌鉴别的选择性培养基，由以下重量份的成分组成：蛋白胨10份，蚕蛹粉6份，茯苓粉3份，苜蓿草粉2份，核桃粉2份，黑大豆皮2份，乳糖2份，合欢米2份，桦菌芝2份，对二甲氨基苯甲醛2份。
实施例3
一种霍乱弧菌鉴别的选择性培养基，由以下重量份的成分组成：蛋白胨9份，蚕蛹粉5份，茯苓粉2.3份，苜蓿草粉1.8份，核桃粉1.5份，黑大豆皮1.6份，乳糖1.7份，合欢米1.8份，桦菌芝1.2份，对二甲氨基苯甲醛1.8份。
实施例4
一种霍乱弧菌鉴别的选择性培养基，由以下重量份的成分组成：蛋白胨8.8份，蚕蛹粉5.4份，茯苓粉2.7份，苜蓿草粉1.2份，核桃粉1.2份，黑大豆皮1.2份，乳糖1.5份，合欢米1.6份，桦菌芝1.4份，对二甲氨基苯甲醛1.7份，琼脂1份，碳酸钠1.1份。
实施例5
一种霍乱弧菌鉴别的选择性培养基，由以下重量份的成分组成：蛋白胨9.4份，蚕蛹粉4.2份，茯苓粉2.1份，苜蓿草粉1.3份，核桃粉1.1份，黑大豆皮1份，乳糖2份，合欢米1.9份，桦菌芝1.2份，对二甲氨基苯甲醛1.9份，明胶1.3份，戊醇1.2份，碳酸钠1.6份。
实施例6
一种霍乱弧菌鉴别的选择性培养基，由以下重量份的成分组成：蛋白胨8.8份，蚕蛹粉5.4份，茯苓粉2.7份，苜蓿草粉1.2份，核桃粉1.2份，黑大豆皮1.2份，乳糖1.5份，合欢米1.6份，桦菌芝1.4份，对二甲氨基苯甲醛1.7份，琼脂1.5份。
实施例7
一种霍乱弧菌鉴别的选择性培养基，由以下重量份的成分组成：蛋白胨9.2份，蚕蛹粉5.7份，茯苓粉2.4份，苜蓿草粉1.5份，核桃粉1.5份，黑大豆皮1.7份，乳糖1.7份，合欢米1.2份，桦菌芝1.9份，对二甲氨基苯甲醛2份，戊醇1.8份。
实施例8
一种霍乱弧菌鉴别的选择性培养基，由以下重量份的成分组成：蛋白胨8.5份，蚕蛹粉5.5份，茯苓粉2.1份，苜蓿草粉1.3份，核桃粉1.7份，黑大豆皮1.6份，乳糖1.2份，合欢米1.1份，桦菌芝1.4份，对二甲氨基苯甲醛1.5份，琼脂1.4份，戊醇1.5份，碳酸钠1.8份。
以下将对本实施例培养基用于霍乱弧菌检测鉴别的使用效果进行实验。
将表1中所述20株标准菌株分别制成108～109CFU/mL的菌悬液，分别取一环划线接种于本实施例中所描述培养基制成的平板(简称HKM)上，37℃培养24h，观察各菌的生长情况及菌落特征，结果如表1所示。注：表1中菌落生长情况用增殖水平来表示，依据人为观察将增殖的生物量划分为4个水平，分别为1～4级，其中4级表示生长良好，菌落大小正常，由3级到1级表示生长受抑制，菌落逐级减小，0级表示几乎不生长。
表1实验用微生物菌落形态特异性特征
| 序号 | 菌种名 | 结果 |
| 1 | 霍乱弧菌 | 4级，黄色菌落，半透明红色外圈 |
| 2 | 产气肠杆菌 | 3级，乳黄色菌落，无显色外圈 |
| 3 | 大肠埃希氏菌 | 3级，白色菌落，无显色外圈 |
| 4 | 枯草芽孢杆菌 | 1级，白色菌落，无显色外圈 |
| 5 | 大肠杆菌 | 4级，白色菌落，无显色外圈 |
| 6 | 肺炎链球菌 | 0级 |
| 7 | 金黄色葡萄球菌 | 1级，黄色菌落，无显色外圈 |
| 8 | 肺炎克雷伯氏菌 | 2级，乳白色菌落，无显色外圈 |
| 9 | 炭疽杆菌 | 0级 |
| 10 | 肉毒梭状芽孢杆菌 | 2级，灰色菌落，无显色外圈 |
| 11 | 铜绿假单胞菌 | 4级，蓝绿色菌落，无显色外圈 |
| 12 | 绿脓杆菌 | 3级，蓝绿色菌落，透明无色外圈 |
| 13 | 鼠疫杆菌 | 1级，白色菌落，无显色外圈 |
| 14 | 脑膜炎双球菌 | 3级，白色菌落，无显色外圈 |
| 15 | 肠膜明串珠菌 | 0级 |
| 16 | 乳酸杆菌 | 1级，乳白色菌落，透明无色外圈 |
| 17 | 双歧杆菌 | 2级，乳白色菌落，无显色外圈 |
| 18 | 幽门螺杆菌 | 3级，灰色菌落，无显色外圈 |
| 19 | 阪崎肠杆菌 | 4级，浅黄色菌落，无显色外圈 |
| 20 | 伤寒沙门氏菌 | 2级，无色半透明菌落，无显色外圈 |
如表1所示，在实验所选择的20株常见陆生菌中，仅霍乱弧菌菌落出现了红色的外圈、检测结果呈阳性，而其余菌株均未出现该特征，因此以本发明培养基执行菌种鉴别确切有效。此外，在该培养基中，乳酸杆菌、鼠疫杆菌、肺炎链球菌等革兰氏阳性细菌生长受到明显抑制，而革兰氏阴性菌株中仅大肠杆菌、阪崎肠杆菌、铜绿假单胞菌、长势良好，其余菌株生长也都受到了一定的抑制，由此可见，该培养基对微生物的适用范围较窄，受其他微生物干扰的风险较小，其特异性良好。
将表1所述20株标准菌株制备成107～108CFU/mL的菌悬液，分别取一环划线接种于本实施例中所描述培养基制成的平板和对照平板上，37℃培养24h，观察菌落的显色情况，实验结果见表2所示。其中对照培养基有：青岛海博生物公司出品的霍乱弧菌显色培养基(简称海博培养基)、上海生工出品的霍乱弧菌显色培养基(简称生工培养基)、OXOID公司的木糖-赖氨酸-去氧胆酸盐琼脂(简称OXOID培养基)。霍乱弧菌在上述对照培养基中特征分别为，海博培养基变成红色，形成清晰白色或无色半透明的菌落；生工培养基变成红色，菌落为白色或无色半透明；OXOID培养基变成红色，无色半透明菌落。
表2本发明培养基与其他对照培养基对霍乱弧菌检测精准性试验结果
在以上实验结果中，“++”表示检测结果阳性，“--”表示检测结果阴性。由表2可知，霍乱弧菌在上述4种培养基中均显示阳性结果。对于其它19种微生物，在作为对比的3中培养基中均出现了错检的情形，假阳性率较高。这表明本发明培养基与其他常用于霍乱弧菌鉴别的培养基相比较，检测精准性有所提升，有助于提升临床上对菌株鉴定的有效性。
取霍乱弧菌标准菌株分别制成102～103CFU/mL菌悬液，取100μL用螺旋接种法分别接种到本实施例所描述培养基、海博培养基、生工培养基、OXOID培养基制成的平板上，37℃培养24h，通过菌落数计算菌悬液的浓度，结果见表3。
表3本发明培养基与其他对照培养基对霍乱弧菌检测灵敏性试验结果
由表3可知，在检测灵敏度方面，本发明培养基显著优于其他3种对照培养基，由于在本发明培养基上霍乱弧菌增殖最快，因此形成菌落较大，显色反应较明显，而且对致病性的O1群、O139群以及非致病性的O22群均具有良好的培养效果，菌体增殖速度较稳定。
综上所述，本发明所描述的霍乱弧菌鉴别的选择性培养基具有特异性强、灵敏度高、易于操作、结果判断简单等优点，检测效果全面优于市场同类产品。此外，本发明所提供的培养基与传统选择性培养基相比较，显著降低了假阳性和假阴性结果的出现，从而为临床的快速检测奠定了基础。
以上对本发明的实施例进行了详细说明，但所述内容仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明。凡在本发明的申请范围内所做的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (7)
1.一种霍乱弧菌鉴别的选择性培养基，其特征在于包括以下重量份的成分：蛋白胨8～10份，蚕蛹粉4～6份，茯苓粉2～3份，苜蓿草粉1～2份，核桃粉1～2份，黑大豆皮1～2份，乳糖1～2份，合欢米1～2份，桦菌芝1～2份，对二甲氨基苯甲醛1～2份。
2.根据权利要求1所述的霍乱弧菌鉴别的选择性培养基，其特征在于还包括1～2重量份的琼脂。
3.根据权利要求1所述的霍乱弧菌鉴别的选择性培养基，其特征在于还包括1～2重量份的明胶。
4.根据权利要求1所述的霍乱弧菌鉴别的选择性培养基，其特征在于还包括1～2重量份的戊醇。
5.根据权利要求1所述的霍乱弧菌鉴别的选择性培养基，其特征在于还包括1～2重量份的碳酸钠。
6.根据权利要求1所述的霍乱弧菌鉴别的选择性培养基，其特征在于所述选择性培养基由以下重量份的成分组成：蛋白胨9份，蚕蛹粉5份，茯苓粉2.5份，苜蓿草粉1.5份，核桃粉1.5份，黑大豆皮1.5份，乳糖1.5份，合欢米1.5份，桦菌芝1.5份，对二甲氨基苯甲醛1.5份。
7.根据权利要求1所述的霍乱弧菌鉴别的选择性培养基，其特征在于所述选择性培养基由以下重量份的成分组成：蛋白胨8.5份，蚕蛹粉5.5份，茯苓粉2.1份，苜蓿草粉1.3份，核桃粉1.7份，黑大豆皮1.6份，乳糖1.2份，合欢米1.1份，桦菌芝1.4份，对二甲氨基苯甲醛1.5份，琼脂1.4份，明胶1.1份，戊醇1.5份，碳酸钠1.8份。
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