CN105567583A - 一种鸡源唾液乳杆菌的应用 - Google Patents

一种鸡源唾液乳杆菌的应用 Download PDF

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陈新亮
何剑斌
张燚
李鹏
杨娜
杨淑华
郭洋
李林
曹中赞
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Abstract

本发明公开了一种命名为Lactobacillus？salivarius？C-1-3鸡源唾液乳杆菌在纤维素降解方面的应用，其对常见的致病菌大肠杆菌、沙门氏菌和金黄色葡萄球菌具有良好的抑菌作用。经过多次驯化后，该菌株表现具有较好的抑菌作用及耐酸、耐胆盐、耐高温特性。可以作为微生态制剂应用于饲料生产中，解决抗生滥用，也可以应用于动物性食品保藏中。该菌株的成功分离鉴定及生物学特性研究为今后其在食品和饲料中的应用奠定了理论和试验基础。

Description

一种鸡源唾液乳杆菌的应用
技术领域
本发明涉及菌株领域，具体涉及一种鸡源唾液乳杆菌的应用。
背景技术
乳酸菌是人和动物体内肠道正常菌群的一种，其抗病、防病及促生长的作用已有很多的报道，并且有研究也表明，理想的益生菌菌株最好来自本源动物。乳酸杆菌作为一种动物体内重要的益生菌，能够调节肠道菌群的平衡，对常见的肠道致病菌具有广谱抗菌作用；增强机体的免疫力和抵抗力、提高乳品质，改善人类对酸奶乳糖不耐受症状；提高饲料利用率、促进动物生长性能和肉品质等许多有益的生理功能。另外，抗生素的滥用带来的严重危害，导致我们需要一种新型的物质来代替抗生素，目前认为，乳酸杆菌是最佳的抗生素替代品。但不同来源的乳酸菌的生物学特性不同。因此，对乳酸杆菌菌种的分离纯化、研究其生物学特性是将其进行生产实践应用中的重要环节。目前，国内外对乳杆菌生物特性的研究多限于乳品、植物来源的乳杆菌，动物源性的乳酸杆菌虽然也被应用，但对其生物特性的报道相对较少且不系统全面，唾液乳杆菌作为2010年4月22日卫生部办公厅关于印发《可用于食品的菌种名单》的通知中可食用的菌种之一。它具有很多重要的生理功能，就使得唾液乳杆菌有望成为优良的食品添加剂及可替代抗生素添加剂的优良益生菌之一。
发明内容
本发明的目的是提供一种鸡源唾液乳杆菌的应用，其命名为LactobacillussalivariusC-1-3。
为实现上述目的，本发明采取的技术方案为：
LactobacillussalivariusC-1-3在纤维素降解方面的应用。
LactobacillussalivariusC-1-3作为微生态制剂应用于饲料生产中。
LactobacillussalivariusC-1-3在动物性食品保藏中的应用。
本发明具有以下有益效果：
菌株对常见的致病菌大肠杆菌、沙门氏菌和金黄色葡萄球菌具有良好的抑菌作用。且该菌株的一个重要的生物学特性是具有纤维素降解能力。经过多次驯化后，该菌株表现具有较好的抑菌作用及耐酸、耐胆盐、耐高温特性。该菌株的成功分离鉴定及生物学特性研究为今后其在食品和饲料中的应用奠定了理论和试验基础。
附图说明
图1为本发明实施例中C-1-3菌株的PCR电泳图，
图中，M为2000bp的marker，1为C-1-3菌株16SrDNA基因序列扩增结果；2为空白对照
图2为本发明实施例中C-1-3菌株的系统发育树
图3为本发明实施例中C-1-3菌株的生长曲线和耐酸能力。
图4为本发明实施例中对不同菌的抑菌圈的大小效果
图5为本发明实施例中的耐高温结果
具体实施方式
为了使本发明的目的及优点更加清楚明白，以下结合实施例对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
实施例1
一材料来源：
试验动物：本地健康散养溜达鸡，购于沈阳某生态养鸡场。
培养基：MRS培养基、SL乳杆菌选择性培养基；LB培养基、麦康凯琼脂培养基、羧甲基纤维素钠(CMC-Na)固体培养基均购于北京奥博星生物技术有限公司；甘露醇氯化钠琼脂培养基购于杭州天和微生物试剂有限公司。
试验菌株：鸡源大肠杆菌、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌，均由沈阳农业大学畜牧兽医临床实验室保存提供。
二、试验方法
(1)乳杆菌分离
剪断颈部血管快速放血致死，迅速无菌取小肠，置无菌平皿中，移至超净工作台中剖开，去掉小肠内容物，用无菌磷酸盐缓冲液(PBS)冲洗3次，用灭菌载破片刮取小肠黏膜黏液，然后用灭菌生理盐水进行稀释，依次稀释至10-2、10-3、10-4梯度，各稀释度都取0.1ml，在无菌条件下，用接种环划线种于SL选择性培养基，置于37℃摇床中培养36小时后，接种到MRS固体培养基中，37℃培养24小时。
(2)乳杆菌鉴定
进行多次划线培养后，挑取形态特征与《伯杰氏细菌鉴定手册》对乳杆菌描述圆形、表面光滑、乳白色相一致菌落进行革兰氏染色，选取疑似菌株进行生理生化鉴定，包括生化反应管试验，主要测定项目有：苦杏仁苷、水杨苷、麦芽糖、半乳糖、甘露糖、葡萄糖等糖类发酵试验、明胶液化试验、厌氧生长以及葡萄糖酸盐和15℃生长与否等测定试验；菌株16SrRNA鉴定：利用购于上海生工的细菌基因组DNA快速提取试剂盒提取细菌的基因组，然后采用16SrRNA通用引物27f：5’-agagttgatcctggctcag-3’；1492r：5’-ggttaccttgttactt-3’，以提取的基因组作为模板，进行PCR扩增其16SrRNA基因片段，扩增体系为30μl：PCRmix15μl，通用引物每样1μl，基因组1μl以及去离子水12μl；PCR反应条件为：95℃预变性5min，94℃变性45s，50/60℃退火45s，72℃延伸90s，24个循环，72℃延伸5min。PCR完成后，产物经过1％琼脂糖凝胶电泳试验检验结果成功与否。扩增成功后送至上海生工生物工程有限公司进行生工测序，为了测序的准确性，要求双向测通。测序结果在NCBI上进行Blast比对，在GenBank中得到几个与分离菌株序列同源性较高的菌株，将这些菌株作为参考菌株进行同源性分析。使用ClustalX1.8把这些参考菌株的序列对齐后，使用DNAstar建立菌株的系统进化树，分析菌株的同源性。
(3)菌株生长曲线的测定
以1％的接种量接种到MRS培养基中，置于37℃摇床中培养，分别在0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、14、18、22h取样，测得培养基的pH及采用比浊法，利用分光光度计测得菌液在OD600nm处的吸光度，然后以培养时间为横坐标，以pH和OD600nm值为纵坐标，绘制生长曲线。
(4)菌株体外抑菌试验
抑菌试验参考刘冬梅等人用牛津杯法测定益生菌的抑菌活力。将37℃培养24h的细菌进行6000rpm离心10min，收集上清液备用；在超净工作台内将事先准备好的鸡源大肠杆菌、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌进行稀释10-2、10-3、10-4倍，并分别各吸取100μl涂布到LB琼脂固体培养基、麦康凯培养基及甘露醇氯化钠琼脂培养基中，然后用镊子将无菌牛津杯轻轻放置到涂完指示菌株的平皿中，再吸取160-180μl的益生菌上清液滴到牛津杯内，注意不要让上清液溢出牛津杯，最后将平皿放置4℃冰箱中24h，进行扩散处理。然后放到37℃恒温箱中培养24h，观察抑菌现象。
(5)纤维素降解试验
将培养24h的菌株梯度稀释后接种CMC-Na固体培养基上，每个接种点吸取20μl菌液，于37℃的恒温箱中培养4d，取出平板后用1mg/ml的刚果红染色液染色20min，倒掉多余的刚果红，分别测量菌落直径(d)和降解圈的直径(D)，以降解圈直径和菌落直径的比(D/d)为指标判定菌株降解纤维素的能力。
(6)耐酸试验
将配制好的MRS培养基用0.1mol/L盐酸溶液及0.1mol/L氢氧化钠溶液调整溶液pH分别为6.0(对照组)、5.0、4.0、3.0、2.0五个试验组[16]，每个试验组做一个平行对照组，将调整好的培养基分装到50ml的三角瓶中，然后高压灭菌备用，以5％的接种量分别接种到灭完菌培养基中，37℃摇床中培养24小时，测得菌液在OD600nm处的吸光度，计算成活率。
(7)耐胆盐试验
在MRS培养基中分别加入0.05％、0.10％、0.15％、0.20％的猪胆盐及不加猪胆盐作为对照组，每组分别做一个平行对照。按5％的接种量接种到含有不同浓度的培养基中，37℃培养24h，平板计数，计算成活率。
(8)耐高温试验
取等量在MRS培养基中培养24h的菌分别放到40、45、50、55℃的水浴处理20min及不做高温处理的对照组。然后以10的倍数进行依次递减稀释处理，最后取20μl处理完的菌液进行涂板，在37℃恒温箱中培养24h，平板计数。
三、结果与分析
(1)菌株的形态学观察结果
菌株在MRS培养基上划线培养后，生长良好，菌落大小在0.6-1.5mm，乳白色、边缘整齐、较光泽并凸起于培养基表面。革兰氏染色观察：培养24h的菌株油镜观察菌株成蓝色直杆状，单个、成双或聚集排列一起，两端钝圆，可以判断我们分离的菌株为革兰氏阳性杆菌。
(2)生化鉴定结果
生化鉴定结果见表1，将鉴定结果与《伯杰氏细菌鉴定手册》对唾液乳杆菌的生理生化鉴定描述相比较。根据比较结果可以初步鉴定我们分离的细菌为乳杆菌属。
表1C-1-3菌株的生理生化鉴定结果
(3)16SrRNA测定及同源性分析结果
PCR扩增及琼脂糖凝胶电泳结果如图1，从电泳结果可以看出PCR扩增后的基因大小1500bp左右，分离菌株的16SrRNA基因片段测序结果为1468bp，与电泳结果相一致，并初步确定C-1-3菌株为Lactobacillussalivarius。基因测序结果已递送GenBank数据库中并被收录，收录号为：KP979479，用BLAST进行基因序列比对，比对结果表明与GenBank中收录的Lactobacillussp.KLDS1.0719(EU600923.1)和LactobacillussalivariusstrainZJ601(登录号JN981843.1)等数个菌株同源性达到99％，将这几个相似度较高的菌株作为参考菌株，见表2。使用ClastalX1.81把C-1-3菌株碱基序列及参考菌株序列对齐后，利用MEGA软件对分离菌株进行同源分析，生成系统发育树，如图2，进一步确定所分离的菌株与参考菌株中那一个菌株属同一分支。
表2参考菌株
(4)菌株生长曲线的绘制
菌株的生长曲线如图3所示，可知C-1-3菌株大约在2h后进入对数期，5h后稳定增长，在14h后活菌数达到最大。在菌体进入对数期时菌液的酸度迅速降低，稳定期时pH维持在3.0左右。
(5)体外抑菌试验结果
抑菌试验结果如图4所示，试验结果表明C-1-3菌对大肠杆菌、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌都具有良好的抑菌效果，尤其是大肠杆菌和沙门氏菌的抑菌效果，抑菌圈的直径为20～22mm左右，原因可能是乳杆菌在生长的过程中产生了乳酸、H2O2或细菌素的结果。
(6)纤维素降解试验结果
经检测表明此次分离的乳杆菌对纤维素有一定的降解能力，菌落直径(d)约为1mm，降解圈直径(D)大小为3.5mm。所以菌株降解纤维素指标为D/d＝3.5。
纤维素降解试验结果
乳酸菌要应用于实际生产中，必须具有耐受胃肠道的酸性环境，菌株在不同pH的溶液中培养24h结果如表3。结果显示在pH2.0时成活率为18.2％，pH4.0时，成活率为126.4％，达到最适pH生长环境。
表3耐酸性试验结果
(7)耐胆盐试验结果
动物体小肠内的胆盐质量分数在0.03％～0.3％左右，在正常范围内的乳杆菌才有机会再肠道内附植生长，耐胆盐结果见表4。其耐胆盐能力较差，在胆盐浓度为0.20％存活率为2.52％，在0.10％时存活率为74.6％。
表4耐胆盐性试验结果
(8)耐高温试验结果
如图5所示，初次进行耐高温筛选时，C-1-3表现出较差的耐高温特性，在50℃水浴20min成活率几乎为零，经过多次驯化后，对高温有一定的耐受性。经过驯化的菌株耐高温结果如图5，40℃时成活率为94.3％，但温度达到55℃时成活率降为23.8％。
本具体实施从本地健康的散养溜达鸡小肠粘膜中分离到一株乳杆菌，经过菌落形态特征的观察、革兰氏染色试验及16SrRNA序列测定结果及同源性分析，确定我们分离的C-1-3菌株为唾液乳杆菌，通过菌株的抑菌、纤维素降解、耐酸、耐胆盐、耐高温性试验研究表明，C-1-3菌株在MRS培养基中生长良好，对常见的肠道致病菌抑菌效果良好，且经过驯化后对酸、胆盐、高温具有一定的适应性，而且具有乳杆菌少见的纤维素降解能力，可以作为微生态制剂应用于饲料生产中，解决抗生滥用。由于该菌株具有很强的抑菌特性，也可以应用于动物性食品保藏中。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以作出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (3)

1.一种鸡源唾液乳杆菌，其命名为LactobacillussalivariusC-1-3，其特征在于，所述的LactobacillussalivariusC-1-3在纤维素降解方面的应用。
2.如权利要求1所述的LactobacillussalivariusC-1-3作为微生态制剂应用于饲料生产中。
3.如权利要求1所述的LactobacillussalivariusC-1-3在动物性食品保藏中的应用。
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