CN105039223B

CN105039223B - 一株具有抑制产气荚膜梭菌作用的枯草芽孢杆菌及其应用

Info

Publication number: CN105039223B
Application number: CN201510501784.0A
Authority: CN
Inventors: 单宝龙; 陈雷; 谷巍; 程福亮; 徐海燕; 王红; 陈甜甜; 樊梅娜; 辛国芹; 聂兆晶; 房栋; 赵影; 王春凤
Original assignee: Shandong Boly Lely Bioengineering Co ltd
Current assignee: Shandong Boly Lely Bioengineering Co ltd
Priority date: 2015-08-14
Filing date: 2015-08-14
Publication date: 2018-05-25
Anticipated expiration: 2035-08-14
Also published as: CN105039223A

Abstract

本发明公开了一株具有抑制产气荚膜梭菌作用的枯草芽孢杆菌，该菌株命名为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)BLCC1‑0155。本发明的枯草芽孢杆菌BLCC1‑0155对产气荚膜梭菌具有较强的抑制作用，同时对大肠杆菌与金黄色葡萄球菌也具有抑制作用。动物试验证明以枯草芽孢杆菌BLCC1‑0155为有效成分的微生态制剂产品能够较好的预防肉鸡的坏死性肠炎，减少坏死性肠炎对肉鸡肠道的伤害，并大大降低了死亡率，同时该微生态制剂产品还能够提高肉鸡的日增重，是一种能够应用于临床的较为理想的预防肉鸡坏死性肠炎的微生态制剂产品。

Description

一株具有抑制产气荚膜梭菌作用的枯草芽孢杆菌及其应用

技术领域

本发明涉及一株具有抑制产气荚膜梭菌作用的枯草芽孢杆菌及其应用。

背景技术

坏死性肠炎是1961年在英国肉鸡上发现并报道的，随后在全球大多数家禽生产国陆续报道。该病对全世界的畜禽生产具有重要的经济影响，至今被广泛研究。2011年，钟永庆在现代农业科技上指出，鸡坏死性肠炎是由A型魏氏梭菌引起的一种急性散发性传染病，该菌在体内繁殖后，从大肠和盲肠向小肠迁移并在小肠产生毒素，从而引起该病的发生。魏氏梭菌(Clostridium welchii)原名产气荚膜梭状杆菌(Clostridium Perfringengs,CP)，最初是由welchii和Nutall从一具腐败的人类尸体产生气泡的血管中分离得到，命名为魏氏梭菌。据中国禽业导刊报道，关于该病，2005年以前仅有30多篇报道，而最近3年报道占到总数的2/3，且呈现逐年增加的趋势。该病对山东半岛养鸡行业的冲击最为严重，长江以南对该类疾病很少报道，几篇相关报道也只是集中在贵州、湖南两地。该病的发生主要针对2～5周龄的幼禽，急性病程主要症状为采食量突然下降、精神沉郁、翅下垂、腹泻、增重率下降，有时突然死亡，有些病例平均每天死亡率可达1％。主要病灶包括小肠下端肠皱壁的大面积坏死，并伴有肝脏及盲肠坏死。典型的坏死性肠炎对肉用鸡具有很高的致病率与死亡率，在经济上对肉鸡养殖业有很大的影响。目前主要通过硫酸新霉素、硫酸粘菌素等抗生素进行治疗，但这种方法容易造成耐药性和药物残留问题。因此研制安全有效而又价格低廉的产品是防治此病的关键。

微生态制剂是一种新型活菌制剂，广泛用于人类、动物和植物，利用动物体正常微生物群成员，通过鉴定、培养、干燥等系列工艺制成的一种活菌制剂。益生菌作为活的微生物制剂，当摄入充足数量时能改善肠道微生物系统，有利于宿主健康。益生菌作为一种特殊的饲料添加剂或食材原料对动物的生长起到有利作用，可通过调节肠道菌群动态平衡来维持宿主健康状态。益生菌可作为抗生素替代物，其主要作用是提高动物对致病菌抵抗力的同时能加强宿主的黏膜屏障作用，可减少动物体内致病菌的入侵，改善其健康状态进而减少食品中的食源性致病菌。Hara等人发现乳杆菌属和双歧杆菌属细菌均可有效改善肠道疾病。Takahashi等人发现仔猪饲料中添加屎肠球菌可使仔猪体重增加，免疫能力显著提高，且体内的大肠杆菌数量明显减少，乳酸菌数量增多。益生菌还可降低新生儿坏死性肠炎的发病率。Butel发现，将肠道双歧杆菌定植到一对3日龄的双胞胎中，可防治新生儿坏死性小肠结肠炎的发生。Srinivas等人通过实验证明，补充双歧杆菌能够降低新生大鼠坏死性小肠结肠炎的发病率。Lin等人的研究表明，母乳喂养的同时添加微生态制剂可降低早产儿坏死性小肠结肠炎的发病率并减缓症状。Caplan等人通过实验证明，肠内双歧杆菌定植后可通过下调炎症级联反应等作用降低新生鼠发生坏死性肠炎的危险性。黄生树等人用枯草芽孢杆菌PB6代替抗生素来控制肉种鸡坏死性肠炎，平均2×10⁶cfu/只，达到了良好的防治效果。

但是，不同芽孢杆菌的益生性能差异较大，筛选出新的具有较强抑制产气荚膜梭菌作用的枯草芽孢杆菌，对于开发新的用于坏死性肠炎疾病防治的药物具有重要的意义。

发明内容

针对上述现有技术中存在的不足，本发明的目的是提供一株具有抑制产气荚膜梭菌作用的枯草芽孢杆菌。

本发明的另一目的是提供以该枯草芽孢杆菌为有效成分的微生态制剂在防治肉鸡坏死性肠炎中的应用。

为实现上述目的，本发明采用下述技术方案：

一株具有抑制产气荚膜梭菌作用的枯草芽孢杆菌，该菌株命名为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)BLCC1-0155，于2015年05月07日保藏于位于中国武汉市武汉大学的中国典型培养物保藏中心，其保藏编号为CCTCC NO:M 2015278。

所述枯草芽孢杆菌BLCC1-0155的菌种生物学特性如下：菌落呈圆形或不规则性，边缘不整齐，表面有皱褶、粗糙，污白色或微带黄色，有隆起；该菌种的细胞大小为(0.7μm～0.8μm)×(2.0μm～3.0μm)，呈杆状，染色均匀，无荚膜，鞭毛侧生，能运动；芽孢呈卵圆形或柱状，中生或偏生，大小为0.8μm×(1.5μm～1.8μm)；游离孢子表面着色弱；革兰氏阳性，接触酶阳性，能发生V-P反应；能利用葡萄糖、阿拉伯糖、木糖和甘露醇产酸，能水解淀粉，分解色氨酸形成吲哚；生长温度最高值45～55℃，最低值5～20℃，最适温度为37℃。

本发明还提供一种菌剂，该菌剂的活性成分为枯草芽孢杆菌BLCC1-0155。

该菌剂具体可采用如下制备工艺，具体步骤为：

(i)菌种：选用枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis BLCC1-0155，CCTCC NO:M2015278；

(ii)斜面培养：将枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis BLCC1-0155的冻干粉菌种接种于固体斜面培养基上，在32～40℃培养20～28h；

(iii)一级种子培养：将培养好的斜面，在无菌条件下用接种环接两环于50mL～100mL种子液体培养基中，在32～40℃条件下，静置培养14～18h，制得一级种子液；

(iv)扩大培养：以4-6％(v/v)的接种量，将一级种子液接于500mL～1000mL种子液体培养基中，在32～40℃条件下，静置培养10～16h，制得二级种子液；

(v)发酵罐培养：以4-6％(v/v)的接种量，将二级种子液接于液体发酵培养基中，于32～40℃条件下，静置培养16～24h；

(ⅵ)收集发酵产物：待步骤(ⅴ)之发酵液黏度达12000～15000cP时，收集发酵液；

(ⅶ)发酵结束后，立即将发酵液离心，菌体沉淀用生理盐水清洗，如此反复2～3遍后加入冻干保护剂冷冻干燥，粉碎，即为菌粉成品；或：发酵结束后，立即喷雾干燥，即得菌粉成品；

上述步骤(ⅲ)、(ⅳ)中所述种子液体培养基配方为：葡萄糖20g/L、蛋白胨10g/L、酵母膏5g/L，使用时，调节pH至6.5～7.5，115℃条件下灭菌20min；步骤(ⅱ)中所述固体斜面培养基为上述种子液体培养基中添加1.5～2.0％的琼脂粉；步骤(ⅴ)中所述液体发酵培养基配方为：葡萄糖20g/L、蛋白胨10g/L、酵母膏5g/L，氯化钠5g/L，使用时，调节pH至6.5～7.5。

所述菌株和/或菌剂在制备防治肉鸡坏死性肠炎的微生态制剂中的应用也属于本发明的保护范围。

本发明还提供了一种用于预防和/或治疗肉鸡坏死性肠炎的微生态制剂，该微生态制剂以枯草芽孢杆菌BLCC1-0155为有效成分。

该微生态制剂为枯草芽孢杆菌BLCC1-0155的菌粉与玉米淀粉载体复配而成，复配后微生态制剂中枯草芽孢杆菌BLCC1-0155的活菌数大于或等于1×10⁸cfu/g。

本发明的有益效果：

本发明的枯草芽孢杆菌BLCC1-0155对产气荚膜梭菌具有较强的抑制作用，同时对鸡大肠杆菌与金黄色葡萄球菌也具有抑制作用。动物试验证明以枯草芽孢杆菌BLCC1-0155为有效成分的微生态制剂产品能够较好的预防肉鸡的坏死性肠炎，减少坏死性肠炎对肉鸡肠道的伤害，并大大降低了死亡率，同时该微生态制剂产品还能够提高肉鸡的日增重，是一种能够应用于临床的较为理想的预防肉鸡坏死性肠炎的微生态制剂产品。

附图说明

图1：两株枯草芽孢杆菌抑菌效果图；

图2：BLCC1-0155的菌落培养性状；

图3：BLCC1-0155的菌体形态(油镜观察)；

图4：菌株BLCC1-0155的系统发育进化分析。

具体实施方式

结合实施例对本发明作进一步的说明，应该说明的是，下述说明仅是为了解释本发明，并不对其内容进行限定。

实施例1：具有抑制产气荚膜梭菌作用的枯草芽孢杆菌的分离鉴定

1材料与方法

1.1材料

1.1.1分离源

泰安及周边地区杜仲的枝条、根、叶、皮等。

1.1.2分离培养基

LB固体培养基：酵母膏0.5％、蛋白胨1％、NaCl 1％、琼脂粉1.5％，pH值为7.0；以质量百分数计。

1.1.3斜面培养基

同1.1.2分离培养基；

1.1.4发酵培养基

发酵培养基为LB液体培养基，成分为：酵母膏0.5％、蛋白胨1％、NaCl 1％，pH值为7.0；以质量百分数计。

1.1.5指示菌培养基

大肠杆菌、金黄色葡萄球菌使用LB培养基进行培养，其培养基配方为：酵母膏0.5％、蛋白胨1％、NaCl 1％，以质量百分数计，pH值为7.0；

产气荚膜梭菌的培养：液体培养基使用液体硫乙醇酸盐-HB5190培养基培养，购买于青岛海博生物技术有限公司；其固体培养基为胰蛋白胨－亚硫酸铁－环丝氨酸(TSC)-HB0253培养基，购买于青岛海博生物技术有限公司。

1.1.6指示菌

鸡大肠杆菌O78(购买于中国兽医微生物菌种保藏管理中心，菌种编号为CVCC1560)、金黄色葡萄球菌(购买于中国兽医微生物菌种保藏管理中心，菌种编号为CVCC3702)、产气荚膜梭菌A型(购买于中国兽医微生物菌种保藏管理中心，菌种编号为CV555CC49)。

1.2方法

1.2.1样品采集与处理

采集泰安及周边地区杜仲中药枝条、叶片及树皮等，置于无菌塑料袋中，在24h内进行表面消毒处理。

1.2.2内生菌的分离和纯化

1.2.2.1杜仲根、叶、皮的处理及细菌的纯化

采用组织块法对所采集的植物组织进行内生菌的分离。取采集的新鲜样品，用蒸馏水将植物表面洗净，稍干后取其茎、叶、皮切成适宜大小的小段，在75％乙醇中浸泡lmin，无菌水漂洗3次后用2.5％NaClO，茎、叶消毒2min，皮消毒3min，最后再用无菌水冲洗3～4次，无菌滤纸吸干。去边缘，切成约0.5cm×0.5cm的小块。

1.2.2.2细菌的纯化

将小块杜仲贴放于分离培养基上，每皿4～6块，置37℃恒温培养箱中培养24-48h。待培养基上植物组织周围长出菌落后，采用划线法进行纯化，将纯化后的单菌落保存至斜面培养基上，4℃冰箱保存。同时挑取单菌落于载玻片上进行革兰氏染色，油镜观察菌体形态，依据伯杰氏细菌鉴定手册初步对分离的菌株进行鉴定。

1.2.3具有抑菌效果菌株的筛选

将上述1.2.2.2中纯化的菌种接种在斜面培养基中，37℃培养复壮，24h后传代到装有50mL发酵培养基的250mL三角瓶中，37℃恒温180r/min振荡培养24h，然后接种到装有100mL发酵培养基的500mL三角瓶中，37℃恒温180r/min振荡培养24h，5000r/min离心取上清液，即为代谢产物；指示菌用生理盐水稀释到10⁷cfu/mL，然后用打孔法对代谢产物进行抑菌活性测定。

将指示菌培养基冷却到50℃左右，将指示菌加入到平皿中，加入培养基混匀。冷却后，在培养基上用打孔器打孔。孔中加满相同量的待测菌菌液(250μL)，每个样品三个重复。将加完样的平皿小心放入37℃恒温箱(产气荚膜梭菌放于厌氧培养箱中)内，培养16h后取出测量抑菌圈直径。

1.2.4中性蛋白酶、淀粉酶及纤维素酶高酶活菌株的筛选

(1)中性蛋白酶酶活的测定：采用福林法。

(2)α-淀粉酶酶活的测定：参照国标GB8275-2009。

(3)纤维素酶酶活的测定：采用CMC糖化力法测定。

1.2.5目的菌株生理生化特性研究及分子生物学鉴定

分析所得的内生菌，经抑菌效果及酶活测定，筛选出效果较好的菌株，进行生理生化及16S rDNA序列测定，明确其分类地位。

(1)生理生化鉴定

挑选单个菌落进行革兰氏染色镜检观察。对革兰氏阳性、有芽孢的菌落进行生化鉴定，包括木糖试验、果糖试验、葡萄糖试验、甘露醇试验、V.P试验、柠檬酸盐试验、淀粉水解试验、明胶水解试验、过氧化物酶试验、吲哚试验，具体方法参照《伯杰氏细菌鉴定手册》进行。

根据分离菌的菌落和菌体形态、革兰氏染色以及生化反应，按《伯杰氏细菌鉴定手册》进行初步鉴定。

(2)16S rDNA的扩增与序列分析

目的菌株接种于新鲜的发酵培养基中培养20h，采用天根公司的试剂盒提取菌体DNA，并对其进行16S rDNA序列扩增。所用引物为细菌16S rDNA通用引物(如序列表中SEQID NO.1和SEQ ID NO.2所示)，PCR反应体系(50μL)为:Mixture 25μL(含Taq DNA聚合酶及dNTP等，购于天根生化科技有限公司)，上下游引物各1μL，模板DNA 2μL，超纯水21μL。PCR扩增程序为94℃预变性5min，94℃变性1min，52℃退火1min，72℃延伸2min，30个循环，72℃延伸10min。PCR产物送北京博尚生物技术有限公司进行序列测定。

(3)系统发育分析

登录GenBank(http://www.ncbi.nlm.nih.gov)对菌株16S rDNA测序结果利用Blast进行检索，并下载相关属种的16S rDNA序列，采用DNAMAN、DNAclub、MEGA3.1等软件进行同源性分析，并构建系统进化树。

2结果

2.1内生菌的抑菌试验结果

测定杜仲内生菌对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌和产气荚膜梭菌的抑制效果，结果如表1、图1所示。

表1杜仲内生菌抑菌试验结果(单位：mm)

菌株编号	种属	金黄色葡萄球菌	大肠杆菌	产气荚膜梭菌
					BLCC1-0155	芽孢杆菌	12.5	9.0	18
BLCC1-0154	芽孢杆菌	8.4	—	—
					BLCC1-0153	芽孢杆菌	—	8.2	—
BLCC1-0156	芽孢杆菌	8.5	8.0	—
					BLCC1-0151	芽孢杆菌	10.4	9.0	11
BLCC1-0158	芽孢杆菌	9.7	8.7	—

注：“—”表示没有抑菌活性。

2.2内生菌的酶活

测定杜仲内生菌的中性蛋白酶、纤维素酶及α-淀粉酶酶活，结果如表2所示：

表2杜仲内生菌酶活

注：“—”表示没有测出含量。

2.3菌株鉴定

2.3.1菌株BLCC1-0155的菌落形态及染色结果

挑取菌株BLCC1-0155纯培养物接种于LB固体培养基，37℃培养20h后，观察其菌落形态不规则、呈乳白色，表面凸起干燥有褶皱，边缘不整齐(见图2)。光学显微镜下观察，菌体为革兰氏阳性，形态为杆状，无荚膜，个别为芽孢，呈椭圆形或柱状，中生或偏生(见图3)。

2.3.2菌株BLCC1-0155的生化鉴定结果

对菌株BLCC1-0155进行一系列的生化反应，结果得出菌株BLCC1-0155可利用葡萄糖、阿拉伯糖、乳糖等多种糖，使明胶液化、触酶阳性及分解色氨酸形成吲哚等生化反应与枯草芽孢杆菌菌种特性描述一致，结果见表3。

表3菌株BLCC1-0155的生化鉴定结果

注：“+”表示阳性或能利用；“－”表示阴性或不能利用；“+/－”表示同一属具体不同菌株之间的细微差别。

2.3.3菌株BLCC1-0155的16S rDNA鉴定结果

菌株BLCC1-0155的16S rDNA(其序列如序列表中SEQ ID NO.3所示)PCR条带在1000～2000bp之间，约为1.5kb的单一扩增产物。将该序列与GenBank的核酸数据作同源性比对。结果表明，该序列与GenBank中公布的已知枯草芽孢杆菌16S rDNA序列的同源率为98％～99％。结合16S rDNA序列分析，菌株BLCC1-0155被鉴定为枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)(见图4)。

3结论

从杜仲皮和叶中分离筛选出了一株综合性能较好的菌株BLCC1-0155。该菌株发酵液的α-淀粉酶酶活达到了474U/mL，中性蛋白酶酶活达到了51U/mL，纤维素酶酶活达到了9.36U/mL；对大肠杆菌与金黄色葡萄球菌的抑菌圈直径分别达到了12.5mm和9.0mm，对产气荚膜梭菌的抑菌直径达到18mm。

4.菌株BLCC1-0155的保藏

通过对菌株BLCC1-0155进行菌种鉴定，结果显示菌株BLCC1-0155为来自枯草芽孢杆菌属(Bacillus subtilis)的新菌，将其命名为枯草芽孢杆菌BLCC1-0155，并于2015年05月07日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO:M 2015278。

实施例2：微生态制剂的制备工艺

1材料

1.1菌种：菌株BLCC1-0155保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCCNO:M 2015278。

1.2培养基：

种子液体培养基配方为：葡萄糖20g/L、蛋白胨10g/L、酵母膏5g/L，调节pH 7.0，115℃条件下灭菌20min；

固体斜面培养基为上述种子液体培养基中添加质量分数为1.5％的琼脂粉；

液体发酵培养基配方为：葡萄糖20g/L、蛋白胨10g/L、酵母膏5g/L、氯化钠5g/L，pH7.0。

2方法

2.1菌粉的制备工艺

(ⅰ)菌种：选用枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)BLCC1-0155，CCTCC NO:M2015278；

(ⅱ)斜面培养：将枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis BLCC1-0155的冻干粉菌种接种于固体斜面培养基上，在37℃培养24h；

(ⅲ)一级种子培养：将培养好的斜面，在无菌条件下用接种环接两环于100mL种子液体培养基中，在37℃条件下，静置培养16h，制得一级种子液；

(ⅳ)扩大培养：以5％的接种量，将一级种子液接于1000mL种子液体培养基中，在37℃条件下，静置培养12h，制得二级种子液；

(ⅴ)发酵罐培养：以5％的接种量，将二级种子液接于液体发酵培养基中，于37℃条件下，静置培养20h；

(ⅵ)收集发酵产物：待步骤(ⅴ)之发酵液黏度达14000cP时，收集发酵液；

(ⅶ)发酵结束后，立即喷雾干燥，即得菌粉成品。

2.2微生态制剂的制备

将上述2.1制备的BLCC1-0155喷干菌粉与玉米淀粉载体进行充分混合，初步制作成微生态制剂产品，使产品中枯草芽孢杆菌BLCC1-0155的活菌数为1×10⁸cfu/g。

实施例3：鸡坏死性肠炎模型的建立

1材料与方法

1.1材料

AA肉鸡购自山东泰安大宇种禽场；510饲料购自山东六和集团有限公司。产气荚膜梭菌A型CVCC49购于中国兽医微生物菌种保藏管理中心。

1.2方法

选取1日龄AA肉鸡50只，随机分为5组，分别为对照组(不攻毒)、攻毒1组(按产气荚膜梭菌10⁹cfu/只的剂量攻毒)、攻毒2组(按产气荚膜梭菌10⁸cfu/只的剂量攻毒)、攻毒3组(按产气荚膜梭菌10⁷cfu/只的剂量攻毒)、攻毒4组(按产气荚膜梭菌10⁶cfu/只的剂量攻毒)。采用六和饲料510进行育雏，按正常程序进行免疫接种和饲养管理。攻毒时间为14日龄时，攻毒方式为经口腔灌胃。攻毒后第二日随机挑取各组鸡只进行解剖观察病变，连续攻毒三天观察病变。

2结果

在连续攻毒三日后，根据鸡只死亡现象(见表4)，确定攻毒剂量为产气荚膜梭菌10⁷cfu/只鸡。

表4鸡只死亡状况

实施例4：微生态制剂对肉鸡坏死性肠炎的作用效果

1材料与方法

1.1材料

AA肉鸡购自山东泰安大宇种禽场；510饲料购自山东六和集团有限公司；本发明实施例2制备的微生态制剂；产气荚膜梭菌A型CVCC49购于中国兽医微生物菌种保藏管理中心。

1.2方法

1.2.1试验分组

选取1日龄AA肉鸡90只，采用六和饲料510进行育雏，按正常程序进行免疫接种和饲养管理至7日龄进行分组。按各组鸡体重差异≤10g进行分组，分为3组，每组两个平行，每个平行15只鸡。其中第1组为空白对照组(常规饲养管理不感染不给药至试验结束)；第2组为试验组(仔鸡9日龄开始上午在饮水中按1‰(质量分数)比例添加本发明制备的微生态制剂产品，下午不添加产品正常饮水；在鸡饲养到14日龄时，经口腔灌胃进行攻毒，攻毒剂量为10⁷cfu/只，连续攻毒3天。)；第3组为攻毒组(仔鸡常规饲养管理至14日龄，经口腔灌胃进行攻毒，攻毒剂量为10⁷cfu/只，连续攻毒3天)。

1.2.2测定指标

攻毒前计算日增重；攻毒结束后第二天解剖观察病理变化；计算法氏囊指数和脾脏指数；取回肠内容物对菌群(大肠杆菌、乳酸菌、芽孢杆菌和产气荚膜梭菌)进行计数；在攻毒前和攻毒后第六天分别取血测白介素-2(IL-2)。

2结果

2.1平均日增重的计算

每组30只鸡，9日龄时每组全部鸡只体重作为初始体重，14日龄每组全部鸡只体重为最终体重，最终得到平均每只鸡日增重，计算公式如下：

由表5可知，试验组的平均日增重高于空白对照组和攻毒组1g以上(由于尚未攻毒，空白对照组和攻毒组的饲喂模式相同，两组平均日增重差异不显著)，说明本发明的微生态制剂产品能够显著提高肉鸡体重。

表5平均日增重

2.2病理剖检变化

解剖后观察各组病理变化，由表6可知，试验组鸡肠道病变轻微，而攻毒组鸡肠道病变较为严重，说明本发明的微生态制剂产品可以显著降低产气荚膜梭菌对鸡肠道的伤害，降低死亡率。

表6病理剖检病变

2.3免疫指数的测定

由法氏囊指数和脾脏指数的测定结果(见表7)可知，试验组的法氏囊指数和脾脏指数均显著高于空白对照组和攻毒组，说明该微生态制剂产品能够显著提高机体的免疫力。

表7法氏囊指数和脾脏指数

2.4回肠菌群变化

由回肠菌群计数结果(见表8)可知，攻毒组的大肠杆菌数显著高于对照组和试验组，而对照组和试验组在10⁴个数量级时，未检出产气荚膜梭菌。这说明了大肠杆菌作为条件性致病菌，在机体免疫力下降或肠道菌群紊乱时数量急剧增加，攻毒产气荚膜梭菌后，肠道受产气荚膜梭菌的破坏，大肠杆菌数量增加；对照组和试验组检测产气荚膜梭菌10⁴个数量级时，未检出产气荚膜梭菌，说明饲喂该微生态制剂能够很好的预防产气荚膜梭菌病的发生。

表8回肠内容物计数结果

2.5白介素-2的变化

由白介素-2(IL-2)测定结果(见表9)可知，在未攻毒前，试验组与空白对照组和攻毒组相比较，各组IL-2值差异不显著；攻毒后，试验组IL-2值与其攻毒前比较差异不显著，而攻毒组IL-2值显著高于其攻毒前。产气荚膜梭菌BLCC1-0155能够刺激机体产生IL-2，而芽孢杆菌能够明显抑制产气荚膜梭菌的生长，因此，试验组中IL-2值与攻毒前相比差异不显著。

表9 IL-2测定结果

3结论

本试验成功证明了以枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)BLCC1-0155为有效成分的微生态制剂在体外具有较好的抑制产气荚膜梭菌的作用；在动物试验中，该微生态制剂产品能够较好的预防肉鸡的坏死性肠炎，减少坏死性肠炎对肉鸡肠道的伤害，并大大降低了死亡率，同时该微生态制剂产品还能够提高肉鸡的日增重，是一种能够应用于临床的较为理想的预防肉鸡坏死性肠炎的微生态制剂产品。

Claims

1.一株具有抑制产气荚膜梭菌作用的枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）BLCC1-0155，于2015年05月07日保藏于位于中国武汉市武汉大学的中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO: M 2015278。

2.一种菌剂，其特征在于，该菌剂的活性成分为权利要求1所述的枯草芽孢杆菌BLCC1-0155。

3.如权利要求2所述的菌剂，其特征在于，所述菌剂的剂型为喷干或冻干菌粉。

4.权利要求2所述的菌剂的制备方法，其特征在于，步骤为：

（i）菌种：以权利要求1所述的枯草芽孢杆菌作为菌种；

（ii）斜面培养：将步骤（i）的菌种接种于固体斜面培养基上，在32～40℃培养20～28h；

（iii）一级种子培养：将培养好的斜面，在无菌条件下接种于种子液体培养基中，在32～40℃条件下，静置培养14～18h，制得一级种子液；

（iv）扩大培养：以4-6％的接种量，将一级种子液接于种子液体培养基中，在32～40℃条件下，静置培养10～16h，制得二级种子液；

（v）发酵罐培养：以4-6％的接种量，将二级种子液接于液体发酵培养基中，于32～40℃条件下，静置培养16～24h；

（vi）当发酵液黏度达12000～15000cP 时，收集发酵液；发酵液经干燥处理后，即得菌剂；

步骤（iii）和步骤（iv）中，所述种子液体培养基的配方为：葡萄糖20 g/L、蛋白胨10 g/L、酵母膏5 g/L，使用时，调节pH至6.5～7.5；

步骤（ii）中，所述固体斜面培养基为在种子液体培养基中添加质量分数为1.5～2.0%的琼脂粉；

步骤（v）中，所述液体发酵培养基的配方为：葡萄糖20 g/L、蛋白胨10 g/L、酵母膏5 g/L，氯化钠5 g/L，使用时，调节pH至 6.5～7.5。

5.权利要求1所述的菌株和/或权利要求2所述的菌剂在制备防治肉鸡坏死性肠炎的微生态制剂中的应用。

6.一种用于预防和/或治疗肉鸡坏死性肠炎的微生态制剂，其特征在于，该微生态制剂以权利要求1所述的菌株和/或权利要求2所述的菌剂为有效成分。

7.如权利要求6所述的微生态制剂，其特征在于，该微生态制剂为枯草芽孢杆菌BLCC1-0155的菌剂与玉米淀粉载体复配而成，复配后的微生态制剂中枯草芽孢杆菌BLCC1-0155的活菌数大于或等于1×10⁸cfu/g。