CN113151364A

CN113151364A - 一种从鸡肠源唾液乳杆菌分离的抑菌活性物质及应用

Info

Publication number: CN113151364A
Application number: CN202110576236.XA
Authority: CN
Inventors: 杨勇军; 毛桥虹; 陈巍; 马轲
Original assignee: Jilin University
Current assignee: Jilin University
Priority date: 2021-05-26
Filing date: 2021-05-26
Publication date: 2021-07-23

Abstract

本发明公开了一种从鸡肠源唾液乳杆菌分离的抑菌活性物质及应用，公开了一种新的抑菌活性物质及分离纯化方法，该活性物质具有广谱抗菌作用，可以用于制备广谱抗菌药物，是一种安全、高效、绿色的天然抗生素替代品，适用于食品工业、畜牧养殖业、保障人类公共健康等领域。

Description

一种从鸡肠源唾液乳杆菌分离的抑菌活性物质及应用

技术领域

本发明公开了一种从鸡肠源唾液乳杆菌分离的抑菌活性物质，同时还公开了该抑菌活性物质在鸡白痢沙门菌感染模型中的应用，属于微生物技术领域。

背景技术

在大健康理念及家禽业产业化的背景下，对比抗生素的使用带来的种种问题，如细菌耐药性，抗生素残留等，需找安全、高效、绿色的天然抗生素替代品成为发展食品工业、畜牧养殖业、保障人类公共健康的时代趋势。目前，肠道菌群的研究已经成为生命科学、食品科学、卫生保健等众多领域的热点。通过肠道菌群来预防治疗一些疾病开始受到越来越多人的认可，菌群通过直接接触、分泌代谢产物与宿主肠道形成交互网络，构成一个复杂的微生态系统。

乳酸菌作为肠道中重要的优势菌群，国内外对其应用研究已经有很长时间，目前主要产品是益生菌膳食补充剂，益生菌制剂。现阶段已经从乳酸菌中分离出了几种具有潜在工业应用价值的细菌素，并对其进行了表征。但是目前只有乳链球菌素Nisin被批准为食品防腐剂，且Nisin对革兰氏阴性菌和真菌的抑制效果较弱。因此，分离鉴定到新的乳酸菌抑菌产物并对其进行详尽的基础研究和开发应用研究，对推动乳酸菌在疫病防治应用具有重要意义。

发明内容

本发明提供了一种从鸡肠源唾液乳杆菌中分离的抑菌活性物质及方法，为一种新的有广谱抗菌作用的物质。

本发明所述的一种鸡肠源唾乳杆菌的抑菌活性物质的制备方法，包括以下步骤：

1）将鸡肠源唾液乳杆菌按1%接种至MRS液体培养基中，37℃厌氧发酵48小时，8000rpm，4℃离心20分钟，上清经0.22μm滤膜过滤即得发酵液；

2）将上述发酵液与乙酸乙酯按1：2的比例混合，萃取3h，重复萃取两次，合并上层有机相，通过旋转蒸发除去乙酸乙酯，得到粗提物，用1/50原上清的体积加入甲醇复溶收集得到甲醇溶的粗提液；

3）将上述粗提活性物质用LH20凝胶过滤层析柱进行分离，所得即为抑菌活性物质粗提液；

4）将上述分离物质用制备型HPLC进行分离，所得即为抑菌活性物质；分子量为162.0467Da，分子式为C₇H₆N₄O。

本发明所述的一种从鸡肠源唾液乳杆菌分离的抑菌活性物质在制备广谱抗菌药物中的用途。

本发明所述的一种从鸡肠源唾液乳杆菌分离的抑菌活性物质在制备天然抗生素替代品中的用途。

一种药物制剂，以本发明所述的一种从鸡肠源唾液乳杆菌分离的抑菌活性物质为活性成分，同时含有一种或多种药学上可接受的载体物质和/或辅剂。

本发明的积极效果在于：

公开了一种新的抑菌活性物质及分离纯化方法，该活性物质具有广谱抗菌作用，可以用于制备广谱抗菌药物，是一种安全、高效、绿色的天然抗生素替代品，适用于食品工业、畜牧养殖业、保障人类公共健康等领域。

附图说明

图1为本发明培养时间对抑菌活性的影响；

图2为本发明pH对抑菌活性的影响；

图3 为本发明温度对抑菌活性的影响；

图4 为本发明酶处理对抑菌活性的影响；

图5 为本发明乙酸乙酯萃取各组分抑菌情况；

图6为本发明萃取优化后的抑菌情况；

图7 为本发明LH20凝胶过滤层析检测曲线；

图8为本发明过LH20凝胶柱后抑菌情况；

图9为本发明高效液相色谱谱图；

图10 本发明负离子模式总离子流色谱图；

图11 -1为本发明YPG35-A的一级质谱图；

图11-2为本发明二级质谱图；

图11-3为本发明抑菌活性图；

图12 为本发明健康评分图；

图13 为本发明生存曲线图；

图14 为本发明体重变化图；

图15 为本发明鸡白痢感染模型用YPG35-A 治疗3d的盲肠和肝脏的情况；

图16 为本发明鸡白痢感染模型用YPG35-A 治疗5d的盲肠和肝脏的情况；

图17 为本发明荷菌图。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域人员所熟知的常规手段。下述实施例中所使用的材料、试剂等如无特殊说明，均可从商业途径得到。本发明实施例采用了牛津杯琼脂扩散法检测抑菌活性。

实施例1

所述唾液乳杆菌抑菌活性物质的分离鉴定及应用：

材料与设备：

菌种来源：本实施例中所使用菌种来源于5月龄三黄鸡盲肠肠道，实验室保存，三黄鸡购自吉林省长春市绿园区四季青市场；

抑菌试验所用指示菌为本实验室保藏的鸡白痢沙门氏菌（Salmonella Pullorum）ATCC19945；

MRS培养基购自青岛海博生物，称取52.24g粉末，加热溶解于1000mL蒸馏水中，固体培养基添加1.5%琼脂，118℃高压灭菌15分钟即得；

LB培养基：蛋白胨，10g、酵母提取物，5g、氯化钠，10g，加热溶解于1000mL蒸馏水中，固体培养基添加1.5%琼脂，121℃高压灭菌15分钟即得。

实验方法：

菌产生抑菌活性物质的性质研究

1.培养时间对抑菌活性物质的影响

1)将YPG35菌株活化两代后，以1%（v/v）接种量接种于MRS液体培养基中，37℃厌氧培养至对数生长期；

2)调节YPG35菌液浓度至10⁹CFU/mL，按1%（v/v）接种量接种于MRS液体培养基中，37℃厌氧培养；

3)每隔12h收集菌液，离心除去菌体得到无细胞发酵上清液，4℃保存，备用；

4)牛津杯法检测各时间发酵液抑菌活性；

2.PH值对抑菌活性物质的影响

1)确定最佳发酵时间后，记录发酵液原始pH；

2)用1mol/L盐酸和NaOH溶液分别调节发酵液pH至2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0；

3)牛津杯法测定处理后的发酵液抑菌活性；

3.温度对抑菌活性物质的影响

1)将发酵液在60℃、80℃、100℃条件下分别水浴加热1h，及在121℃加热20min；

2)将发酵液在-80℃与室温（25℃）反复冻融3次；

3)牛津杯法测定处理后发酵液抑菌活性，以未经热处理的发酵液作为对照；

4.酶处理对抑菌活性物质的影响

1)用1mol/L盐酸和NaOH溶液分别调节发酵液pH至3.0（胃蛋白酶最适pH）和7.0(其他酶最适pH)；

2)分别加入胃蛋白酶和过氧化氢酶、淀粉酶、脂肪酶、胰蛋白酶、蛋白酶K至终浓度1mg/mL，37℃水浴2h，将pH调回初始值；

3)牛津杯法测定处理后发酵液抑菌活性，以未加酶相同pH处理的发酵液作为对照；

结果可知该抑菌活性物质稳定性较好，耐热，耐酶，酸性条件下活性更强。

根据上述方法对抑菌物质的性质进行大致的了解，通过培养时间对抑菌活性的影响见附图图1，温度对抑菌活性的影响结果见附图图2，pH对抑菌活性影响结果见附图图3，酶对抑菌活性的影响结果见附图图4。结果可知该抑菌活性物质稳定性较好，耐热，耐酶，酸性条件下活性更强。

乙酸乙酯粗提制备：

1.无菌发酵上清制备：4℃离心，8000rpm/min离心20min，取上清用0.22um的滤器过滤；

2.乙酸乙酯粗提过程：上清与乙酸乙酯按1：1的比例混合均匀，萃取3h，收集上层有机相，通过旋转蒸发除去乙酸乙酯，得到粗提物，用1/50原上清的体积加入甲醇复溶收集得到甲醇溶的粗提液；对乙酸乙酯萃取的各部分进行抑菌活性的检测；如萃取后水相，蒸发水相，有机相层，蒸发有机相层，原上清和乙酸乙酯为对照，鸡白痢沙门菌为指示菌，牛津杯平板抑菌实验，37℃培养16-24h后观察抑菌圈大小，各组分的抑菌结果见附图图5；

3.由图5可知乙酸乙酯萃取确实可以提取出上清中的抑菌组分，但是萃取一次的水相仍具有抑菌活性，而乙酸乙酯溶剂单独不会产生抑菌作用，对乙酸乙酯的萃取进行比例和时间上的优化后得到以下最适方法：

上清与乙酸乙酯按1：2的比例混合均匀，萃取3h，重复萃取两次，合并上层有机相，通过旋转蒸发除去乙酸乙酯，得到粗提物，用1/50原上清的体积加入甲醇复溶收集得到甲醇复溶液。优化后的抑菌情况见附图图6。

凝胶过滤纯化

甲醇复溶液通过SephadexLH20凝胶过滤层析进一步纯化，具体方法如下：

1)SephadexLH20葡聚糖凝胶预处理：

在室温条件下，将Sephadex LH20凝胶干粉浸泡于蒸馏水中过夜，充分搅拌以保证凝胶溶胀，凝胶体积不在变化为止；

2)装柱：

将溶胀好的凝胶根据装柱要求一次性置入柱内，注意保持湿态装柱，并避免柱子内部产生气泡或断层。装柱要均匀，要在凝胶耐受的操作压下装柱，装好的凝胶柱可以检测柱效；

3)平衡：

上样前用平衡液平衡层析柱至少3-5个柱体积（流出液的pH值等于上柱的Buffer的pH值）；

4)上样：

上样时需要等待洗脱液流至刚好露出凝胶表平面（表现为胶状平面，没有明显液体），用1mL移液器吸取样品，垂直于凝胶表面，缓慢滴入，注意每滴一滴轻度移动枪头，保证样品均匀平铺在凝胶表面；切勿快速加入导致凝胶表面出现坑洼，导致分离效果有差异；

5)洗脱：

使用甲醇进行洗脱，上样后，静置等待样品液面完全渗入凝胶，贴壁缓慢加入洗脱液，直至洗脱结束；

6)收集样品及检测：

用4mL tube收集流出组分，采用分光光度仪检测230nm的吸光度，检测曲线见附图图7所示；

7)收集样品旋蒸浓缩：

将凝胶过滤后的样品收集后进行抑菌检测，抑菌情况见附图图8，对有抑菌作用的组分进行合并、旋转蒸发浓缩。

抑菌物质的终纯化-HPLC制备

采用制备型高效液相色谱对凝胶过滤层析复溶液进行纯化，参数如下：

1)色谱柱温：室温（25℃）；

2)检测波长：214、230、280nm；

3)流动相A：0.1%TFA水溶液；

4)流动相B：乙腈；

5)洗脱条件：双流动相动态洗脱；

6)流速：10mL/min；

7)上样量：5mL/次；

8)采用手动收集样品，检测器出峰后立刻收集；

9)样品收集后冻干，再将冻干样品称重，复溶于ddH2O配成固定的浓度，测定各组分抑菌活性。

采用高效液相色谱对制备型高效液相色谱组分进行纯度鉴定，参数如下：

1)色谱柱温：室温（25℃）；

2)检测波长：214nm；

3)流动相A：0.1%TFA水溶液；

4)流动相B：乙腈；

5)洗脱条件：双流动相动态洗脱；

6)上样量：10μL/次。

物质鉴定

将纯化制备后的活性峰达到纯度大于85%，纯度检测见高效液相色谱分析结果图附图图9，送往上海微谱化工技术服务有限公司进行高效液相色谱-四极杆飞行时间质谱法的鉴定。

实验条件: 仪器型号：Agilent1290-6545，色谱条件：Agilent ZORBAX RX-C18色谱柱（150 mm×2.1 mm，5μm）；流动相A：水；流动相B: 乙腈，流速：0.4 mL/min；梯度条件：0~1 min 10%B→5 ~8min90%B→8.5~10 min 10%B；柱温：35℃；进样量：2μL。

质谱条件：质谱仪：Agilent6545B MS Q-TOF；离子源（Dual AJS ESI），正离子全扫描方式，MS1扫描范围：50-2000m/z；雾化气：35psig；干燥气温度：320℃；干燥速率：10L/min；鞘气温度：350℃；鞘气流速：11L/min；喷嘴电压500v；碰撞解离电压80v；扫描范围100-1000m/z；采集速率：2spectra/s。

结果：

本发明得到一个分子量为162.0467Da，分子式为C₇H₆N₄O的小分子化合物，结果见附图图10，图11-1，图11-2，图11-3上所示，根据文献中唾液乳杆菌代谢产物的研究，未看见有性质相似，大小差不多的抑菌物质的报道。从其他乳酸菌中已知鼠李糖乳杆菌LS-8分离到一个新型抗菌物质，分子式为C₆H₁₁N₃O₂，该物质的特点也是具有耐热性好，耐酶，酸性条件下活性强。所以根据文献的对比研究，推测本发明鉴定的物质可能是类似于这个已知的新型抑菌物质，但是分子量更小；组成元素也相似，性质表现上相同可能都是小分子类物质有关。

抑菌物质的应用

分离鉴定的物质YPG-A在体外对鸡白痢沙门菌有较强的抑制作用，最小抑菌浓度为0.3mg/ml，根据这个进行在体动物的验证是否还有作用。

实验动物：1日龄海兰褐色蛋鸡（鸡白痢净化的鸡场）；

实验材料:小鸡配合饲料-正大510（适合0-21日龄）5kg/袋；

SS琼脂-青岛海博生物 HB4089；恩诺沙星可溶性粉末-规格10%，100g/袋，长春昌泰兽药店；一次性1ml注射器，饮水采食盒；

实验方法

1、1日龄雏鸡正常饲养至3日龄开始实验，攻菌前禁食12h；

2、准备鸡白痢沙门菌液：取-80℃LB甘油冻存菌，活化后按1%接种于2管3ml的试管中，37℃，摇床200rpm/min，培养4h到达生长对数期，以LB培养基为空白测菌液OD600的读数后，用无菌PBS洗两遍后，调节菌量为1x10⁹CFU/ml；

攻菌剂量参考论文中的1x10⁸cfu、1x10⁷cfu、1x10⁶cfu /只，进行预实验，选择用1x10⁸cfu/只，出现鸡白痢症状，24h后状态低落，达到治疗的模型要求。

实验分组如表1：

表1实验分组

3.准备SS琼脂，用于鸡白痢沙门菌荷菌计算涂板，使用方法，63.5g/L,蒸馏水溶解后加热煮沸（对于500nl培养基需微波炉高火加热6min，培养基从混浊变成透明状态，紫红色），冷却至40-50℃即可倒板；

4.实验前对每组的鸡进行体重称量记录，每日记录各组体重情况，结果见图14；

5.健康状况评价：每日定时观察各组的状态进行评分，死亡记0分，蹲伏地面，停止进食，濒死记1分，双目紧闭，形态异常，糊肛记2分，精神不济，进食减少，发育不良记3分，怕冷抱团，活动减少记4分，基本健康，活动饮食均正常记5分；结果见附图图12；

6.肠道细菌数量测定，于实验1，3，5，7d，收集各组粪便2g，无菌PBS进行1000倍稀释后进行SS琼脂培养基计数；

7.治疗7d结束后，观察各组雏鸡的心脏，肝脏，盲肠病理变化，结果见附图图15、16；

8.统计治愈数量，计算治愈率，结果见附图图13。标准：鸡白痢典型症状减轻，肠道含菌量下降；

9.治疗3d、5d、7d随机取3只鸡，对肝，盲肠进行研磨，测细菌数/每克组织；荷菌图见附图图17；

10. 对实验期间死亡的鸡及时解剖，观察记录病变情况。

Claims

1.一种从鸡肠源唾液乳杆菌分离的抑菌活性物质，其特征在于是通过以下方法制备的：

2.如权利要求1所述一种从鸡肠源唾液乳杆菌分离的抑菌活性物质的制备方法，包括以下步骤：

4）将上述分离物质用制备型HPLC进行分离，所得即为抑菌活性物质。

3.如权利要求1所述的一种从鸡肠源唾液乳杆菌分离的抑菌活性物质在制备广谱抗菌药物中的用途。

4.如权利要求1所述的一种从鸡肠源唾液乳杆菌分离的抑菌活性物质在制备天然抗生素替代品中的用途。

5.一种药物制剂，其特征在于以权利要求1所述的一种从鸡肠源唾液乳杆菌分离的抑菌活性物质为活性成分，同时含有一种或多种药学上可接受的载体物质和/或辅剂。