KR101673450B1 - 콜레스테롤 저하 효과를 가진 Pediococcus pentosaceus KID7 균주 포함 생균제 조성물 - Google Patents
콜레스테롤 저하 효과를 가진 Pediococcus pentosaceus KID7 균주 포함 생균제 조성물 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 항미생물 물질과 호스트의 콜레스테롤을 저하시키는 효과를 갖는 유산균 및 이를 함유하는 생균제 조성물에 관한 것이다. 본 발명에서는 자연 발효된 손가락 수수(Eleusine coracana)죽에서 유래된 균주 Pediococcus pentosaceus KID7 (Pediococcus pentosaceus KID7, KCTC 번호 18308P)이 분리, 동정되었다.
또한 본 발명에서는 이들을 이용한 생균제 조성물의 다양한 섭취 방법이 제공되고 이러한 섭취를 통해 조성물은, 고지혈증 유도 마우스에 경구 투여하였을 경우 혈중 총 콜레스테롤을 20% 저하시키고 혈중 LDL-콜레스테롤을 30% 저하시키는 효과를 가지므로 고지혈증에 대한 예방과 치료에 이용될 수 있고, 장내 유해균 성장을 막으므로 장질환 예방과 치료에 이용될 수 있다.
또한 본 발명에서는 이들을 이용한 생균제 조성물의 다양한 섭취 방법이 제공되고 이러한 섭취를 통해 조성물은, 고지혈증 유도 마우스에 경구 투여하였을 경우 혈중 총 콜레스테롤을 20% 저하시키고 혈중 LDL-콜레스테롤을 30% 저하시키는 효과를 가지므로 고지혈증에 대한 예방과 치료에 이용될 수 있고, 장내 유해균 성장을 막으므로 장질환 예방과 치료에 이용될 수 있다.
Description
본 발명은 콜레스테롤 저하 효과 및 장내 유해균 증식 방지를 통한 이로운 효과를 얻기 위해 사용될 수 있는 Pediococcus pentosaceus KID7 균주(KCTC 18308P)를 포함하는 생균제 조성물에 관한 것으로 더욱 자세하게는 손가락 수수(Eleusine coracana)죽으로부터 Pediococcus pentosaceus 중에서 KID7 균주(KCTC 18308P)를 분리 동정하고 이 균주를 사용한 생균제 조성물을 제조하고 이를 이용하여 콜레스테롤 저하 효과 및 장내 유해균 증식 방지를 통한 지사제 효과 등 이로운 효과를 얻는 방법에 관한 것이다.
유산균(Lactic Acid Bactria, LAB)은 사람이나 동물의 장내에 자연적으로 존재하는 미생물 종류 중 하나로서 호스트의 미생물 균형을 유지하면서 다양한 이로운 효과를 주는 역할을 하고 있다. 유산균이 호스트에게 주는 이로운 효과에는, 이로운 미생물들의 비율을 높여서 소화관 내의 미생물 균형을 유지하는 효과, 면역 조절 활성 효과, 병원균의 억제 효과, 저콜레스테롤혈증 효과, 여성의 비뇨생식기 감염 방지 효과, 설사 방지 효과가 있다. 또한 염증, 류마티스, 알레르기, 유당과민증, HIV 감염 또는 면역 결핍증, 간 질환, 과민성 대장 증후군, 신생아 괴사성 장염, 결장암, 소아 자폐증 등 다양한 질환들의 개선을 위해 사용될 수 있다[Critchfield, J.W., van Hemert, S., Ash, M., Mulder, L., Ashwood, P., 2011. The potential role of probiotics in the management of childhood autism spectrum disorders. Gastroenterology research and practice, 1-8.].
유산균은 사람이나 가축의 삶의 질을 개선할 잠재력을 가지고 있으며, 이러한 유산균의 효과가 생체내에서 나타나기 위해서는 유산균이 장내에서 오랜 시간동안 살아남아야 한다. 그러므로 장에 의해 빠르게 제거되지 않는 능력을 가져서 생균제로 사용될 수 있는 유산균 스트레인을 분리 동정하는 것이 중요하다. 생균제로 효과적인 유산균은 위에서 사멸되지 않고 통과하여 장에서 생존하여 잠시 동안이라도 장내 상피에 부착하여 군집을 형성할 수 있어야 한다. 결과적으로 점막에 더 잘 부착하는 능력을 갖는 유산균은 균의 군집이 더 잘 유지되고 오래동안 장내에 존재할 수 있게 되어 그렇지 않은 유산균에 비해 장점을 가지게 된다 [Salminen, S. et al., (1996) Clinical uses of probiotics for stabilizing the gut mucosal barrier: successful strains and future challenges. Antonie Van Leeuwenhoek 70:347-358].
유산균은 포유류의 위와 장에서 다양한 메카니즘을 통해 장내에서 군집을 형성하여 살 수 있다. 예를 들어, 몇 종류의 세균은 다양한 서브-상피 매트릭스 단백질이나 장내 점막의 특정 리셉터에 부착할 수 있다. 어떤 세균은 세균 표면과 호스트 세포 표면의 탄수화물과 단백질 요소의 복합작용으로 포유류의 장내 세포에 부착할 수 있다. 부착 메카니즘이 무엇이든 부착되어 장내에 성공적으로 군집을 이룬 유산균은 생균제 효과를 보인다[Greene, J. D., Klaenhammer, T. R. (1994) Factors involved in adherence of lactobacilli to human Caco-2 cells. Appl Environ Microbiol 60:4487-4494].
고지혈증은 높은 농도의 콜레스테롤이 혈액에서 유지되는 현상이다[Durrington, P (2003). Dyslipidaemia. 362: 717-31]. 콜레스테롤은 동물의 지질 중에서 중요한 종류의 분자로서 스테로이드 호르몬, 담즙산 및 비타민 D의 전구체이다. 콜레스테롤은 물에 녹지 않기 때문에 혈장에서 단백질과 복합체(lipoprotein)를 이루어 전송된다. 이 복합체는 지질단백질인데 밀도에 따라 VLDL(very low density lipoprotein), IDL(intermediate density lipoprotein), LDL(low density lipoprotein) 및 HDL(high density lipoprotein)로 구분된다[Biggerstaff KD, Wooten JS (2004). Understanding lipoproteins as transporters of cholesterol and other lipids. Adv Physiol Educ 28: 105-6].
LDL-콜레스테롤의 농도가 증가하면 동맥경화나 관상동맥 심장질환의 위험이 높아진다. 반대로 HDL 콜레스테롤의 농도가 증가하면 동맥경화나 관상동맥 심장질환의 위험이 낮아진다. HDL이 아닌 콜레스테롤과 LDL의 농도가 증가하는 이유는, 섭취 식품, 비만, 유전적 요인(예를 들어, LDL 수용체 변이로 인한 유전적 고지혈증 환자), 당뇨병 및 갑상선 기능부진 등의 결과로 보인다.
한편 항생제의 남용은 사람과 동물에서 항생제 내성을 기른다. 그리하여 질병의 치료를 점점 힘들게 만든다. 내성이 빠르게 증가하는 이유는, 동물의 사육과정에서 과잉 사육으로 인한 유해균 감염을 막기 위해 무차별로 항생제를 사용하기 때문이다. 그 결과 동물에서 유래한 고기와 우유에 항생제 잔류물이 남게 되고, 이를 사람이 섭취하여 결국 항생제가 축적되는 것이다. 유해균이 지속적으로 낮은 농도의 항생제에 노출되면 내성을 획득하게 된다. 따라서 여러 약에 대해 내성을 가진 새로운 유해균 균주의 출현 가능성이 점점 높아진다. 결국 동물 사육 과정에서 항생제 사용은 금지되고 있는데, 이 결과 가금류의 장내세균 감염이 늘어나고 동물 사육의 생산성이 줄어들게 된다.
생균제는 항생제의 대체제가 되어, 사람과 동물 체내의 유해균을 조절하는 역할을 할 수 있다. 몇몇 미생물은 젖산이나 박테리오신(bacteriocin)같은 항미생물 물질을 생산하여 유해한 미생물의 성장을 저해하는 생균제 역할을 한다. 최근의 연구는 이러한 생균제 미생물을 포함하는 음식물과 첨가물을 섭취하는 것이 체내 유해균으로 인한 질병을 예방하고 실질적으로 치료하는 방법이라고 밝히고 있다.
이러한 생균제 미생물의 이로운 특성을 이용하기 위해, 인간 및 동물의 소화관이나 전통적인 발효식품에서 효과적인 미생물을 스크리닝하는 것이 중요하다. 이렇게 분리된 미생물은 in vitro와 in vivo 환경에서 다양한 생균제 활성이 종합적으로 연구되어야 한다. 선택된 미생물은 생산과정, 저장, 소화관 통과 과정에서 안정적이어서 장내까지 의미있는 양의 생균제 미생물이 전달될 수 있도록 만들어져야 한다.
본 발명에서는 새로운 균주인 P. pentosaceus KID7(KCTC 18308P, 이하에서 줄여서 KID7 균주)을 분리하였다. 새로운 균주인 KID7은 자연 발효된 손가락 수수(Eleusine coracana)죽에서 분리되었으며, 숙주의 콜레스테롤 수치를 저하시키는 활성 등 균주의 특성을 밝히고 미생물자원센터(Korean Collection for Type Cultures)에 기탁하여 발명을 완성하였다. 또한 KID7 균주의 활성을 살리고 의학적으로 효과적인 양의 미생물을 장내까지 전달할 수 있는 제형을 발명하였다.
본 발명의 목적은 사람과 동물의 체내 유해균의 성장을 막고 콜레스테롤 저하 효과를 가지는 새로운 유산균 균주를 분리 동정하고 그 균주를 사용한 생균제 조성물을 제공함에 있다.
또한, 본 발명은 생균제 조성물을 이용하여 콜레스테롤 저하 효과 및 장내 유해균 증식 방지를 통한 지사제 효과 등 이로운 효과를 얻는 방법을 제공함에 있다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 자연 발효된 손가락 수수(Eleusine coracana)죽으로부터 분리된 페디오코쿠스 펜토사세우스 KID7 (Pediococcus pentosaceus KID7, KCTC 18308P) 균주를 제공한다.
상기 페디오코쿠스 펜토사세우스 KID7 (Pediococcus pentosaceus KID7, KCTC 18308P) 균주는 (a) 용혈(hemolytic)현상이 없고, 바이오아민(bio-amine)을 만들지 않고, 뮤신(mucin) 분해를 하지 않아 인체에 유해성이 없으며, (b) 구강부터 장에 이르는 소화관을 통과하여 장내 상피세포층에 콜로니(colony)를 형성할 수 있으며, (c) 인간과 동물 및 식품에 존재하는 유해균에 대한 항미생물 물질인 페디오신(Pediocin) 또는 젖산을 생산하여 유해균의 생육을 억제하는 활성을 보유하며, (d) 숙주(host)의 콜레스테롤 수치를 저하시키며, (e) 타우로콜릭산(Taurocholic acid), 타우로디옥시콜릭산(Taurodeoxycholic acid) 및 글리코콜릭산(glycocholic acid)으로 구성된 군 중에서 선택된 하나 이상의 산의 혼합물인 담즙산을 디컨쥬게이트(deconjugate)시킬 수 있어서 내담즙산성을 보유하며, (f) Shigella boydii KACC 10792, Salmonella choleraesuis KCTC 2932 및 Yersinia enterocolitica KACC 15320로 구성된 군 중에서 선택된 하나 이상의 유해균에 대해 공동응집(coaggregation)을 일으키는 활성을 보유하는 특징을 갖는다.
상기 페디오코쿠스 펜토사세우스 KID7 (Pediococcus pentosaceus KID7, KCTC 18308P) 균주를 1.0 X 109내지 1.0 X 1011cfu/g으로 포함하는 균주 분말이 포함된 생균제 조성물을 제공한다.
또한 본 발명은 상기 생균제 조성물에 당알콜(sugar alcohol), 이당류, 다당류 및 단백질로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 구성요소를 더 포함하는 생균제 조성물을 제공한다.
상기 당알콜은 마니톨(mannitol)인 것을 특징으로 한다.
상기 이당류는 트레할로스(trehalose)인 것을 특징으로 한다.
상기 다당류는 갈락토마난(galactomannan)인 것을 특징으로 한다.
상기 단백질은 대두 추출 단백질인 것을 특징으로 한다.
일 실시예에 따르면, 본 발명은 페디오코쿠스 펜토사세우스 KID7 (Pediococcus pentosaceus KID7, KCTC 18308P) 균주 분말 3 내지 15 중량%, 당알콜 15 내지 40 중량%, 이당류 15 내지 40 중량%, 다당류 15 내지 40 중량%, 단백질 5 내지 30 중량%로 이루어진 생균제 조성물을 제공한다. 각 구성요소의 합은 100 중량%이다.
본 발명은 상기 생균제 조성물을 포함하는 건강기능식품을 제공한다.
본 발명은 상기 생균제 조성물을 포함하는 기능성음료를 제공한다.
본 발명은 페디오코쿠스 펜토사세우스 KID7 (Pediococcus pentosaceus KID7, KCTC 18308P) 균주를 포함하는 설사, 장염, 위장관염, 복통 및 식중독으로 이루어진 군으로부터 선택되는, 장내 유해균으로 인한 질환의 치료 또는 예방용 조성물을 제공한다.
본 발명은 상기 생균제 조성물을 포함하는 동물 사료를 제공한다.
본 발명은 상기 생균제 조성물을 그대로 또는 사료에 첨가하여 동물에 급여함으로써 동물 장내 유해균의 생육을 억제하여 유해균으로 인한 질환을 예방하거나 치료하는 방법을 제공한다.
상기와 같은 본 발명에 따르면, 자연 발효된 손가락 수수(Eleusine coracana)죽에서 유래된 균주 Pediococcus pentosaceus KID7 (Pediococcus pentosaceus KID7, KCTC 번호 18308P) 및 이 균주를 포함하는 생균제 조성물을 제공하는 효과가 있다.
또한, 본 발명에 따른 Pediococcus pentosaceus KID7 균주를 포함하는 생균제 조성물은 고지혈증 유도 마우스에 경구 투여하였을 경우 혈중 총 콜레스테롤을 20% 저하시키고 혈중 LDL-콜레스테롤을 30% 저하시키는 효과 및 유해균으로 인한 사람 및 동물의 장 질환을 예방 또는 치료하는 효과가 있다.
도 1은 Pediococcus pentosaceus strain KID7 균주에 대해 In vitro에서 실험한 안전성 측정 결과도.
도 2는 KID7 균주의 형태적 특성과 표현형 특성을 P. pentasaceous KACC12311 균주와 비교한 비교도.
도 3은 KID7 균주의 16s rDNA 서열로 정한 계통분류학적 트리.
도 4는 KID7 균주의 항미생물 효능도.
도 5는 Prussian Blue 배지상에서 수행한 과산화수소 발생 시험 결과도.
도 6은 Pediocin 오페론의 유전자의 PCR 결과물을 1% Agarose 젤에 전기영동시킨 모습.
도 7은 KID7 균주가 구강에서 위를 거쳐 장에 이르기까지 생존하는 정도.
도 8은 KID7 균주의 담즙산염 하이드롤라제 활성 비교도.
도 9는 KID7 균주의 콜레스테롤 저하 활성 비교도.
도 10는 KID7 균주와 다른 비교 균주의 Caco-2 세포층 부착능력 비교도.
도 11은 NaCl 농도에 따른 KID7 균주의 성장률 비교도.
도 12는 KID7 균주의 세포 표면 소수성 측정도.
도 13은 KID7 균주의 고지혈증 유도 마우스 모델에서의 혈중 콜레스테롤 저하 시험 결과도.
도 2는 KID7 균주의 형태적 특성과 표현형 특성을 P. pentasaceous KACC12311 균주와 비교한 비교도.
도 3은 KID7 균주의 16s rDNA 서열로 정한 계통분류학적 트리.
도 4는 KID7 균주의 항미생물 효능도.
도 5는 Prussian Blue 배지상에서 수행한 과산화수소 발생 시험 결과도.
도 6은 Pediocin 오페론의 유전자의 PCR 결과물을 1% Agarose 젤에 전기영동시킨 모습.
도 7은 KID7 균주가 구강에서 위를 거쳐 장에 이르기까지 생존하는 정도.
도 8은 KID7 균주의 담즙산염 하이드롤라제 활성 비교도.
도 9는 KID7 균주의 콜레스테롤 저하 활성 비교도.
도 10는 KID7 균주와 다른 비교 균주의 Caco-2 세포층 부착능력 비교도.
도 11은 NaCl 농도에 따른 KID7 균주의 성장률 비교도.
도 12는 KID7 균주의 세포 표면 소수성 측정도.
도 13은 KID7 균주의 고지혈증 유도 마우스 모델에서의 혈중 콜레스테롤 저하 시험 결과도.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
일 관점에서 본 발명은 자연 발효된 손가락 수수(Eleusine coracana)죽으로부터 분리된 페디오코쿠스 펜토사세우스 KID7 (Pediococcus pentosaceus KID7, KCTC 18308P) 균주를 제공한다.
본 발명의 상기 페디오코쿠스 펜토사세우스 KID7 (Pediococcus pentosaceus KID7, KCTC 18308P) 균주는 (a) 용혈(hemolytic)현상이 없고, 바이오아민(bio-amine)을 만들지 않고, 뮤신(mucin) 분해를 하지 않아 인체에 유해성이 없으며, (b) 구강부터 장에 이르는 소화관을 통과하여 장내 상피세포층에 콜로니(colony)를 형성할 수 있으며, (c) 인간과 동물 및 식품에 존재하는 유해균에 대한 항미생물 물질인 페디오신(Pediocin) 또는 젖산을 생산하여 유해균의 생육을 억제하는 활성을 보유하며, (d) 숙주(host)의 콜레스테롤 수치를 저하시키며, (e) 타우로콜릭산(Taurocholic acid), 타우로디옥시콜릭산(Taurodeoxycholic acid) 및 글리코콜릭산(glycocholic acid)으로 구성된 군 중에서 선택된 하나 이상의 산의 혼합물인 담즙산을 디컨쥬게이트(deconjugate)시킬 수 있어서 내담즙산성을 보유하며, (f) Shigella boydii KACC 10792, Salmonella choleraesuis KCTC 2932 및 Yersinia enterocolitica KACC 15320로 구성된 군 중에서 선택된 하나 이상의 유해균에 대해 공동응집(coaggregation)을 일으키는 활성을 보유하는 특징을 갖는다.
본 발명은 1그람(g) 당 109내지 1011 개수의 상기 페디오코쿠스 펜토사세우스 KID7 (Pediococcus pentosaceus KID7) 균주 분말이 포함된 생균제 조성물을 제공한다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 페디오코쿠스 펜토사세우스 KID7 (Pediococcus pentosaceus KID7) 균주의 특징 (d)에서 숙주의 콜레스테롤 수치를 저하시키는 것은 페디오코쿠스 펜토사세우스 KID7 (Pediococcus pentosaceus KID7, KCTC 18308P) 균주의 배양물을 고지혈증 유도 마우스모델에 경구 투여하였을 경우 혈 중 총 콜레스테롤을 20% 저하시키고 혈 중 LDL-콜레스테롤을 30% 저하시키는 것일 수 있다.
또 다른 관점에서, 본 발명은 페디오코쿠스 펜토사세우스 KID7 (Pediococcus pentosaceus KID7, KCTC 18308P) 균주 생균제 조성물에 당알콜(sugar alcohol), 이당류, 다당류 및 단백질로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 구성요소를 더 포함하는 생균제 조성물을 제공한다. 이 조성물을 캡슐에 담은 제형으로 만들 수 있다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 당알콜은 마니톨(mannitol)일 수 있다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 이당류는 트레할로스(trehalose)일 수 있다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 다당류는 갈락토마난(galactomannan)일 수 있다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 단백질은 대두 추출 단백질일 수 있다.
또 다른 관점에서, 본 발명은 페디오코쿠스 펜토사세우스 KID7 (Pediococcus pentosaceus KID7, KCTC 18308P) 균주 분말 3 내지 15 중량%, 당알콜 15 내지 40 중량%, 이당류 15 내지 40 중량%, 다당류 15 내지 40 중량%, 단백질 5 내지 30 중량%로 이루어진 생균제 조성물을 제공한다. 각 구성요소의 합은 100 중량%이다.
또한 본 발명은 Pediococcus pentosaceus strain KID7(KCTC 균주 번호 18308P)의 냉동건조를 통한 생균제 조성물 형성을 표준 방법을 이용해 수행한다.
또한 본 발명은 Pediococcus pentosaceus strain KID7(KCTC 균주 번호 18308P) 포함 젤 형태 생균제 조성물을 제공한다.
또한 본 발명은 젤라틴, 캡슐, 타블렛 또는 젤 형태로 섭취할 수 있는 Pediococcus pentosaceus strain KID7 조성물을 제공한다.
또 다른 관점에서, 본 발명은 상기 생균제 조성물을 포함하는 건강기능식품을 제공한다. 건강기능식품은 콜레스테롤 수준 저하 기능을 제공한다. 또한 유해균의 장내 증식을 저해하는 기능을 제공한다.
또 다른 관점에서, 본 발명은 상기 생균제 조성물을 포함하는 기능성음료를 제공한다. 기능성음료는 향미 증진제, 감미료, 점성 증진제 및 기타 식품 첨가물을 포함할 수 있다.
또 다른 관점에서, 본 발명은 페디오코쿠스 펜토사세우스 KID7 (Pediococcus pentosaceus KID7, KCTC 18308P) 균주를 포함하는 설사, 장염, 위장관염, 복통 및 식중독으로 이루어진 군으로부터 선택되는, 장내 유해균으로 인한 질환의 치료 또는 예방용 조성물을 제공한다.
또 다른 관점에서, 본 발명은 상기 생균제 조성물을 포함하는 동물 사료를 제공한다. 동물 사료는 향미 증진제, 점성 증진제 및 기타 식품 첨가물을 포함할 수 있다. 동물은 인간을 제외하며, 포유류 가축 및 가금류 가축을 포함한다.
또 다른 관점에서, 본 발명은 상기 생균제 조성물을 그대로 또는 사료에 첨가하여 동물에 급여함으로써 동물 장내 유해균의 생육을 억제하여 유해균으로 인한 질환을 예방하거나 치료하는 방법을 제공한다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.
실시예 1.
PEDIOCOCCUS PENTOSACEUS
STRAIN KID7의 분리 및 동정
1. 생균제 미생물 후보의 특성확인
본 발명의 생균제 미생물은 자연적으로 발효된 손가락 수수(Eleusine coracana)죽에서 분리되었다. 전통적 방식으로 발효된 손가락 수수(Eleusine coracana)죽은 적어도 30년간 안전하게 사람들이 소비해 왔으며, 이에 대한 생균제 미생물 분리과정은 세 가지 선택적 미생물 배지를 사용하여 미생물 분야에서 일반적인 기술을 사용하여 수행되었다. 유산균 선택 배지는 De Man Rogosa Sharpe (MRS) 배지(Difco) 및 GYP (Glucose Yeast extract Peptone) 배지를 포함한다. 유산균만이 이러한 특수 배지, 특히 GYP 배지에서 노란색 콜로니를 생성한다.
생균제 유산균 후보는 카탈라제 음성, 단발효성(homo-fermentative), 그람 양성, 포자 비생성, 낮은 pH 형성, 위산과 담즙에 대한 내성을 보였다. 모두 25개의 후보 미생물이 분리되어 생균제 미생물 후보가 되었으며, 다음 15가지 기준에 따라 특성이 확인되었다.
1) In vitro 안전도 측정. 예를 들어 용혈작용 여부, 바이오아민 형성 여부, 뮤신 분해 여부를 측정하였다. 생균제 후보 균주는 이러한 특성을 가지지 않아야 한다.
2) 구강에서 위를 거쳐 장까지 이동하는 동안의 내성
3) 장내의 엔테로사이트(enterocyte) 유사 Caco-2 세포 단일층에 부착할 수 있는 능력
4) 사람에게 해로운 미생물의 성장을 저해할 수 있는 능력
5) 동물에게 해로운 미생물의 성장을 저해할 수 있는 능력
6) 식품에 포함된 해로운 미생물의 성장을 저해할 수 있는 능력
7) 사람에게 사용되는 보통의 항생제에 의해 사멸되는 지 여부
8) 세포 표면의 특성
9) 과산화수소 생산 여부
10) 자가 군집형성 능력
11) 다른 유산균 또는 해로운 미생물과 함께 군집을 형성하는 능력
12) 담즙산 염(salt)을 디콘주게이트(deconjugate)시키는 활성
13) 콜레스테롤을 획득하고 낮추는 활성
14) 자유 담즙산과 콘주게이트된 담즙산염이 존재하는 상태에서 콜레스테롤을 획득하고 낮추는 활성
15) 다양한 염화나트륨 농도에 대한 내성
이러한 특성을 측정한 결과는 Pediococcus pentosaceus KACC 12311과 비교하여 아래 표 1과 같이 정리되었다.
가) 산과 담즙에 대한 내성 확인
카탈라제가 음성인 분리된 균주는 산과 담즙으로 인한 스트레스에 사멸한다. 균주를 MRS 액체 배지에서 24시간 배양하고, 세포를 원심분리하고 두 번 PBS용액(pH 7.2)으로 세척하여 회수하였다. pH2 버퍼용액에 이 세포를 3시간 동안 두어 산 내성을 확인하였다. 원심분리한 후 PBS용액으로 세척하여 회수하였다. 회수물을 세척하여 MRS 고체 배지에서 배양하였다. MRS 고체 배지는 37˚C 48시간동안 배양하였다. 동시에 카탈라제 음성 균주를 0.3% 담즙이 첨가된 MRS 고체 배지에서 37˚C 48시간 동안 배양하였다. 이 과정을 통해 산과 담즙에 대한 내성을 가진 균주가 선택되었다.
나) 안전성 측정
생체유래의 아민 형성, 뮤신 분해, 용혈 활성을 측정한다. 분리된 균주들은 이러한 안전성 측정 시험을 거친다. 뮤신 분해는 돼지의 위에서 분리한 타입 3(Sigma, Korea) 뮤신을 이용한다. 생체유래 아민 생성은 Bover-Cid와 Holzapfel이 1999년 발표한 방법에 따라 측정하는데, 아미노산은 L-phenlyalanine, L-lysine, L-tyrptophan, L-tyrosine, L-argnine, L-ornithine, L-histidine이 사용된다. 뮤신 분해와 용혈 활성 측정은 Abe와 그의 동료들이 2010년 발표한 방법과 Zhou와 그의 동료들이 2001년 발표한 방법에 따라 측정되었다.
분리되어 선택된 KID7 균주에 대한 (도 1)의 In vitro 측정결과를 보면, (a)에서 KID7 균주를 다양한 아미노산이 추가된 decarboxylase 배지에서 배양한 결과를 보면, 바이오아민이 형성되지 않음을 알 수 있다. 포지티브 컨트롤은 ornithine과 arginine이 추가된 배지에서 바이오아민을 만드는 Enterococcus faecalis의 모습이다. (b)에서는 KID7 균주가 용혈현상을 보이 지 않는 것을 나타낸다. 포지티브 컨트롤은 Bacillus cereus KACC 11240 균주와 Streptococcus sp. TI23 균주이다. (c)에서는 KID7 균주가 뮤신 분해를 하지 않는다는 것을 나타낸다. 포지티브 컨트롤 균주는 Bacillus cereus KACC 11240와 Pseudomonas aeruginosa KCCM 11802이다.
다) 구강에서 위를 거쳐 장까지 이동(Oro-gastrointestinal transit) 측정
오로가스트로 인테스티날(Oro-gastrointestinal transit) 이동 내성 측정은, Bove와 그 동료들의 방법을 약간 변형하여 수행되었다. 측정 과정은, 구강 스트레스, 위 스트레스, 장 스트레스로 나뉠 수 있다.
분리된 균주를 위산 전해질 용액(150 mg/L 리소좀(Sigma-Aldrich) 첨가)에 10분간 두고, 그 다음으로 위산 전해질 용액(pH 2 내지 pH 3, 0.3% pepsin (Sigma-Aldrich) 첨가)에 30분간 두고, 마지막으로 장 전해질 용액(pH 7, 0.3% bile oxgall and 0.1% pancreatin (Sigma-Aldrich) 첨가)에 60분간 두어 스트레스를 겪게 한다. PBS 용액(pH 7.2)의 균주는 스트레스를 주지 않고 컨트롤로 삼아 추후 비교하였다. 스트레스 실험 각 단계마다 균주에서 샘플이 수집되어 즉시 분석되었다. 스트레스 받은 균주와 컨트롤 균주를 적당히 농도를 낮추어 MRS agar 배지에 배양하여, 콜로니 형성 유닛(CFU) 숫자를 계산하였다. 미생물의 생존성은 또한 LIVE/DEAD® BacLight™ bacterial viability kit를 사용하여 체크되었다.
(도 7)을 보면, (A)에서 구강부터 위를 거쳐 장에 이르는 과정에서 일어나는 스트레스를 구현한 LIVE/DEAD® BacLight 미생물 생존성 시험 키트를 사용하여 살아있는 세균과 죽거나/손상된 세균을 동정하였다. 초록색은 살아있는 세균을 나타내고 붉은색은 죽거나 손상된 세균을 나타낸다. (B)에서 세균의 회복률은 MRS 배지상에서의 CFU 숫자를 로그스케일로 계산하여 결정하였다.
라) 세포 표면 소수성 결정
유산균 균주의 세포 표면 소수성과 전자획득/공여 특성이 Valeriano 및 그의 동료들의 2014년 방법을 변형한 방법으로 결정되었다. 간단히, 2ml의 박테리아 배양액을 원심분리하여 세포 펠렛(pellet)을 세척하고 PBS 용액에 다시 녹인다. 처음의 흡수 스펙트럼은 600nm에서 측정되었다. 세균을 같은 부피의 용매(예를 들어 톨루엔, o-자일렌, n-헥사데칸, 클로로포름 및 에틸아세테이트)에 섞은 후 2분간 vortex하여 섞었다. 혼합물은 37℃에서 30분간 인큐베이트하였다. 낮은 페이즈에서의 흡수도 측정과 소수성 비율은 Valeriabno 및 그의 동료들의 2014년 방법에 따라 측정되었다.
그 결과로 해당 용매에 대한 부착성(Adherence) 값은 아래 표 2와 같이 정리되었다.
(도 12)를 보면, n-hexadecane, toluene and xylene 같은 유기용매를 사용하여 선택하여 분리된 KID7 균주에 대한 세포 표면 소수성값을 그래프로 도시하였다.
마) 자가 군집 및 다른 균주와의 군집 형성
자가 군집과 다른 균주와의 군집 형성능력은 Kos와 그의 동료의 방법(2003년)에 의해 수행되었다. 다른 균주와의 군집형성 능력 측정에서는 L. plantarum, L. rhamnosus, E. coli, 및 Staphylococcus aureus 등이 사용되었다.
그 결과로 KID7 strain의 공동응집 능력은 아래 표 3과 같이 정리되었다.
바) 항생제 감수성
항생제 감수성은 디스크 확산법에 의해 결정되었다. 100마이크로 그람의 각 항생제가 종이 디스크에 사전 로딩되어 사용되었다.
KID7은 또한 chloramphenicol, tetracycline, Lincomycin, Amikacin, Erythromycin, Streptomycin, paromomycin, penicillin, Ampicillin, Novobiocin, Rifampicin 및 Neomycin 같은 항생제에 내성을 갖지 않는 것이 확인되었다.
KID7 strain은 kanamycin B sulfate와 streptomycin sulfate에 대해서는 내성을 가진다. kanamycin B sulfate와 streptomycin sulfate는 둘 다 항생제 중에서 amino-glycoside 그룹에 속한다. 대부분의 유산균은 amino-glycoside 그룹 항생제에 저항성을 갖는다는 것이 알려져 있다(Catia M. Peres, et al., 2014; Ingo Klare, et al., 2007; J.S. Zhou, et al., 2005). 이러한 저항성은 유산균 자체 DNA에 있는 유전자에 의한 것이다(Ammor, et al., 2008; Ingo Klare, et al., 2007). 이러한 저항 유전자를 보유한 생균제를 섭취하면, 해당 항생제를 섭취할 때 장내 유산균 환경을 보존하기 쉽게 된다.
그 최종 결과로 KID7 strain의 항생제 감수성은 아래 표 4와 같이 정리되었다.
사) 항미생물 활성
균주의 항미생물 활성은 인간, 동물 및 음식의 유해미생물을 사용하여 결정하였다. 미생물 배양물을 거른 것을 원심진공증발기를 사용하여 10배로 농도를 높이고 나서 멸균시킨 증류수에 녹였다. 농축 배양물 거른 액체 100㎕를 8mm 종이 디스크에 로딩하여 건조시킨다. 종이 디스크를 유해균이 도포된 LB 한천 플레이트 상에 두어 18시간 동안 배양하여 저해 영역을 측정한다. 전체적인 측정은 재현성을 점검하기 위해 3배수로 수행되었다.
KID7 균주은 콜레스테롤 수치를 낮추며 해로운 균의 성장을 저해하는 항미생물 물질을 생산한다. 이러한 해로운 균에는 E. coli O138 KCTC 2615, E. coli O1 KCTC 2441, Salmonella typhi KCTC 2514, Salmonella choleraesuis KCTC 2932, Pseudomonas aeruginosa KCCM 11802, Yersinia enterocolitica subsp. enterocolitica KACC 15320, Listeria monocytogenes KACC 10764, Shigella boydii KACC 10792, Bacillus subtilis KSP12, Bacillus cereus KACC 11240, Staphylococcus aureus KCCM 11335, Staphylococcus epidermidis KCTC1917, Salmonella gallinarum KCTC 2931, and Methicillin- resistant Staphylococcus aureus KCCM 40510이 해당하고, 다른 장내 해로운 미생물도 해당할 수 있다.
그 결과로 KID7 strain의 항미생물 활성은 아래 표 5와 같이 정리되었다.
(도 4)를 보면, (A)는 사람과 동물의 각종 유해균에 대한 항미생물 활성을 나타낸다. (B)는 KID7 균주의 배양물 필터액의 효과를 나타낸다. KID7 균주는 다른 유산균을 저해하지 않음을 알 수 있다.
아) Pediocin 유전자의 PCR 증폭
Pediocin 유전자를 두 세트의 primer를 이용하여 증폭시켰다. 하나의 primer 세트는 PedF (5'-GGTAAGGCTACCACTTGCAT-3')와 PedR (5'-CTACTAACGCTT GGCTGGCA-3')이며(Suwanjinda와 그 동료들의 2007년 방법을 따름), 다른 primer 세트는 Ped-PA1-F (5'-TTGTGATGAAAAAAATTGAAAAATTA-3') 와 Ped-PA1-R (5'-GCATTTATGATTA CCTTGATGTCC-3')이다(Shin과 그 동료들의 2008년 방법을 따름). PCR 반응은 Maxime PCR PreMix 키트(Intron Biotechnology, Kyunggido, Korea)를 사용하여 0.5kb 이하의 PCR증폭 절차대로 수행하였다. PCR로 증폭시킨 결과물은 1%(w/v) agarose 젤(1X TAE buffer, pH 8)에 전기영동하여 PCR이 잘 수행되었는지 확인하였다. 젤의 PCR 결과물 밴드는 GFXTM PCR DNA와 젤 밴드 퓨리피케이션 키트(GE health care UK limited, UK)를 이용하여 용리시켰다. 서열정보는 BLAST로 탐색하였고, 확인을 위해 GenBank를 사용하였다.
(도 6)을 보면, M은 분자 마커이고, 1은 KID7 균주의 PCR 증폭 결과물, 2는 P. pentosaceus KACC 12311 균주의 PCR 증폭 결과물이다. KID7 균주는 P. pentosaceus KACC 12311 균주와 같이 Pediocin을 생산하여 항미생물 활성을 가짐을 알 수 있다.
자) Coco-2 세포 배양과 부착 측정
Coco-2 셀 라인은 KCTC에서 획득하였고, 지속적으로 MEM 고포도당 배지(Gibco)에서 배양되었다. MEM 고포도당 배지에는 20%(v/v)의 비활성화 FBS와 100유닛(U)의 페니실린-스트렙토마이신 항생제(10,000 U/ml)가 첨가되었다. 배양액을 37℃ 5% CO2 환경에서 인큐베이트하였다. 부착도 측정을 위해 39번째와 41번째 분열기 사이의 caco-2 셀 라인이 사용되었다. caco-2 세포들은 5 X 102 ml-1 농도로 12개의 세포배양 플레이트 웰에 로딩되어 3일간 인큐베이트되어 80%가 채워진 단일세포층을 형성하였다. 배지는 매일 교환되었고, 단일세포층의 caco-2 세포의 숫자를 결정하기 위해 세포를 0.25% trypsin EDTA(Gibco)용액으로 37℃에서 5분간 트립신화시킨 후, 헤마사이토미터로 숫자를 세었다.
유산균의 caco-2 세포에 대한 부착도는 Chauviere와 그의 동료들의 방법(1992년 )을 약간 변형 사용하여 결정하였다. 부착도 측정 전에 caco-2세포를 항생제가 없는 MEM 배지에서 2시간 동안 배양한다. 이 배양액을 0.5ml의 측정 대상 세균이 담긴 동일 부피 PBS 용액와 혼합하여 최종 세균 농도가 2 X 108 CFU ml-1이 되도록 하였다. 그리고 이 용액을 각 조직배양 플레이트 웰에 첨가하고 37℃ 5% CO2 환경에서 2시간 동안 인큐베이트하였다. 그 이후 단일세포층을 멸균한 PBS(pH7.2) 용액으로 2번 세척하고, 10% 포르말린 용액으로 고정시켰다. 크리스탈 바이올렛으로 염색하고 현미경하에서 관찰하였다. 각 부착도 측정 시험은 복수로 행해졌으며 부착된 세균의 숫자는 20번 현미경으로 측정되어 비율이 계산되었다.
(도 10)을 보면, (A)는 컨트롤, (B)는 P. pentasaceous strain KID7, (C)는 L. rhamnosus ATCC 53103 (D)는 L. plantarum 상업적 균주가 Caco-2 세포 단일층에 부착한 것을 사진으로 각각 보인 것이다. (E)는 부착된 비율을 그래프로 그린 것이다. 부착된 비율은 20개의 다른 현미경 영역에서 부착된 균주의 숫자를 구하여 계산하였다.
차) 담즙산염 하이드롤라제 활성
담즙산염 하이드롤라제 활성 측정은 TLC를 사용한다. 반응혼합물은 Guo와 그의 동료들의 2010년 방법을 약간 변형하여 준비하였다. MRS 반응 혼합물은 인산나트륨 버퍼(pH7.4) 용액에 5nM TDCA, GCA, TCA를 첨가하여 준비하였고, 37℃에서 16시간동안 인큐베이트하였다. 인큐베이션 후에 혼합물을 감압동결건조시키고 1ml의 메탄올에 녹였다. 1㎕의 샘플을 TLC(silica gel 60, 20 X 20 cm)위에 로딩하여 전개하였다. 전개시 이동상은 헥산:메틸에틸케톤:냉각된 아세트산을 부피비 56:36:8로 혼합한 용매를 이용(Chavez와 Krone의 1976년 실험법)하였다. 전개 후, 플레이트를 열풍으로 건조시키고 에탄올에 녹인 10% phosphomolybdic acid를 뿌린 후 뜨거운 오븐을 이용하여 110℃에서 10분간 가열한다. 이를 통해 자유 cholic acid와 deoxycholic acid를 검출할 수 있다.
(도 8)을 보면, (A)는 0.3% 담즙산이 첨가된 MRS 배지상에서 담즙산의 결정화 현상을 보인다. (B)는 MRS 액체 배지에서 배양한 KID7 균주의 담즙 디콘주게이팅(decnojugating) 활성을 측정하기 위해 자유 콜린산(cholic acid)에 대해 TLC 분석을 한 것이다. KID7 균주를 배양하는 MRS 액체 배지에는 콘주게이트된 다양한 담즙산염이 들어간다. 예를 들어, 5mM taurodeoxycholic acid, 5mM taurocholic acid, 5mM glycocholic acid가 있다. 비교 분석을 위해 마지막 레인에는 표준의 자유 담즙산과 콘주게이트된 담즙산의 혼합물을 적용하였다.
카) 유산균 균주의 콜레스테롤 저하 활성
콜레스테롤 저하 활성을 갖는 유산균 균주를 스크리닝하기 위해 콜레스테롤이 첨가된 MRS 액체배지를 준비하였다. 우선 MRS 액체배지를 준비하여 멸균시킨 후, 에탄올:Tween 80을 부피비 3:1로 혼합한 용액에 녹인 콜레스테롤(100㎍/ml, w/v)을 첨가하였다. MRS-콜레스테롤 액체 배지에 로그페이즈에 있는 세균배양액을 부피비 1%로 접종하였고 37℃에서 24시간 동안 미세호기(microaerophilic) 상태로 배양하였다. 배양 후 3000 rpm 4℃에서 10분간 원심분리하여 세포들을 회수하였으며 남은 배지의 콜레스테롤 농도는 BCS Total cholesterol kit(Bioclinical system, Seoul, South Korea)을 이용하여 효소적 방법으로 측정되었다. 비교 대상이 되는 컨트롤은 접종되지 않은 MRS-콜레스테롤 액체 배지를 사용하였다. 제거된 콜레스테롤 비율은 공식을 사용하여 계산되었다.
(도 9)는, 콜레스테롤이 포함된 MRS 액체배지에서 자유 콜린산(cholic acid)의 존재 여부에 따라, 담즙(소의 담즙)의 존재여부에 따라, KID7 균주의 콜레스테롤 저하 활성이 어떻게 변화하는 지 보인다. 자유 콜린산의 존재 여부에 따라서는 콜레스테롤 저하 활성에 별다른 변화가 보이지 않고, 담즙(소의 담즙)을 0.3%에서 0.5%로 증가시킨 결과 콜레스테롤 저하 활성이 72%에서 50%로 감소하였다.
타) 과산화수소 생산 여부 측정
(도 5)를 보면, (A)는 KID7 균주를 PB 배지에서 배양해서 색깔의 변화가 없음을 알 수 있다. 이는 KID7 균주에서 과산화수소를 만들지 않는다는 것을 나타낸다. (B)를 보면 P. pentasaceous KACC 12311 균주를 PB 배지에서 배양해서 색깔의 변화가 없음을 알 수 있다. 이는 P. pentasaceous KACC 12311 균주에서 과산화수소를 만들지 않는다는 것을 나타낸다. (C)를 보면 포지티브 컨트롤로 사용한 L. rhamnosus ATCC 53013 균주를 PB 배지에서 배양해서 푸른 색깔이 나타남을 알 수 있다. 이는 L. rhamnosus ATCC 53013 균주에서 과산화수소를 만든다는 것을 나타낸다.
파) 다양한 염화나트륨 농도에 대한 내성 측정
(도 11)을 보면, 염화나트륨의 농도 증가에 따라 KID7 균주의 생장비율이 변화하는 곡선이다. 염화나트륨이 전혀 없을 때의 생장비율을 100%로 하여 계산하였다. 이러한 생장 시험은 MRS 액체 배지를 사용하여 수행되었다.
2. 선택된 균주의 동정
가) Pediococcus pentosaceus KID7 균주의 동정
생균제 후보인 25개의 균주를 분석한 후, 위에서 동정된 모든 특성을 가진 하나의 균주를 선택하였다. 이 균주는 KID7으로 명명되었고, 최종적으로 16S rDNA 서열을 통해 Pediococcus pentosaceus로 식별되었고, 탄수화물 이용 양상, 성장 곡선 비율, 동결건조 특성, 재생 특성 및 향기(aroma/flavor) 양상으로부터 확인되었다.
분리된 KID7 균주는, 생균제로 만들어지기 위해, 생물학적으로 순수한 배양으로 유지되었다, 설명한 대로 생물학적으로 순수한 배양이란 고체 또는 준고체 배지 위에서 배양했을 때 하나의 동정 가능한 유기체에서 유래한 것을 말한다.
Pediococcus pentosaceus KID7 균주(또는 간단히 KID7 균주) 분말, 페이스트, 젤, 볼루스(bolus) 및 다른 생균제 조성물은 모두 생물학적으로 순수 배양된 것임을 염두에 두어야 한다.
나) 동정된 Pediococcus pentosaceus KID7 균주에 대한 생화학적 테스트
Strain KID7은 Gram 염색 및 현미경 관찰로 동정되었으며, API 50 CHL kit (Biomerieux S.A., La Balme les Grottes, France)을 사용하여 분리되었다. 이 균주는 P. pentasaceous KACC 12311 균주와 비교하여 49개 탄수화물 발효 반응을 포함하고 있다. 추가로, 단일/복합 발표 배지(HHD 배지)를 사용하여 발효 패턴이 동정되었다(McDonald 및 그의 동료들의 1987년 방법).
동정과 발효패턴에 대한 결과는 앞의 표 1에 나타나 있다.
균주의 DNA는 genomic DNA isolation kit (GeneALL, Seoul, South korea)를 사용하여 분리되었으며, 16S rRNA 유전자를 증폭시키기 위해 27F부터 1492R까지의 primer를 사용하고, 거의 전체 길이의 16S rRNA 시퀀싱을 하기 위해 27F부터 785F까지의 primer를 사용하여 PCR을 수행하였다. 얻어진 서열정보는 BLAST 프로그램을 사용하여 EzTaxon 데이터베이스에서 유사성을 탐색하였다. Clustral X를 사용하여 다수 균주의 연관관계 있는 서열을 배치하였고, MEGA 5 소프트웨어를 사용하여 이웃 종과의 진화관계 트리를 만들어, 진화적관계도를 완성하였다.
(도 2)를 보면, (A)는 KID7 균주와 P. pentasaceous KACC12311 균주의 SEM 전자현미경 사진이다. (B)는 api50 CHL 키트를 사용하여 탄수화물 발효 패턴을 KID7 균주와 P. pentasaceous KACC12311 균주에 대해 측정한 것이다. (C)는 X-gal이 첨가된 MRS 배지에서 KID7 균주와 P. pentasaceous KACC12311 균주를 배양한 결과 베타-갈락토시다제(β-galactosidase)의 활성을 나타낸다. (D)는 프로테아제 생산 배지에서 KID7 균주와 P. pentasaceous KACC12311 균주의 카제인 부분 분해 특성을 나타낸다. (E) HHD(Homo-and hetero- differential) 배지에서 homo-발효할 때 생성되는 초록색 콜로니를 나타낸다. KID7 균주와 P. pentasaceous KACC12311 균주가 이에 해당한다.
(도 3)을 보면, KID7 균주는 Pediococcus pentosaceus 와 99%의 유사성을 갖는 것을 알 수 있다.
KID7 균주를 ' Pediococcus pentosaceus KID7'으로 명명한 후, 2014년 7월 11일 한국생명공학연구원에 기탁하여 기탁번호 'KCTC18308P'를 부여받았다.
KID7 균주를 ' Pediococcus pentosaceus KID7'으로 명명한 후, 2014년 7월 11일 한국생명공학연구원에 기탁하여 기탁번호 'KCTC18308P'를 부여받았다.
실시예 2.
Pediococcus pentosaceus
strain KID7 조성물의 준비
대량의 Pediococcus pentosaceus strain KID7이 실시예의 사례대로 준비되었고, 발효미생물학 분야에서 당 업자에게 알려진 표준 발효과정을 거쳐 대량 생산되었다. 정제된 Pediococcus pentosaceus strain KID7은, 미세 분말, bolus 캡슐, 젤 및 건조시킨 동물 먹이 혼합물 등 아래에서 설명하는 다양한 전달방법으로 사용될 수 있다.
1. 냉동건조시킨 KID7 균주를 미세분말 형태로 준비
-80℃에 저장해 둔 Pediococcus pentosaceus strain KID7의 순수 배양물을 MRS 액체 배지에서 재생시킨다. 250ml 플라스크에서 100ml의 시드 배양물을 준비한다. 미생물의 순도는 발효 과정 중 정해진 시간(로그 페이즈를 통해 최종 사이클까지)에 모니터링 된다. 미생물 총량은 멸균된 원심분리기 용기를 사용하여 원심분리하여 수확된다. 그리고 수확된 미생물은, 트레할로스, 대두단백질 정제물, 마니톨 및 갈락토마난의 혼합물을 포함하는 전달체와 혼합한 후 냉동 건조된다. Pediococcus pentosaceus strain KID7은 냉동 건조 과정에서 수분이 2% 내지 4%가 된다. 냉동 건조된 KID7 정제물을 멸균된 장비를 이용해 미세 분말로 갈아서 미세 분말로 만든다. KID7 분말의 품질은 사용 전에 순도와 생존성으로 확인된다.
모든 과정은 통제된 환경에서 제한된 온도(22-28℃)와 제한된 습도(30-40%)에서 수행된다. 만들어진 분말(대략 1011 CFU/g Pediococcus)은 적당한 컨테이너에 제습 팩을 포함시키고 수증기에서 보호하는 장벽을 포함시키고 외부 공기를 막는 덮개로 막는다.
이하에서 "대략"이라는 말은, 대량의 물질을 재고 제조하는 과정에서 어쩔 수 없이 발생하는 에러를 포함하기 위한 용어로 사용되며 0.1 내지 0.5%의 에러 요소를 포함한다. 또한 모든 %는 중량%를 의미한다.
탄수화물이 조성물에 포함될 수 있는데, 당류 알콜, 이당류 및 다당류가 이에 해당하며, 트레할로스, 엿당, 설탕, 덱스트로스, 젓당, 이눌린, 리보오스, 맥아 덱스트린, 갈락토마난 및 그 유사체를 예로 들 수 있다. 하나의 사례로 이당류는 트레할로스 이수화물, 다당류는 갈락토마난, 단백질은 대두단백질 정제물을 들 수 있다. 적당한 단백질로 유장 단백질, 계란 알부민, 젤라틴, 우유 단백질 및 다른 동물과 식물 단백질을 들 수 있다.
본 발명의 Pediococcus pentosaceus KID7 생균제는 다음 표 6과 같은 중량비 구성 성분을 가질 수 있다.
2. Bolus 캡슐의 준비
KID7 세포의 바이오매스, 트레할로스 이수화물(음식용), 마니톨(음식용), Ceratonia siliqua(locust bean) 씨앗의 갈락토마난(음식용) 및 대두단백질 정제물(음식용)을 2%: 2%: 4%: 6%: 6%의 비율로 500 ml 물에 넣고 완전히 섞은 후 -20℃에서 12시간 동안 얼린다. 얼린 혼합물을 16시간 이상 동결건조시켜 수분 함량을 2 내지 4%로 줄인 동결건조분말로 만든다. 16시간은 건조를 위해 꼭 필요한 시간이다.
분말은 멸균된 그라인더를 사용하여 미세하게 만들어진다. 이렇게 만들어진 분말은 젤라틴 캡슐에 다음 표 7과 같은 혼합 사례와 같은 비율로 채워진다. KID7 bolus 캡슐은 실제 사용을 위해 순도와 유산균의 생존성이 시험된다.
3. 젤(Gel) 형태로 KID7 균주를 준비
KID7 세포 바이오매스를 트레할로스 이수화물, 마니톨, 갈락토마난 및 대두단백질 정제물을 아래 비율대로 넣어 분말로 만들고 이를 물에 녹여 젤로 만든다. 이 경우 KID7 외의 다른 물질들은 사용전에 멸균시킨다. KID7을 제외한 다른 구성물들은 500ml 물에 넣어 녹이고 121℃에서 15분간 오토클레이브하여 멸균시킨다. 만들어진 젤은 실온에서 냉각시키고 KID7 세포와 섞는다. 다음 표 8과 같은 혼합 사례와 같은 비율로 섞여진다. KID7 젤은 10ml 튜브에 넣어 사용된다.
모든 경우의 혼합 사례에서 KID7 균주의 농도는 최종산물 세포가 109내지 1011세포/g 농도가 될 수 있도록 맞춘다.
실시예3. KID7 균주의 고지혈증 유도 마우스 모델에서의 혈중 콜레스테롤 농도 저하능력 측정
1. 경구투여용 KID7 균주의 배양물 준비
-80℃에 저장해 둔 Pediococcus pentosaceus strain KID7의 순수 배양물을 MRS 액체 배지에서 재생시켰다. 250ml 플라스크에서 100ml의 시드 배양물을 준비하였다. 미생물의 순도는 발효 과정 중 정해진 시간(로그 페이즈를 거쳐 최종 사이클까지)에 모니터링 하였다. 미생물 총량은 멸균된 원심분리기 용기를 사용하여 원심분리하여 수확하였다. 대조균주인 Lactobacillus acidophilus의 배양물도 상기와 같은 방법으로 준비되었다.
2. 고지혈증 유도 마우스 모델에서의 혈중 콜레스테롤 개선효과 측정
하기 표 9와 같은 식이 조성으로 고지혈증 유도 식이를 공급하는 마우스모델을 확립하였다.
고지혈증 유도 식이를 4주간 투여한 후 정상 식이 군(125.25±4.75 mg/dL)과 고지혈증 유도 식이군(200.54±11.03 mg/dL)의 혈중 콜레스테롤 차이를 확인하였다. 대조군(NCD), 고지혈증 유발 마우스를 식이 조건에 따라 Con군(HCD만 투여), 생균 KID7을 함유하는 KID7군(HCD군에 KID7 3 X 106 cfu/kg인 생균 투여) 및 생균 L. acidophilus를 함유하는 L. ac군(HCD군에 L. acidophilus 3 X 106 cfu/kg인 생균 투여)으로 나누고 4주간 실험을 진행하였다. 유산균 섭취에 의한 혈 중 콜레스테롤량을 조사한 결과 Con군의 경우 200.54±11.03 mg/dL에서 KID7군은 160.93±10.83 mg/dL, L. ac군은 174.74±10.94 mg/dL로 KID7군과 L. ac군이 콜레스테롤 농도를 Con군 대비 20% 씩 유의적으로 감소시켰다(도 13 참조). 혈중 LDL-콜레스테롤량을 조사한 결과 Con군의 경우 82.79±5.0 mg/dL에서 KID7군은 51.21±11.68 mg/dL, L. ac군은 53.78±6.34 mg/dL로 KID7군과 L. ac군이 콜레스테롤 농도를 Con군 대비 30% 씩 유의적으로 감소시켰다(도 13 참조).
이상, 본 발명내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 실시태양일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의해 정의된다고 할 것이다.
Claims (13)
- 하기의 특징을 나타내는, 자연 발효된 손가락 수수(Eleusine coracana)죽으로부터 분리된 페디오코쿠스 펜토사세우스 KID7 (Pediococcus pentosaceus KID7, KCTC 18308P) 균주:
(a) 용혈(hemolytic)현상이 없고, 바이오아민(bio-amine)을 만들지 않고, 뮤신(mucin) 분해를 하지 않아 인체에 유해성이 없음;
(b) 구강부터 장에 이르는 소화관을 통과하여 장내 상피세포층에 콜로니(colony)를 형성할 수 있음;
(c) 인간과 동물 및 식품에 존재하는 유해균에 대한 항미생물 물질인 페디오신(Pediocin) 또는 젖산을 생산하여 유해균의 생육을 억제하는 활성을 보유함;
(d) 숙주(host)의 콜레스테롤 수치를 저하시킴;
(e) 타우로콜릭산(Taurocholic acid), 타우로디옥시콜릭산(Taurodeoxycholic acid) 및 글리코콜릭산(glycocholic acid)으로 구성된 군 중에서 선택된 하나 이상의 산의 혼합물인 담즙산을 디컨쥬게이트(deconjugate)시킬 수 있어서 내담즙산성을 보유함; 및
(f) Shigella boydii KACC 10792, Salmonella choleraesuis KCTC 2932 및 Yersinia enterocolitica KACC 15320로 구성된 군 중에서 선택된 하나 이상의 유해균에 대해 공동응집(coaggregation)을 일으키는 활성을 보유함.
- 제1항의 균주를, 1.0 X 109내지 1.0 X 1011cfu/g 양으로 포함하는 생균제 조성물.
- 제2항에 있어서,
당알콜(sugar alcohol), 이당류, 다당류 및 단백질로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 구성요소를 더 포함하는 생균제 조성물.
- 제3항에 있어서,
상기 당알콜은 마니톨(mannitol)인 것을 특징으로 하는 생균제 조성물.
- 제3항에 있어서,
상기 이당류는 트레할로스(trehalose)인 것을 특징으로 하는 생균제 조성물.
- 제3항에 있어서,
상기 다당류는 갈락토마난(galactomannan)인 것을 특징으로 하는 생균제 조성물.
- 제3항에 있어서,
상기 단백질은 대두 추출 단백질인 것을 특징으로 하는 생균제 조성물.
- 제1항의 균주를 3 내지 15 중량%,
당알콜 15 내지 40 중량%,
이당류 15 내지 40 중량%,
다당류 15 내지 40 중량%,
단백질 5 내지 30 중량%를 포함하는 생균제 조성물.
- 제2항 또는 제8항의 생균제 조성물을 포함하는 건강기능식품.
- 제2항 또는 제8항의 생균제 조성물을 포함하는 기능성음료.
-
제1항의 균주를 포함하는 설사, 장염, 위장관염, 복통 및 식중독으로 이루어진 군으로부터 선택되는, 장내 유해균으로 인한 질환의 치료 또는 예방용 조성물.
- 제2항 또는 제8항의 생균제 조성물을 포함하는 동물 사료.
- 제2항 또는 제8항의 생균제 조성물을 그대로 또는 사료에 첨가하여 인간이 아닌 동물에 급여함으로써 인간이 아닌 동물 장내 유해균의 생육을 억제하여 유해균으로 인한 질환을 예방하거나 치료하는 방법
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