KR100435505B1

KR100435505B1 - 김치에서 분리된 헬리코박터 필로리의 부착과성장억제성능 락토바실러스 플란타룸

Info

Publication number: KR100435505B1
Application number: KR10-2002-0016873A
Authority: KR
Inventors: 이연희; 신은주; 남혜란; 이기은; 이학미; 이은정; 하미선; 백경수
Original assignee: (주) 피엘바이오
Priority date: 2002-03-27
Filing date: 2002-03-27
Publication date: 2004-06-10
Also published as: KR20030077895A

Abstract

본 발명은 헬리코박터 필로리의 활성을 억제하는 유산균에 관한 것으로, 김치에서 분리되었으며 헬리코박터 필로리의 위점막 부착을 억제시키고 헬리코박터 필로리의 성장을 저해시키는 균주인 락토바실러스 플란타룸 PL 9010 (KCCM-10357)과 PL 9011 (KCCM-10358)을 제공한다. 본 발명의 균주들은 위궤양 억제제, 식품원료, 식품첨가제, 헬리코박터 감염 예방제 또는 치료제, 식중독 치료제, 세균감염 치료제 등으로 사용할 수 있다.

Description

김치에서 분리된 헬리코박터 필로리의 부착과 성장억제성능 락토바실러스 플란타룸{LACTOBACILLUS PLANTARUM ISOLATED FROM KIMCHI WITH INHIBITING ACTIVITIES ON HELICOBACTER PYLORI}

본 발명은 헬리코박터 필로리의 활성을 억제하는 유산균에 관한 것으로서, 더욱 상세하게는 위궤양의 원인균인 헬리코박터 필로리의 위점막 부착을 억제할 수 있으며 성장도 억제할 수 있는 균주에 관한 것이다.

헬리코박터 필로리(Helicobacter pylori)는 그람음성 세균으로서 1983년 웨렌(Warren)과 마샬(Marshall)에 의하여 처음으로 사람의 위 점막조직에서 분리 및 동정되었다. 처음에는 캠필로박터 파이로리디스(Campylo bacter pyloridis)로 명명되었으나, 체내에서의 모양과 위내에서 주로 서식하는 유문부(pylorus)의 명칭을 인용하여 '헬리코박터 필로리'로 명명되었다.

헬리코박터 필로리는 위궤양의 원인균으로, 위암의 원인균이기도 하다.(Dubois, A. 1995. Spiral bacteria in the human stomach: the gastric Helicobacters. Emerg. Infect. Dis. 1: 790085 ; Slomiany, B. L. and A. Slomiany. 1992. Mechanism of Helicobacter pylori pathogenesis: focus on mucus. J. Clin. Gastroenterol. 14 Suppl 14 Suppl 1 S114-21) 헬리코박터 필로리에 일단 감염되면 감염이 수십 년간 지속되고, 자연적으로 제거되는 경우는 거의 없어 헬리코박터 필로리는 만성 위염의 주원인이다.

헬리코박터 필로리의 감염은 식품 등과 함께 경구적으로 침입한 균이 위, 십이지장 점막에 부착함에 따라 시작된다. 헬리코박터 필로리의 병독인자로는 위내의 강산에서 생존하기 위해 분비하는 유레아제, 운동성을 유지하도록 하는 편모, 위 상피세포에 쉽게 부착하도록 도와주는 세포 표면의 외막단백질이 있다.

헬리코박터 필로리는 위점막에 부착시 사람의 적혈구에서 발현되는 것과 같은 항원에 부착된다.(Alkout, A. M., C. C. Blackwell, D. M. Weir, I. R. Poxton, R. A. Elton, W. Luman, and K. Palmer. 1997.Gastroenterol. 112: 1179001187 ; Boren, T., P. Flak, K. A. Roth, G. Larson, and S. Normark. 1993.Science262: 1892-1895 ; Clyne, M. and B. Drumm. 1997.Gastroenterol. 113: 72-80) 특히 O형 적혈구에 발현되는 레비스 항원(Lewis antigen)과 같은 항원이 위점막에도 발현되어 O형에서 위궤양 발생율이 높다.(Heneghan, M. A., A. P. Moran, K. M. Feeley, E. L. Egan, J. Goulding J, C. E. Connolly, and C. F. McCarthy. 1998.FEMS Immunol.Med. Microbiol. 20: 257-266 ; Kobayashi, K., J. Sakamoto, Y.Yamamura, T. Kito, H. Inagaki, T. Watanabe, and H. Nakazato. 1991.Nippon Geka Gakkai Zasshi92: 813-819 ; Kobayashi, K., J. Sakamoto, Y. Kito, Y. Yamamura, T. Koshikawa, M. Fugita, T. Watanabe, and H. Nakazato. 1993.Am. J. Gastroenterol.88: 91900924)

헬리코박터 필로리의 치료방법으로는 항생제, 프로톤 펌프 억제제, 위산 제거제를 이용한 방법을 사용하고 있으며, 헬리코박터 필로리의 대량 배양이 어려워 전체 세균을 이용한 백신 개발은 아직 이루어지지 않은 실정이다. 항생제를 이용한 방법은 약물 부작용이 있으며, 항생제에 대한 내성을 갖는 헬리코박터 필로리가 발생하는 문제점을 가지고 있다. 위산 제거제를 이용한 방법 역시 위산분비를 억제하는 방법으로 헬리코박터 필로리의 근본적인 치료가 되지 못한다. 또한 헬리코박터 필로리의 유레아제를 이용한 백신이 개발되었으나 효과가 탁월하지 않은 실정이다. 현재로써는 헬리코박터 필로리에 대한 백신은 헬리코박터 필로리의 까다로운 배양 조건과 작용 부위 때문에 앞으로도 개발이 쉽지 않을 것으로 생각된다.

한편, 락토바실러스(Lactobacillus)는 락테이트와 아직 규명되지 않은 미지의 물질을 생산하여 헬리코박터 필로리를 억제하는 것으로 밝혀져 있으며, 현재까지는 락토바실러스 살리바리우스(Lactobacillus salivarius)의 경우 그 배양액이 가장 헬리코박터 필로리 성장 억제 효과가 큰 것으로 알려져 있다.(Aiba, Y., N. Suzuki, A. M. Kabir, A. Takagi, and Y. Koga. 1998 Am. J. Gastroenterol. 93: 2097-2101) 또한 락토바실러스가 헬리코박터 필로리의 위점막 결합 부착되는 레비스 항원 (Lewis antigen) 결합을 억제하는 것으로 확인되었다.(Lee, Y., E. Shin,J. Lee, and J.H. Park. 1999. Lactobacillus acidophilus inhibits the Helicobacter pylori adherence.J. Microb. Biotech.9: 794-797)

따라서, 본 발명은 위궤양을 억제할 수 있는 균주를 제공하는 것을 목적으로 한다.

또한 본 발명은 헬리코박터 필로리의 위점막 부착을 억제할 수 있는 균주를 제공하는 것을 목적으로 한다.

또한 본 발명은 헬리코박터 필로리의 환성을 억제할 수 있는 균주를 제공하는 것을 목적으로 한다.

또한 본 발명은 헬리코박터 필로리의 성장을 억제하는 물질을 생산하는 균주를 제공하는 것을 목적으로 한다.

또한 본 발명은 식중독 균의 성장을 억제할 수 있는 균주를 제공하는 것을 목적으로 한다.

도 1은 PL 균주들의 그람염색 사진,

도 2는 PL 균주들의 SEM (전자현미경 사진)

도 3는 PL 균주들이 위세포주인 MKN-45에 부착된 그람 염색후 광학현미경 사진

도 4는 PL 균주들이 위세포주인 MKN-45에 부착된 전자현미경사진 (SEM)

도 5는 PL 균주들이 헬리코박터 피로리가 MKN-45 세포에 부착되는 것을 억제하는 것을 FITC 형광을 이용하여 형광현미경으로 관찰한 사진

도 6은 PL 균주들이 헬리코박터 피로리가 MKN-45 세포에 부착되는 것을 억제하는 것을 ELISA를 이용하여 정량적으로 측정한 그래프

도 7은 PL 균주들의 배양농축액이 헬리코박터 피로리 성장을 억제한 사진

도 8은 PL 균주들이 헬리코박터 피로리 성장을 억제한 결과 우레아제 생산 억제로 암모니아 생산이 억제된 결과

도 9는 PL9010의 배양액이 각종 식중독 균의 성장을 억제한 결과

도 10은 PL9011의 배양액이 각종 식중독 균의 성장을 억제한 결과

도 11은 PL9010과 PL9011 배양액이 혐기성세균인Clostridium perfringens의 성장을 억제한 결과

도 12는 PL9010과 PL9011의 배양액이 pepsin에 안정한 것을 보여준 사진

도 13은 PL9010과 PL9011의 배양액이 각종 pH 에 안정한 것을 보여준 사진

도 14는 PL9010과 PL9011의 배양액이 열처리에 안정한 것을 보여준 사진

도 15는 PL 균주들이 장세포주인 Caco-2 세포에 결합된 것을 그람 염색후 광학현미경으로 관찰한 사진

도 16은 PL 균주들이 장세포주인 Caco-2 세포에 결합된 것을 전자현미경 (SEM)으로 관찰한 사진이다.

상기의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 헬리코박터 필로리 위점막부착억제능을 나타내는 락토바실러스 플란타룸을 제공한다.

또한 본 발명은 헬리코박터 필로리의 성장을 억제하는 락토바실러스 플란타룸을 제공한다.

또한 본 발명은 락토바실러스 플란타룸를 포함하는 세균성장 저해용 조성물을 제공한다.

또한 본 발명은 락토바실러스 플란타룸 또는 이의 배양여액을 포함하는 식품첨가제를 제공한다.

또한 본 발명은 락토바실러스 플란타룸를 종균으로 사용하여 제조된 유제품을 제공한다.

또한 본 발명은 락토바실러스 플란타룸 또는 이의 배양여액을 포함하는 정장용 조성물을 제공한다.

이하 본 발명을 상세하게 설명한다.

본 발명은 헬리코박터 필로리의 위점막 부착을 억제시키는 김치에서 분리된 균주를 제공한다. 상기 균주는 유산균으로 락토바실러스 플란타룸이 바람직하다. 가장 바람직하게는 락토바실러스 플란타룸 PL 9010 과 PL 9011이다 .

상기 PL 균주들(락토바실러스 플란타룸 PL 9010 과 락토바실러스 플란타룸 PL 9011)은 한국미생물보존센터에 국제기탁하여 기탁번호를 부여받았다. 국제기탁번호로는 락토바실러스 플란타룸 PL 9010는 KCCM-10357이고, 락토바실러스 플란타룸 PL 9011은 KCCM-10358이다.

또한 본 발명은 위궤양 억제제를 제공한다. 위궤양 억제제는 락토바실러스 플란타룸 속 균주들을 단독 또는 혼합하여 포함하는 것을 특징으로 하고, 더욱 바람직하게는 상기 PL 균주들을 포함한다. 락토바실러스 플란타륨 균주들은 헬리코박터 필로리 성장을 억제할 뿐만 아니라 헬리코박터 필로리 위막 부착능을 억제시킨다. 상기한 효과는 락토바실러스 플란타룸 PL 9010 (KCCM-10357)과 락토바실러스 플란타룸 PL 9011 (KCCM-10358)에 대하여 실험하여 확인하였다. 또한 PL 균주들은헬리코박터 필로리 성장을 억제 또는 헬리코박터 필로리 위막 부착능을 억제시키는 물질을 생산하므로, PL 균주 배양여액 역시 위궤양 치료제로 사용할 수 있다. PL 균주들은 내항생제성, 내산성 및 내담즙성을 가지므로 생체내에서 안정한 상태를 유지할 수 있으며, 생균, 건조균 또는 사균 형태로 사용될 수 있다.

본 발명의 위궤양 억제제는 어떠한 제형으로도 적용가능하며, 제조한 제형은 경구용, 비경구용, 도포용으로 사용 할 수 있다. 상기 제형은 주사용 또는 경구용으로 조제하는 것이 바람직하고, 경구용으로 조제하는 것이 가장 바람직하다. 상기 위궤양 억제제는 단일제 또는 복합제제로 제조할 수 있으며 복합제일 경우 약리학적으로 허용가능한 담체를 더욱 포함시켜 제조한다. 또한 제제에 포함되는 균주는 제조하는 제형에 따라 함량비를 조절하는 것이 바람직하다.

상기 PL 균주들의 배양여액은 통상적인 배양배지상에서 배양한 배양물을 여과 또는 원심분리하여 균주를 제거한 여액이 바람직하고, 더욱 바람직하게는 MRS 액체배지에 PL 균주를 접종하고 37℃에서 16시간 내지 48시간 배양한 다음 원심분리로 분리한 상등액이다.

또한 본 발명의 락토바실러스 플란타룸 균주는 다른 세균의 활성을 억제할 용도로 더욱 사용할 수 있다. 상기 식중독 유발균은 리스테리아증, 이질, 설사, 0157, 식중독을 유발하는 균이다.

또한 본 발명의 PL 균주들은 위세포 부착 및 장세포 부착활성을 가진다. 본 발명의 PL 균주들은 위세포 부착 및 장세포 부착으로 위 및 장에 서식하여 세균의 성장을 저해하는 정장 작용을 수행한다.

따라서, 본 발명의 PL 균주들은 헬리코박터 필로리 활성 저해, 세균의 활성저해, 정장작용을 위한 조성물로 사용할 수 있으며, 상기 조성물은 사료, 사료 첨가제, 식품, 식품첨가제, 또는 약제로 사용할 수 있다. 또한 상기 조성물은 PL 균주들의 파쇄된 세포벽 분획, 생균, 사균, 건조균 또는 배양여액을 유효성분으로 포함시킬 수 있으며, 부형제 또는 담체를 더욱 포함할 수 있다. 조성물내의 PL 균주 함량은 조성물의 용도, 제형에 따라 다르다. 상기 조성물이 부형제 또는 담체를 포함하는 경우, 조성물내 PL 균주함량은 0.001 중량% 내지 90 중량%가 바람직하며, 이에 한정되는 것은 아니다.

상기 사료 또는 사료첨가제는 통상의 사료에 PL 균주를 0.001 내지 50 중량%로 포함하는 것이나, 이에 한정되진 않는다. 사료 또는 사료첨가제는 음료 또는 고형분으로 제조할 수 있다.

상기 식품 또는 식품첨가제는 요구르트, 이유식, 치즈, 유제품, 김치, 각종 음료 등 모든 식품이 바람직하고, 또한 본 발명의 PL 균주를 종균으로 사용하여 제조된 것도 바람직하다.

상기 약제는 단일제로 제조할 수 있으며, 1종 이상의 허용가능한 약리학적 조성물을 더욱 포함하여 복합제로 제조할 수 있다. 또한 약제는 약리학적으로 유용한 것으로 알려진 적합한 약학용 희석제를 더욱 포함할 수 있으며, 바람직한 희석제는 식염수, 완충 식염수, 덱스트로스, 물, 글리세롤, 및 에탄올로 이루어진 군으로부터 1종이상 선택된 것이다.

하지만 상기 희석제는 이에 국한되지 않는다. 당해 기술 분야에 알려진 적합한 제제는 문헌(Remington's Pharmaceutical Science(최근판), Mack Publishing Company, Easton PA)에 기재되어있다. 약제의 사용량은 사용용도 및 질병의 상태에 따라 달리 적용하는 것이 바람직하다. 치료의 종류와 정도, 다른 약물의 복용여부(예, 화학요법제), 환자의 연령, 체중, 일반 건강 상태, 성별 및 식이, 투여 시간, 투여 경로 및 조성물의 분비율 등의 다양한 인자와 의약 분야에 잘 알려진 유사 인자에 따라 다르게 적용하는 것이 좋다. 더욱 바람직하게, 약제의 단위 투여량은 1 내지 800 mg이 좋고, 가장 바람직하게는 40 내지 400 mg이다. 또한 환자, 질환의 종류 및 질환의 정도에 따라 용량 및 투여방법이 달라지기는 하나, 일반적으로 일일 0.1 내지 20 mg/kg으로 투여할 수 있으며, 선택적으로는 0.2 내지 10 mg/kg을 투여하고 1일 1-3회 투여하는 것이 바람직하다.

상기 약제는 경구, 비경구 또는 도포법으로 투여할 수 있다. 비경구 투여는 직장, 국소, 정맥내, 복강내, 근육내, 동맥내, 경피, 비측내, 흡입, 안구내 또는 피내 주사 및 주입을 포함하는 투여 방식을 의미한다. 약제 제형은 어떠한 제형으로도 적용가능하며, 경구용 및 주사용 형태(용액, 현탁액 또는 유탁액)로 조제하는 것이 바람직하고, 정제, 캅셀제, 연질캅셀제, 수액제, 과립제, 환제 등 경구용으로 조제하는 것이 가장 바람직하다. PL 균주를 포함하는 약제는 연질캅셀에 부형제없이 충전하거나 미립된 고체 담체, 액체 담체 또는 그 양자와 균일하게 충분히 접촉시키고, 바람직한 제제로 성형할 수 있다. 상기 담체의 예로는 전분, 물, 식염수, 링거액 및 덱스트로스 용액이 있으며, 문헌(Remington's Pharmaceutical Science(최근판), Mack Publishing Company, Easton PA)에 개시되어 있는 것을 사용할 수있다.

또한 본 발명은 락토바실러스 플란타룸에서 생성되는 유해세균 성장억제물질을 제공한다. 상기 유해세균 성장억제물질은 헬리코박터 필로리, 또는 식중독 유발균의 성장을 저해하는 물질로, 상기 균주를 배양하였을 때 배양여액에서 수득되어질 수 있다. 따라서 락토바실러스 플란타룸에서 생성되는 유해세균 성장억제물질 역시 세균저해용 및 면역증강용으로 사용할 수 있다.

이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시 예를 제시한다. 그러나 하기의 실시 예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐 본 발명이 하기의 실시 예에 한정되는 것은 아니다.

실시예 1: 균주의 분리

MRS broth(Difco, bacto proteose peptone No.3 10 g, bacto beef extract 10 g, bacto yeast extract 5 g, bacto dextrose 20 g, polysorbate 80 g, ammonium citrate 2 g, sodium acetate 5 g, magnesium sulfate 0.1 g, manganese sulfate 0.05 g, dipotassium phosphate 2 g /L)에 브롬페놀 블루(bromphenol blue)를 0.002 %로 첨가한 MRS+BPB 배지를 준비하였다. 김치 시료는 펩톤수로 십배수 희석하여 0.1 ㎖씩 MRS+BPB 배지에 접종한 후 유리막대로 도말하였다. 배양은 25℃의 항온배양기에서 3-4일간 배양한 후 생성된 콜로니를 관찰하여 유산균을 분리하였다.

유산균의 집락 형태를 구별하기 위해 pH 3.0일 때 황색, PH 4.6일 때 자색을 나타내는 BPB(bromphenol blue)를 MRS 고체배지에 첨가하여 집락의 BPB 착색정도로유산균을 감별하였다. BPB에 의한 착색 정도는 유산 생성정도와 PH 내성, 그리고 수명에 따라 형성된다.P. acidolactic와S. faecalis는 정상유산발효균주이며,L. mesenteroides와L. brevis는 이상유산발효를 하며,L. plantarum는 임의정상유산발효를 하는 것으로 알려져 있다.S. faecalis는 정상유산발효를 하므로 유산을 많이 생성하기 때문에 백색의 집락이 형성되고, 배지는 담황색으로 변화된다. 이상유산발효를 하는L. mesenteroides는 유산생성이 적으므로 집락의 색상은 전체적으로 암청색으로 환이 없고 집락의 크기가 작게 나타난다.

락토바실러스는 전체적으로 담청색을 띄거나 중앙에 암청색의 환이 있고, 또는 전체적으로 흰색이며 집락의 크기가 큰 것으로 구분하였다. 그리고P. acidolactic와L. mesenteroides가 암청색으로 되는 이유는 짧은 수명(life time)과 pH에 기인한다. 그 예로L. mesenteroides는 pH 4.8 이하에서는 생장 할 수 없다.

본 균주들은 모두 0.3 mm이상의 흰색의 집락을 형성하여 락토바실러스로 구분하였다.

단일 콜로니로 분리한 후 버기스 매뉴얼(Bergy's manual of systematic bacteriology)에 준하여 형태학적, 생화학적 특성을 조사하여, 그람염색과 카탈라제반응을 확인한 다음, API system (La Balme-les-Grottes, France)으로 동정하였다. 면봉을 이용하여 콜로니를 취한 후 멸균 증류수 2 ㎖에 부유시켰다. 부유액은 API 50 CHL 배지에 첨가하여 균질화시켰다. 균질화된 API 50 CHL 배지는 API 50 CH의 50개의 튜브에 200 ㎕씩 접종하고 미네랄 오일로 튜브 위를 덮어 준 후 37℃에서 48시간 동안 배양시킨 후 결과를 관찰하였다. API 50 CH 및 API 50 CHL로 49종의 탄수화물 발효패턴을 확인한 후 이 결과를 ATB 동정 컴퓨터 시스템(identification computer system, bio Merieux France)에 입력하여 동정하였다. 분리한 균 중 제 1 균의 동정 결과는 표 1과 같다. 그람염색후 광학현미경과 전자현미경으로 확인한 결과 도 1(a, PL9010의 그람염색사진; b, PL9010의 그람염색사진)과 도 2 (a, PL9010의 전자현미경사진; b, PL9010의 전자현미경사진)와 같이 전형적인L. plantarum의 형태를 가지고 있었다.

[표 1]

동정한 결과 제 1균주는 락토바실러스 플란타룸(Lacto. plantarum)에 99.9 %에 동일성을 가짐을 확인하였다. 또한 제 1균주의 16S rRNA를 Microseq 16S rRNA gene kit(Perkin Elmer Applied Biosystem)로 염기서열을 분석하여 서열번호 1의 염기서열을 확인하였다. 서열번호 1의 염기서열은 BLAST 검색결과(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast)락토바실러스 플란타룸의 16S rRNA의염기서열과 동일하였으며 Genbank Accession No. AYO78431로 등록되었다. 본 균주를 락토바실러스 플란타룸 PL 9010 (KCCM-10357)로 한국미생물보존센터에 국제기탁하였다.

제 2균의 동정결과는 표 2와 같다.

[표 2]

동정한 결과 제 2균주는 락토바실러스 플란타룸(Lacto. plantarum)에 99.6 % 동일하였다. 또한 16S rRNA의 염기서열 분석 결과는 BLAST 검색결과 (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast) 락토바실러스 플란타룸의 16S rRNA의 염기서열과 동일하였으며 Genbank Accession No. AY078432로 등록되었다. 상기 균주는 락토바실러스 플란타룸 PL 9011 (KCCM-10358)로 한국미생물보존센터에 국제기탁하였다.

실시 예 2: 헬리코박터 필로리 위점막 부착 억제능 실험

(1) 균주 준비

헬리코박터 필로리(ATCC 43504)는 Brucella 고형배지(Brucella broth, fungizone(2.5 mg/ml amphotericin B), Skirrow's supplement (0.16 mg/ml polymyxin B, 5 mg/ml vancomycin, 2.5 mg/ml trimethoprim), 10 % horse serum, 1.5 % agar)에 접종하여 5 내지 10% 이산화탄소 배양기에서 37℃, 48시간 배양하였다. 배양된 균체는 배지로부터 긁어모아 인산완충액 (PBS, pH7.4)으로 2-3회 세척하고, 소량의 10 mM Tris-Cl 완충용액에 현탁시켜 사용하기 전까지 -20℃에 보관하였다.

실시예 1의 균주들은 통칭하여 이하 PL 균주로 나타낸다. PL 균주들(락토바실러스 플란타룸 PL 9010 (KCCM-10357), 락토바실러스 플란타룸 9011 (KCCM-10358))을 MRS 액체배지에 접종하여 37 ℃에서 24시간 배양한 후 원심분리로 가라앉힌 균체를 PBS(pH 7.4)로 2-3회 세척하고, 소량의 10 mM Tris-Cl 완충용액에 균체를 현탁시켜 즉시 사용하였다.

(2)헬리코박터 필로리의 위점막 부착능 억제실험 (그람염색과 광학현미경)

위와 같이 준비된 살아있는 유산균과 75℃에서 15분간 가열한 사균을 준비하였다.

MKN-45 세포주를 2 g/L의 소듐 바이카보네이트, 10 % 열-비활성화된 FBS 및 항생제 안티마이코틱을 포함하는 RPMI-1640 배지(pH 7.2)에서 배양하였다. 3 X 10⁵세포를 2 ml의 배양배지에 접종하고, 30 mm 배양접시에 세포 단일층으로 배양하였다. 배지는 매일 교환해 주었다. 6일간 배양 후 2 ml PBS로 단일세포군을 2회 세척하였다.

1 x 10⁷CFU/mL의 유산균 및 사균을 각각 완전배지 2 mL에 혼합하고, 37℃, 5 % CO₂-95% 공기 조건상에서 배양하였다. 60분간 배양 후 세포 단일층을 멸균된 PBS로 2회 세척하고 메탄올로 고정시켰다. 살아있는 유산균과 75℃에서 15분간 가열한 사균을 준비하였다. MKN-45(Human Gastric adenocarcinoma) 세포주에 생균과 사균의 부착력을 확인하였다. 도3은 본 발명의 PL 균주들의 생균과 사균의 위벽세포 부착력을 확인한 사진이다.

(a)는 PL9010 생균, (b)는 PL9010 생균과 헬리코박터 피로리, (c)는 PL9010 사균, (d)는 PL9010 사균과 헬리코박터 피로리를 첨가한 사진이며, (e)는 PL9011 생균, (f)는 PL9011 생균과 헬리코박터 피로리, (g)는 PL9011 사균, (h)는 PL9011 사균과 헬리코박터 피로리를 첨가한 사진으로 본 발명의 PL 균주들은 생존에 상관없이 위세포 부착력을 나타내었으며 헬리코피로리의 부착을 억제하였다.

또한 정량적인 측정을 위해 X100배 현미경상에서 20개의 필드를 관찰하였으며, 부착된 균수를 세어 20필드의 총수가 400개 이상일 경우 부착능력이 있는 것으로 판정하였다(Bibiloni, R., Perez, P.F., and DeAntoni, G.L. (1999)Anaerobe5, 483-485). 하기 표 3는 관찰된 유산균 수를 나타낸 것이다.

[표 3]

(3) 헬리코박터 필로리의 위점막 부착능 억제실험 (전자현미경)

전자전미경으로 본 발명의 균주들이 위벽세포에 부착하는 것을 확인하기 위해 SEM촬영을 위해 다음과 같이 실험을 실시하였다. 상기 실험과 동일하게 MKN-45세포주를 단일 세포층으로 30 mm 배양접시에서 6일간 배양하였다. PBS로 2회 세척 후 각각의 세포주에 PL9010, PL9011를 (7∼8×10⁷) 각각 넣어 배양하였다. 60∼90분간 37℃, 5% CO_2,95% 공기 조건상에서 배양하고, 배양접시를 0.1 M 소듐카코디레이트 완충용액 (pH 7.2)으로 3회 세척하였다. 0.1 M 소듐카코디레이트 완충용액 (pH 7.2)으로 만든 2.5% 글루타르알데하이드 용액으로 12∼16시간 고정시켰다. 고정 후 0.1 M 소듐카코디레이트 완충용액(pH 7.2)으로 만든 25%, 50%, 75%, 95% 에탄올로 단계별로 25∼30분정도 탈수시켰고, 100% 에탄올로 25 ∼30분정도 탈수시켰다. Critical Point Drier를 사용하여 건조 시킨 후 gold coating 하여 SEM으로 관찰하였다. 본 발명의 PL9010 과 PL9011이 MKN 세포에 부착되는 것이 도 4에서 관찰되었다. a는 MKN-45 세포에 PL9010이 부착한 사진이고, b는 MKN-45 세포에 PL9011 이 부착한 사진이다.

(4) PL9010과 PL9011에 의한 헬리코 박터 부착억제력 확인 실험 (형광항체법)

본 발명의 유산균들이 헬리코박터 피로리 균이 위벽에 부착하는 것을 경쟁적으로 억제하는 지를 확인하기 위하여 헬리코박터 피로리에 특이하게 결합하는 항체와 효소가 결합된 이차 항체를 이용하여 세포에 결합된 헬리코박터 피포리 균의 수를 측정하였다.

MKN-45 (3×10⁵)를 2 ml의 배양배지(30 mm 배양접시)에 접종하여 세포 단일층으로 배양하였다. 배지는 2일에 한번 교환해 주었다. 6일간 배양 후 2 ml의 PBS로 세포 단일층을 2회 세척하였다. 유산균 생균 및 사균 (1×10⁷)을 배양배지에 각각 혼합하고, 헬리코박터 필로리(1×10⁶)를 첨가하여 혼합했다. 유산균과 헬리코가 첨가된 세포를 37℃, 5% CO₂-95 % 공기 조건상에서 배양하였다. 60∼90분간 배양후 배양접시를 멸균 PBS로 3회 세척하고, 4% 포름알데하이드 용액으로 4℃에서 1시간이상 고정시켰다. 고정된 배양접시를 PBS-Tween20용액으로 3회 세척하고, PBS-1%BSA를 배양접시에 넣어 37℃에서 30분간 정치하였다. 배양접시를 PBS-Tween20 용액으로 3회 세척하고, 1:600으로 희석된 anti-helico anti-rabbit IgG antibody 용액을 배양접시에 0.5 ml 씩 채워서 37℃에서 2시간 동안 반응 시켰다. 반응 후 PBS-Tween20 용액으로 3회 세척하고, Mouse monoclonal anti-rabbit IgG (clone RG-96 FITC conjugate; 2.2 mg/ml) antibody용액을 1:100으로 희석하여 배양접시에0.5 ml 씩 채워서 37℃에서 2시간 동안 반응시켰다. 반응 후 PBS-Tween20 용액으로 3회 이상 충분히 세척하여 주었다. 세포에 결합된 헬리코박터 피로리 균수를 Nikon Eclipse E600 현미경과 Nikon FDX-35로 EX 450-490 nm, DM 505 BA 520 nm에서 관찰하고 촬영하였다.

도 5는 PL균주들의 헬리코박터 필로리의 위점막 부착 억제능을 확인한 사진으로, a는 MKN-45세포이고, b는 MKN-45세포에 헬리코박터 필로리만을 처리한 것이고, c는 MKN-45세포에 헬리코박터 필로리 및 PL9010 생균을 처리한 것이고, d는 MKN-45세포에 헬리코박터 필로리 및 PL9010 사균을 처리한 것이고, e는 MKN-45세포에 헬리코박터 필로리 및 PL9011 생균을 처리한 것이고, f는 MKN-45세포에 헬리코박터 필로리 및 PL9011사균을 처리한 것이다. MKN-45세포는 푸른색을 띄며, 헬리코박터 필로리는 노란 형광색으로 관찰된다. 이같이 형광현미경으로도 PL9010과 PL9011 생균 및 사균 처리시 헬리코박터 필로리가 위세포에 부착되지 못함을 확인 할 수 있었다.

(5) PL9010과 PL9011에 의한 헬리코박터 부착 억제력 정량적 측정 실험 (ELISA)

MKN-45(Human Gastric adenocarcinoma) 세포주에 생균과 사균을 처리하여 헬리코박터 필로리의 위점막 부착에 대한 억제능을 정량적으로 측정하였다. 96 well 세포배양 plate 각 well 마다 3 ×10⁵세포를 접종하고, 하루 동안 세포 단일층으로 배양하였다. PBS로 2회 세척하고, 각각의 유산균 생균 및 사균(1×10⁸) 을 각각 혼합하여 넣고, 헬리코박터 필로리(1×10⁷)를 첨가 혼합하여 37℃, 5% CO₂-95 % 공기 조건상에서 배양하였다. 60∼90분간 배양 후 plate를 멸균 PBS로 3회 세척하고, 4% 포름알데하이드 용액으로 4℃에서 1시간이상 고정시켰다. 고정된 plate를 PBS-Tween20용액으로 3회세척하고, PBS-1%BSA를 plate에 넣어 37℃에서 30분간 정치하였다. plate를 PBS-Tween20 용액으로 3회 세척하고, 1:600으로 희석된 anti-helico anti-rabbit IgG antibody용액을 각각의 well에 50㎕ 씩 채워서 37℃에서 2시간 동안 반응시켰다. 반응 후 PBS-Tween20 용액으로 3회 세척하고, Anti-rabbit IgG-Alkaline phosphatase conjugate antibody 용액을 1:1000으로 희석하여 각 well에 504 씩 넣고, 37℃에서 2시간 동안 반응 시켰다. 반응 후 PBS-Tween 20 용액으로 3회 세척하고, 효소 기질 완충용액에 p-nitrophenyl phosphate를 1 mg/ml이 되게 넣어 섞은 후 각 well에 200 ㎕씩 첨가해 주었다. 암 처리하여 실온에서 30분간 정치하여 발색이 되면 3 M 소듐 하이드록사이드를 50 ㎕씩 넣어 반응을 정지시켰다. 반응이 완료된 용액을 다른 96 well로 200 ㎕씩 옮겨 ELISA reader로 흡광도 405 nm에서 측정하였다.

표4은 ELISA reader로 측정한 결과를 나타낸 것이며, 도6은 측정값을 그래프로 표기 한 것이다. 대조군의 흡광도 값과 비교해본 결과 본 발명의 PL균주 들의 흡광도 값이 훨씬 떨어지는 것으로 보아 본 발명의 PL균주들이 헬리코박터 필로리의 위점막 부착능 억제력이 대조군에 비해 탁월한 것으로 나타났다.

[표 4]

실시예 4: 헬리코박터 필로리 성장억제능 실험

(1) PL균주 배양 농축액 준비

PL 9010과 PL 9011을 MRS 액체배지에 접종하여 37℃에서 24시간 배양한 후 원심분리하여 상등액을 분리한 다음 상기 상등액 (이하 배양여액이라 기재함)과 동량의 Ethyl acetate를 넣고 1시간동안 shaking을 하였다. 분별깔대기를 이용하여 상층의 ethyl acetate층을 분리한 뒤 evaporator로 45도에서 ethyl acetate를 제거하였다. 상기 상등액의 1/100 부피의 멸균수에 녹여 100배 배양농축액을 준비하였다.

(2)배양농축액에 의한 헬리코박터 성장 억제실험

PL 균주 배양농축액에 의한 헬리코박터 성장 억제실험을 실시하였다. PL 균주 배양농축액은 멸균수로 2배수로 희석하여 512배까지 희석하였다. 이것을 10 ul 씩 헬리코박터 피포리가 접종된 위에 올려놓거나 (Overlay method) Brucella 고형배지에 헬리코박터 필로리를 도말하고 멸균된 파스퇴르 파이펫을 이용하여 구멍(well)을 만들고, PL 균주 배양농축액 (100 ul)을 첨가하여 이산화탄소배양기(5-10% CO₂)에서 배양하고 2-3일 뒤 헬리코박터 필로리의 성장이 억제된 환의 지름을 측정하였다. 도 7a는 PL9010 배양농축액을 2배씩 희석하여 overlay 방법으로 헬리코박터 필로리 성장 억제능을 측정한 사진이고, 도 7b는 PL9010 배양농축액을 2배씩 희석하여 well test로 관찰한 결과이다. 도7c는 PL9011 배양농축액을 2배씩 희석하여 overlay 방법으로 헬리코박터 필로리 성장 억제능을 측정한 사진이고, 도 7d는 PL9011 배양농축액을 2배씩 희석하여 well test로 관찰한 결과이다.

표 5는 PL 균주 배양농축액에 의한 헬리코박터 필로리 성장 억제환의 지름을 나타낸 것이다. 도7과 표 4 의 결과에서 알 수 있듯이, PL 균주들은 헬리코박터 필로리의 성장을 억제하는 물질을 분비함을 할 수 있다.

[표 5]

(3) 유레아제를 이용한 헬리코 박터 성장억제

배양농축액 시료를 10배로 희석하여(배양액의 10X) 1 ml씩 취하여 헬리코박터 필로피(OD625=1.0)를 10 ul씩 첨가한 후 1시간동안 37℃ 이산화탄소 배양기에서 배양하였다. 원심분리(15000 rpm, 10 min)한 상등액에 존재하는 암모니아의 양을 인돌페놀(indophenol)방법(Schener, D. 1976. Determination of ammonia and Kieldahl nitrogen by indophenol method. Water Res. 10, 3136) 으로 측정하여 유레아제(urease)의 활성을 측정하였다. 측정된 수치는 헬리코박터 필로리로부터 유래한 유레아제 활성에 비례하므로 배양여액에 의해 헬리코박터 피로리 균이 사멸했을 경우 유레아제 생산이 멈추고 이 결과 시료에 존재하는 헬리코박터 필로리 균의 양을 알 수 있다. 도 8은 본 발명의 PL 균주 배양여액에 의한 헬리코박터 필로리 성장억제정도를 나타낸 그래프다.

실시예 5: 각종 식중독균 성장억제실험

각 PL 균주의 MRS 배양여액과 2배 농도의 BHI 배양액을 동량 혼합하였다. 여기에 BHI(Brain Heart Infusion : Brain Hear, Infusion form, 6.0 g, Peptic digest of animal tissue 6.0 g, sodium chloride 5.0 g, dextrose 3.0 g, pancreatic digest of gelatin 14.5 g, disodium phosphate 2.5 g)에서 성장한 살모넬라 티피무리움(Salmonella typhimurium), 살모넬라 엔테리티디스(Salmonella enteriditis), 쉬겔라 소네이 (Shigella sonnei), 쉬겔라 프렉스너리 (Shigella flexneri),E. coliO157:H7, 에로모나스 히드로필라(Aeromonas hydrophila), 리스테리아 모노시토제네스(Listeria monocytogenes)을 최종농도가 1 % 되도록 접종하여 37℃에서 배양하였다. 24시간 후 배양액 내의 각각의 생균수를 측정하였다. 이때 리스테리아 모노시토제네스 (L.M 이라 기재함)는 혈액한천배지에, 살모넬라 티피무리움(S.T라 기재함), 살모넬라 엔테리티디스(S.E라 기재함), 쉬겔라 소네이(S.S 이라 기재함), 쉬겔라 프렉스너리(S.F이라 기재함), E. coli O157:H7(O157이라 기재함), 및 에로모나스 히드로필라(A.H라 기재함)는 MacConkey 배지에 접종하여 CFU/ml 값으로 생균수를 측정하였다.

이를 그래프로 그린 결과는 도 9와 같다. 도 9에서 관찰되듯이 락토바실러스 플란타룸 PL 9010 (KCCM-10357)은 식중독균을 억제하는 물질을 생산하여 식중독균의 성장을 억제하였다.

또한 락토바실러스 플란타룸 PL 9011 (KCCM-10358)도 식중독균의 성장을 억제하였다. 측정결과는 도 10에 나타내었다. 도 10에서 알 수 있듯이 락토바실러스 플란타룸 PL 9011은 식중독균의 성장을 크게 억제하는 물질을 생성함을 알 수 있었다.

상기에서 나타난 바와 같이, 본 발명의 PL 균주들이 식중독을 유발하는 균주의 성장을 억제하는 물질을 생산함을 확인할 수 있었다.

실시예 6: 혐기성 세균 성장 억제

클로스트로디움 페르프린젠스(Clostrodium perfringens)를 헤민(Hemin, 0.01 g/ℓ)과 L-시스테인(0.5 g/ℓ)이 함유된 BHI 액체배지에 접종하고 37℃에서 24시간 혐기적으로 배양하였다.(Balows A Hausler WJ Herrmann KL Isenberg HD Shadomy HJ. Chapter 50. Clostridium. p505-521. Manual of Clinical Microbiology, 5th ed. ASM Washington D.C. U.S.A.) PL균주 배양여액과 2배 농도 BHI 배양액의 동량 혼합하여 클로스트로디움 페르프린젠스의 최종농도가 1 % 되도록 접종하여 배양액 위에 파라핀 오일을 덮어 혐기적으로 37℃에서 배양하였다. 24시간후 배양액을 희석한 후 혈액한천배지에 접종하여 혐기적 배양기에서 37℃, 48시간 배양한 후 생균수를 측정하여 도 11에 나타내었다. 도 11a는 PL9010에 의해Cl. perfringens성장이 억제된 결과이고 도 11b는 PL9011 의해Cl. perfringens성장이 억제된 결과이다.

실시예 7: 헬리코박터 성장 억제능의 펩신에 대한 안정성 실험

PL균주의 배양여액의 펩신에 대한 안정성에 대한 실험을 하였다. 멸균수로 희석한 3OX 배양농축액 10 ml을 1 N HCI로 pH 2로 적정한 다음 pepsin을 30 unit/ml 농도로 넣고 5분, 10분, 15분, 30분간 37도에서 반응처리한 후 1 N NaOH로 pH를 중화하여 pepsin 반응을 중단시킨 후 고형배지에 헬리코박터 필로리를 도말하고, 구멍을 뚫은 후 상기의 각각의 처리된 시료 100 ul를 첨가하여 헬리코 억제능력의 안정성을 확인하였다. 도 12a는 PL9010의 배양액을 펩신으로 0, 5, 10, 15, 30 분 처리후 억제능을 관찰한 것으로 30분 후에도 억제환이 생기는 것이 관찰되었다 (표 6). 도 12b는 PL9011 배양액을 펩신으로 0, 5, 10, 15, 30 분 처리후 억제능을 관찰한 것으로 30분 후에도 억제환이 생기는 것이 관찰되었다. 즉 두 균주 모두의 배양액은 위에 존재하는 펩신에 30분까지도 안정성을 보였다.

[표 6]

실시예 8: 헬리코박터 성장 억제능의 pH 안정성 실험

30X 배양농축액을 1 N HCl과 1 N NaOH로 pH를 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9로 적정한 다음 고형배지에 헬리코박터 필로리를 도말하고, 구멍을 뚫은 후 상기의 각각의 처리된 시료 100 ul를 첨가하여 헬리코 억제능력의 안정성을 확인하였다. 이의대조군으로 10 mM Potassium phosphate buffer (pH6, 7, 8)와 여기에 1 N HCl와 1 N NaOH로 pH를 맞추어 사용하였다. 억제능은 표 7에 표시하였다. 또한 도 13a는 각 pH 조건으로 맞춘 PL9010의 배양여액의 억제능이 지속되는 것을 도 13b는 각 PH 조건으로 맞춘 PL9010의 배양여액의 억제능이 지속되는 것을 보여준다.

[표 7]

실시예 9: 헬리코박터 성장 억제능의 열 안정성 실험

30X 배양농축액을 75도와 100도에서 각각 15분, 30분간 열처리를 하고 130도에서 30초, 1분간 열처리를 하여 사용하였다. 고형배지에 헬리코박터 필로리를 도말하고, 구멍을 뚫은 후 상기의 각각의 처리된 시료 100 ul를 첨가하여 헬리코 억제능의 안정성을 확인하였다. 표 8에는 PL9010과 PL9011 두 배양액 모두 억제능이 열에 안정함을 보여주는 것이다.

도 14a는 PL9010 배양액의 열안전성을 14b는 PL9011의 열안정성을 보여준 사진이다.

[표 8]

실시예 10: PL9010과 PL9011의 내산성 및 내담즙성 검증

시스테인이 첨가된 MRS 배지는 4 N HCl과 0.1 N NaOH로 pH를 7, 5.0, 4.5로 적정한 다음 멸균하여 사용하였으며, 담즙의 영향은 옥스갈(oxgall powder)를 0 %, 0.25 %, 0.50 % 농도로 배지에 첨가하여 멸균한 후 사용하였다. 배지에 활성화된 균액(OD=1)을 1%로 접종시키고, 24시간 간격으로 620 nm에서 흡광도를 측정하였다. 하기 표 9은 내산성, 내담즙성을 나타낸 것으로, PL9010, PL9011 모두 산과 담즙에 강한 것으로 나타났다.(Conway PL Gorback SL Goldin BR. 1987. Survival of lactic acid bacteria in the human stomach and adhesion to intestinal cells. J. Dairy Sci. 70: 1-12. : Ibrahim SA Bezkorovainy A. 1993. Survival of bifidobacteria in the presence of bile salt. J. Sci. Food Agric. 62: 351-354)

[표 9]

실시예 11: PL9010과 PL9011의 항생제 안정성 측정

PL 균주들에 대한 항생제 안정성을 측정하였다. PL 균주를 MRS 고체배지에 접종하고, 여기에 표 10의 항생제가 포함된 필터(직경 6 mm)를 올려놓고 24-48시간 배양하여 항생제에 의한 형성된 억제환의 크기를 측정하였다. 억제환의 크기가 작을수록 항생제에 대한 안정성이 크다는 것을 의미한다. 하기 표 9은 PL 균주에 대한 항생제 안정성 정도를 나타낸 것이다. 표 10 결과와 같이, 본 발명의 PL 균주들은 항생제 안정성을 가진다.

[표 10]

실시예 12: 유산균의 장세포 부착력 확인 실험

Caco-2세포주를 2.7g/L의 소듐 바이카보네이트, 20%(v/v) FBS 및 안티바이오틱스 안티마이코틱스를 포함한 DMEM배지(pH 7.0)에서 배양하였다. 30 mm배양접시에 3×10⁵세포를 2 ml의 배양배지에 접종하여 세포 단일층으로 배양하였다. 배지는 2일에 한번 교환해 주었다. 6일간 배양후 2ml의 PBS로 세포단일층을 2회 세척하였다. 1×10⁷세포의 유산균을 배양배지 2 ml에 혼합하고, 혼합액은 배양접시에 둔 후 37℃, 5% CO₂-95% 공기 조건상에서 배양하였다. 60∼90분간 배양후 배양접시를 멸균 PBS로 2회 세척하고, 메탄올로 10분간 고정시켰다. 그람염색후 광학현미경 하에서 관찰하였다.

도 15는 그람염색한 후 광학현미경으로 장세포에 부착된 유산균을 관찰한 것으로 도 15a는 Pl9010, 15b는 PL9011의 사진이다. 또한 전자현미경으로 관찰한 경우에도 도 16a의 PL9010 16b의 PL9011 사진에서 관찰되듯이 PL9010, 9011 모두 부착이 우수하였다.

정량적 측정을 위해 100배 현미경상에서 20개의 필드를 관찰하였으며, 부착된 균수를 세어 Caco-2 세포 100개당 부착된 균수로 표기하였다. (R.Bibiloni, P.F.Perez, and G.L.DeAntoni (1999)Anaerobe5, 483-485 ; Edited by R.Fuller (1997)Probiotice2, 10-22). 하기 표 11는 장세포에 부착된 유산균수를 나타낸 것으로, 본 발명의 PL유산균들은 장세포 부착력이 뛰어난 것으로 알려져 있는B. infantis, B. longum에 비해 6-7배 이상의 높은 부착력을 가지고 있음을 알 수 있다.

[표 11]

상기에 언급한 바와 같이, 본 발명의 김치에서 분리된 락토바실러스 플란타룸 PL 9010 (KCCM-10357)과 락토바실러스 플란타룸 PL 9011 (KCCM-10358)은 헬리코박터 필로리의 성장 및 위세포 부착을 억제한다. 또한 본 발명의 PL 균주, PL 균주 사균체, 또는 PL 균주 배양여액은 헬리코박터의 감염을 예방 및 치료하는 용도로사용할 수 있다. 또한 PL 균주 및 PL 균주 배양여액은 우수한 식중독 성장억제 효과와 장 부착력을 가지고 있어 각종 식중독 감염 예방 및 치료의 목적으로 사용할 수 있다.

Claims

헬리코박터 필로리 위점막부착억제능 또는 성장억제능을 나타내는 김치에서 분리된 락토바실러스 플란타룸 균주.
헬리코박터 필로리 위점막부착억제능 또는 성장억제능을 나타내는 김치에서 분리된 락토바실러스 플란타룸 PL 9010 (KCCM-10357).
헬리코박터 필로리 위점막부착억제능 또는 성장억제능을 나타내는 김치에서 분리된 락토바실러스 플란타룸 PL 9011 (KCCM-10358).
제 1항에 있어서, 상기 균주는 생균, 건조균, 또는 사균인 것인 균주
락토바실러스 플란타룸을 포함하는 세균성장 저해용 조성물.
제 5항에 있어서, 상기 락토바실러스 플란타룸은 락토바실러스 플란타룸 PL 9010 (KCCM-10357) 혹은 락토바실러스 플란타룸 PL 9011 (KCCM-10358) 인 세균성장 저해용 조성물.
제 5항에 있어서, 상기 세균은 헬리코박터 필로리, 식중독 유발균으로 이루어진 군으로부터 1종 이상 선택된 것인 세균성장 저해용 조성물.
제 5항에 있어서, 상기 세균성장 저해용 조성물은 락토바실러스 플란타룸 균주의 생균, 상기 균주의 사균체 또는 상기 균주의 배양여액을 포함하는 세균성장 저해용 조성물.
락토바실러스 플란타룸 또는 이의 배양여액을 포함하는 식품첨가제.
제 9항에 있어서, 상기 식품 첨가제는 요구르트, 이유식, 유제품, 치즈, 김치, 라면, 빵, 생크림케익, 젓갈류, 두유, 음료, 주류 또는 식품에 사용되는 것을 특징으로 하는 식품 첨가제.
락토바실러스 플란타룸을 종균으로 사용하여 제조된 유제품.
락토바실러스 플란타룸을 종균으로 사용하여 제조된 발효생생식.
락토바실러스 플란타룸 또는 이의 배양여액을 포함하는 정장용 조성물.
제 13항에 있어서, 상기 정장용 조성물은 헬리코박터 필로리 및 식중독 유발균으로 이루어진 군으로부터 1종 이상 선택된 것인 세균의 성장을 억제하는 것인정장용 조성물.