KR20020045496A - 헬리코박터 필로리의 활성을 억제하는 유산균 - Google Patents

헬리코박터 필로리의 활성을 억제하는 유산균 Download PDF

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Abstract

본 발명은 헬리코박터 필로리의 활성을 억제하는 유산균에 관한 것으로, 헬리코박터 필로리의 위점막 부착을 억제시키고 헬리코박터 필로리의 성장을 저해시키는 균주, 락토바실러스 코프로필러스 PL 9001(KCCM-10245), 엔테로코커스 두란스 PL 9002(KCCM-10246), 엔테로코커스 패칼리스 PL 9003(KCCM-10247), 락토바실러스 코프로필러스 PL 9004(KCCM-10248), 락토바실러스 퍼멘텀 PL 9005(KCCM-10250) 및 락토바실러스 퍼멘텀 PL 9006(KCCM-10251)를 제공한다. 본 발명의 균주들은 위궤양 억제제, 식품첨가제, 헬리코박터 감염 예방제 또는 치료제, 식중독 치료제, 세균감염 치료제 등으로 사용할 수 있다.

Description

헬리코박터 필로리의 활성을 억제하는 유산균{LACTIC ACID BACTERIA WITH INHIBITING ACTIVITIES ON HELICOBACTER PYLORI}
본 발명은 헬리코박터 필로리의 활성을 억제하는 유산균에 관한 것으로서, 더욱 상세하게는 위궤양의 원인균인 헬리코박터 필로리의 위점막 부착을 억제할 수 있으며 성장도 억제할 수 있는 균주에 관한 것이다.
헬리코박터 필로리(Helicobacter pylori)는 그람음성 세균으로서 1983년 웨렌(Warren)과 마샬(Marshall)에 의하여 처음으로 사람의 위 점막조직에서 분리 및 동정되었다. 처음에는 캠필로박터 파이로리디스(Campylo bacter pyloridis)로 명명되었으나, 체내에서의 모양과 위내에서 주로 서식하는 유문부(pylorus)의 명칭을인용하여 '헬리코박터 필로리'로 명명되었다.
헬리코박터 필로리는 위궤양의 원인균으로, 위암의 원인균이기도 하다.(Dubois, A. 1995. Spiral bacteria in the human stomach: the gastric Helicobacters. Emerg. Infect. Dis. 1: 790085 ; Slomiany, B. L. and A. Slomiany. 1992. Mechanism of Helicobacter pylori pathogenesis: focus on mucus. J. Clin. Gastroenterol. 14 Suppl 1 S114-21) 헬리코박터 필로리에 일단 감염되면 감염이 수십 년간 지속되고, 자연적으로 제거되는 경우는 거의 없어 헬리코박터 필로리는 만성 위염의 주원인이다.
헬리코박터 필로리의 감염은 식품 등과 함께 경구적으로 침입한 균이 위, 십이지장 점막에 부착함에 따라 시작된다. 헬리코박터 필로리의 병독인자로는 위내의 강산에서 생존하기 위해 분비하는 유레아제, 운동성을 유지하도록 하는 편모, 위 상피세포에 쉽게 부착하도록 도와주는 세포 표면의 외막단백질이 있다.
헬리코박터 필로리는 위점막에 부착시 사람의 적혈구에서 발현되는 것과 같은 항원에 부착된다.(Alkout, A. M., C. C. Blackwell, D. M. Weir, I. R. Poxton, R. A. Elton, W. Luman, and K. Palmer. 1997.Gastroenterol. 112: 1179001187 ; Boren, T., P. Flak, K. A. Roth, G. Larson, and S. Normark. 1993.Science262: 1892-1895 ; Clyne, M. and B. Drumm. 1997.Gastroenterol. 113: 72-80) 특히 O형 적혈구에 발현되는 레비스 항원(Lewis antigen)과 같은 항원이 위점막에도 발현되어 O형에서 위궤양 발생율이 높다.(Heneghan, M. A., A. P. Moran, K. M. Feeley, E. L. Egan, J. Goulding J, C. E. Connolly, and C. F. McCarthy. 1998.FEMS Immunol. Med. Microbiol. 20: 257-266 ; Kobayashi, K., J. Sakamoto, Y. Yamamura, T. Kito, H. Inagaki, T. Watanabe, and H. Nakazato. 1991.Nippon Geka Gakkai Zasshi92: 813-819 ; Kobayashi, K., J. Sakamoto, Y. Kito, Y. Yamamura, T. Koshikawa, M. Fugita, T. Watanabe, and H. Nakazato. 1993.Am. J. Gastroenterol. 88: 91900924)
헬리코박터 필로리의 치료방법으로는 항생제, 프로톤 펌프 억제제, 위산 제거제를 이용한 방법을 사용하고 있으며, 헬리코박터 필로리의 대량 배양이 어려워 전체 세균을 이용한 백신 개발은 아직 이루어지지 않은 실정이다. 항생제를 이용한 방법은 약물 부작용이 있으며, 항생제에 대한 내성을 갖는 헬리코박터 필로리가 발생하는 문제점을 가지고 있다. 위산 제거제를 이용한 방법 역시 위산분비를 억제하는 방법으로 헬리코박터 필로리의 근본적인 치료가 되지 못한다. 또한 헬리코박터 필로리의 유레아제를 이용한 백신이 개발되었으나 효과가 탁월하지 않은 실정이다. 현재로써는 헬리코박터 필로리에 대한 백신은 헬리코박터 필로리의 까다로운 배양 조건과 작용 부위 때문에 앞으로도 개발이 쉽지 않을 것으로 생각된다.
한편, 락토바실러스(Lactobacillus)는 락테이트와 아직 규명되지 않은 미지의 물질을 생산하여 헬리코박터 필로리를 억제하는 것으로 밝혀져 있으며, 현재까지는 락토바실러스 살리바리우스(Lactobacillus salivarius)의 경우 그 배양액이 가장 헬리코박터 필로리 성장 억제 효과가 큰 것으로 알려져 있다.(Aiba, Y., N. Suzuki, A. M. Kabir, A. Takagi, and Y. Koga. 1998 Am. J. Gastroenterol. 93: 2097-2101) 또한 락토바실러스가 헬리코박터 필로리의 위점막 결합 부착되는 레비스 항원 (Lewis antigen) 결합을 억제하는 것으로 확인되었다.(Lee, Y., E. Shin, J. Lee, and J.H. Park. 1999. Lactobacillus acidophilus inhibits the Helicobacter pylori adherence.J. Microb. Biotech. 9: 794-797)
따라서, 본 발명은 위궤양을 억제할 수 있는 균주를 제공하는 것을 목적으로 한다.
또한 본 발명은 헬리코박터 필로리의 부착을 억제할 수 있는 균주를 제공하는 것을 목적으로 한다.
또한 본 발명은 헬리코박터 필로리의 활성을 억제할 수 있는 균주를 제공하는 것을 목적으로 한다.
또한 본 발명은 헬리코박터 필로리의 성장을 억제하는 물질을 생산하는 균주를 제공하는 것을 목적으로 한다.
또한 본 발명은 식중독 균의 성장을 억제할 수 있는 균주를 제공하는 것을 목적으로 한다.
또한 본 발명은 혐기성 세균 또는 여드름 유발균의 성장을 억제할 수 있는 균주를 제공하는 것을 목적으로 한다.
도 1은 적혈구에서 추출한 당지질에 헬리코박터 필로리를 결합시킨 것으로, 당지질의 양이 증가할수록(0 ug, 0.14 ug, 1.4 ug, 14 ug, 70 ug, 140 ug, 280 ug) 헬리코박터 필로리 부착량이 증가함을 확인한 것이고,
도 2는 본 발명의 PL 균주들이 헬리코박터 필로리의 당지질 부착을 억제하는지에 대하여 측정한 것이고,
도 3은 본 발명의 PL 균주들이 생산하는 물질에 의해 헬리코박터의 증식이 억제됨을 나타낸 것이고,
도 4는 각 PL 균주별 헬리코박터 성장 억제환의 지름을 나타낸 것이고,
도 5는 PL 균주 배양여액에 의한 헬리코박터 필로리 성장억제정도를 나타낸 그래프이고,
도 6은 본 발명의 락토바실러스 코프로필러스 PL 9001의 식중독균 성장억제능을 그래프로 나타낸 것이고,
도 7은 본 발명의 엔테로코커스 두란스 PL 9002의 식중독균 성장억제능을 그래프로 나타낸 것이고,
도 8은 본 발명의 엔테로코커스 패칼리스 PL 9003의 식중독균 성장억제능을그래프로 나타낸 것이고,
도 9는 본 발명의 락토바실러스 코프로필러스 PL 9004의 식중독균 성장억제능을 그래프로 나타낸 것이고,
도 10은 본 발명의 락토바실러스 퍼멘텀 PL 9005의 식중독균 성장억제능을 그래프로 나타낸 것이고,
도 11은 본 발명의 락토바실러스 퍼멘텀 PL 9006의 식중독균 성장억제능을 그래프로 나타낸 것이고,
도 12는 본 발명의 PL 균주들에 의한 여드름균 성장억제능을 그래프로 도시한 것이고,
도 13은 본 발명의 PL 균주들의 면역증강효과를 나타낸 그래프이다.
상기의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 헬리코박터 필로리 위막부착억제능을 나타내는 엔테로코커스를 제공한다.
또한 본 발명은 엔테로코커스를 포함하는 세균 감염 예방제 또는 치료제를제공한다.
또한 본 발명은 엔테로코커스 또는 배양여액을 포함하는 화장품 조성물을 제공한다.
또한 본 발명은 엔테로코커스 두란스 PL 9002(KCCM-10246) 또는 상기 균주의 배양여액을 포함하는 식품첨가제를 제공한다.
또한 본 발명은 엔테로코커스 두란스 PL 9002(KCCM-10246)을 유제품 제조의 종균으로 사용하여 제조되어진 식품을 제공한다.
이하 본 발명을 상세하게 설명한다.
본 발명은 헬리코박터 필로리의 위점막 부착을 억제시키는 균주를 제공한다. 상기 균주는 유산균으로 락토바실러스 속 균주 및 엔테로코커스 속 균주가 바람직하다. 더욱 바람직하게는 상기 균주가 락토바실러스 코프로필러스(Lactobacillus coprophilus), 엔테로코커스 두란스(Enterococcus durans), 엔테로코커스 패칼리스(Enterococcus faecalis) 또는 락토바실러스 퍼멘텀(Lactobacillus fermentum)이고, 가장 바람직하게는 락토바실러스 코프로필러스 PL 9001, 엔테로코커스 두란스 PL 9002, 엔테로코커스 패칼리스 PL 9003, 락토바실러스 코프로필러스 PL 9004, 락토바실러스 퍼멘텀 PL 9005 또는 락토바실러스 퍼멘텀 PL 9006이다.
상기 PL 균주들(락토바실러스 코프로필러스 PL 9001, 엔테로코커스 두란스 PL 9002, 엔테로코커스 패칼리스 PL 9003, 락토바실러스 코프로필러스 PL 9004, 락토바실러스 퍼멘텀 PL 9005 및 락토바실러스 퍼멘텀 PL 9006)은 한국미생물보존센터에 국제기탁하여 기탁번호를 부여받았다. 국제기탁번호로는 락토바실러스 코프로필러스 PL 9001는 KCCM-10245이고, 엔테로코커스 두란스 PL 9002는 KCCM-10246이고, 엔테로코커스 패칼리스 PL 9003은 KCCM-10247이고, 락토바실러스 코프로필러스 PL 9004는 KCCM-10248이고, 락토바실러스 퍼멘텀 PL 9005는 KCCM-10250이고, 락토바실러스 퍼멘텀 PL 9006은 KCCM-10251이다.
또한 본 발명은 위궤양 억제제를 제공한다. 위궤양 억제제는 락토바실러스 속 균주 또는 엔테로코커스 속 균주들을 단독 또는 혼합하여 포함하는 것을 특징으로 하고, 더욱 바람직하게로는 상기 PL 균주들을 포함한다. 락토바실러스 속 균주 또는 엔테로코커스속 균주들은 헬리코박터 필로리 성장을 억제할 뿐만 아니라 헬리코박터 필로리 위막 부착능을 억제시킨다. 상기한 효과는 락토바실러스 코프로필러스 PL 9001(KCCM-10245), 엔테로코커스 두란스 PL 9002(KCCM-10246), 엔테로코커스 패칼리스 PL 9003 (KCCM-10247), 락토바실러스 코프로필러스 PL 9004(KCCM-10248), 락토바실러스 퍼멘텀 PL 9005 (KCCM-10250) 및 락토바실러스 퍼멘텀 PL 9006 (KCCM-10251)에 대하여 실험하여 확인하였다. 또한 PL 균주들은 헬리코박터 필로리 성장을 억제 또는 헬리코박터 필로리 위막 부착능을 억제시키는 물질을 생산하므로, PL 균주 배양여액 역시 위궤양 치료제로 사용할 수 있다. PL 균주들은 내항생제성, 내산성 및 내담즙성을 가지므로 생체내에서 안정한 상태를 유지할 수 있으며, 생균, 건조균 또는 사균 형태로 사용될 수 있다.
본 발명의 위궤양 억제제는 어떠한 제형으로도 적용가능하며, 제조한 제형은 경구용, 주사용, 도포용으로 사용 할 수 있다. 상기 제형은 주사용 또는 경구용으로 조제하는 것이 바람직하고, 경구용으로 조제하는 것이 가장 바람직하다. 상기위궤양 억제제는 단일제 또는 복합제제로 제조할 수 있으며 복합제일 경우 약리학적으로 허용가능한 담체를 더욱 포함시켜 제조한다. 또한 제제에 포함되는 균주는 제조하는 제형에 따라 함량비를 조절하는 것이 바람직하다.
상기 PL 균주들의 배양여액은 통상적인 배양배지상에서 배양한 배양물을 여과 또는 원심분리하여 균주를 제거한 여액이 바람직하고, 더욱 바람직하게는 MRS 액체배지에 PL 균주를 접종하고 37 ℃에서 16시간 내지 48시간 배양한 다음 원심분리로 분리한 상등액이다.
또한 본 발명의 락토바실러스 속 균주 및 엔테로코커스 속 균주는 다른 세균의 활성을 억제할 용도로 더욱 사용할 수 있다. 바람직하게는 PL 균주(PL9001, PL9002, PL9003, PL9004, PL9005, PL9006), 세포벽 파쇄 분획, 및 PL 균주 배양여액을 혐기성 세균, 식중독 유발균, 여드름 유발균 등의 증식을 방지하는 용도로 사용하는 것이다.
상기 혐기성 세균은 통상적인 병원성 세균으로 파상풍균, 가스괴저균, 클로로스트리듐균이 바람직하고, 더욱 바람직하게는 클로로스트리듐균이다.
상기 식중독 유발균은 리스테리아증, 이질, 설사, 0157, 식중독을 유발하는 균이다.
또한 본 발명의 락토바실러스 속 균주 및 엔테로코커스 속 균주는 면역성을 증가시킬 수 있는 활성을 가져, 건강증진을 위한 용도로 활용될 수 있다.
따라서, 락토바실러스 속 균주 및 엔테로코커스 속 균주는 동물사료, 동물사료 첨가제, 식품, 식품첨가제, 약제 또는 화장품제로 사용될 수 있으며, 파쇄된 세포벽 분획, 생균, 사균, 건조균 또는 배양여액을 유효성분으로 포함시킬 수 있다. 본 발명의 락토바실러스 속 균주 및 엔테로코커스 속 균주는 독성검사 결과, 안전한 시료로 확인되었다.
상기 식품 또는 식품첨가제는 요구르트, 이유식, 치즈, 유제품, 김치, 각종 음료등 모든 식품이 바람직하고, 또한 본 발명의 락토바실러스 또는 엔테로코커스를 종균으로 사용하여 제조된 것도 바람직하다.
본 발명의 락토바실러스 또는 엔테로코커스를 포함하는 약제의 경우 액형, 분말형, 고체형, 캡슐형으로 제조하는 것이 바람직하며, 가장 바람직하게는 건조하여 캡슐로 제조하는 것이 좋다.
본 발명의 락토바실러스 또는 엔테로코커스를 포함하는 화장품제는 여드름 등 일반 세균에 의한 피부질환 예방 및 치료를 위한 마사지, 팩, 화장수 등 화장품이나 화장품첨가제가 바람직하다.
또한 본 발명은 락토바실러스 속 균주 또는 엔테로코커스 속 균주에서 생성되는 유해세균 성장억제물질을 제공한다. 상기 유해세균 성장억제물질은 헬리코박터 필로리, 혐기성 세균, 여드름 유발균, 또는 식중독 유발균의 성장을 저해하는 물질로, 상기 균주를 배양하였을 때 배양여액에서 수득되어질 수 있다. 따라서 락토바실러스 속 균주 또는 엔테로코커스 속 균주에서 생성되는 유해세균 성장억제물질 역시 세균 감염 치료제 또는 예방제로 사용할 수 있다.
이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐 본 발명이 하기의 실시예에 한정되는 것은 아니다.
[실시예]
MRS broth(Difco, bacto proteose peptone No.3 10 g, bacto beef extract 10 g, bacto yeast extract 5 g, bacto dextrose 20 g, polysorbate 80 g, ammonium citrate 2 g, sodium acetate 5 g, magnesium sulfate 0.1 g, manganese sulfate 0.05 g, dipotassium phosphate 2 g /L)에 브롬페놀 블루(bromphenol blue)를 0.002 %로 첨가한 MRS+BPB 배지를 준비하였다. 김치 시료는 펩톤수로 십배수 희석하여 0.1 ㎖씩 MRS+BPB 배지에 접종한 후 유리막대로 도말하였고, 영유아의 분변은 면봉으로 채취한 뒤 MRS+BPB 배지에 접종하였다. 배양은 25 ℃의 항온배양기에서 3-4일간 배양한 후 생성된 콜로니를 관찰하여 유산균을 분리하였다.
유산균의 집락 형태를 구별하기 위해 pH 3.0일 때 황색, pH 4.6일 때 자색을 나타내는 BPB(bromphenol blue)를 MRS 고체배지에 첨가하여 집락의 BPB 착색정도로 유산균을 감별하였다. BPB에 의한 착색 정도는 유산 생성정도와 pH 내성, 그리고 수명에 따라 형성된다.P. acidolactic와S. faecalis는 정상유산발효균주이며,L. mesenteroides와L. brevis는 이상유산발효를 하며,L. plantarum는 임의정상유산발효를 하는 것으로 알려져 있다.S. faecalis는 정상유산발효를 하므로 유산을 많이 생성하기 때문에 백색의 집락이 형성되고, 배지는 담황색으로 변화된다. 이상유산발효를 하는L. mesenteroides는 유산생성이 적으므로 집락의 색상은 전체적으로 암청색으로 환이 없고 집락의 크기가 작게 나타난다.
락토바실러스는 전체적으로 담청색을 띄거나 중앙에 암청색의 환이 있고, 또는 전체적으로 흰색이며 집락의 크기가 큰 것으로 구분하였다. 그리고P. acidolactic와L. mesenteroides가 암청색으로 되는 이유는 짧은 수명(life time)과 pH에 기인한다. 그 예로L. mesenteroides는 pH 4.8 이하에서는 생장 할 수 없다.
본 균주들은 모두 0.3 mm이상의 흰색의 집락을 형성하여 락토바실러스로 구분하였다.
단일 콜로니로 분리한 후 버기스 매뉴얼(Bergy's manual of systematic bacteriology)에 준하여 형태학적, 생화학적 특성을 조사하여, 그람염색과 카탈라제반응을 확인한 다음, API system (La Balme-les-Grottes, France)으로 동정하였다. 면봉을 이용하여 콜로니를 취한 후 멸균 증류수 2 ㎖에 부유시켰다. 부유액은 API 50 CHL 배지에 첨가하여 균질화시켰다. 균질화된 API 50 CHL 배지는 API 50 CH의 50개의 튜브에 200 ㎕씩 접종하고 미네랄 오일로 튜브 위를 덮어 준 후 37 ℃에서 48시간 동안 배양시킨 후 결과를 관찰하였다. API 50 CH 및 API 50 CHL로 49종의 탄수화물 발효패턴을 확인한 후 이 결과를 ATB 동정 컴퓨터 시스템(identification computer system, bio Merieux France)에 입력하여 동정하였다. 분리한 균 중 제 1 균의 동정 결과는 표 1과 같다.
Strip No.1 tube/substrate Strip No.2 tube/substrate Strip No.3 tube/substrate Strip No.4 tube/substrate Strip No.5 tube/substrate
- Control - Galactose - D-Mannoside - Melibiose - D-Turanose
- Glycerol + D-Glucose - D-Glucoside + Saccharose - D-Lyxose
- Erythritol + D-Fructose + Glucosamine - Trehalose - D-Tagatose
- D-Arabinose + D-Mannose + Amygdaline - Inuline - D-Fucose
- L-Arabinose - L-Sorbose + Arbutine - Melezitose - L-Fucose
- Ribose - Rhamnose + Esculine - D-Raffinose - D-Arabitol
+ D-Xylose - Dulcitol + Salicine - Amidon - L-Arabitol
- L-Xylose - Inositol + Cellobiose - Glycogene + Gluconate
- Adonitol - Mannitol + Maltose - Xylitol - 2-Gluconate
- Xyloside - Sorbitol - Lactose + Gentiobiose - 5-Gluconate
동정한 결과 제 1균주는 락토바실러스 코프로필러스(Lacto. coprophilus)에 99.9 %, 락토바실러스 브레비스(Lacto. brevis)에 0.1 % 동일성을 가짐을 확인하였다. 또한 제 1균주의 16S rRNA를 Microseq 16S rRNA gene kit(Perkin Elmer Applied Biosystem)로 염기서열을 분석하여 서열번호 1의 염기서열을 확인하였다. 서열번호 1의 염기서열은 BLAST 검색결과(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast) 락토바실러스 코프로필러스의 16S rRNA의 염기서열과 동일하였다. 락토바실러스 코프러필러스는 바이젤라 콘퓨자(Weissella confusa) 또는 락토바실러스 콘퓨서스(L. confusus)라고도 한다. 상기 균주는 락토바실러스 PL 9001(KFCC-11240)로 한국종균협회에 국내기탁하였고, 동일 균주를 락토바실러스 코프로필러스 PL 9001(KCCM-10245)로 한국미생물보존센터에 국제기탁하였다.
제 2균은 API STREP Kit을 사용하여 동정하였고, 동정결과는 표 2와 같다.
VP + ARA +
HIP - MAN +
ESC + SOR -
PYRA + LAC -
AGAL - TRE -
βGUR - INU -
βGAL - RAF -
PAL - AMD -
LAP - GLYG -
ADH + β- HEM -
RIB +
상기 제 2 균주는 API STREP KIT으로는 동정이 되지 않아 16S rRNA 염기서열을 분석하였다. 그 결과 서열번호 2의 염기서열을 가지고 있었으며, 엔테로코커스 두란스(Enterococcus durans)의 16S RNA 염기서열과 동일하였다. 따라서 가장 정확한 염기서열분석결과를 토대로, 제 2균주를 엔테로코커스 두란스 PL 9002로 명명하였다. 상기 균주는 엔테로코커스 두란스로 PL 9002(KFCC-11241)로 한국종균협회에 국내기탁하였고, 동일 균주를 엔테로코커스 두란스로 PL 9002(KCCM-10246)로 한국미생물보존센터에 국제기탁하였다.
제 3균의 동정결과는 표 3과 같다.
VP + ARA -
HIP - MAN +
ESC + SOR +
PYRA + LAC +
AGAL - TRE +
βGUR - INU -
βGAL - RAF -
PAL - AMD +
LAP + GLYG -
ADH + β- HEM -
RIB +
동정한 결과 제 3균주는 엔테로코커스 페칼리스(Enterococcus faecalis)와 99.1% 동일한 것으로 동정되었다. 상기 균주는 엔테로코커스 페칼리스 PL9003(KFCC-11242)로 한국종균협회에 국내기탁하였고, 동일 균주를 엔테로코커스 페칼리스 PL 9003 (KCCM-10247)로 한국미생물보존센터에 국제기탁하였다.
상기 제 3균주의 16S rRNA 분석결과 서열번호 3의 염기서열을 가지고 있었으며, 엔테로코커스 패칼리스(Enterococcus faecalis)의 16S RNA와 염기서열이 동일하였다.
제 4균의 동정결과는 표 4와 같다.
Strip No.1tube/substrate Strip No.2tube/substrate Strip No.3tube/substrate Strip No.4tube/substrate Strip No.5tube/substrate
- Control - Galactose - D-Mannoside - Melibiose - D-Turanose
- Glycerol + D-Glucose - D-Glucoside + Saccharose - D-Lyxose
- Erythritol + D-Fructose + Glucosamine - Trehalose - D-Tagatose
- D-Arabinose + D-Mannose + Amygdaline - Inuline - D-Fucose
+ L-Arabinose - L-Sorbose - Arbutine - Melezitose - L-Fucose
- Ribose - Rhamnose + Esculine - D-Raffinose - D-Arabitol
+ D-Xylose - Dulcitol + Salicine - Amidon - L-Arabitol
- L-Xylose - Inositol + Cellobiose - Glycogene + Gluconate
- Adonitol - Mannitol + Maltose - Xylitol - 2-Gluconate
- Xyloside - Sorbitol - Lactose + Gentiobiose - 5-Gluconate
동정한 결과 제 4균주는 락토바실러스 코프로필러스(Lacto. coprophilus)에 98.2 %, 락토바실러스 브레비스(Lacto. brevis)에 1.3 % 동일하였다. 또한 제 4균주의 16S RNA는 서열번호 4로 확인되었고, 서열번호 4의 염기서열은 BLAST 검색결과(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast) 락토바실러스 코프로필러스의 16S rRNA의 염기서열과 동일하였다. 상기 균주는 락토바실러스 PL 9004(KFCC-11243)로 한국종균협회에 국내기탁하였고, 동일 균주를 락토바실러스 코프로필러스 PL 9004(KCCM-10248)로 한국미생물보존센터에 국제기탁하였다.
제 5균의 동정결과는 표 5와 같다.
Strip No.1tube/substrate Strip No.2tube/substrate Strip No.3tube/substrate Strip No.4tube/substrate Strip No.5tube/substrate
- Control + Galactose - D-Mannoside + Melibiose - D-Turanose
- Glycerol + D-Glucose - D-Glucoside + Saccharose - D-Lyxose
- Erythritol + D-Fructose + Glucosamine - Trehalose - D-Tagatose
- D-Arabinose + D-Mannose - Amygdaline - Inuline - D-Fucose
- L-Arabinose - L-Sorbose - Arbutine - Melezitose - L-Fucose
+ Ribose - Rhamnose - Esculine + D-Raffinose - D-Arabitol
- D-Xylose - Dulcitol - Salicine - Amidon - L-Arabitol
- L-Xylose - Inositol - Cellobiose - Glycogene + Gluconate
- Adonitol - Mannitol + Maltose - Xylitol - 2-Gluconate
- Xyloside - Sorbitol - Lactose - Gentiobiose - 5-Gluconate
동정한 결과 제 5균주는 락토바실러스 퍼멘텀(Lacto. fermentum)에 93.2 %Leuoconostoc lactis와 6.7 % 동일하였다. 또한 제 5균주의 16S rRNA는 서열번호 5로 나타났으며, 서열번호 5의 염기서열을 BLAST 검색한 결과(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast) 락토바실러스 퍼멘텀의 16S rRNA의 염기서열과 일치하였다. 상기 균주는 락토바실러스 퍼멘텀 PL 9005 (KCCM-10250)로 한국미생물보존센터에 기탁하였다.
제 6균의 동정결과는 표 6과 같다.
Strip No.1tube/substrate Strip No.2tube/substrate Strip No.3tube/substrate Strip No.4tube/substrate Strip No.5tube/substrate
- Control + Galactose + D-Mannoside + Melibiose - D-Turanose
- Glycerol + D-Glucose - D-Glucoside + Saccharose - D-Lyxose
- Erythritol + D-Fructose - Glucosamine + Trehalose - D-Tagatose
- D-Arabinose + D-Mannose - Amygdaline - Inuline - D-Fucose
- L-Arabinose - L-Sorbose - Arbutine - Melezitose - L-Fucose
+ Ribose - Rhamnose - Esculine + D-Raffinose - D-Arabitol
- D-Xylose - Dulcitol - Salicine - Amidon - L-Arabitol
- L-Xylose - Inositol - Cellobiose - Glycogene - Gluconate
- Adonitol - Mannitol + Maltose - Xylitol - 2-Gluconate
- Xyloside - Sorbitol + Lactose + Gentiobiose - 5-Gluconate
동정한 결과 제 6균주는 락토바실러스 퍼멘텀(Lacto. fermentum)에 94.4 %, 락토바실러스 락티스에 5.4 % 동일하였다. 또한 제 6균주의 16S rRNA는 서열번호5로 나타났으며, 서열번호 6의 염기서열을 BLAST 검색한 결과 (http://www.ncbi.nlm.nih. gov/blast) 락토바실러스 퍼멘텀의 16S rRNA의 염기서열과 동일하였다. 상기 균주는 락토바실러스 퍼멘텀 PL 9006 (KCCM-10251)로 한국미생물보존센터에 기탁하였다.
[실험예 1] 헬리코박터 필로리 위점막 부착 억제능 실험
(1) 균주 준비
헬리코박터 필로리(ATCC 43504)는 Brucella 고형배지(Brucella broth, fungizone(2.5 mg/ml amphotericin B), Skirrow's supplement(0.16 mg/ml polymyxin B, 5 mg/ml vancomycin, 2.5 mg/ml trimethoprim), 10 % horse serum, 1.5 % agar)에 접종하여 5 내지 10 % 이산화탄소 배양기에서 37 ℃, 48시간 배양하였다. 배양된 균체는 배지로부터 긁어모아 인산완충액(PBS, pH7.4)으로 2-3회 세척하고, 소량의 10 mM Tris-Cl 완충용액에 현탁시켜 사용하기 전까지 -20 ℃에 보관하였다.
실시예 1의 균주들은 통칭하여 이하 PL 균주로 나타낸다. PL 균주들(락토바실러스 코프로필러스 PL 9001(KCCM-10245), 엔테로코커스 두란스 PL 9002(KCCM-10246), 엔테로코커스 패칼리스 PL 9003 (KCCM-10247), 락토바실러스 코프로필러스 PL 9004(KCCM-10248), 락토바실러스 퍼멘텀 PL 9005(KCCM-10250), 락토바실러스 퍼멘텀 9006(KCCM-10251))을 MRS 액체배지에 접종하여 37 ℃에서 24시간 배양한 후 원심분리로 가라앉힌 균체를 PBS(pH 7.4)로 2-3회 세척하고, 소량의 10 mM Tris-Cl 완충용액에 균체를 현탁시켜 사용하기 전까지 -20 ℃에 보관하였다.
(2) 당지질(Glycolipid) 추출 및 분리
혈액형이 O형인 사람의 적혈구 농축액으로부터 당지질을 발표된 논문에 기술된 방법으로 추출, 분리하였다.(Lee, Y., E. Shin, J. Lee, and J.H. Park. 1999. J. Microb. Biotech. 9: 794-797) 적혈구 농축액을 최소량의 물에 풀어서 -70 ℃에서 얼렸다가 녹이는 과정을 반복하여 적혈구를 파괴한 다음, 정치시켜 상등액 표면의 부유물은 제거하고 나머지 부분을 취하는 추출과정을 실시하였다. 추출은 클로로포름과 메탄올이 2:1(v/v) 비율로 혼합된 용액으로 수행하였으며, 상기 용액을 혼합하여 분리된 층에서 하층(lipid 함유)을 취하여 회전식 증발기(Rotary Evaporator)에서 건조시켰다. 건조시킨 고형물을 2 % 메탄올이 함유된 클로로포름 용액에 용해시켜 규산(silicic acid; H2SiO3) 컬럼으로 분리하였다. 시료는 클로로포름으로 충진된 규산 컬럼에 넣고, 클로로포름, 아세톤/메탄올(3:1, v/v), 메탄올 용액을 순차적으로 컬럼에 흘려 분획으로 분리시켰다. 그 중 메탄올로 용출된 분획을 취하여 증류기로 건조시킨 후 소량의 메탄올에 다시 녹여 적당량 미세원심분리 튜브(microcentrifuge tube)에 나누어 분주하여 -70 ℃에서 보관하였다.
(3) 경쟁적 지질 결합실험(Competitive Lipid Binding Assay)
부착억제능 측정은 기발표된 논문에 기재된 방법에 따라 수행하였다.(Lee, Y., E. Shin, J. Lee, and J.H. Park. 1999. J. Microb. Biotech. 9: 794-797) 추출한 당지질(14 ug/5 uL)을 박막크로마토그래피(TLC) 플레이트(Merck, Kreselgel60, EM Separations, Gibbstown, NJ, U.S.A)에 점적시킨 후 비특이적인부착을 방지하기 위해 3 % 젤라틴이 함유된 10 mM Tris-Cl(pH7.6) 완충용액에 잠기게 하여 37 ℃에서 2시간 동안 교반시켰다. 2시간 후 10 mM Tris-Cl(pH 7.6) 완충용액을 사용하여 TLC 플레이트를 2회 씻어낸 다음 PL균주(OD600=1, CFU 2.4 X 108) 현탁액을 주입하고, 5-30분 경과한 뒤에 헬리코박터 필로리를 최종 CFU가 2.0 X 108되도록 주입하여 2시간 동안 교반시켰다. 또한 락토바실러스를 제외하고 헬리코박터 필로리만 상기와 동일하게 TLC 플레이트에 주입하여 2시간 동안 교반하였다. 2시간 후 TLC 플레이트를 완충용액으로 10분씩 3회 씻어내고, 1차 항체인 헬리코박터 필로리 토끼항혈청(rabbit-antiserum, 1:600)을 첨가하여 2시간 동안 상온에서 교반하여 반응시키고, 완충용액으로 씻어낸 후 2차 항체인 항-토끼 IgG(1:1,000)를 첨가하여 상온에서 1시간동안 교반하여 반응시켰다. 1시간 후 완충용액으로 씻어낸 TLC 플레이트에 BCIP/NBT 용액을 첨가하여 발색을 관찰하였다. 적혈구에서 추출한 당지질에 헬리코박터 필로리의 부착정도의 발색정도로 확인할 수 있었다.
도 1은 적혈구에서 추출한 당지질에 헬리코박터 필로리를 결합시킨 것으로, 당지질의 양이 증가할수록(0 ug, 0.14 ug, 1.4 ug, 14 ug, 70 ug, 140 ug, 280 ug) 헬리코박터 필로리 부착량이 증가함을 확인할 수 있었다.
도 2는 본 발명의 6종의 균주가 헬리코박터 필로리의 당지질 부착을 억제하는지에 대하여 측정한 것으로, PL균주(락토바실러스 코프로필러스 PL 9001(KCCM-10245), 엔테로코커스 두란스 PL 9002(KCCM-10246), 엔테로코커스 패칼리스 PL 9003(KCCM-10247), 락토바실러스 코프로필러스 PL 9004(KCCM-10248), 락토바실러스퍼멘텀 PL 9005(KCCM-10250), 락토바실러스 퍼멘텀 PL 9006(KCCM-10251))와 헬리코박터 필로리를 각각 TLC 플레이트에 주입한 것이다. 도 2에서 나타난 바와 같이, 본 실험에서 분리한 균주는 헬리코박터 필로리의 당지질 부착을 억제시켰다.
[실험예 2] 헬리코박터 필로리 성장억제능 실험
(1) PL 균주 배양여액에 의한 헬리코박터 성장 억제실험
PL 균주들(락토바실러스 코프로필러스 PL 9001 (KCCM-10245), 엔테로코커스 두란스 PL 9002(KCCM-10246), 엔테로코커스 패칼리스 PL 9003(KCCM-10247), 락토바실러스 코프로필러스 PL 9004(KCCM-10248), 락토바실러스 퍼멘텀 PL 9005(KCCM-10250), 락토바실러스 퍼멘텀 PL 9006 (KCCM-10251))을 MRS 액체배지에 접종하여 37 ℃에서 24시간 배양한 후 원심분리하여 상등액을 분리한 다음 상기 상등액을 배양여액으로 준비하였다.
PL 균주 배양여액에 의한 헬리코박터 성장 억제실험을 실시하였다. Brucella 고형배지(Brucella broth에 멸균된 파스퇴르 파이펫을 이용하여 구멍(well)을 만들었다. 고형배지에 헬리코박터 필로리를 도말하고, 구멍에 PL 균주 배양여액(spent culture: 배양한 후 균을 제거한 배양여액)을 첨가하였다. 이산화탄소 배양기(5 % 내지 10 % CO2)에서 배양하고 이틀 뒤 배양액여내의 억제 물질로 인하여 헬리코박터 필로리의 성장이 억제된 환의 지름을 측정하였다.
도 3은 PL균주 배양여액의 헬리코박터 필로리 성장 억제능을 측정한 사진이고, 도 4는 PL 균주 배양여액에 의한 헬리코박터 필로리 성장 억제환의 지름을 나타낸 것이다. PL 9001은 락토바실러스 코프로필러스 PL 9001(KCCM-10245), PL 9002는 엔테로코커스 두란스 PL 9002 (KCCM-10246), PL 9003은 엔테로코커스 패칼리스 PL 9003 (KCCM-10247), PL 9004는 락토바실러스 코프로필러스 PL 9004 (KCCM-10248)이다. 도 4의 결과에서 알 수 있듯이, PL 균주들은 헬리코박터 필로리의 성장을 억제하는 물질을 분비함을 할 수 있다.
(2) 동결건조된 PL 균주 배양여액의 헬리코박터 성장억제
PL균주 MRS 배양여액 4 ml에 멸균된 MQ 2 ml을 첨가하여 총 6 ml로 맞추어 동결건조시켰다. 동결건조된 배양여액 시료는 6 ml(동량)의 skim milk(10 mg/ml)에 다시 풀어서 1 ml 씩 취하고, 헬리코박터 필로피(OD625=1.0)를 10 ul씩 첨가하여 1시간동안 37 ℃ 이산화탄소 배양기에서 배양하였다. 원심분리(15000 rpm, 10min)하여 상등액을 멸균 MQ로 1/2 희석한 후 인돌페놀(indophenol)방법에 의한 유레아제(urease)성분을 측정하였다. 측정된 수치는 헬리코박터 필로리로부터 유래한 유레아제 활성에 비례하므로 시료상에 존재하는 헬리코박터 필로리 균의 양을 알 수 있다. 이러한 원리를 통하여 헬리코박터 필로리에 대한 PL균주 배양여액의 처리에 따른 헬리코박터 성장억제 효과를 측정하였다.
도 5는 본 발명의 PL 균주 배양여액에 의한 헬리코박터 필로리 성장억제정도를 나타낸 그래프로, 동결건조된 PL 균주 배양여액이 헬리코박터 필러리 성장억제능을 유지함을 알 수 있었다.
[실험예 3] 독성검사
실시예의 PL 균주들에 대한 경구독성시험은 식품의약품안전청고시 제19990061호 '의약품 등의 독성시험기준(1999. 12. 22)'에 의거하여 실시하였다.
5 주령(암컷 : 100 ∼ 120g / 수컷 : 110 ∼ 130g)의 랫드(Sprague- Dawley)를 (260 W x 20 L x 80H mm) 케이지에 온도 23 ±2 ℃, 상대습도 50 ±10 %의 조건으로 사육하였다.
국립보건안전연구원 예규 10호 "의약품 등의 독성시험기준(1988. 10. 29.)"2)에 따르면 경구투여시 LD50치가 5,000 mg/kg 이상이면 저독성으로 해석하고 있다. 따라서 본 시험에서는 생균제제의 LD50치를 밝히기 위하여 랫드에 투여할 수 있는 최대용량인 체중 kg 당 5,000 mg을 투여용량(투여액량 ; 20 ml/kg B.W.)으로 설정하였다.
유산균 성별 동물수 투여량(mg/kg B.W) 투여액량(ml/kg B.W)
I(PL 90011) Male 5 5,000 20
Female 5
II(PL 9002) Male 5 5,000 20
Female 5
III(PL 9003) Male 5 5,000 20
Female 5
IV(PL 9004) Male 5 2,500 20
Female 5
V(PL 9004) Male 5 5,000 20
Female 5
VI(대조군) Male 5 0 20
Female 5
상기 표 7의 방법으로 14일간 실시하였으나, 사망예는 전혀 관찰되지 않아 LD50치의 산정은 불가능하였다.
표 8은 실험군의 체중변화를 나타낸 것으로, 유의성 있는 체중차이는 전혀관찰되지 않았다.
Sex Days Ⅰ Ⅱ Ⅲ Ⅳ Ⅴ Ⅵ
M 0 120.1±3.10 120.2±3.08 120.1±3.08 120.4±2.86 120.2±3.25 120.1±3.31
3 142.6±6.81 146.9±4.15 140.5±5.46 140.7±8.85 145.4±7.73 143.0±3.68
7 162.7±7.96 161.0±5.87 155.5±2.92 156.6±11.59 162.1±5.64 159.8±3.06
14 212.3±8.40 193.1±18.03 194.9±9.14 201.1±22.72 195.5±11.14 193.6±16.24
F 0 114.0±4.34 113.9±4.11 113.9±4.17 113.5±4.41 113.5±4.45 113.6±4.50
3 134.3±6.81 132.6±4.15 131.0±5.46 132.5±8.85 129.8±7.73 129.2±3.68
7 155.4±8.01 151.5±5.69 149.5±5.86 152.2±7.55 148.6±5.81 148.8±6.57
14 199.8±8.16 192.7±10.87 192.5±10.0 193.8±12.06 194.7±7.55 192.6±9.35
또한 모든 생존동물의 부검을 실시하였으나 유의할 만한 육안적인 병변은 관찰되지 않았다.(표 9)
기 관 Ⅰ Ⅱ Ⅲ Ⅳ Ⅴ Ⅵ
Brain No. of observations 5 5 5 5 5 5
No gross findings 5 5 5 5 5 5
Kidney-Left No. of observations 5 5 5 5 5 5
No gross findings 5 5 5 5 5 5
Kidney-Right No. of observations 5 5 5 5 5 5
No gross findings 5 5 5 5 5 5
Heart No. of observations 5 5 5 5 5 5
No gross findings 5 5 5 5 5 5
Lung No. of observations 5 5 5 5 5 5
No gross findings 5 5 5 5 5 5
Spleen No. of observations 5 5 5 5 5 5
No gross findings 5 5 5 5 5 5
Liver No. of observations 5 5 5 5 5 5
No gross findings 5 5 5 5 5 5
Stomach No. of observations 5 5 5 5 5 5
No gross findings 5 5 5 5 5 5
Intestine No. of observations 5 5 5 5 5 5
No gross findings 5 5 5 5 5 5
Pancreas No. of observations 5 5 5 5 5 5
No gross findings 5 5 5 5 5 5
Adrenal gland(left) No. of observations 5 5 5 5 5 5
No gross findings 5 5 5 5 5 5
Adrenal gland(right) No. of observations 5 5 5 5 5 5
No gross findings 5 5 5 5 5 5
Pituitary gland No. of observations 5 5 5 5 5 5
No gross findings 5 5 5 5 5 5
Ovary-L No. of observations 5 5 5 5 5 5
No gross findings 5 5 5 5 5 5
Ovary-R No. of observations 5 5 5 5 5 5
No gross findings 5 5 5 5 5 5
Other organs No. of observations 5 5 5 5 5 5
No gross findings 5 5 5 5 5 5
따라서, 실시예의 PL 균주는 경구독성 및 부작용을 유발하지 않는 안전한 시료로 확인되었다.
[실험예 4] 식중독 성장억제실험
각 PL 균주의 MRS 배양여액과 2배 농도의 BHI 배양액을 동량 혼합하였다. 여기에 BHI(Brain Heart Infusion : Brain Hear, Infusion form, 6.0 g, Peptic digest of animal tissue 6.0 g, sodium chloride 5.0 g, dextrose 3.0 g, pancreatic digest of gelatin 14.5 g, disodium phosphate 2.5 g)에서 성장한 살모넬라 티피무리움(Salmonella typhimurium), 살모넬라 엔테리티디스(Salmonella. enteriditis),E. coliO157:H7, 에로모나스 히드로필라(Aeromonas hydrophila), 리스테리아 모노시토제네스(Listeria monocytogenes)을 최종농도가 1 % 되도록 접종하여 37 ℃에서 배양하였다. 접종 후 6시간과 24시간에 배양액 내의 각각의 생균수를 측정하였다. 이때 리스테리아 모노시토제네스(L.M 이라 기재함)는 혈액한천배지에, 살모넬라 티피무리움(S.T라 기재함), 살모넬라 엔테리티디스(S.E라 기재함), E. coli O157:H7(O157이라 기재함), 및 에로모나스 히드로필라(A.H라 기재함)는 MacConkey 배지에 접종하여 O.D600값으로 생균수를 측정하였다.
표 10은 PL 9001 배양여액에 의한 식중독 균주 성장 O.D600값을 나타낸 것이다.
조건 0 시간 5 시간 24 시간
L.M 0.055 0.487 0.335
L.M+배양액 0.059 0.069 0.068
S.T 0.053 0.538 0.748
S.T+배양액 0.063 0.073 0.072
S.E 0.053 0.572 0.966
S.E+배양액 0.059 0.073 0.07
O157 0.051 0.408 0.468
0157+배양액 0.06 0.074 0.065
A.H 0.077 0.418 0.432
A.H+배양액 0.069 0.093 0.083
도 6은 본 발명의 락토바실러스 코프로필러스 PL9001의 식중독균 성장억제능을 그래프로 나타낸 것으로, 표 10의 결과를 나타낸(0시간일 때 O.D600값을 100으로 하여 환산) 것이다. 표 10 및 도 6에서 알수 있듯이, 락토바실러스 코프로필러스 PL 9001은 식중독균을 억제하는 물질을 생산하여 식중독균의 성장을 억제하였다.
또한 엔테로코커스 두란스 PL 9002는 식중독균의 성장을 억제하였다. 측정결과는 하기 표 11과 도 7에 나타내었다.
조건 0 시간 5 시간 24 시간
L.M 0.055 0.487 0.335
L.M+배양액 0.059 0.071 0.17
S.T 0.053 0.538 0.748
S.T+배양액 0.064 0.073 0.196
S.E 0.053 0.572 0.966
S.E+배양액 0.061 0.074 0.167
O157 0.051 0.408 0.468
0157+배양액 0.59 0.073 0.17
A.H 0.077 0.418 0.432
A.H+배양액 0.065 0.086 0.235
또한 엔테로코커스 패칼리스 PL 9003에 의한 식중독 균 성장억제정도를 측정하였다. 하기 표 12는 엔테로코커스 패칼리스 PL 9003 배양여액상에서 식중독균의 O.D600값을 나타낸것이고, 도 8은 표 12의 결과를 그래프로 나타낸 것이다. 엔테로코커스 패칼리스 PL 9003은 식중독균의 성장을 크게 억제하는 물질을 생성함을 알 수 있었다.
조건 0 시간 5 시간 24 시간
L.M 0.055 0.487 0.335
L.M+배양액 0.058 0.007 0.075
S.T 0.053 0.538 0.748
S.T+배양액 0.063 0.074 0.084
S.E 0.053 0.572 0.966
S.E+배양액 0.062 0.074 0.082
O157 0.051 0.408 0.468
0157+배양액 0.058 0.07 0.071
A.H 0.077 0.418 0.432
A.H+배양액 0.066 0.085 0.094
또한 락토바실러스 코프로필러스 PL 9004에 의한 식중독 균 성장억제정도를 측정하였다. 하기 표 13은 락토바실러스 코프로필러스 PL 9004 배양여액상에서 식중독균의 O.D600값을 나타낸 것이고, 도 9는 표 13의 결과를 그래프로 나타낸 것이다. 락토바실러스 코프로필러스 PL 9004은 식중독균의 성장을 크게 억제시키나, 시간이 경과됨에 따라 식중독균 성장 억제능이 약화되었다.
조건 0 시간 5 시간 24 시간
L.M 0.055 0.487 0.335
L.M+배양액 0.06 0.075 0.287
S.T 0.053 0.538 0.748
S.T+배양액 0.063 0.071 0.266
S.E 0.053 0.572 0.966
S.E+배양액 0.061 0.073 0.227
O157 0.051 0.408 0.468
0157+배양액 0.062 0.073 0.267
A.H 0.077 0.418 0.432
A.H+배양액 0.065 0.087 0.251
또한 락토바실러스 퍼멘텀 PL 9005에 의한 식중독 균 성장억제정도를 측정하였다. 하기 표 14는 락토바실러스 퍼멘텀 PL 9005 배양여액상에서 식중독균의 O.D600값을 나타낸 것이고, 도 10은 리스테리아증에 대한 락토바실러스 퍼멘텀 PL 9005의 성장억제능을 그래프로 나타낸 것이다. 락토바실러스 퍼멘텀 PL 9005은 식중독균의 성장을 크게 억제시켰다.
조건 0 hr 5 hr 24 hr
L.M 0.055 0.487 0.335
L.M+배양액 0.06 0.068 0.413
S.T 0.053 0.538 0.748
S.T+배양액 0.065 0.074 0.434
S.E 0.053 0.572 0.966
S.E+배양액 0.062 0.075 0.448
O157 0.051 0.408 0.468
O157+배양액 0.06 0.077 0.389
A.H 0.077 0.418 0.432
A.H+배양액 0.067 0.087 0.245
또한 락토바실러스 퍼멘텀 PL 9006에 의한 식중독 균 성장억제정도를 측정하였다. 하기 표 15는 락토바실러스 퍼멘텀 PL 9006 배양여액상에서 식중독균의 O.D600값을 나타낸것이고, 도 11은 리스테리아증에 대한 락토바실러스 퍼멘텀 PL 9006의 성장억제능을 그래프로 나타낸 것이다. 락토바실러스 퍼멘텀 PL 9006은 식중독균의 성장을 크게 억제시켰다.
조건 0 hr 5 hr 24 hr
L.M 0.055 0.487 0.335
L.M+배양액 0.058 0.068 0.283
S.T 0.053 0.538 0.748
S.T+배양액 0.061 0.073 0.303
S.E 0.053 0.572 0.966
S.E+배양액 0.065 0.069 0.428
O157 0.051 0.408 0.468
O157+배양액 0.063 0.077 0.435
A.H 0.077 0.418 0.432
A.H+배양액 0.067 0.087 0.112
상기에서 나타난 바와 같이, 본 발명의 PL균주들이 식중독을 유발하는 균주의 성장을 억제하는 물질을 생산함을 확인할 수 있었다. 또한 시간의 경과에 따라 감소되는 효과는 식중독균 배지내에 투여한 한정된 억제물질이 모두 소모된 것에 의한 것으로, 계속적으로 PL 균주를 사용할 경우 계속적인 식중독균 성장억제효과를 나타낼 수 있을 것이다.
[실험예 5] 여드름균 성장 억제능
피부에 정상으로 존재하는 균의 하나로, 여드름생성에 관여하는 프로피오니박테륨 아크네(Propionibacterium acne, KCTC3314)를 액티노마이세스 브로스(actinomyces broth, 5 ml)에 접종하고, 위에 멸균된 파라핀오일을 덮어서 2일간 혐기적으로 정치배양하였다.(BR Vowels, S Yang, JJ Leyden. 1995. Inductionof proinflammatory cytokines by a soluble factor of Profionibacterium acnes: Implications for chronic inflammatory acne. Infection and Immunity 63: 3158-3165) MRS 액체배지에 배양한 PL 배양여액 45 ml에 프로피오니박테륨 아크네 배양물 5 ml을 혼합하였다. 혼합액 50 ul를 새로운 액티노마이세스 액체배지 5 ml에 접종하여 2일간 혐기적으로 정치배양하였다. 배양액내의 생균수를 측정하기 위하여 배양액을 0.05 % L-시스테인(Cysteine)이 함유된 혐기성 세균용 희석 용액으로 희석하고(OD600=2.4 일 때 약 9.6 X 108CFU/ml), 이중 100 ul를 취하여 액티노마이세스 고형 평판배지에 접종한 후 혐기성 배양기(anaerobic jar)에 넣어 37 ℃에서 6-7일간 배양하여 형성된 콜로니를 측정하여 생균수를 확인하였다. 도 12는 본 발명의 PL 균주에 의한 여드름균 성장억제능을 그래프로 도시한 것으로, 락토바실러스 코프로필러스 PL 9001는 프로피오니박테륨 아크네 성장을 거의 억제하지 못하였고, 엔테로코커스 두란스 PL 9002 및 엔테로코커스 패칼리스 PL 9003는 프로피오니박테륨 아크네 성장을 완전히 억제하였으며, 락토바실러스 코프로필러스 PL 9004, 락토바실러스 퍼멘텀 PL 9005 및 락토바실러스 퍼멘텀 PL 9006은 프로피오니박테륨 아크네 성장을 억제하였다.
[실험예 6] 혐기성 균의 성장억제
클로스트로디움 페르프린젠스(Clostrodium perfringens)를 헤민(Hemin, 0.01 g/L)과 L-시스테인(0.5 g/L)이 함유된 BHI 액체배지에 접종하고 37 ℃에서 24시간 혐기적으로 배양하였다.(Balows A Hausler WJ Herrmann KL Isenberg HD ShadomyHJ. Chapter 50. Clostridium. p505-521. Manual of Clinical Microbiology, 5th ed. ASM Washington D.C. U.S.A.) PL균주 배양여액과 2배 농도 BHI 배양액의 동량 혼합액하여 클로스트로디움 페르프린젠스의 최종농도가 1 % 되도록 접종하여 배양액 위에 파라핀 오일을 덮어 혐기적으로 37 ℃에서 배양하였다. 24시간후 배양액을 희석한 후 혈액한천배지에 접종하여 혐기적 배양기에서 37 ℃, 48시간 배양한 후 생균수를 측정하여 log 값으로 나타내었다.
생균수(log cfu)
0 hrs 24 hrs
클로스트로디움 페르프린젠스 6.60 8.30
락토바실러스 코프로필러스 PL 9001 6.60 7.60
엔테로코커스 두란스 PL 9002 6.78 7.66
엔테로코커스 패칼리스 PL 9003 6.60 7.48
락토바실러스 코프로필러스 PL 9004 6.90 8.00
락토바실러스 퍼멘텀 PL 9005 6.60 7.78
락토바실러스 퍼멘텀 PL 9006 6.60 7.41
본 발명의 PL 균주 모두 혐기성 균주의 성장의 억제할 수 있는 물질을 생산하는 것으로 확인되었다.
[실험예 7] 면역증강효과
마이크로웰에 정제한 토끼 항-TNF-α 또는 IL-6를 포함하는 IL-코팅 완충액 50 ul로 피복하고 냉장 온도에서 하룻밤 방치하였다. PBST(tween80+phosphate buffer)용액으로 피복된 마이크로웰을 3회 세척한 다음 3 % BSA-PBST를 넣은 후 30분동안 반응시켰다. 마이크로웰을 PBST로 4회 세척하고 TNF-α standard/IL-6 standard(recombinant mouse TNF-alpha/IL-6, SEROTEC.UK) 또는 하룻밤 PL 균주를 첨가하여 배양한 마크로파지(macrophage) 상등액을 50 ul씩 첨가한 후 37 ℃에서 1시간 반응시켰다. 마이크로웰은 PBST로 4회, 멸균 증류수로 1회 세척하고, 3 % BSA-PBST에 바이오티닐레이티드 렛 항-마우스 TNF-alpha 또는 IL-6(biotinylated rat anti-mouse TNF-alpha/IL-6, 1ug/ml)를 첨가하여 50 ul 씩 분주한 후 상온에서 1시간 반응시켰다. 마이크로웰을 PBST로 6회, 멸균 증류수로 1회 세척하고, 스트렙타비딘 퍼록시데이즈(streptavidin peroxidase)을 분주하여 1시간 반응시켰다. 마이크로웰은 PBST로 8회, 멸균 증류수로 2회 세척하고, TMB substrate(25 ml citric-phosphate buffer+400 ul TMB stock+100ul 1%H2O2)를 첨가한 후 발색할 때 까지 상온에 놓아두었다. 마이크로웰에 6 N H2SO4를 넣어 반응을 종료시킨 후 OD450에서 면역반응성을 측정하였다.
따라서, 본 발명의 유산균은 면역 증강제로 사용될 수 있으며 특히 어린이와 환자들과 같이 면역이 약화된 사람들의 면역을 증가시키는 건강보조식품 및 치료제로 사용될 수 있다.
[실험예 8] 내산성 및 내담즙성 검증
시스테인이 첨가된 MRS 배지는 4 N HCl과 0.1 N NaOH로 pH를 7, 4.5, 4.0로 적정한 다음 멸균하여 사용하였으며, 담즙의 영향은 옥스갈(oxgall powder)를 0 %, 0.25 %, 0.50 % 농도로 배지에 첨가하여 멸균한 후 사용하였다. 배지에 활성화된 균액(OD=1)을 1 %로 접종시키고, 24시간 간격으로 620 nm에서 흡광도를 측정하였다. 하기 표 18은 내산성, 내담즙성을 나타낸 것으로, PL 9003이 내산실험에서 산에 약한 것으로 나타났으나 나머지 PL 9001, PL 9002, PL 9004, PL 9005, PL 9006은 내산성이 강했으며 PL 균주 모두 강한 내담즙성을 나타내었다. 즉, 6종의 PL 균주들은 위 및 장에서 안전함을 알 수 있었다.(Conway PL Gorback SL goldin BR. 1987. Survival of lactic acid bacteria in the human stomach and adhesion to intestinal cells. J. Dairy Sci. 70: 1-12. : Ibrahim SA Bezkorovainy A. 1993. Survival of bifidobacteria in the presence of bile salt. J. Sci. Food Agric. 62: 351-354)
Time PL 9001 PL 9002 PL 9003 PL 9004 PL 9005 PL 9006
pH 7 24 hr 1.40 1.20 1.00 1.40 1.50 1.50
48 hr 1.50 1.50 1.20 1.50 1.50 1.50
pH 5.0 24 hr 1.00 0.70 0.31 0.90 1.50 1.50
48 hr 1.50 0.80 0.45 1.10 1.50 1.50
pH 4.5 24 hr 0.18 0.21 0.06 0.18 1.50 1.50
48 hr 0.70 0.28 0.09 0.15 1.50 1.50
옥스갈 0.25 % 24 hr 1.40 1.20 1.00 1.20 1.10 1.20
48 hr 1.50 1.50 1.40 1.50 1.40 1.20
옥스갈 0.50 % 24 hr 1.10 1.20 1.10 0.85 0.75 0.70
48 hr 1.40 1.50 1.40 1.00 0.76 0.70
[실험예 9] 항생제 내성 측정
PL 균주들에 대한 항생제 내성을 측정하였다. PL 균주를 MRS 고체배지에 접종하고, 여기에 표 18의 항생제가 포함된 필터(직경 6 mm)를 올려놓고 24-48시간 배양하여 항생제에 의한 형성된 억제환의 크기를 측정하였다. 억제환의 크기가 작을수록 항생제에 대한 내성이 크다는 것을 의미한다. 하기 표 18은 PL 균주에 대한 항생제 내성정도를 나타낸 것이다.
항생제 PL9001 PL9002 PL9003 PL9004 PL9005 PL9006
Penicillin(10 IU/E/UI) 20 mm 20 mm 24 mm 23 mm 30 mm 30 mm
Ampicillin(10 ug) 30 mm 24 mm 26 mm 30 mm 30 mm 32 mm
Cephalothin(30 ug) 30 mm 20 mm 20 mm 24 mm 30 mm 30 mm
Gentamycin(10 ug) 13 mm - - 12 mm 15 mm 16 mm
Vancomycin(30 ug) - 20 mm 16 mm - - -
Erythromycin(15 ug) 21 mm - - 22 mm 26 mm 29 mm
Tetracycline(30 ug) 26 mm 30 mm 10 mm 24 mm 27 mm 30 mm
상기의 결과와 같이, 본 발명의 PL 균주들은 높은 항생제내성을 가진다.
상기에 언급한 바와 같이, 본 발명의 락토바실러스 코프로필러스 PL 9001, 엔테로코커스 두란스 PL 9002, 엔테로코커스 패칼리스 PL 9003, 락토바실러스 코프로필러스 PL 9004, 락토바실러스 퍼멘텀 PL 9005, 락토바실러스 퍼멘텀 PL 9006은 헬리코박터 필로리의 성장 및 위막 부착능을 억제한다. 또한 본 발명의 PL 균주, PL 균주 파쇄물, 또는 PL 균주 배양여액은 헬리코박터의 감염을 예방 및 치료하는 용도로 사용할 수 있으며, PL 균주 및 PL 균주 배양여액은 식중독 성장억제, 여드름균 성장억제, 혐기성균 성장억제 및 면역증강효과를 나타내어 감염 예방 및 치료의 목적으로 사용할 수 있다.

Claims (14)

  1. 헬리코박터 필로리 위막부착억제능을 나타내는 엔테로코커스.
  2. 제 1항에 있어서, 상기 엔테로코커스는 엔테로코커스 두란스 PL 9002(KCCM-10246)인 것을 특징으로 하는 엔테로코커스.
  3. 제 1항 내지 제 2항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 엔테로코커스는 생균, 건조균, 또는 사균인 것을 특징으로 하는 엔테로코커스.
  4. 엔테로코커스를 포함하는 세균 감염 예방제 또는 치료제.
  5. 제 4항에 있어서, 상기 엔테로코커스는 엔테로코커스 두란스 PL 9002(KCCM-10246)인 것을 특징으로 하는 세균 감염 예방제 또는 치료제. .
  6. 제 4항에 있어서, 상기 세균은 헬리코박터 필로리, 식중독 유발균, 여드름 유발균 또는 혐기성 세균인 것을 특징으로 하는 세균 감염 예방제 또는 치료제.
  7. 제 4항에 있어서, 상기 엔테로코커스는 생균, 파쇄된 세포벽 분획 또는 배양여액인 것을 특징으로 하는 세균 감염 예방제 또는 치료제.
  8. 엔테로코커스 또는 엔테로코커스 배양여액을 포함하는 화장품 조성물.
  9. 제 8항에 있어서, 상기 엔테로코커스는 엔테로코커스 두란스 PL 9002(KCCM-10246)인 것을 특징으로 하는 화장품 조성물.
  10. 제 8항에 있어서, 상기 화장품 조성물은 세균성 질환에 피부 외용제로 사용되는 것을 특징으로 하는 화장품 조성물.
  11. 제 8항에 있어서, 상기 화장품 조성물은 여드름 치료제로 사용되는 것을 특징으로 하는 화장품 조성물.
  12. 엔테로코커스 두란스 PL 9002(KCCM-10246) 또는 상기 균주의 배양여액을 포함하는 식품첨가제.
  13. 제 12항에 있어서, 상기 식품 첨가제는 요구르트, 이유식, 유제품, 치즈, 김치, 음료 또는 식품에 사용되는 것을 특징으로 하는 식품 첨가제.
  14. 엔테로코커스 두란스 PL 9002(KCCM-10246)을 유제품 제조의 종균으로 사용하여 제조되어진 식품.
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