KR20160053445A

KR20160053445A - 염증 질환 예방 또는 치료용 조성물

Info

Publication number: KR20160053445A
Application number: KR1020140152294A
Authority: KR
Inventors: 정명준
Original assignee: 주식회사 쎌바이오텍
Priority date: 2014-11-04
Filing date: 2014-11-04
Publication date: 2016-05-13
Also published as: KR101656208B1

Abstract

본 발명은 유효성분으로서 락토바실루스 카제이 LC5 (Lactobacillus casei LC5, (KCTC 12398)), 락토바실루스 플란타룸 LP3((Lactobacillus plantarum LP3(KCTC 10782)), 락토바실루스 람노수스 LR5 (Lactobacillus rhamnosus LR5(KCTC 12202BP), 및 비피도박테리움 애니말리스 락티스 BL3(Bifidobacterium animalis subsp. lactis BL3 (KCTC 11904BP)), 또는 이들의 배양물을 포함하는 염증 질환의 예방 또는 치료에 효과적인 조성물에 관한 것이다.

Description

염증 질환 예방 또는 치료용 조성물{COMPOSITION FOR USE IN THE PREVENTION OR TREATMENT OF INFLAMMATORY DISEASE}

본 발명은 염증 질환 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 4종의 유산균 균주들을 포함하여 염증의 예방 및 치료에 유용한 복합 유산균 함유 염증 질환 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것이다.

일반적으로, 염증성 장 질환(Inflammatory Bowel Disease : "IBD")은 장내의 항원에 대한 이상 면역 반응으로 인해 유전적으로 민감한 개체에서 발생하는 증상이다. 염증성 장 질환의 발병은 점막 면역계의 파괴를 유발하여, 내인성 항원에 대한 반응을 약화시키는 것으로 여겨진다. 염증성 장 질환은 궁극적으로 장 점막의 손상을 유발하는 점막 T-세포의 기능 이상, 이상 사이토카인 생성 및 세포 염증을 특징으로 하는 일련의 만성, 재발성 및 조직 파괴성 질환이다.

염증성 장 질환(IBD)의 임상 증상은 설사, 복통, 직장 출혈, 체중 감소, 피로감이며, 간혹 발열이 발생하고, 염증성 장 질환의 임상 진행은 매우 다양해서, 경증 또는 중도 증상인 환자는 입원하지 않고 치료를 받을 수 있으나, 환자의 10-15%는 심각한 수준으로 질병이 진행되어, 많은 경우 수술을 동반한다.

IBD는 의학적으로 염증을 완화시켜, 위장 증상을 제어함으로써 치료된다. 그러나 현재 IBD에 대한 의학적 치료법은 없는 실정이다. 대장 절제술로 대장 궤양을 제거할 수는 있지만, 삶의 질을 저하시키고 합병증 위험성을 높일 수 있다. 이용가능한 의학적 치료법은 약품과 면역조절제를 사용하는 것이다. 그러나 기존에 사용되고 있는 약제들은 설사 또는 복통 등의 부작용이 발생하고, 장기간 사용 시 골량 감소, 감염, 당뇨병, 근육 소모증 및 정신 분열을 비롯한 중증 부작용이 나타난다. 면역조절제는 면역계를 억제함으로써 IBD 증상을 제어하지만, 그 결과로 형성되는 면역-저하 상태로 인해서 환자는 여러 질환들에 걸리기 쉬운 상태가 된다. 이와 같이, 최근 안전성에 대한 문제들로 인해 그 적용이 여러 가지로 제약 되고 있다. 따라서 IBD에 대한 새로운 치료제를 개발하는데 관심이 집중되고 있다.

염증성 장 질환 환자를 치료하기 위한 프로바이오틱스를 단독으로 또는 항생제와 조합하여 이용한 연구들이 수행되고 있다. 일례로 국내 특허 공개 제2012-0016647호는 락토바실루스 람노수스 LGG (ATCC 53103), 락토바실루스 람노수스 LC705 (DSM 7061) 및/또는 프로피오니박테리움 프레우덴레이키이 ssp. 셔마니 JS (DSM 7067) 또는 이들의 혼합물로 구성되는 식이에 의해 유발된 저등급 염증을 완화, 예방 및/또는 치료하기 위한 프로바이오틱 조성물을 개시하고 있다.

미국 특허 제7,195,906호에서는 염증 질환, 특히 위장 염증을 치료하기 위한, 인간 위장관에서 분리된 비피도박테리움 균주(비피도박테리움 NCIMB 41003)를 개시하고 있고, 미국특허공재 제2012/0269791호는 발효된 시리얼과 락토바실루스 또는 비피도박티움과 같은 비병원성 미생물을 포함하는 조성물을 이용해서 염증성 장 질환을 치료하는 방법을 개시하고 있다.

유망한 잠재성에도 불구하고, 염증성 장 질환뿐만 아니라 다른 위장 질환의 치료에 사용하기 위해, 프로바이오틱의 효과에 상당한 개선이 요구되고 있다. 그러나 상기 조성물들의 염증 질환 개선 효과는 충분하지 아니하므로, 보다 효과가 우수한 프로바이오틱스를 포함하는 염증 질환, 특히 위장 염증의 치료에 유용한 조성물의 개발이 요구되고 있다.

본 발명은 상술한 본 발명이 속하는 기술 분야의 기술적 요구에 부응하기 위한 것으로, 본 발명의 하나의 목적은 다양한 종의 유산균 균주들을 포함하여 염증 질환의 예방 또는 치료에 유용한 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 다양한 종의 프로바이오틱스를 또는 그 배양물을 포함하는 식품(foodstuff)을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 염증 질환의 예방 또는 치료에 유용한 효능을 제공하는 신규한 유산균 균주들을 제공하는 것이다.

상술한 목적을 달성하기 위한 본 발명의 하나의 양상은 락토바실루스 카제이 LC5 (Lactobacillus casei LC5), 락토바실루스 플란타룸 LP3 (Lactobacillus plantarum LP3), 비피도박테리움 애니말리스 락티스 BL3 (Bifidobacterium animalis subsp. lactis BL3 (KCTC 11904BP)), 락토바실루스 람노수스 LR5 (Lactobacillus rhamnosus LR5(KCTC 12202BP) 또는 이들의 배양물을 포함하는 염증 질환 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것이다.

본 발명의 복합 유산균을 포함하는 염증 질환 예방 또는 치료용 조성물은 기타 유산균 또는 제약학적으로 허용가능한 담체 또는 부형체를 추가로 포함할 수 있다.

상술한 목적을 달성하기 위한 본 발명의 다른 양상은 한국생명공학연구원 유전자은행(Korean Collection for Type Culture; KCTC)에 수탁 번호 KCTC 12398BP로서 국제기탁된 락토바실루스 카제이 LC5 (Lactobacillus casei LC5) 균에 관한 것이다.

상술한 목적을 달성하기 위한 본 발명의 또 다른 양상은 한국생명공학연구원 유전자은행(Korean Collection for Type Culture; KCTC)에 수탁 번호 KCTC 10782BP로서 국제기탁된 락토바실루스 플란타룸 LP3 (Lactobacillus plantarum LP3) 유산균에 관한 것이다.

본 발명의 조성물은 4종의 프로바이오틱 유산균 또는 그 배양물을 포함하므로, 본 발명에 따르면, 염증 질환, 특히 장의 염증의 치료에 유용한 조성물이 제공될 수 있다.

더욱이 본 발명의 염증 질환 예방 또는 치료용 조성물은 환자의 장내 미생물총의 안정성을 유지함으로써 다양한 장내 병원성 세균들의 감염을 억제할 수 있음은 물론, 부가적으로 정장작용, 지사작용, 소화촉진 작용을 나타내므로, 염증 질환 예방 또는 치료용 조성물로서 의약품, 식품, 또는 건강 기능성 식품으로 유용하게 활용될 수 있다.

도 1은 본 발명의 락토바실루스 카제이 LC5 (Lactobacillus casei LC5) KCTC 12398BP 균주의 16S rRNA 서열, 및 본 발명의 락토바실루스 카제이 LC5와 관련 락토바실루스 속 유산균종들의 16S rRNA 서열의 상동성 및 계통발생적 관계(phylogenetic relationship)를 비교 도시한 것이다.
도 2는 본 발명의 락토바실루스 카제이 LC5 균주의 지놈 DNA의 RAPD(Random Amplified Polymorphic DNA) 분석 결과 및 PFGE(Pulse Field Gel Electrophoresis) 분석 결과이다.
도 3은 본 발명의 락토바실루스 플란타룸 LP3 (Lactobacillus plantarum LP3) KCTC 10782BP 균주의 16S rRNA 서열 및 본 발명의 락토바실루스 플란타룸 LP3 균주와 관련 비피도박테리움 속 균종의 16S rRNA 서열의 상동성 및 계통발생적 관계를 비교 도시한 것이다.
도 4는 본 발명의 락토바실루스 플란타룸 LP3 균주의 지놈 DNA의 RAPD 분석 결과 및 PFGE 분석 결과이다.
도 5a는 본 발명의 락토바실루스 플란타룸 LP3 균주의 장정착성 실험 결과를 도시한 사진이고, 도 5b는 본 발명의 락토바실루스 플란타룸 LP3 균주의 장정착성 실험 결과를 도시한 그래프이다.
도 6은 본 발명에 따른 비교평가실험에 있어 RAW-264.7 세포에서의 NO (nitric oxide) 생성을 비교한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 7은 본 발명의 조성물의 직장 주사가 TNBS-유발 대장염 발병에 미치는 영향을 평가한 결과로 대장 벽 두께의 변화를 나타낸 그래프와 대장의 병변을 관찰하기 위한 H&E 염색 결과 사진이다.
도 8은 본 발명의 조성물의 경구 투여가 TNBS-유발 대장염 발병에 미치는 영향을 평가한 결과로 대장 벽 두께의 변화를 나타낸 그래프와 대장의 병변을 관찰하기 위한 H&E 염색 결과 사진이다.
도 9는 본 발명의 조성물을 투여한 경우와 투여하지 않은 경우의 대장 조직에서의 유전자 발현을 역전사 중합효소 연쇄 반응 분석에 의해서 분석한 결과를 나타낸 사진이다.

본 발명에서 "염증 질환"이란 염증유발인자 또는 방사선 조사 등 유해한 자극으로 인해 인체 면역체계를 과도하게 항진시켜 대식세포와 같은 면역세포에서 분비되는 TNF-α(tumor necrosis factor-α), IL-1(interleukin-1), IL-6, 프로스타글란딘(prostagladin), 루코트리엔(luecotriene) 또는 산화질소(nitric oxide, NO)와 같은 염증유발물질(염증성 사이토카인)에 의해 유발되는 질환을 의미한다.

본 발명에서 "치료"란, 달리 언급되지 않는 한, 염증 질환 또는 질병, 또는 상기 질환 또는 질병의 하나 이상의 증상을 역전시키거나, 완화시키거나, 그 진행을 억제하거나, 또는 예방하는 것을 의미한다.

본 발명의 또 하나의 양상은 염증 질환의 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것으로, 이러한 조성물에는 아래와 같은 유산균 균종들이 포함되는데, 이러한 유산균 균주들은 한국생명공학연구원 유전자은행(Korean Collection for Type Culture; KCTC)에 아래와 같이 기탁되었다.

1) 락토바실루스 카제이 LC5 (Lactobacillus casei LC5), KCTC 12398BP,

2) 락토바실루스 플란타룸 LP3 (Lactobacillus plantarum LP3), KCTC 10782BP,

3) 비피도박테리움 애니말리스 락티스 BL3 (Bifidobacterium animalis subsp. lactis BL3), KCTC 11904BP; 및

4) 락토바실루스 람노수스 LR5(L. rhamnosus LR5), KCTC 12202BP.

락토바실루스 카제이 LC5 (Lactobacillus casei LC5), 락토바실루스 플란타룸 LP3 (Lactobacillus plantarum LP3), 및 락토바실루스 람노수스 LR5(L. rhamnosus LR5)는 장에서 대부분의 유해 세균의 성장을 억제한다.

비피도박테리아(bifidobacteria)는 주로 대장에 콜로니를 형성하는 그람-양성, 비-운동성, 비-포자성 및 혐기성 간균의 속이다. 이들은 탄수화물을 분해하여 짧은 사슬 유기산, 특히 초산 및 젖산을 형성하기 때문에, 주위의 pH가 이에 의해 감소하고 유해 박테리아의 성장 및 이들의 활성저해가 가능하게 된다. 병원성 박테리아의 저해에 의해, 비피도박테리아는 감염, 특히 박테리아 장내 감염에 대한 보호 및 예방효과를 갖는다. 비피도박테리아는 병원성 미생물의 억제, 혈액에서 암모니아 및 지방 농도의 감소, 항생제에 의해 손상된 장내 균총의 복구, 면역 시스템의 자극과 면역 조절 작용을 한다.

비피도박테리움에 속하는 유산균종들은 대장(colon)이 최적 서식지이기 때문에, 락토바실루스와 비피도박테리움에 속하는 유산균들로 이루어진 혼합유산균의 섭취는 단일 종 혹은 소수의 서로 다른 종으로 이루어진 유산균 혼합물에 비해 높은 정장기능성을 제공할 수 있다. 본 조성물에 포함된 락토바실루스와 비피도박테리움 유산균들을 단독 혹은 혼합된 형태로 사용하였을 때 유해균의 생장을 억제하는 반면 장내 유익균의 증식을 유도하는 효능을 제공한다. 또한 이들 균주들을 염증성 장 질환(inflammatory bowel disease) 모델 마우스에 단독 혹은 혼합된 형태로 사용하였을 때 염증성 사이토카인 또는 케모카인을 억제하는 반면 항염증성 싸이토카인의 합성을 유도하는 효능을 가지고 있다. 전염증성 사이토카인 또는 케모카인에는 염증성 반응의 상향 조절에 연관된 것으로 당업계에 알려진 것들이 포함된다. 예에는 TNF-α, IL-1β, IL-6, 및 IL-18가 포함되나, 반드시 이들로 제한되지는 않는다.

본 발명의 조성물은 염증 질환, 특히 염증성 장 질환의 치료 또는 예방에 유효하고, 이러한 염증성 장 질환으로는 크론병, 궤양성 대장염, 장관형 베체트병, 단순성 궤양, 방사선 장염 및 허혈성 장염 등을 들 수 있으며, 특히 크론병이나 궤양성 대장염에 대하여 효과적이다.

상기 조성물은 4종의 유산균을 동일한 비율로 포함하거나, 락토바실루스 속 유산균과 비피도박테리움속 유산균을 1:1 내지 3:1의 비율로 포함할 수 있다.

본 발명의 조성물은 조성물 총 중량에 대해, 유효성분으로서 유산균 균주의 혼합물을 10⁸ 내지 10¹² cfu/g의 함량으로 포함하거나, 동등한 수의 생균을 가진 배양물을 포함한다.

본 발명의 조성물은 상술한 유산균 이외에 락토바실루스 살리바리우스(Lactobacillus salivarius), 락토바실루스 브레비스(Lactobacillus brevis), 락토바실루스 헬베티쿠스(Lactobacillus helveticus), 락토바실루스 퍼멘툼(Lactobacillus fermentum), 락토바실루스 파라카세이( Lactobacillus paracasei), 락토바실루스 델브루에키(Lactobacillus delbrueckii), 락토바실루스 레우테리(Lactobacillus reuteri), 락토바실루스 부츠네리(Lactobacillus buchneri), 락토바실루스 가세리(Lactobacillus gasseri), 락토바실루스 존스니(Lactobacillus johonsonii), 락토바실루스 케피르(Lactobacillus kefir), 락토코쿠스 락티스(Lactococcus lactis), 비피도박테리움 브레브(Bifidobacterium breve), 비피도박테리움 인판티스(Bifidobacterium infantis), 비피도박테리움 수도롱굼( Bifidobacterium pseudolongum), 비피도박테리움 써모필룸 (Bifidobacterium themophilum), 및 비피도박테리움 아돌센티스 (Bifidobacterium adolescentis)로 구성되는 군에서 선택되는 1종 이상의 유산균을 추가로 포함할 수 있다.

상기 유산균 균주들은 유산균을 위한 일반적인 배양 방법으로 성장되고, 원심분리와 같은 분리 과정으로 회수되며, 건조, 예컨대, 동결건조에 의해 생균제 형태로 제조하여 이용될 수 있다.

본 발명의 조성물은 상기 유효 성분 이외에 제약학적으로 허용가능한 담체 및/또는 부형제를 추가로 포함할 수 있으며, 이 외에도 바인더, 분해제, 코팅제, 윤활제 등과 같은 제약학적으로 통상적으로 사용되는 다양한 첨가제와 함께 제형화되어 조제될 수 있다.

본 발명의 조성물은 상기 유산균들과 적절한 담체, 부형제, 보조 유효 성분 등과의 혼합에 의하여 분말제, 과립제, 정제, 캡슐 또는 액상의 형태로 제형화 될 수 있다. 본 발명의 조성물은 장내 또는 경구 투여용 제품으로 제형화될 수 있다. 또한 본 발명의 조성물은 공지의 방법을 사용하여, 위장을 통과한 뒤 소장에 도달하여 활성 성분인 미생물이 신속하게 장내에 방출되도록 장용 피복되어 제품화될 수 있다.

본 발명에서 사용가능한 부형제는 수크로오스, 락토오스, 만니톨, 글루코오스 등과 같은 설탕 및 옥수수 전분, 감자 전분, 쌀 전분, 부분적으로 전젤란틴화된 전분 등의 전분을 포함한다. 바인더는 덱스트린, 소듐알지네이트, 카라지난, 구아검, 아카시아, 아가 등의 폴라사카라이드, 트라가칸트, 젤라틴, 글루텐 등의 천연-발생 거대분자 물질, 히드록시프로필셀룰로오스, 메틸셀룰로오스, 히드록시프로필메틸셀룰로오스, 에틸셀룰로오스, 히드록시프로필에틸셀룰로오스, 카복시메틸셀룰로오스소듐 등의 셀룰로오스 유도체 및 폴리비닐피롤리돈, 폴리비닐알코올, 폴리비닐아세테이트, 폴리에틸렌글리콜, 폴리아크릴산, 폴리메타크릴산 및 비닐아세테이트 수지 등의 고분자를 포함한다.

분해제로는 카복시메틸셀룰로오스, 카복시메틸셀룰로오스칼슘, 저치환 히드록시프로필셀룰로오스 등의 셀룰로오스 유도체 및 소듐카복시메틸 전분, 히드록시프로필 전분, 옥수수 전분, 감자 전분, 쌀 전분 및 부분적으로 전젤라틴화된 전분 등의 전분을 사용할 수 있다.

본 발명에서 사용가능한 윤활제의 예들은 활석, 스테아르산, 칼슘스테아레이트, 마그네슘스테아레이트, 콜로이드성 실리카, 히드로스실리콘 다이옥사이드, 다양한 종류의 왁스 및 히드로게네이티드 오일 등을 포함한다.

코팅제로는 디메틸아미노에틸메타크릴레이트-메타크릴산 공중합체, 폴리비닐아세탈디에틸아미노아세테이트, 에틸아크릴레이트-메타크릴산 공중합체, 에틸아크릴레이트-메틸메타크릴레이트-클로로트리메틸암모늄에틸메타크릴레이트 공중합체, 에틸셀룰로오스 등의 수불용성 중합체, 메타크릴산-에틸아크릴레이트 공중합체, 히드록시프로필메틸셀룰로오스프탈레이트, 히드록시프로필메틸 셀룰로오스아세테이트석시네이트 등의 장성 중합체 및 메틸셀룰로오스, 히드록시 프로필메틸셀룰로오스, 폴리비닐피롤리돈, 폴리에틸렌글리콜 등의 수용성 중합체를 포함하나, 반드시 이들로 제한되는 것은 아니다.

본 발명의 염증 질환 예방 또는 치료용 조성물에서 유효성분인 상기 유산균 균주들의 투여량은 치료나 예방의 목적, 치료 또는 예방하려는 환자의 종류, 환자의 증상, 체중, 연령이나 성별 등을 고려하여 적절하게 결정될 수 있다. 일반적으로, 성인 환자의 경우, 1×10⁶ 이상의 생균, 바람직하게는 1×10⁸ 내지 1 ×10¹²의 생균이 필요에 따라 한번 또는 나눠서 투여될 수 있다.

본 발명의 다른 양상은 락토바실루스 카제이 LC5 (Lactobacillus casei LC5, (KCTC 12398BP)), 락토바실루스 플란타룸 LP3 (Lactobacillus plantarum LP3, (KCTC 10782BP)), 비피도박테리움 애니말리스 락티스 BL3 (Bifidobacterium animalis subsp. lactis BL3 (KCTC 11904BP)), 락토바실루스 람노수스 LR5 (Lactobacillus rhamnosus LR5(KCTC 12202BP) 또는 이들의 배양물을 포함하는 식품에 관한 것이다.

본 발명의 유산균 함유 제품은 밀크 또는 유장계 발효 유제품과 같은 식품 또는 영양 제품으로서 또는 식품보조제 또는 건강기능성 식품으로서 섭취될 수 있다. 본 발명의 일 구현예에 따라서 상기 제품은 유제품, 음료수, 쥬스, 수프 또는 어린이용 식품과 같은 식품을 예로 들 수 있지만, 반드시 이들로 제한되는 것은 아니다.

본 발명에서, 유제품(dairy product)은 다양한 지방 함량을 갖는 임의의 액체 또는 반고체 밀크 또는 유장계 제품을 의미한다. 상기 유제품은 예를 들어 우유, 염소의 젖, 양의 젖, 크림, 전지유(full-fat milk), 전유(whole milk), 저지방유(low-fat milk) 또는 탈지유(skim milk), 한외여과유, 이중여과유(diafiltered milk), 미세여과유(microfiltered milk), 임의의 가공을 통해 분유 또는 유장으로부터 얻은 재조합유, 가공 제품, 예를 들어, 요거트, 응유, 산유, 산전유(sour whole milk), 버터유, 기타 발효유 제품, 예를 들어 빌리(viili), 스낵바의 필링(filling of snack bars)등 일 수 있다. 또 다른 중요한 그룹은 유음료(milk beverage), 예를 들어, 유장 음료, 발효유, 농축유, 유아 및 아기용 밀크, 아이스크림, 단것과 같은 유함유 식품이 포함된다.

본 발명의 또 다른 양상은 신규한 유산균 균주에 관한 것으로, 한국생명공학연구원 유전자은행(Korean Collection for Type Culture; KCTC)에 수탁 번호 KCTC 12398BP로서 국제기탁된 락토바실루스 카제이 LC5 (Lactobacillus casei LC5) 유산균과 한국생명공학연구원 유전자은행(Korean Collection for Type Culture; KCTC)에 수탁 번호 KCTC 10782BP로서 국제기탁된 락토바실루스 플란타룸 LP3 (Lactobacillus plantarum LP3) 유산균이다.

이하에서 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 의해서 한정되는 것은 아니다.

실시예

1. 락토바실루스 카제이 LC5 ( Lactobacillus casei LC5) KCTC 12398BP 균주의 분리 및 동정화

(1) 요약

유제품인 치즈에서 분리한 락토바실루스 카제이 LC5 (Lactobacillus casei LC5)는 L. casei ^T (ATCC 393)를 대조군으로 한 생화학적 방법 (API) 및 분자생물학적 방법 (16s rDNA 서열분석, RAPD, PFGE)을 통해 동정하였고, 기능성 (효소 활성) 및 안전성 (항생제 내성)을 통해 프로바이오틱스(Probiotics)의 기능을 가질 수 있는 유산균 제제임을 확인하였다. 이러한 결과들을 토대로 분리된 락토바실루스 카제이 LC5을 한국생명공학연구원, 미생물자원센터 (KCTC)에 기탁하여 수탁번호 KCTC 12398BP를 부여받았다.

(2) 분리 및 동정

2-1. 신규 미생물의 분리

치즈를 멸균 혐기수에 연속 희석법으로 희석한 후 희석액 각 1 ㎖을 Man-Rogosa-Sharpe (MRS. BD. USA) 고체 배지에 부어 혐기 조건에서 3일간 배양하였다. 성장한 콜로니는 다시 MRS에 BCP(bromocresol purple)를 첨가 (0.17g/L)한 고체 배지에 피킹한 후 같은 조건에서 다시 3일간 배양하였다. BCP 지시약은 유산균이 젖산을 형성하여 주변 pH가 낮아지면 보라색에서 노란색으로 변하게 되므로, 콜로니 주위의 색이 노란 색으로 변한 콜로니를 유산균으로 판단하였고, 이 콜로니를 취하여 생화학적, 및 분자생물학적 동정을 진행하였다.

2-2. 신규 미생물의 동정

1) API 키트를 이용한 생화학적 동정

MRS 육즙에서 순수 배양한 락토바실루스 카제이 LC5 균주(Lactobacillus casei LC5) 1 ㎖을 취하여 원심분리한 후 상등액을 버리고 침전물을 CHL 용액 1 ㎖에 현탁한 후 원심분리하였다. 침전물을 9 ㎖의 CHL 용액에 재현탁한 후 API 50CHL 키트에 적당량 분주한 후 멸균한 파라핀 오일을 웰 위에 분주하고 37℃ 배양기에서 3일간 배양하여 당 이용도를 관찰하였다. 당 이용성 확인 결과는 API 웹(https://apiweb.biomerieux.com)에 입력하여 확인하였으며, 그 결과는 하기 표 1에 나타내었다. 분리한 락토바실루스 카제이 LC5는 글루코스, 말토스, 락토스, 만니톨, 소르비톨 등 다양한 당을 잘 이용하는 것으로 확인되었다.

No	Carbohydrates	이용	No	Carbohydrates	이용
0	Control	-	25	Esculine	+
1	Glycerol	+	26	Salicine	+
2	Erythritol	-	27	Cellobiose	+
3	D-Arabinose	+	28	Maltose	+
4	L-Arabinose	+	29	Lactose	+
5	Ribose	+	30	Melibiose	-
6	D-Xylose	-	31	Saccharose	+
7	L-Xylose	-	32	Trehalose	+
8	Adonitol	+	33	Inuline	-
9	β-Methyl-xyloside	-	34	Melezitose	-
10	Galactose	+	35	D-Raffinose	+
11	D-Glucose	+	36	Amidon	-
12	D-Fructose	+	37	Glycogene	-
13	D-Mannose	+	38	Xylitol	-
14	L-Sorbose	-	39	β-Gentiobiose	+
15	Rhamnose	+	40	D-Turanose	+
16	Dulcitol	-	41	D-Lyxose	+
17	Inositol	+	42	D-Tagatose	+
18	Mannitol	+	43	D-Fucose	-
19	Sorbitol	+	44	L-Fucose	+
20	α-Methyl-D-mannoside	+	45	D-Arabitol	-
21	α-Methyl-D-glucoside	-	46	L-Arabitol	+
22	N-Acetyl glucosamine	+	47	Gluconate	+
23	Amygdaline	+	48	2-Ceto-gluconate	+
24	Arbutine	+	49	5-Ceto-gluconate	-

2) 16s rDNA 유전자 염기서열 결정을 통한 동정

락토바실루스 카제이 LC5는 균주를 분자생물학적 방법을 이용하여 동정하기 위해서 16s rRNA 염기서열을 분석하였다. 치즈에서 분리한 균주의 순수 배양액 1㎖에서 Accuprep 지놈 추출 키트(Bioneer, Korea)를 이용하여 지놈 DNA를 추출하였다. 추출한 DNA를 주형으로 16s rRNA 영역을 프라이머 F (5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3')와 프라이머 R (5'-AAGGAGGTGATCCAGCC-3’)을 이용하여 PCR (MyCycler, BIO-RAD, USA)을 수행하였다. PCR 산물은 pGEM-Teasy 벡터(Promega, USA)에 연결하여 E.coli 균주 DH5α에 형질전환시킨 후 LB/x-gal/amp plate에 도말하여 37℃에서 밤새 배양하였다. 스크리닝을 통하여 형질전환체로부터 삽입체를 포함하는 재조합 플라스미드를 분리한 후, DNA 염기서열 분석을 진행하였다(도 1의 (A) 참조).

DNA 염기서열 분석은 DNA star program의 Cluster V method를 이용하여 L. casei ^T (ATCC 393)와 유연관계가 높은 균종들과 염기서열의 동일성을 비교함으로써 확인하였다. 분리 균주의 16s rRNA 염기서열은, 도 1의 (B)에 도시된 바와 같이, L. casei ^T(ATCC 393)와 가장 높은 96.9%의 동일성을 보였다

또한 16s rDNA 유전자 염기서열들을 이용하여 진화학적 유연관계를 계통수(phylogenetic tree)를 통해서 분석한 결과 락토바실루스 카제이 LC5 균주는 L. casei ^T(ATCC 393)과 동일한 군으로 묶이는 것을 확인하였다 (도 1의 (C)). 따라서 락토바실루스 카제이 LC5 균주는 유전학적으로도 L. casei 종에 속하는 균주임을 확인하였다.

3) RAPD (Random Amplified Polymorphic DNA) 분석

RAPD 분석은 치즈에서 분리한 락토바실루스 카제이 LC5로부터 지놈 DNA를 추출하였으며, 분리한 DNA를 주형으로 (GTG)₅ (5’-GTGGTGGTGGTGGTG 3’) 프라이머를 이용하여 PCR-RAPD (MyCycler, BIO-RAD, USA)를 수행하였다. 최종 산물인 PCR 산물은 EtBr에 염색 후 G:BOX (SYNGENE, UK)로 관찰하여 도 2(a)에 나타내었다.

또한, PFGE (Pulse Field Gel Electrophoresis) 분석은 순수 배양한 락토바실루스 카제이 LC5를 최종 흡광도(OD)를 OD₆₀₀=4로 해서 플러그를 제작한 후 여러 가지 효소를 이용해 지놈 DNA를 잘라서 전기영동을 행한 후 대조군인 L. casei ^T(ATCC 393)와 비교 분석하였다. 결과는 도 2(b)에 나타내었다.

RAPD 결과에서는 분리한 균주는, 도 2(a)에 도시된 바와 같이, L. casei ^T(ATCC 393)와 상이한 밴드 패턴을 보였다. 도 2(a)에서 레인 1은 L. casei ^T(ATCC 393)의 결과이고, 레인 2는 락토바실루스 카제이 LC5의 결과이다. 위의 결과를 토대로 치즈에서 분리한 미생물인 락토바실루스 카제이 LC5는 L. casei ^T(ATCC 393)와 다른 신규 균주임을 확인하였다.

RAPD 또는 PFGE에 의한 DNA 지문 패턴을 분석한 결과, LC5와 L. casei ^T(ATCC 393)는 전반적으로 유사한 지문 패턴을 보이나 각 균주 특이적인 밴드가 존재하는 것으로 나타났다. 따라서 이와 같은 분자 타이핑 분석을 통해서 락토바실루스 카제이 LC5는 락토바실루스 카제이 종에 속하는 신규한 균주임을 재확인하였다.

이상의 결과들을 토대로 치즈에서 분리한 해당 균주를 락토바실루스 카제이 LC5(Lactobacillus casei LC5)로 명명하였으며, 2013년 4월 11일로부터 대한민국 특허균주 기탁기관인 한국생명공학연구원, 미생물자원센터(KCTC)에 기탁하여 수탁번호 KCTC 12398BP를 부여받았다.

(3) 기능성 및 안전성

3-1. 신규 미생물의 기능성 및 안정성

1) 효소 활성 시험 (API ZYM 키트)

락토바실루스 카제이 LC5의 효소활성을 측정하기 위해 API ZYM 키트를 사용하여 생성 효소를 확인하여 하기 표 2에 나타내었다. 락토바실루스 카제이 LC5는 L. casei ^T (ATCC 393)보다 Naphol-AS-BI-phosphohydrolase와 α-Glucosidase의 효소 활성이 높았다. Naphol-AS-BI-phosphohydrolase는 백혈구 내 호중구의 식균 작용을 활성화하고 α-glucosidase는 유당분해효소결핍증에 효과 있는 효소로 특히 유제품 분리 유산균에서 그 활성이 높은 것으로 알려져 있다. 표 2를 통해서 확인되는 바와 같이, 유제품에서 분리된 락토바실루스 카제이 LC5는 L. casei ^T (ATCC 393) 보다 우수한 효소활성을 보인다.

Enzyme	L. casei ^T (ATCC393)	L. casei LC5
1. Control	0	0
2. Alkaline phosphatase	0	1
3. Esterase (C4)	2	2
4. Esterase Lipase(C8)	3	2
5. Lipase (C14)	0	0
6. Leucine arylamidase	5	5
7. Valine arylamidase	5	5
8. Crystine arylamidase	2	2
9. Trypsin	0	0
10. α-Chymotrypsin	0	1
11. Acid phospatase	2	4
12. Naphol-AS-BI-phosphohydrolase	1	3
13. α-Galactosidase	0	1
14. β-Galactosidase	5	3
15. β-Glucuronidase	0	0
16. α-Glucosidase	0	3
17. β-Glucosidase	4	5
18. N-Acetyl-β-glucosidase	0	1
19. α-Mannosidase	0	0
20. α-Fucosidase	0	0
0, 0 nmol; 1, 5 nmol; 2, 10 nmol; 3, 20 nmol; 4, 30 nmol; 5, ≥ 40 nmol.

2) 장 정착성

락토바실루스 카제이 LC5의 장 정착성 측정은 L. casei ^T (ATCC 393)를 대조군으로 하여 사람의 대장 상피세포에서 유래한 HT-29 세포주에서 실시하였다. HT-29 세포주에 각 균주들을 1시간 처리한 후 그람 염색과 생균수를 측정함으로써 균주들의 장 정착능을 비교하여 하기 표 3에 타내었다.

	L. casei ^T	L. casei LC5	대조군
장 정착률(%)	81.25	85.75	00.00

장 정착성 측정 결과, 락토바실루스 카제이 LC5는 L. casei ^T (ATCC 393) 보다 우수한 장 정착성을 보이는 균주임을 확인하였다.

3-2. 신규 미생물의 안정성

1) 항생제 내성

분리된 락토바실루스 카제이 LC5의 항생제 내성을 측정함으로써 안전성을 검증하였다. 항생제 내성실험은 European Food Safety Authority (EFSA)에서 추천하는 micro-dilution 방법을 이용하여 수행하였다. 실험에 사용된 항생제는 10종으로 암피실린(AMP), 반코마이신(VAN), 젠타미신(GEN), 카나마이신(KAN), 스트렙토마이신(STM), 에리트로마이신(ERM), 시너시드(Q/D), 클린다마이신(CLM), 테트라사이클린(TET) 및 클로람페니콜(CP)이다.

시너시드를 제외한 항생제에 대해서는 ISO-sensitest 육즙 10%와 MRS 육즙 90%를 혼합한 육즙에 512, 256, 128, 64, 32, 16, 8, 4, 2, 1, 0.5, 0.25 ㎍/㎖의 농도로 첨가해 사용하였으며, 시너시드는 BioMeriux 사의 E-테스트 스트립을 이용하여 진행하였다.

마이크로플레이트를 37℃하 혐기성 조건하에서 48시간 동안 인큐베이션하고, 이어서 MIC를 가시적인 성장이 관찰되지 않는 최저 항생제 농도로 측정하였다. EFSA 브레이크포인트에 기초하여, 락토바실루스 카제이 LC5가 각각의 항생제에 대해서 내성이 있는지 여부를 확인하여 그 결과를 하기 표 3에 나타내었다.

신규한 유산균주인 락토바실루스 카제이 LC5는 실험에 사용된 모든 항생제에 대해 EFSA가 제시한 항생제 내성 기준 이하로 나타났다. 반코마이신 및 스트렙토마이신에 대한 내성은 내성 유전자의 존재에 의한 것이 아니라 락토바실루스 카제이의 유산균 균주가 가지는 고유한 특성이므로 EFSA에서는 락토바실루스 카제이의 반코마이신과 스트렙토마이신 내성에 대한 자료를 따로 요구하지 않는다. 따라서 락토바실루스 카제이 LC5 균주는 항생제 내성에 대한 우려가 없는 안전한 균주로 확인되었다.

항생제	MIC of LC5	EFSA breakpoint (mg/L)
Ampicilin (AMP)	0.5	2
Vancomycin (VAN)	>512	n.r
Gentamycin (GEN)	8	32
Kanamycin (KAN)	64	64
Streptomycin (ST)	32	n.r
Erythromycin (ERM)	0.5	1
Clindamycin (CM)	0.25	1
synercid (Q/D)	0.5	4
Tetracycline (TET)	1	4
Chloramphenicol (CP)	1	4
n.r: not required

2. 락토바실루스 플란타룸 LP3 ( Lactobacillus plantarum LP3) KCTC 10782BP의 분리 및 동정

(1) 요약

전통 발효식품인 김치에서 분리한 락토바실루스 플란타룸 LP3 (Lactobacillus plantarum LP3)는 L. plantarum ^T (ATCC 14917)를 대조군으로 한 생화학적 방법 (API) 및 분자생물학적 방법 (16s rDNA sequence, RAPD, PFGE)을 통해 동정하였고, 기능성(장정착성) 및 안전성(항생제 내성)을 통해 프로바이오틱스(Probiotics)의 기능을 가질 수 있는 유산균 제제임을 확인하였다. 이 결과들을 토대로 분리된 락토바실루스 플란타룸 LP3을 한국생명공학연구원, 미생물자원센터 (KCTC)에 기탁하여 수탁번호 KCTC 10782BP를 부여받았다.

(2) 분리 및 동정

2-1. 신규 미생물의 분리

김치를 멸균 혐기수에 연속 희석법으로 희석한 후 희석액 각 1 ㎖을 Man-Rogosa-Sharpe (MRS. BD. USA) 고체 배지에 부어 혐기 조건에서 3일간 배양하였다. 성장한 콜로니는 다시 MRS에 BCP (bromocresol purple)를 첨가 (0.17g/L)한 고체배지에 피킹한 후 같은 조건에서 다시 3일간 배양하였다. BCP 지시약은 유산균이 젖산을 형성하여 주변 pH가 낮아지면 보라색에서 노란색으로 변하게 되므로, 콜로니 주위의 색이 노란 색으로 변한 콜로니를 유산균으로 판단하였고, 이 콜로니를 취하여 생화학적 및 분자생물학적 동정을 진행하였다.

2-2. 신규 미생물의 동정

1) API 키트를 이용한 생화학적 동정

MRS 육즙에서 순수 배양한 락토바실루스 플란타룸 LP3 1 ㎖을 취하여 원심분리한 후 상등액을 버리고 침전물을 CHL 용액 1 ㎖에 현탁한 후 원심분리하였다. 침전물을 9㎖의 CHL 용액에 재현탁한 후 API 50CHL 키트에 적당량 분주한 후 멸균한 파라핀 오일을 웰 위에 분주하고 37℃ 배양기에서 3일간 배양하여 당 이용도를 조사하여, 그 결과를 하기 표 4에 나타내었다. 당 이용 여부를 API 웹 (https://apiweb.biomerieux.com)에 입력하여 분석한 결과 락토바실루스 플란타룸과 99.9% 동일한 생화학적 특성을 가지는 것으로 나타났으며, 이 결과는 분리된 균주가 락토바실루스 플란타룸에 속하는 균주라는 것을 의미한다.

No	Carbohydrates	이용	No	Carbohydrates	이용
0	Control	-	25	Esculine	+
1	Glycerol	-	26	Salicine	+
2	Erythritol	-	27	Cellobiose	+
3	D-Arabinose	-	28	Maltose	+
4	L-Arabinose	+	29	Lactose	+
5	Ribose	+	30	Melibiose	+
6	D-Xylose	-	31	Saccharose	+
7	L-Xylose	-	32	Trehalose	+
8	Adonitol	-	33	Inuline	-
9	β-Methyl-xyloside	-	34	Melezitose	+
10	Galactose	+	35	D-Raffinose	+
11	D-Glucose	+	36	Amidon	-
12	D-Fructose	+	37	Glycogene	-
13	D-Mannose	+	38	Xylitol	-
14	L-Sorbose	-	39	β-Gentiobiose	+
15	Rhamnose	-	40	D-Turanose	-
16	Dulcitol	-	41	D-Lyxose	-
17	Inositol	-	42	D-Tagatose	-
18	Mannitol	+	43	D-Fucose	-
19	Sorbitol	+	44	L-Fucose	-
20	α-Methyl-D-mannoside	+	45	D-Arabitol	-
21	α-Methyl-D-glucoside	-	46	L-Arabitol	-
22	N-Acetyl glucosamine	+	47	Gluconate	+
23	Amygdaline	+	48	2-Ceto-gluconate	-
24	Arbutine	+	49	5-Ceto-gluconate	-

2) 16s rDNA 유전자 염기서열 결정을 통한 동정

락토바실루스 플란타룸 LP3 균주의 순수 배양액 1 ㎖로부터 Accuprep Gemomic Extraction 키트 (Bioneer, Korea)를 이용하여 지놈 DNA를 추출하였다. 추출된 DNA를 주형으로 16s rDNA 유전자 부위를 프라이머 F (5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3')와 프라이머 R (5'-AAGGAGGTGATCCAGCC-3')을 이용하여 PCR (MyCycler, BIO-RAD, USA)을 수행하였다. PCR 산물은 pGEM-T Easy vector (Promega, USA)에 연결한 후 E. coli DH5α에 형질전환하였다. 형질전환된 형질전환체는 LB/X-gal/amp 플레이트에 도말하여 37℃에서 밤새 배양하여 선별하였다. 선별된 형질전환체로부터 16s rDNA 유전자를 포함하는 재조합 플라스미드를 분리한 후, DNA 서열결정을 통해 클로닝된 DNA 절편의 염기서열을 결정하여 도 3의 (A)에 나타내었다.

결정된 DNA 염기서열은 DNA Star 프로그램의 Cluster V method를 이용하여 L. plantarum ^T (ATCC 14917)와 유연관계가 높은 균종들과 염기서열의 동일성을 비교함으로써 확인하였다. 그 결과 도 3의 (B)를 통해서 확인되는 바와 같이, 락토바실루스 플란타룸 LP3 균주는 L. plantarum ^T(ATCC 14917)와 가장 높은 99.9%의 동일성을 보였다.

또한 16s rDNA 유전자 염기서열들을 이용하여 진화학적 유연관계를 계통수를 통해서 분석한 결과 락토바실루스 플란타룸 LP3 균주는 L. plantarum ^T(ATCC 14917)과 동일한 군으로 묶이는 것을 확인하였다(도 그림 3(C)). 따라서 락토바실루스 플란타룸 LP3 균주는 유전학적으로도 락토바실루스 플란타룸 종에 속하는 균주임을 확인하였다.

3) RAPD 및 PFGE에 의한 DNA 지문 분석

락토바실루스 플란타룸 LP3 균주로부터 추출한 지놈 DNA를 주형으로 하고 (GTG)₅ (5'- GTGGTGGTGGTGGTG-3') 프라이머를 이용한 PCR-RAPD (MyCycler, BIO-RAD, USA)를 수행하였으며, PCR 산물은 EtBr에 염색한 후 UV illuminator (G:BOX, SYNGENE, UK)로 관찰하였다 (그림 4(a)).

PFGE 분석은 락토바실루스 플란타룸 LP3을 순수 배양하여 최종 흡광도 (OD)가 4가 되도록 하여 플러그(plug)를 제작한 후 여러 제한효소 (SmaI, ApaI, XhoI)로 지놈 DNA를 절단하였다. 절단된 DNA 절편은 전기영동을 실시한 후 대조군인 L. plantarum ^T(ATCC 14917)와 비교 분석하였다 (그림 4(b)).

RAPD 또는 PFGE에 의한 DNA 지문 패턴을 분석한 결과, 락토바실루스 플란타룸 LP3와 L. plantarum ^T(ATCC 14917)는 전반적으로 유사한 지문 패턴을 보이나 각 균주 특이적인 밴드가 존재하는 것으로 확인되었다. 따라서 이와 같은 분자 타이핑 분석을 통해서 락토바실루스 플란타룸 LP3은 L. plantarum 종에 속하는 신규한 균주임을 재확인하였다.

이상의 결과들을 토대로 치즈에서 분리한 해당 균주를 락토바실루스 플란타룸 LP3로 명명 하였으며, 2005년 3월 21일로부터 대한민국 특허균주 기탁기관인 한국생명공학연구원, 미생물자원센터(KCTC)에 기탁하여 수탁번호 KCTC 10782BP를 부여받았다.

3. 기능성 및 안정성

3-1. 신규 미생물의 기능성

1) 장 정착성

락토바실루스 플란타룸 LP3의 장 정착성 측정은 L. plantarum ^T (ATCC 14917)를 대조군으로 하여 사람의 대장 상피세포에서 유래한 HT-29 세포주에서 실시하였다. HT-29 세포주에 각 균주들을 1시간 처리한 후 그람 염색과 생균수를 측정함으로써 균주들의 장 정착능을 비교하여 하기 표 5 및 도 5a-5b에 타내었다.

	L. plantarum ^T	L. plantarum LP3	대조군
정착률(%)	80.85	84.93	00.00

장 정착성 측정 결과, 락토바실루스 플란타룸 LP3는 L. plantarum ^T(ATCC 14917) 보다 우수한 장 정착성을 보이는 균주임을 확인하였다.

3-2. 신규 미생물의 안정성

1) 항생제 내성

분리된 락토바실루스 플란타룸 LP3의 항생제 내성을 측정함으로써 안전성을 검증하였다. 항생제 내성실험은 European Food Safety Authority (EFSA)에서 추천하는 micro-dilution 방법을 이용하여 수행하였다. 실험에 사용된 항생제는 10종으로 암피실린(AMP), 반코마이신(VAN), 젠타미신(GEN), 카나마이신(KAN), 스트렙토마이신(STM), 에리트로마이신(ERM), 시너시드(Q/D), 클린다마이신(CLM), 테트라사이클린(TET) 및 클로람페니콜(CP)이다.

마이크로플레이트를 37℃하 혐기성 조건하에서 48시간 동안 인큐베이션하고, 이어서 MIC를 가시적인 성장이 관찰되지 않는 최저 항생제 농도로 측정하였다. EFSA 브레이크포인트에 기초하여, 락토바실루스 플란타룸 LP3가 각각의 항생제에 대해서 내성이 있는지 여부를 확인하여 하기 표 6에 나타내었다.

신규한 유산균주인 락토바실루스 플란타룸 LP3는 실험에 사용된 모든 항생제에 대해 EFSA가 제시한 항생제 내성기준 이하로 나타났다. 반코마이신과 스트렙토마이신에 대한 내성은 내성 유전자의 존재에 의한 것이 아니라 락토바실루스 플란타룸의 유산균 균주가 가지는 고유한 특성이므로 EFSA에서는 락토바실루스 플란타룸의 반코마이신과 스트렙토마이신 내성에 대한 자료를 따로 요구하지 않는다. 따라서 락토바실루스 플란타룸 LP3 균주는 항생제 내성에 대한 우려가 없는 안전한 균주인 것으로 나타났다.

항생제	MIC of LP3	EFSA breakpoint (mg/L)
Ampicilin (AMP)	2	2
Vancomycin (VAN)	256	n.r
Gentamycin (GEN)	16	16
Kanamycin (KAN)	64	64
Streptomycin (ST)	256	n.r
Erythromycin (ERM)	1	1
Clindamycin (CM)	1	1
synercid (Q/D)	0.38	4
Tetracycline (TET)	32	32
Chloramphenicol (CP)	8	8
n.r: not required

실험예

1. 동물 모델

6주령의 암컷 ICR 마우스들을 효창 과학(대한민국, 대구)으로부터 구입하여, 인제대학교 동물 자원 센터에 의해서 승인된 프로토콜에 따라서 취급하였다. 마우스들을 깨끗한 톱밥을 포함하는 폴리에틸렌 케이지에 수용하고, 설치류 사료와 물을 자유급식 (ad libitum feeding)하였다. 실험동물들은 식이와 물을 사육실의 온도는 22 - 25℃, 습도는 55%로 유지하였고, 명암은 12시간 간격으로 점등 및 소등하였다. 실험동물은 2주 적응기간을 거친 후 실험에 사용하였다

2. 염증성 장 질환 예방/치료용 조성물 제조

(1) 유산균 발효 배지

본 발명의 조성물에 포함되는 유산균 균주의 배양을 위한 발효 배지는 탈지분유와 대두 분리 단백질을 각각 단독 혹은 혼합하여 1%-10% (w/v) 수용액으로 만든 후 유산균종에 따라 단백질 대비 0.01%-1% (w/w) 범위의 단백분해 효소 (Delvolase; DSM, 네덜란드) 용액을 가하여 효소처리하였다.

효소처리 후 상기 효소처리 반응액에 0.1%-5% (w/v) 범위의 포도당, 유당, 과당, 혹은 자당 등의 당류, 0.1%-5% (w/v) 범위의 효모추출물, 0.1%-5% (w/v) 범위의 소이펩톤, 0.01%-0.1% (w/v) 범위의 암모니움 시트레이트, 소디움 아세테이트, 디포타시움 포스페이트, 마그네슘 설페이트, 망간 설페이트, 소디움 클로라이드의 이온성분을 첨가하고 용해시켜 유산균 배양배지를 준비하였다. 준비된 유산균 배양배지는 열교환기 (Heat exchanger)를 이용하여 살균하였다.

(2) 유산균 배양 및 유산균 원말 제조

상기 (1) 단계에서 준비된 유산균 발효 배지에 전배양한 유산균 종균을 0.1%-1% (v/v) 수준으로 접종하고 37℃, pH 5.0-6.0 범위에서 유지되도록 하여 유산균종에 따라 8시간-18시간 동안 발효배양하였다. 유산균 배양이 종료된 후 유산균체를 연속식 원심분리기(Separator)를 이용하여 분리 및 농축하였다. 분리된 유산균체는 동결보호제 등을 첨가하여 동결건조시킨 후 분쇄기를 이용하여 유산균체를 분쇄하여 일정한 입도를 가지게 한 후 유산균 원말로 제조하였다.

(3) 유산균 조성물의 제조

상기 단계(2)에서 제조된 유산균 원말은 다음과 같은 생균수를 가지는 것으로 측정되었다;

락토바실루스 카제이 LC5 유산균 (1.25X10⁸ CFU/g 이상),

락토바실루스 플란타룸 LP3 유산균 (1.25X10⁸CFU/g 이상),

비피도박테리움 애니말리스 락티스 BL3 비피더스균(1.25X10⁹ CFU/g 이상),

락토바실루스 람노수스 LR5 유산균(1.25X10⁸CFU/g 이상).

본 발명의 조성물을 "ATP" 조성물이라 약칭한다. 본 실시예에서는 각 유산균종을 부형제와 함께 혼합하였으며, 총 생균수는 5 X 10⁸ CFU이 되도록 제조하였다.

3. 시험관내 항염증 활성 (NO 분비량 억제 확인)

산화질소(NO)는 중요한 세포 내 전염증 매개인자로서, 수퍼옥사이드 라디칼과 반응하여 과산화아질산 이온(peroxynitrite anion, ONOO-)을 생산하며, 이렇게 생산된 과산화아질산 이온은 염증 활성을 유도하고 관절염, 궤양성대장염, 전신홍반성 루푸스와 같은 다양한 병리학적 이환상태를 야기하는 것으로 알려져 있다. 따라서 산화질소(NO) 생산 억제 기작을 통하여 염증 반응을 억제할 수 있다. 본 발명의 조성물이 RAW 264.7 대식세포의 NO 분비량에 미치는 영향을 조사하기 위하여 하기와 같이 실험을 수행하였다.

세포 배양액을 수집하여 생성된 NO 분비량을 그리스 시약(Griess reagent: 1% sulfanilamide/0.1% naphthylethylene diamine dihydrochloride/2% phosphoric acid)으로 측정하였다(Griess et al., 1982). 간단히 설명하면 100 ㎕의 각 배양 상청액을 실온에서 10분간 동량의 그리스 시약과 혼합한 후 아질산염(산화질소의 지표) 농도를 측정하였다. 이때 아질산염은 배지 내에서 그리스 시약을 기초로 한 비색분석법을 이용하여 측정하였다. 산화질소(NO)의 기질인 L-아르기닌은 L-씨트룰린과 일산화질소로 변하는데, 이는 빠르게 안정된 이산화질소, 아질산염, 질산염으로 변한다. 그리스 시약은 아질산염과 화학 반응하여 보라색의 아조염을 형성하고 이것은 일산화질소의 농도와 일치하기 때문에, 아조염의 농도로부터 아질산염의 농도를 측정하여 540 nm에서 그 최대 흡수 정도를 측정하여 구할 수 있다.

자세하게는 RAW 264.7 대식세포를 10% FBS가 포함된 DMEM 배지에 희석하여 50,000 세포/웰의 밀도로 만든 후 24-웰 플레이트에 분주하여 24시간 동안 배양하여 벽에 부착되게 하였다. RAW 264.7 세포에 본 발명의 신규한 락토바실루스 카제이 LC5 균주(2.5×10⁶CFU), 락토바실루스 플란타룸 LP3 균주(2.5×10⁶CFU) 및 이들을 포함하는 ATP 조성물을 농도별로 처리하고, 0.01 μM 덱사메타손(Dex)을 처리한 것을 항염증 대조군으로 이용하였다. 신규한 균주들과 조성물을 첨가하여 1시간 배양한 후, 세포들을 0.1 ㎍/㎖ 농도의 LPS로 처리하여 습도 37,5% CO₂ 인큐베이터에서 15시간 배양하고, 산화질소(NO) 양은 그리스 시약으로 측정하였다. 즉, 세포 배양액 100 ㎕와 동량의 그리스 시약을 혼합하여 반응시킨 후, 아질산염(NO₂-)을 TACS MTT 분석(R&D systems)으로 흡광도를 측정하였다. 각 웰 내의 배양 상청액을 새로운 DMEM 배지로 대체한 후, 보라색 침전물이 될 때까지 MTT 시약을 처리하였다. 이어서 595 nm에서 흡광도를 측정하여 표준곡선을 얻은 후, NO의 농도를 산출하였다.

그 결과 도 6에 나타낸 바와 같이, 대식세포에 LPS만을 처리한 비교예와 비교하여 본 발명의 조성물(ATP)을 처리한 실시예에서 농도 의존적으로 아질산염 수준이 감소되는 것을 알 수 있었다. 자세하게는 본 발명의 조성물을 2 또는 4 ㎎/㎖로 각각 처리한 실험군에서 아질산염 감소가 2배가 되었다(도 6(A)의 5) 및 6) 참조). 이를 통해 본 발명의 조성물이 RAW 264.7 대식세포에서 LPS에 의해 유도된 산화질소(NO) 생성을 효과적으로 감소시켜 강력한 항염증 활성을 가지는 것을 확인할 수 있었다. 또한 락토바실루스 카제이 LC5 균주 및 락토바실루스 플란타룸 LP3 균주도 NO 생산을 억제함으로써 항염증 효과를 나타낸다는 것을 알 수 있다.

한편, 본 발명의 조성물이 RAW-264.7 세포의 생존능력에 억제 효과를 미치는지 확인하기 위하여, MTT 감소 분석을 실시하였는데, 도 6의 (B)에 도시된 바와 같이, 세포 밀도에는 거의 영향을 미치지 않았다. 이는 본 발명의 조성물이 배양물 내의 세포의 수에는 영향을 미치지 않으면서 NO 생성만 조절하였다는 것을 시사한다. 따라서 이러한 결과는 본 발명의 조성물이 시험관 내에서 항염증 활성을 갖는다는 것을 입증한다.

참고로 도 6에서 레인 1)은 LPS 처리 없이 비히클만 처리한 경우이고, 레인 2) 및 3)은 LPS 처리 전에 비히클과 덱사메타손(Dex)을 처리한 경우이고, 레인 4), 5) 및 6)은 LPS 처리 전에 본 발명의 조성물은 각각 1, 2, 및 4 ㎎/㎖로 처리한 실험군의 결과이다. 7)은 본 발명의 락토바실루스 카제이 LC5 균주를 처리한 실험군의 결과이고, 8)은 본 발명의 락토바실루스 플란타룸 LP3 균주를 처리한 실험군의 결과이다. P 값이 LPS-처리 대조군에 비해서 0.05 미만인 경우를 통계적으로 유의한 경우로 보고 *로 표시하였다.

대식세포에 의해서 생성된 NO는 면역반응에서 중요한 역할을 담당하기 때문에, LPS-처리 RAW-264.7 대식세포로부터의 NO 생성은 시험관 내에서의 염증을 연구하기 위한 좋은 모델이다. 본 실시예에서는 본 발명의 락토바실루스 카제이 LC5 균주, 락토바실루스 플란타룸 LP3 균주 및 이들을 포함하는 4 종류의 프로바이오틱 균주를 포함하는 본 발명의 조성물들의 항염증 활성을 조사하여, 본 발명의 조성물이 용량-의존 방식으로 LPS에 의해 유발된 NO 생성을 현저하게 억제하는 것을 확인할 수 있었다.

4. 생체내( in vivo ) 항염증 활성

본 발명의 조성물의 생체내(in vivo) 에서의 함염증 활성을 인간의 대장염과 가장 가까운 모델인 트리니트로벤젠 설포닉 산(trinitrobenzene sulfonic acid, TNBS) 유발 대장염 모델 마우스를 이용하여 평가하였다.

접촉성 감작 알레르겐인 TNBS를 에탄올과 함께 대장에 관장 투여하면 대장염을 유발할 수 있다. 이때 에탄올은 점막 장벽(mucosal barrier)을 깨서 TNBS를 장벽으로 들어가게 하는 역할을 한다. TNBS가 장에 저촉되게 되면 산화적 손상에 의해 급성 전층성 괴사를 일으키게 되며, 관장 후 수일 내에 급성 괴사와 염증이 생기고 그 후로는 단핵구 침윤 등과 함께 만성 염증 소견을 보인다. 이러한 TNBS 유발 대장염 모델은 반복성이 있으며, 전벽성 궤양을 얻을 수 있고, 면역 기전을 통한 병변이므로 만성염증까지 유발할 수 있어 사람의 염증성 장 질환과 매우 유사하다.

염증성 장 질환 유발 물질로는 2% TNBS 용액(50% 알콜에 용해, Sigma)을 사용하였다. 24시간 절식시킨 6주령의 수컷 Sprague-Dawley 쥐에 대장염을 유발하기 위해서 폴리에틸렌 튜브를 항문으로 밀어 넣은 후 130 ㎕의 TNBS 용액을 주사하고, 30초간 거꾸로 세웠다가 케이지에 넣었다. TNBS에 의해 유발된 염증에 대한 본 발명의 조성물의 효과는 직장 투여의 경우와 경구 투여의 두 가지 프로토콜에 따라서 평가하였다.

1) 직장 주사에 의한 TNBS-유발 장 염증의 억제 효과

직장 투여 프로토콜에서는, 2% TNBS와 본 발명의 조성물을 혼합한 것을 대장에 주사하고, 주사 후의 염증 변화를 조사하였다. 또한 본 발명의 조성물에 포함되는 락토바실루스 카제이 LC5 균주와 락토바실루스 플란타룸 LP3 균주의 항염증 효과도 확인하기 위하여 2% TNBS와 이들 각각의 균주를 혼합한 것을 대장에 주사하고, 주사 후의 염증 변화를 조사하였다. 이때 동물 모델들을 7 가지 그룹으로 나누어 처리하였다: 비히클과 50% 에탄올만 주사한 대조군 그룹, 비히클과 2% TNBS를 주사한 TNBS-처리 대조군 그룹, 및 본 발명의 ATP 조성물과 2% TNBS를 함께 주사한 세 개의 본 발명의 조성물 처리 그룹(1 ㎎(5×10⁶ CFU), 2 ㎎(1×10⁷ CFU), 및 4 ㎎(2×10⁷ CFU), 2% TNBS와 락토바실루스 카제이 LC5 균주(2.5×10⁶ CFU)를 함께 주사한 그룹 및 2% TNBS와 락토바실루스 플란타룸 LP3 균주(2.5×10⁶ CFU)를 함께 주사한 그룹). 모든 처리 그룹에는 세 마리 이상의 마우스를 포함시켰다.

항문으로부터 가까운 대장의 조직 단편을 절제하여, 대장의 벽두께를 측정하고 대장을 절개하여 궤양 및 염증상태의 병변을 조사하여, 그 결과를 도 7의 (A)에 나타내었다.

한편, 대장에서 절제한 조직을 10% 포름알데히드에 보관했다가 고정된 조직을 OCT 화합물에 박고나서 동결절편법에 의해 절편으로 만들었다. 5 ㎛ 절편을 헤마톡실린 및 에오신 염색하여, 상피 점막 세포의 손상 여부 및 항염증 세포의 대장 조직으로의 침윤을 광현미경으로 조사하였다. 현미경 사진을 도 7의 (B)에 나타내었다.

한편, TNBS만을 처리한 마우스의 대장 벽 두께는 상당히 두꺼웠지만(도 7A의 2), 이에 비해서, TNBS와 본 발명의 ATP 조성물을 농도별로 함께 주사한 마우스에서는 대장 벽 두께가 줄어들었다(도 7A의 4 및 5). TNBS와 락토바실루스 카제이 LC5 균주 또는 락토바실루스 플란타룸 LP3 균주를 함께 주사한 마우스에서는 대장 벽 두께가 감소하는 경향을 보였다. 이러한 결과는 본 발명의 유산균 조성물이 대장벽 조직을 TNBS-유발 부종성 변화(edematous change)로부터 보호한다는 것을 의미한다.

도 7(B)을 참고하면, TNBS만을 처리한 마우스에서는 TNBS 처리한 지역에 염증성 장 질환과 유사한 병변, 즉, 염증과 출혈을 보인 반면에, 본 발명의 ATP 조성물과 TNBS를 직장에 주사한 마우스에서는 어떠한 염증성 변화도 관찰되지 않았다. 락토바실루스 카제이 LC5 균주 또는 락토바실루스 플란타룸 LP3 균주를 2% TNBS와 함께 직장에 주사한 마우스에서도 염증 반응이 거의 나타나지 않았다.

도 7(B)를 참고하면, 대장벽의 표면을 살펴보면, TNBS와 본 발명의 조성물을 함께 주사할 경우, TNBS에 의해서 유발된 괴사성 손상이 차단된다. TNBS만을 처리한 마우스의 대장 벽 표면은 대장 조직의 출혈성 괴사로 인해서 매우 어둡게 보이는 반면에, 본 발명의 조성물과 TNBS를 직장에 주사한 마우스의 대장벽 조직의 표면은 TNBS를 처리하지 않은 대조군(도 7(B)의 1))과 마찬가지로 매우 깨끗한 것으로 확인되었다(도 7(B)의 4) 및 5)). 이러한 모든 결과는 본 발명의 유산균 조성물이 TNBS에 의해서 유도되는 염증성 변화를 도스 의존성 방식으로 예방한다는 것을 가리킨다.

2). 경구투여에 의한 TNBS-유발 장 염증의 억제 효과

본 발명의 조성물이 장 조직을 변화시켜 TNBS에 의한 염증 변화를 억제하는지 확인하기 위해서, 본 발명의 조성물의 경구 투여의 TNBS-유발 대장염에 대한 효과를 평가하였다.

마우스에 TNBS를 직장에 주사하기 전에 본 발명의 조성물을 경구 투여하였다. 간단하게 설명하면, 마우스에 4 ㎎(2××⁷ CFU)의 본 발명의 조성물을 하루에 세 번, 이틀 연속하여 경구 투여하고나서, TNBS를 직장에 주사하였다. 이 실험에서는 동물 모델들을 5 개의 그룹으로 나누어 처리하였다: 비히클을 경구투여하고 50% 에탄올을 직장에 주사한 대조군 그룹; 비히클을 경구 투여하고, 2% TNBS를 직장에 주사한 TNBS-처리 대조군 그룹; 및 4 ㎎의 본 발명의 조성물을 경구 투여하고 2% TNBS를 직장에 주사한 본 발명의 조성물 처리 그룹, 락토바실루스 카제이 LC5 균주를 경구 투여하고 2% TNBS를 직장에 주사한 그룹 및 락토바실루스 플란타룸 LP3 균주를 경구 투여하고 2% TNBS를 직장에 주사한 그룹. 모든 처리 그룹에는 세 마리 이상의 마우스를 포함시켰다.

대장 조직(colon tissue)에서의 염증성 변화의 정도를 확인하기 위해서, 대장 벽의 두께 비교, 대장 표면의 괴사성 손상, 및 대장 조직 단편의 조직학적 분석을 행하여, 그 결과를 도 8a-8b에 나타내었다.

도 8a-8b를 통해서 확인되는 바와 같이, 사전에 본 발명의 조성물을 경우 투여한 마우스에서는 TNBS에 의해서 유발된 염증 변화가 현저하게 억제되었다. TNBS-처리 대조군(도 8(A)의 2))에 비해서, 본 발명의 조성물을 경구 투여한 마우스(도 8(A)의 3))는 대장 벽 두께가 현저하게 감소되어 거의 TNBS-무처리 대조군(도 8(A)의 1))의 벽 두께에 근접하였다. 락토바실루스 카제이 LC5 균주를 경구 투여하고 2% TNBS를 직장에 주사한 그룹 및 락토바실루스 플란타룸 LP3 균주를 경구 투여하고 2% TNBS를 직장에 주사한 그룹에서도 대장 벽 두께가 많이 감소되었다.

본 발명의 조성물을 사전에 경구투여한 마우스의 대장 벽 표면을 조사해 본 결과, 괴사성 손상은 나타나지 않았다(도 8b의 (B)). TNBS-처리된 마우스(도 8b의 (B)의 2))에서는 대장 조직의 출혈성 괴사 때문에 장 조직의 표면이 매우 검게 나타난 반면에, 본 발명의 조성물을 사전에 경구 투여한 마우스(도 8b의 (B)의 2))에서는 TNBS-무처리 대조군(도 8(B)의 1))과 마찬가지로 장 벽 표면에 어떠한 괴사도 나타나지 않았다.

본 발명의 조성물은 직장 투여 시와 마찬가지로 경구 투여 시에도 TNBS에 의한 대장 상피조직 점막의 궤양성 손상 및 호산구 침윤을 억제하였다(도 8b의 (C)). TNBS로 처리된 마우스의 대장 상피조직 점막에서는 상피 조직이 완전히 파괴되었으나(도 8b의 (C)의 2)), 이러한 손상은 본 발명의 조성물을 투여한 마우스의 대장 조직에서는 완전히 사라졌다(도 8b의 (C)의 3)). 이러한 결과는 본 발명의 조성물의 경구 투여가 대장 조직을 TNBS에 의해서 유발된 염증 발병과 조직 손상을 차단하도록 조절할 수 있게 한다는 것을 의미한다.

일반적으로 염증성 장 질환의 알려진 특징은 NO 생성, 대장 벽 후벽화, 출혈성 괴사, 백혈구 침윤, 및 상피 점막세포 파괴인데, 본 실시예에 의해서 본 발명의 조성물이 염증 반응 진행과 TNBS에 의해서 유발된 손상을 효과적으로 억제하는 것을 확인하였다.

본 발명의 조성물을 경구 투여하는 경우에도, 직장 주사에 의해서 유발된 염증성 변화를 차단하였는데, 이는 본 발명의 조성물에 의한 항염증 효과가 단지 본 발명의 조성물과 TNBS 사이의 직접적인 상호작용에 의한 결과는 아니라는 것을 시사한다. 본 발명의 조성물은 대장의 미세 환경을 염증 변화에 견딜 수 있도록 변화시키는 것으로 추정된다.

5. 직장 조직 내에서의 싸이토카인의 발현에 대한 영향 평가

싸이토카인과 다른 면역조절제들은 염증성 장 질환에서 염증 반응의 조절에 관여하기 때문에, 이들 유전자의 발현이 본 발명의 조성물의 투여에 의해서 영향을 받는지 조사하였다. 대장 조직에서 싸이토카인의 농도를 역전사 중합효소 연쇄 반응법(RT-PCR)에 의해서 조사하였다. 4 mg의 본 발명의 조성물을 하루에 세 번씩 2일간 투여하고나서, 2% TNBS를 직장에 주사한 마우스의 대장 조직 절편을 이용하여 RNA를 준비하였다. 필러를 경구 투여하고, TNBS를 직장에 주사한 대조군 마우스로부터의 조직 절편으로부터도 RNA를 준비하였다. 전체 RNA를 SV Total RNA Isolation System을 이용하여 제작사의 설명에 따라서 준비하고, cDNA는 마우스 Fas, FasL, IL-6 및 β-액틴 유전자에 대한 프라이머 세트를 이용해서 PCR하였다. β-actin용으로 PCR 프라이머 세트 GGCACCAGGGTGTGATGG 및 ACGGTTGGCCTTAGGGTTC를 선택하고, IL-6용으로 세트 TGCACTTGCAGAAAACAATC 및 TGGTCTTGGTCCTTAGCC를 선택하였다. FasL용으로 프라이머 세트 CAACACAAATCTGTGGCTACCG 및 CCCATATCTGTCCAGTAGTGCA를 합성하고, Fas용으로 프라이머 세트 AGGAATTCGTGTGAACATGGAACCCT 및 AGAAGCTTCACTCCAGACATTGTCCT를 선택하였다. PCR 반응은 하기의 과정으로 실시하였다. 94℃에서 5분간의 1회 사이클: 94℃에서 4초간, 60℃에서 4초간 어닐링, 72℃에서 45초간 연장을 1회로 하여 30회 반응시켰고, 최종 증폭(last extension)은 72℃에서 10분간 수행하였다.

본 실시예에서는 본 발명의 조성물이 대장 조직에서 염증전 또는 면역 조절 싸이토카인 유전자의 전사 레벨에 미치는 영향을 조사하였다. 마우스에 TNBS만을 처리하거나 TNBS와 본 발명의 조성물을 혼합해서 투여한 후에, TNBS 주사 부위 주변의 대장 조직을 회수하여 RNA를 준비하여, 유전자 발현 상의 변화를 조사하여 그 결과를 도 9에 나타내었다.

도 9를 참고하면, 역전사 중합효소 연쇄반응 실험 결과 본 발명의 조성물(4 mg)을 경구 투여한 마우스의 대장 조직에서는 IL-6 및 FasL 유전자의 발현이 감소된 반면에(도 9의 2), 2% TNBS만을 처리한 마우스에서는 상기 유전자의 발현이 상향조절되었다(도 9의 1). Fas 유전자의 발현은 차이를 보이지 않았다.

염증성 장 질환 환자에서는 IL-6과 FasL 발현 농도가 증가하기 때문에, 본 발명의 조성물의 투여에 의해서 IL-6과 FasL 발현이 하향 조절되었다는 것은, 본 발명의 조성물이 대장에서의 염증을 예방할 수 있다는 것을 가리킨다. IL-6는 염증성 장 질환의 염증 발생에서 매우 중요한 역할을 수행하는 염증전 싸이토카인(pro-inflammatory cytokine)이기 때문에, 본 발명의 유산균 조성물은 IP-6 유전자의 발현을 억제함으로써 함염증 활성을 나타내는 것으로 볼 수 있다.

FasL은 세포 죽음을 담당하고, IL-6을 포함하는 염증전 싸이토카인의 생성에 관여하기 때문에, 본 발명의 조성물에 의한 FasL 유전자 발현의 하향 조절 역시 TNBS-유발 염증성 변화의 억제와 관련된다. Fas와 FasL은 이들의 상호작용이 조직 손상을 담당하는 T-세포 매개 세포독성 이펙터 메카니즘에서 역할을 하는 죽음 수용체이기 때문에, 본 발명의 조성물에 의한 FasL의 하향 조절은 본 발명의 조성물이 TNBS에 의해 유발된 대장 조직 손상에 대한 보호 효과를 설명한다. FasL이 침윤된 백혈구에 의한 대장 조직 세포의 아폽토시스를 통해서 조직 손상에 관여한다고 가정하면, 본 발명의 조성물에 의한 FasL의 하향 조절은 아포톱틱 조직 손상을 억제하는 것으로 추정할 수 있다.

본 발명은 그 사상 및 범위로부터 벗어남 없이 다양하게 변형 및 변화되어 실시될 수 있고, 이러한 사실은 당업자에게 자명할 것이다. 본 명세서에 기재된 구체적 실시예는 단지 본 발명의 바람직한 구현예를 설명하기 위한 것으로, 본 발명을 제한하는 것으로 해석되어서는 안 된다. 본 발명의 보호범위는 첨부된 특허청구범위에 의해서 정해져야 하며, 상기의 다양한 변형 및 변화는 본 발명의 보호범위에 포함되는 것으로 의도된다.

한국생명공학연구원

KCTC12398BP

20130411

한국생명공학연구원

KCTC10782BP

20050321

한국생명공학연구원

KCTC12202BP

20120507

한국생명공학연구원

KCTC11904BP

20120507

Claims

락토바실루스 카제이 LC5 (Lactobacillus casei LC5, (KCTC 12398BP)), 락토바실루스 플란타룸 LP3 (Lactobacillus plantarum LP3, (KCTC 10782BP)), 비피도박테리움 애니말리스 락티스 BL3 (Bifidobacterium animalis subsp. lactis BL3 (KCTC 11904BP)), 및 락토바실루스 람노수스 LR5 (Lactobacillus rhamnosus LR5(KCTC 12202BP) 또는 이들의 배양물을 포함하는 염증 질환 예방 또는 치료용 조성물.
제1항에 있어서, 상기 조성물이 조성물 총 중량에 대해, 유효성분으로서 유산균 혼합물을 10⁸ 내지 10¹² cfu/g의 함량으로 포함하거나, 동등한 수의 생균을 가진 배양물을 포함하는 것을 특징으로 하는 염증 질환 예방 또는 치료용 조성물.
제1항에 있어서, 상기 조성물이 크론병, 궤양성 대장염, 장관 베체트병 및 허혈성 장염으로 이루어지는 군에서 선택되는 염증성 장 질환의 예방 또는 치료에 유용한 것임을 특징으로 하는 염증 질환 예방 또는 치료용 조성물.
제1항에 있어서, 상기 조성물은 락토바실루스 살리바리우스(Lactobacillus salivarius), 락토바실루스 브레비스(Lactobacillus brevis), 락토바실루스 헬베티쿠스(Lactobacillus helveticus), 락토바실루스 퍼멘툼(Lactobacillus fermentum), 락토바실루스 파라카세이(Lactobacillus paracasei), 락토바실루스 델브루에키(Lactobacillus delbrueckii), 락토바실루스 레우테리(Lactobacillus reuteri), 락토바실루스 부츠네리(Lactobacillus buchneri), 락토바실루스 가세리(Lactobacillus gasseri), 락토바실루스 존스니(Lactobacillus johonsonii), 락토바실루스 케피르(Lactobacillus kefir), 락토코쿠스 락티스(Lactococcus lactis), 비피도박테리움 비피둠(Bifidobacterium bifidum), 비피도박테리움 인판티스(Bifidobacterium infantis), 비피도박테리움 수도롱굼(Bifidobacterium pseudolongum), 비피도박테리움 써모필룸 (Bifidobacterium themophilum), 및 비피도박테리움 아돌센티스 (Bifidobacterium adolescentis)로 구성되는 군에서 선택되는 1종 이상의 유산균을 추가로 포함하는 염증 질환 예방 또는 치료용 조성물.
제1항에 있어서, 상기 조성물이 제약학적 허용되는 담체 또는 부형제를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 염증 질환 예방 또는 치료용 조성물.
제1항에 있어서, 상기 조성물은 락토바실루스 속 유산균과 비피도박테리움속 비피더스균을 1:1 내지 3:1의 비율로 포함하는 것을 특징으로 하는 염증 질환 예방 또는 치료용 조성물.
제1항에 있어서, 상기 조성물은 4종의 유산균을 동일한 비율로 포함하는 것을 특징으로 하는 염증 질환 예방 또는 치료용 조성물.
제1항에 있어서, 상기 조성물은 유산균 및 비피더스균을 동결건조하여 생균제 형태로 제조된 것임을 특징으로 하는 염증 질환 예방 또는 치료용 조성물.
제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 따른 유산균 함유 염증 질환 예방 또는 치료용 조성물로 이루어진 것을 특징으로 하는 약품.
한국생명공학연구원 유전자은행(Korean Collection for Type Culture; KCTC)에 수탁 번호 KCTC 12398BP로서 국제기탁된 락토바실루스 카제이 LC5 (Lactobacillus casei LC5) 유산균.
한국생명공학연구원 유전자은행(Korean Collection for Type Culture; KCTC)에 수탁 번호 KCTC 10782BP로서 국제기탁된 락토바실루스 플란타룸 LP3 (Lactobacillus plantarum LP3) 유산균.
락토바실루스 카제이 LC5 (Lactobacillus casei LC5, (KCTC 12398BP)), 락토바실루스 플란타룸 LP3 (Lactobacillus plantarum LP3, (KCTC 10782BP)), 비피도박테리움 애니말리스 락티스 BL3 (Bifidobacterium animalis subsp. lactis BL3 (KCTC 11904BP)), 및 락토바실루스 람노수스 LR5 (Lactobacillus rhamnosus LR5(KCTC 12202BP) 또는 이들의 배양물을 포함하는 식품.