KR20030064030A

KR20030064030A - 위액 및 담즙산에 대한 내성이 높아 장내 생존력이 우수한한국인 분변 유래 유용 프로바이오틱 생균 및 그의 용도

Info

Publication number: KR20030064030A
Application number: KR1020020004436A
Authority: KR
Inventors: 백현동; 정황영
Original assignee: 주식회사 푸코
Priority date: 2002-01-25
Filing date: 2002-01-25
Publication date: 2003-07-31

Abstract

본 발명은 위액 및 담즙산에 대한 내성이 높아 장내 생존력이 우수한 한국인 분변으로부터 분리된 신규한 유용 프로바이오틱 생균 및 그의 용도에 관한 것으로, 본 발명 프로바이오틱 생균인 락토바실러스 퍼멘툼(Lactobacillus fermentum) HY701은 위액 및 담즙산에 대한 내성이 기존 균주에 비해 월등하게 높고, 많은 β-갈락토시다제를 생산하므로 유당불내증을 감소시킬 수 있는 효과가 있으며, 리스테리아 및 대장균 감염을 억제할 수 있는 뛰어난 효과가 있다.

Description

위액 및 담즙산에 대한 내성이 높아 장내 생존력이 우수한 한국인 분변 유래 유용 프로바이오틱 생균 및 그의 용도{Novel probiotic strain isolated from Korean feces having gastric juice-resistance, bile acid-resistance and its use}

본 발명은 위액 및 담즙산에 대한 내성이 높아 장내 생존력이 우수한 신규한 유용 프로바이오틱 생균 및 그의 용도에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 우리나라사람의 인체 분변으로부터 분리되고, 위액 및 담즙산에 대한 내성이 높아 장내 생존력이 기존 균주에 비해 매우 뛰어나고 우수한 프로바이오틱 생균인 락토바실러스 퍼멘툼(Lactobacillus fermentum) HY701에 관한 것이다.

프로바이오틱 생균제란 살아있는 미생물 균체를 섭취함으로써 미생물이 분비하는 효소, 유기산, 비타민 및 무독성 항균물질 등에 의한 장내 균총의 정상화는 물론 장질환 치료를 통해 신체기능 개선을 목적으로 생산된 제품을 말한다(Fuller, R. 1989. Probiotics in man and animals. J. Appl. Bacteriol. 66: 365-378). 이러한 프로바이오틱 생균제는 장내 균총의 안정화, 유해세균의 정착 억제에 따른 부패산물 생성 감소 및 질병예방, 면역의 활성화, 간접적인 항암작용, 콜레스테롤 저하, 유당불내증의 감소, 변비억제 및 예방과 관련되어 기능성이 인정되어 있다(Goldin, B.R. and Borbach, S.L. 1977. Alterations in fecal microflora enzymes related to diet, age, lactobacillus supplements, and dimethylhydrazine. Cancer 40: 2421-2426; Fuller, R. 1991. Probiotics in human medicine. Gut. 32: 439-442; Shah, N. 1994.Lactobacillus acidophilusand lactose intolerance, a review. ASEAN Food J. 9: 47-54; Takiguchi et al. 1997.Lactobacillus acidophilusSBT 2062 andBifidobacterium longumSBT 2928 on harmful intestinal bacteria. J. Int. Microbiol. 11: 11-17). 프로바이오틱 생균제로 많이 이용되고 있는 세균은 락토바실러스(Lactobacillus)속,스트렙토코커스(Streptococcus)속, 비피도박테리움(Bifidobacterium)속 그리고 유포자 유산균인 바실러스(Bacillus)속 등이 있다. 한편, 프로바이오틱 생균제로서균이 가져야 할 이론적 근거는 안전성, 기능적 측면(생존성, 정착성, 서식성, 항미생물제 생성능, 면역 촉진능, antigenotoxic 활성, 병원성 세균의 억제능), 기술적 측면(관능적 특성, 안전성, 박테리오파지 저항성, 제조과정중의 생존성), 그리고 GRAS(Generally Recognized As Safe)미생물로서 장내 생존력이 커야 한다는 것이다.

본 발명자들은 상기와 같은 점을 고려하여 한국인의 분변으로부터 분리된 유용 유산균 중에서 위액 및 담즙산의 내성이 시판중인 상업용 프로바이오틱 생균제에 비해 매우 우수한 균주를 선발하고, 상기 균주의 특성을 분석함으로써 본 발명을 완성하였다.

따라서, 본 발명의 목적은 위액 및 답즙산에 대한 내성 있는 유용 인체용 프로바이오틱 생균을 제공함에 있다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 프로바이오틱 생균을 기능성 건강식품 및 의약품 등에 사용하는 용도를 제공함에 있다.

본 발명의 상기 목적은 우리나라 사람의 인체 분변으로부터 락토바실러스 퍼멘툼(Lactobacillus fermentum) HY701 균주를 선발 분리하고, 상기 분리한 균주의 인공위액 및 인공 담즙액에 대한 내성을 확인하는 한편, 효소활성, 항생물질에 대한 내성 및 항균활성을 측정하므로써 달성하였다.

도 1은 본 발명 프로바이오틱 생균의 인공위액에 대한 내성을 나타낸 그래프이다.

도 2는 본 발명 프로바이오틱 생균의 인공담즙산에 대한 내성을 나타낸 그래프이다.

도 3은 본 발명 프로바이오틱 생균의Listeria monocytogenesATCC 19111(A) 및E.coliJM109(B) 의 생장 억제능을 조사한 결과이다.

본 발명은 우리나라 사람의 인체 분변으로부터 락토바실러스 퍼멘툼 HY701를 분리하는 단계; Kobayashi 등의 방법에 따라 인공위액과 인공담즙산에 대한 본 발명 균주의 내성을 측정하는 단계; 그램 염색법 및 API CHL(bioMereux co., France)에 의해 49개의 탄소원에 대한 이용성을 검토함으로써 본 발명 균주의 미생물적 동정을 실시하는 단계; API ZYM 키트를 이용하여 상기 균주의 효소활성을 측정하는 단계; Paper disc방법에 따라 항생물질의 내성을 조사하는 단계 및Listeria monocytogenesATCC 19111 및E.coliJM109에 대한 항균력을 측정하는 단계로 구성된다.

상기 인공위액에 대한 내성, 인공담즙산에 대한 내성을 측정하는 단계에 있어서, 총균수는 배양액을 0.1% 펩톤수로 10배씩 연속적인 희석을 시킨 다음, 평판배지에 0.1 ml씩 분주하여 도말한 후, 각각의 최적온도에서 배양한 후, 콜로니형성단위(colony forming unit)를 측정하여 총균수를 계산하였다.

상기 단계에서 사용한 상업용 프로바이오틱 균주 DH65, KM332, PA212은 국내에서 시판중인 대표적인 프로바이오틱 생균((주)셀바이오텍)을 사용하였으며, 항균활성을 측정하는데 사용한Listeria monocytogenesATCC 19111은 ATCC사로부터 구입하여 사용하였다.

본 발명의 프로바이오틱 생균을 락토바실러스 퍼멘툼(Lactobacillus fermentum) HY701로 명명하고 이를 국제기탁기관인 한국종균협회 미생물 보존센터에 2001년 1월 16일자로 수탁하였다(수탁번호: KCCM-10351).

본 발명은 상기 균주를 유효성분으로 함유하는 것을 특징으로 하는 기능성식품, 건강보조식품 및 의약품을 제공한다.

본 발명의 조성물은 대상 개체에 매일 일회 이상 투여될 수 있으며, 성인의 경구 투여용 투여 단위는 체중 1 kg당 1 μg 내지 200 mg으로 투여하는 것이 바람직하다. 그러나, 투여량은 체중, 연령, 건강상태, 투여방법, 약제혼합 및 질환의 중증도에 따라 변화될 수 있으며, 통상적인 방법에 의하여 정제, 캅셀제, 과립제, 현탁제, 유제와 같은 단위 투여형 또는 수회 투여형 제제로 제형화하거나 캡슐화하여 사용할 수 있다.

본 발명 조성물을 주기적으로 복용하는 경우에 장내에 본 발명의 미생물들이 균총을 이루면서 β-갈락토시다제를 생산하여 유당불내증을 완화시키는 작용을 하며, 리스테리아균 및 대장균 등의 장내 감염을 억제할 수 있다.

또한 본 명세서의 '조성물'은 반드시 의약품으로 허가되는 것만을 의미하는 것은 아니고, 통상적인 기능성 식품 또는 건강보조식품까지 포함하는 개념이다.

이하, 본 발명의 구체적인 방법을 실시예를 들어 상세히 설명하고자 하지만,본 발명의 권리범위는 이들 실시예에만 한정되는 것은 아니다.

실시예 1: 본 발명 프로바이오틱 생균의 분리 및 배양

본 발명은 프로바이오틱 생균을 분리하기 위하여 우리나라 사람의 인체 분변으로부터 100 여개의 균을 분리하고 이중 락토바실러스균(Lactobacillussp.)과 유사한 형태적 특성을 갖는 균주를 28주 선발하였다. 이 균주들을 사용하여 젖산을생산하는 혐기성 그램양성 간균을 선별하고, 이들 균주 중에서 효소활성을 측정하여 β-갈락토시다제(β-galactosidase)활성이 강하고, β-글루쿠로니다제(β-glucuronidase) 활성이 없는 균주를 선별하고 이를 HY701 균주로 약칭하였다. 상기 분리한 젖산균은 배양배지로 lactobacilli MRS 배지(Difco Laboratories, USA)를 사용하여 배양하였다.

젖산균은 순수 분리되어 MRS agar plate에 보존 중인 균주를 10 ml test tube의 MRS 브로스에 한 백금이 접종하여 32℃에서 12시간 정치배양을 하였다.

실시예 2: 본 발명 프로바이오틱 생균의 인공위액에 대한 내성

프로바이오틱 생균으로서 가져야 할 특성이 여러 가지가 있는데, 이 중에서 가장 중요한 특성 중 하나가 생존력이 높아야 한다는 점이다(Fuller, R. 1989. Probiotics in amn and animals. J. Appl. Bacteriol. 66: 365-378). 구강을 통하여 섭취되는 균은 위와 십이지장을 통해 생존하여 최종 목적 부위인 장에 도달하기 때문에 프로바이오틱 생균제로서의 기능을 발휘하기 위해서는 강산성의 위액을 통과하여야 한다. 순수한 위액의 pH는 1.4∼2.0 정도로 거의 대부분 미생물은 여기에서 사멸하게 된다. 하지만 섭취한 음식물의 완충작용으로 인해 다소 pH가 높아져 미생물의 사멸율이 어느 정도 감소하게 된다(Conway et al. 1987. Survival of lactic acid bacteria in the human stomach and adhesion to intestinal cells. J. Dairy Sci. 70: 1-12). 내산성 실험으로는in vivo에서 직접 생존율을 확인하는 방법과 인공위액을 이용한 간접적으로 측정하는 방법이 알려져 있다. 프로바이오틱 생균의 사멸은 주로 낮은 pH에 의한 것이며in vitro와in vivo에서의 실험결과가 거의 일치한다는 사실이 보고되어 있다(Conway et al. 1987. Survival of lactic acid bacteria in the human stomach and adhesion to intestinal cells. J. Dairy Sci. 70: 1-12; Giannella et al. 1972. Gastric acid barrier to ingested microorganisms in man: Studiesin vivoandin vitro. Gut 13: 251-256; Berrada et al. 1991.Bifidobacteriumfrom fermented milks: Survival during gastric transit. J. Dairy Sci. 74: 409-413).

본 실시예에서는 상기와 같은 점을 감안하여 pH 2.5로 조정된 인공위액에서의 본 발명 균주의 내성을 측정하였다.

인공위액은 Kobayashi 등의 방법에 따라 1N HCl을 사용하여 pH 2.5로 조정한 각각의 브로스에 펩신 1%를 첨가하여 사용하였다(Kobayashi et al. 1974. Tolerance of the multiple antibiotic resistant strain,L. caseiPSR 3002, to artificial digestive fluids. Jpn. J. Microbiol. 29: 691-197). 인공위액에 대한 내성을 실험하기 위해 각 균주의 배양액을 에펜돌프 튜브에 1 ml 넣은 후 6000 rpm에서 10분간 원심분리한 후 배양 상등액을 버리고 균체만을 회수하였다. 회수된 균체는 다시 인공위액을 상등액과 동량으로 첨가하여 9 ml 테스트 튜브 인공위액에 넣어 2시간 동안 37℃에서 배양하여 총균수를 측정하였다. 대조구는 pH를 조절하지 않고 또한 펩신을 첨가하지 않은 각각의 브로스를 사용하여 위와 같은 동일한 방법을 거쳤다.

실험결과, 도 1에 나타난 바와 같이 HY701균은 2시간 경과 후 77.6%의 균이생존하는 매우 높은 생존율을 보여 인공위액에 대한 내성을 지니고 있음을 알 수 있었다.

본 발명 균주와 상업용 균주와의 인공위액내성 비교

균주명시간 (hour)	본 발명 균주(HY701)	상업용 균주1(DH65)	상업용 균주2(KM332)	상업용 균주3(PA212)
0	2.3×10⁸	2.0×10⁸	1.8×10⁸	1.9×10⁸
30	2.1×10⁸	8.9×10⁷	9.2×10⁷	7.8×10⁷
60	1.9×10⁸	8.7×10⁷	6.4×10⁷	6.8×10⁶
90	1.8×10⁸	4.0×10⁵	8.5×10⁴	3.1×10⁵
120	1.8×10⁸	1.6×10³	2.3×10³	8.5×10²
[주](단위: 콜로니형성단위/ml)

실시예 3: 본 발명 프로바이오틱 생균의 인공담즙산에 대한 내성

섭취된 프로바이오틱 생균이 장에 도달하기 위해서 위를 거쳐 췌장과 십이지장을 통과하게 된다. 이 부위에서 분비되는 담즙액에 대한 내성 또한 프로바이오틱 생균이 가져야 할 중요한 특성이다. Gilliland 등은 프로바이오틱 생균이 가져야 할 담즙액에 대한 내성은 oxgall이 0.3% 함유된 배지에서 성장할 수 있어야 한다고 보고했다(Gilliland et al. 1984. Importance of bile tolerance ofLactobacillus acidophilusused as a dietary adjunct. J. Dairy Sci. 67: 3045-3051).

상기와 같은 점을 감안하여, 인공담즙액은 멸균된 각각의 브로스에 멸균한 10% oxgall (Difco) 용액을 1% 첨가하여 사용하였다. 인공담즙산 내성을 실험하기 위해서 인공위액을 거친 배양액을 인공담즙액이 있는 테스트 튜브(test tube)에 첨가하여 37℃에서 24시간 동안 배양한 후 생존력을 조사하기 위해서 인공위액과 마찬가지로 총균수를 측정하였다. 대조구는 oxgall이 첨가되지 않은 각각의 브로스에 위와 같은 동일한 방법을 사용하여 실험하였다.

인공담즙산에 대한 내성을 실험한 결과, 젖산균의 인공위액을 거친 인공담즙산의 내성은 도 2에서 보는 바와 같이 인공위액을 통과한 인공담즙산에 대한 내성은 control에 비해 다소 낮은 생존율을 보였지만 거의 대부분 10⁸CFU/ml 수준을 상회하고 있고 초기 접종 균수에 비해 높은 수치이다.

따라서 본 발명 프로바이오틱 생균인 HY701은 인공위액 뿐 아니라 인공 담즙산에 대하여도 내성을 지니고 있어 목적부위인 장에 도달하여 프로바이오틱 생균으로서의 역할을 수행할 수 있다.

실시예 4 : 본 발명 프로바이오틱 생균의 미생물학적 동정

현재 널리 이용되는 세균의 분류 방식은 미국의 Bergey식의 분류법(Bergey's Manual of Determinative Bacteriology)과 소련 및 동구지역에서 이용되는 Krassilinikov (1949)의 분류법 그리고 프랑스를 비롯한 유럽 및 아프리카의 일부 등지에서 쓰이는 Prevot (1961)의 분류법 등이 있다.

우리 나라에서는 Begey식의 분류법을 따르고 있는데 Bergey 편람은 여러 학자들이 분담 저술한 것을 미국 미생물학회의 편집위원회에서 편집한 것으로 장점도 있는 반면에 내용에 통일성이 없다는 단점도 있다.

본 실시예에서는 그람 염색법 및 API CHL(bioMereux Co., France)에 의해 49개의 탄소원에 대한 이용성을 검토함으로써 젖산균 HY701 균주를 동정하였다(Kim, W.J. 1996. Screening of bacteriocinogenic lactic acid bacteria and their antagonistic effects in sausage fermentation. J. Microbiol. Biotechnol. 6: 461-467).

API CHL 키트에 의해 탄소원 이용성을 살펴본 결과 표 2처럼 HY701 균주는 96.6%의 유사성으로Lactobacillus fermentum으로 동정되었다.

API 50 CHL kit을 이용한 프로바이오틱 균주 HY701의 미생물학적 동정

Test items	균 주 HY701
대조구````	균 주 HY701
글리세롤(Glycerol)	-
에리트리톨(Erythritol)	-
D-아라비노스(D-Arabinose)	-
L-아라비노스(L-Arabinose)	-
리보오스(Ribose)	+
D-크실로스(D-Xylose)	+
L-크실로스(L-Xylose)	-
아도니톨(Adonitol)	-
β-메틸크실로시드(β-Methylxyloside)	-
갈락토스(Galactose)	-
글루코스(Glucose)	+
프락토스(Fructose)	+
만노스(Mannose)	-
소르보스(Sorbose)	-
람노스(Rhamnose)	-
둘시톨(Dulcitol)	-
이노시톨(Inositol)	-
만니톨(Mannitol)	-
솔비톨(Sorbitol)	-
α-메틸-D-만노시드(α-Methyl-D-mannoside)	-
α-메틸-d-글루코시드(α-Methyl-D-glucoside)	-
N-아세틸글루코사민(N-Acetylglucosamine)	-
아미그달린(Amygdaline)	-
아르부틴(Arbutin)	-
에스큘린(Esculin)	-
살리신(Salicin)	-
셀로비오스(Cellobiose)	-
말토오스(Maltose)	-
락토오스(Lactose)	+
멜리비오스(Melibiose)	+
사카로스(Saccharose)	+
트레할로스(Trehalose)	+
이눌린(Inulin)	-
멜레지토스(Melezitose)	-
라피노스(Raffinose)	-
녹말(Starch)	+
글리코겐(Glycogen)	-
자일리톨(Xylitol)	-
겐티오비아제(Gentiobiose)	-
D-투라노스(D-Turanose)	-
D-릭소스(D-Lyxose)	-
D-타카토스(D-Tagatose)	-
D-푸코스(D-Fucose)	-
L-푸코스(L-Fucose)	-
D-아라비톨(D-Arabitol)	-
L-아라비톨(L-Arabitol)	-
글루코네이트(Gluconate)	+
2-케토글루코네이트(2-Ketogluconate)	-
5-케토글루코네이트(5-Ketogluconate)	-
[주] +: utilized, -: not utilized

실시예 5: 본 발명 프로바이오틱 생균의 효소활성 측정

프로바이오틱 생균이 가져야 할 특성 중에 이들 균이 생산하는 효소 또한 중요한 부분을 차지하고 있다. 예를 들어 발암효소로 알려진 β-글루쿠로니다제(β-glucuronidase)경우, 벤조피렌(Benzo(a)pyrene) 등의 발암물질이 체내에 들어오면 간에서 glucuronic acid와 포합되어 해독작용이 이루어지지만, 이것이 담즙과 함께 장내에 배설되어 장내 세균의 β-글루쿠로니다제에 의해 탈포합되면 다시 독성을 가지게 된다(Cole et al. 1989. Effect of probiotic supplements ofLactobacillus acidophilusandBifidobacterium adolescentis2204 on β-glucosidase and β-glucuronidase activity in the lower gut of rats associated with a human fecal flora. Microb. Ecol. Health Dis. 2: 223-225). 따라서 프로바이오틱 생균으로서 사용되는 균들이 발암효소인 β-글루쿠로니다제의 활성을 갖고 있다는 것은 바람직하지 않다. 그리고 프로바이오틱 생균들의 유익한 효소는 사람이나 동물이 영양분을 섭취하였을 때 위와 장을 통해 흡수되지 않거나 분해되지 않아서 장내에서 이상발효를 일으킬 수 있는 방지해 준다.

효소활성을 측정하기 위해서 선별된 균주를 각각의 브로스에 3회 계대배양하여 배양액을 원심분리하여 균체만을 회수하여 멸균수로서 2회 반복하여 세척하였다. 세척한 후 멸균수에 현탁하여 10⁶CFU/ml 정도의 농도가 되도록 하였다. 이 현탁액을 API ZYM(bioMerieux Co.)에 접종하여 어두운 곳에서 37℃, 4시간 동안 배양하였다. 표현활성 증가와 용해를 돕기 위해 ZYM A, B 시약을 각각의 큐플에 한 방울씩 떨어뜨린 후 밝은 곳에서 약 5분간 반응시킨 후 색깔의 변화를 관찰하여 효소활성을 측정하였다.

본 연구에서 선택되어진 젖산균 HY701균을 API ZYM kit에 의해 확인한 결과 하기 표 3에서와 같이 발암 효소인 β-글루쿠로니다제에 대한 활성이 없는 것으로 나타났다. 이러한 결과는 프로바이오틱 생균으로 인해 발생할 수 있는 발암 유발의 위험성이 없다는 것이다. 한편 유당불내증을 완화시킬 수 있는 β-갈락토시다제(β-galactosidase)를 강력하게 생산하므로 프로바이오틱 생균으로서의 좋은 특성을 가지고 있다.

API ZYM 키트에 의한 프로바이오틱 HY701 균주의 효소활성 측정

효소	균주
효소	HY701
대조구(Control)	0
알카라인 포스파타제(Alkaline phosphatase)	0
에스테라제(Esterase; C₄)	3
에스테라제 리파제(Esterase Lipase; C₈)	2
리파제(Lipase; C₁₄)	0
로이신 아릴아미다제(Leucine arylamidase)	3
발린 아릴아미다제(Valine arylamidase)	0
크리스틴 아릴아미다제(Crystine arylamidase)	0
트립신(Trypsin)	0
α-키모트립신(α-Chymotrypsin)	0
에시드 포스파타아제(Acid phosphatase)	4
나프톨-AS-BI-포스포하이드로아제(Naphthol-AS-BI-phosphohydrolase)	3
α-갈락토시다제(α-Galactosidase)	4
β-갈락토시다제(β-Galactosidase)	5
β-글루쿠로니다제(β-Glucuronidase)	0
α-글루쿠로니다제(α-Glucosidase)	0
β-글루쿠로니다제(β-Glucosidase)	0
N-아세틸-β-글루코사민다제( N-Acetyl-β-glucosaminidase)	0
α-만노시다제(α-Mannosidase)	0
α-푸코시다제(α-Fucosidase)	0
[주]0: 0 nmole, 1: 5 nmole, 2: 10 nmole, 3: 20 nmole, 4: 30 nmole, 5: ≥ 40 nmole

실시예 6: 본 발명 프로바이오틱 생균의 항생물질에 대한 내성조사

항생물질 내성을 측정하기 위해서 paper disc 방법을 사용하였다. 즉, 각각의 균주를 최적의 온도에서 12시간 배양하고, 그리고 각각의 소프트 아가(0.7%)에 배양액을 100 ㎕로 접종하여 아가플레이트에 overlay한다. Overlay된 플레이트에 각 농도별의 항생물질(nisin, tetracycline, streptomycin 외 7종)을 충분히 적신 paper disc를 올려서 24시간 배양하여 항생물질 내성을 측정하였다.

하기 표 4에서 보는 바와 같이 HY701 균주가 에리스로마이신 15, 30 ㎍/㎖의 , 록시스로마이신 20, 30 ㎍/㎖, 테트라사이클린 20 ㎍/㎖ 농도에서 저해를 받았고 나머지 9종류의 항생물질에 대해서는 내성을 가지고 있다. 이러한 결과들은 이 등이 보고한 항생물질에 대한 내성보다도 높은 내성을 가지고 있었다(Lee, S.H. and No, M.J. 1997. Viability in artificial gastric and bile juice and antimicrobial activity of some lactic acid bacteria isolated from Kimchi. J. Appl. Microbiol. Biotechnol. 6: 617-622).

프로바이오틱 HY701 균주의 항생물질에 대한 내성조사

항생물질(㎍/ml)	균 주
항생물질(㎍/ml)	HY701
나이신(Nisin)	0	+
	25	+
	50	+
	100	+
스트렙토마이신(Streptomycin)	0	+
	5	+
	10	+
	20	+
테트라사이클린(Tetracycline)	0	+
	5	+
	10	+
	20	-
리파마이신(Rifamycin)	0	+
	5	+
	10	+
	20	+
암피실린(Ampicillin)	0	+
	10	+
	20	+
	30	+
시클로플록사신(Ciprofloxacin)	0	+
	5	+
	10	+
	20	+
독시사이클린(Doxycycline)	0	+
	10	+
	20	+
	30	+
록시스로마이신(Roxithromycin)	0	+
	10	+
	20	-
	30	-
니스타틴(Nystatin)	0	+
	5	+
	10	+
	20	+
황산젠타마이신(Gentamycin-Sulfate)	0	+
	5	+
	10	+
	20	+
클로로암피니콜(Chloramphenicol)	0	+
	10	+
	20	+
	30	+
에리스로마이신(Erythromycin)	0	+
	10	+
	15	-
	30	-

실시예 7 : 본 발명 프로바이오틱 생균의 항균활성 측정

본 발명 균주의 병원성 세균에 대한 항균력을 측정하기 위해 리스테리아 모노사이토지니스(Listeria monocytogenes)ATCC 19111 및E.coliJM109를 사용하였다.

병원성 세균인 리스테리아(listeria)는 그램 음성 무포자 간균으로서 가축(소, 말 양, 돼지, 산양 등) 및 가금(닭, 오리 등)에 감염되는 질환을 일으키고 때로는 사람에게 감염된다. 사람은 감염동물과 직접 접촉 및 오염된 식육이나 유제품 등에 의한 경구감염이 되는 경우가 주이며, 때로는 오염된 먼지에 의한 호흡을 통하여 감염되기도 한다. 잠복기는 3일에서 수 주일이며 증상은 수막염, 패혈증 및 자궁내막염(임산부)등을 일으킨다(오승희, 김동원. 1997. 최신식품위생학. pp. 241).

항균활성 측정에 사용된 리스테리아는 TSB 배지에서 37℃, 24시간 동안 3회 계대배양하여 사용하였으며, 선택배지로서는 영국 Unipath사 제품의 Listeria Selective Agar base를 사용하였다.

항균활성을 측정하기 위해서 HY701 균주와L. monocytogenesATCC 19111 및E.coliJM109을 각각 12시간 동안 배양한 다음 균수를 10³∼10⁴CFU/ml 수준으로 희석하고 1:1 부피비율로 각각 테스트 튜브에 5 ml를 혼합하여 37℃ shaking water bath에서 배양하였다. 배양을 하면서 1, 2, 4, 8, 24 시간 간격으로 시료를 취하여 리스테리아 선택배지를 사용하여 균수를 측정하였다.

젖산균인 HY701 균주는 도 3에서 보는 바와 같이 4시간까지는 리스테리아의 균수(A)가 증가하다가 8시간 이후부터는 감소하기 시작하였으며 24시간 후에는 대조구에 비해 상당히 많은 감소를 보였다(log 2 이하까지 감소). 대장균(B)의 경우에는 약 2시간까지는 증가하다가 4시간이후부터 감소하여 리스테리아와 같은 현상이 나타났다. 이러한 저해의 주된 원인은 젖산균에 의해서 생성된 유기산과 젖산에 의한 pH 저하와 박테리오신과 같은 물질에 기인한 것으로 보인다(Hong et al. 1996. Growth ofLactobacillus acidophilusin whey-based medium and preparation of cell concentrate for production of probiotics. J. Appl. Microbiol. Biotechnol. 2: 128-131).

상기와 같은 결과에 의해 만약 리스테리아 및 대장균에 감염이 되었을 경우 장내에 상주하는 프로바이오틱 균주들에 의해 강력하게 억제할 수 있을 것이라 판단된다.

이상, 상기 실시예를 통하여 설명한 바와 같이 본 발명 프로바이오틱 생균인Lactobacillus fermentumHY701는 위액 및 담즙산에 대한 내성이 매우 높아 장내 생존력이 뛰어나고, β-갈락토시다제를 생산하므로 유당불내증을 감소시킬 수 있는 효과가 있으며 리스테리아 및 대장균 감염을 억제할 수 있는 뛰어난 효과가 있고 기존 균주에 비해 우수하여 기능성 식품으로의 이용 가능성이 있으므로 식품산업상 및 의학 산업상 매우 유용한 발명인 것이다.

Claims

위액 및 담즙산에 대한 내성이 우수하며, β-갈락토시다제를 생산하고, 리스테리아균 및 대장균에 대하여 항균활성을 가지는 락토바실러스 퍼멘툼(Lactobacillus fermentum) HY701 균주(기탁번호 KCCM 10351).
제 1항의 프로바이오틱 생균을 유효성분으로 함을 특징으로 하는 유당불내증 치료용 조성물.
제 1항의 프로바이오틱 생균을 유효성분으로 함을 특징으로 하는 기능성 건강식품용 조성물.
제 1항의 프로바이오틱 생균을 유효성분으로 함을 특징으로 하는 리스테리아 및 대장균 감염 억제용 조성물.