KR20180014316A - 다양한 생리활성과 열 안정성이 우수한 프로바이오틱 락토바실러스 퍼멘텀 pl9119 - Google Patents
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Abstract
본 발명의 신규한 균주인 락토바실러스 퍼멘텀(Lactobacillus fermentum) PL9119 균주 및 이의 용도에 관한 것으로, 구체적으로 인체, 식품, 환경 등에서 분리한 유산균 1000여 균주를 대상으로 80℃에서도 생존성을 보이는 신규한 락토바실러스 퍼멘텀(Lactobacillus fermentum) PL9119 균주 및 이의 배양액은 열안정성, 내산성 및 내담즙성이 우수하고 항생제 내성 전이의 위험이 없으며, 식중독균 및 혐기성균 성장 억제능 및 리파제 생산능력 등이 뛰어나므로 상기 락토바실러스 퍼멘텀 PL9119 균주 및 이의 배양액은 배변활동 및 장 건강 상태를 증진시키는 생균제 또는 유산균제제, 발효유제품, 건강보조식품, 사료첨가제, 의약품, 화장품 등의 다양한 제품의 건강기능성 첨가제로 유용하게 사용될 수 있다.
Description
본 발명은 장 건강 증진에 도움을 주며, 열 안정성이 뛰어난 신규한 프로바이오틱 락토바실러스 퍼멘텀(Lactobacillus fermentum) 균주 및 상기 균주의 생균제 용도에 관한 것이다.
유산균은 세균 중에서 가장 오래전부터 인간에게 유용하게 이용되고 있는 균으로서, 영양소의 흡수와 장의 운동성을 개선하며 면역 활성 작용, 항균작용 및 항암효과를 갖는다고 보고되고 있다. 상기와 같이, 유산균의 다양한 건강 효과가 기대되기 때문에, 사람의 장에서 검출되는 락토바실러스 아시도필루스(Lactobacillus acidophilus), 비피도 박테리움(Bifidobacterium) 속 같은 균주를 사용하는 발효유 및 유산균 음료가 시판되고 있다. 그러나 이러한 유산균들은 고온에서 생존이 어려우므로 이에 인체, 식품, 환경 등에서 분리한 유산균 1000여 균주를 대상으로 80℃에서도 생존성을 보이는 유산균을 분리하여 이 중 프로바이오틱으로써의 여러 가지 기능을 가지고 있고, 고온에도 안정하여 유통 기한 내에 생존성이 유지되는 유산균을 개발하고, 특히 현재 전 세계적으로 문제가 되고 있는 항생제 내성 전이가능성이 없고, 건강에 도움을 주는 신규 기능성 유산균을 개발하여 효능 있는 생균제로 사용하려고 한다.
생균제(probiotics)는 적당량 섭취 시 장내 미생물의 성질을 개선시켜 숙주에 유익한 영향을 주는 살아있는 미생물의 단독 또는 복합 균주로 정의되었으나, 최근 들어 Salminen 등(Salminen et al. 1999. Probiotics:how should they be defined, Trends in Food Science & Technology, 10, 107-110)에 의해 인체나 동물의 건강을 증진시키기 위하여 고안된 식품 및 사료 또는 식이 첨가제에 들어있는 살아있는 미생물 제제라고 정의되고 있다.
프로바이오틱스 유산균은 크게 락토바실러스(Lactobacillus), 락토코커스(Lactococcus), 스트렙토코커스(Streptococcus), 루코노스톡(Leuconostoc), 페디오코커스(Pediococcus), 비피도박테리움(Bifidobacterium)으로 구분하며, 장관 및 비뇨생식기의 미생물 오염방지 및 장 건강 유지, 변비완화, 유해균 증식억제, 항암, 면역증강, 콜레스테롤 감소, 공액 리놀레산(CLA, Conjugated linoleic acid) 생산, 헬리코박터 피롤리 억제 기능 등의 역할을 함으로써 인체 건강 증진에 중요한 역할을 하고 있다.
생균제(probiotics)로서 갖추어야 할 바람직한 조건은, 우선 안전해야 하고, 산과 담즙에 대한 내성(tolerance)이 있어야 하며, 병원성균(pathogenic bacteria)에 대하여 억제 활성이 있어야 하며, 항생제 내성전이가 되지 말아야 한다.
세균은 항생제 내성을 두 가지 방법으로 가지게 된다. 첫째는 내재 내성으로 외부에서 전이되지 않고 태생적으로 가지고 있는 내성이다. 예를 들어, 락토바실러스 애시도필러스 (Lactobacillus acidohphilus)를 제외한 대부분 유산균의 경우 세포벽의 구조와 세포벽의 두께가 두꺼워 밴코마이신(vancomycin)에 자연내성 (intrinsic resistance)을 보이는 경우를 말하며, 이런 내재 내성은 전이로 이루어지지 않고 또한 다른 세균으로 내성 유전자를 전이하지 않는다. 둘째는 외재 내성 (extrinsic resistance)으로, 외재 내성은 내성 유전자가 플라스미드 또는 트랜스포존에 결합하여, 외부 다른 세균에서 들어가 생기는 내성을 말하며, 이 경우 이런 내성 세균의 유전자는 다른 세균에게도 내성을 쉽게 전달하게 된다.
이전에는 내성이 강한 유산균이 좋은 것으로 알려져서, 다양한 항생제를 처리해서 살아남은 항생제 내성 유산균을 좋은 유산균으로 생각했으나, 여러 가지 항생제에 내성을 가진 유산균의 내성 유전자가 장내 세균으로 전이되어 내성 문제를 일으킨다는 보고가 많이 되고 있다. 이에 따라 서구에서는 이미 오래전부터 항생제 내성 유산균이 내성 유전자를 전이할 수 있는 경우는 모두 상업화하지 못하게 하고 있는 실정이다(Clinical Laboratory Standard Institute, CLSI, USA). 또한, 우리나라도 최근에 식약처 미생물의 식품원료 판단기준에 항생제 내성에 관한 조항을 삽입하여, 미생물의 식품원료 판단기준으로 사용하고 있다.
한편, 많은 유산균 제제 및 유산균 제품에서 유통기한 내의 유산균 생균수의 유지를 위한 목적으로 사용되고 있는 균은 스트렙토코커스 더머필러스(Streptococcus thermophilus)로 열 안정성이 높고 젖산을 생산하지만 분류학적으로는 유산균으로 분류되지 않으며, 이 균주가 건강에 유익하다고 알려진 바 없다.
따라서, 본 발명자들은 일반적인 유산균의 프로바이오틱스 기능을 가지고 있으며, 특히 고온에 안정하여 기존 유산균 생균제 제품들에 사용되고 있는 스트렙토코커스 더머필러스(Streptococcus thermophilus)를 대체할만한 유산균을 찾고자 노력한 결과, 인체, 식품, 환경 등에서 분리한 유산균 1000여 균주로부터 신규한 락토바실러스 퍼멘텀(Lactobacillus fermentum)균주를 분리하였고, 상기 균주 및 이의 배양액이 열 안정성, 내산성, 내담즙성, 리파제(lipase) 생산능을 가지고 식중독세균 성장 억제능, 혐기성세균 성장 억제능과 같은 일반적인 유산균의 프로바이오틱스 기능을 가지며 항생제에 대한 외재내성이 없고, 유해물질을 생성하지 않으므로, 상기 신규한 락토바실러스 퍼멘텀 PL9119 또는 이의 배양액을 유산균제제, 발효유제품, 건강보조식품, 사료첨가제 등 다양한 제품의 첨가제로 사용할 수 있음을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 목적은 프로바이오틱 기능이 우수하고 고온에 안정한 신규한 균주 락토바실러스 퍼멘텀 PL9119 (Lactobacillus fermentum PL9119)를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 신규한 락토바실러스 퍼멘텀 PL9119 균주 또는 이의 배양액을 유효성분으로 하는 생균제 조성물 및 배변활동 향상 및 증강용 건강기능 식품을 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여,
본 발명은 신규한 프로바이오틱 락토바실러스 퍼멘텀 (Lactobacillus fermentum) 균주를 제공한다.
또한, 본 발명은 고온에 안정한 신규한 락토바실러스 퍼멘텀 PL9119 균주 또는 이들의 배양액을 유효성분으로 함유하는 생균제 조성물을 제공한다.
아울러, 본 발명은 신규한 락토바실러스 퍼멘텀 PL9119 균주, 또는 이들의 배양액을 유효성분으로 함유하는 장 건강 활성 증진과 면역 증강을 위한 건강기능 식품을 제공한다.
본 발명의 신규한 락토바실러스 퍼멘텀(Lactobacillus fermentum) PL9119 또는 이의 배양액은 인체 안전성이 있으며, 항생제 내성 전이의 위험이 없고, 내산성 및 내담즙성이 우수하고, 식중독균 및 혐기성균 성장을 억제하며, 지방 분해능이 뛰어나고, 특히 락토바실러스 퍼멘텀 PL9119 균주는 고온에 높은 안정성을 가지므로, 상기 락토바실러스 퍼멘텀 PL9119 균주 및 이의 배양액은 유효기간이 매우 긴 배변활동 및 장 건강 상태를 증진시키는 생균제 또는 유산균제제, 각종 유제품, 건강보조식품, 사료첨가제, 의약품, 화장품, 비누 등의 다양한 제품의 첨가제로 유용하게 사용될 수 있다.
도 1은 락토바실러스 퍼멘텀(Lactobacillus fermentum) PL9119 균주 및 락토바실러스 퍼멘텀 IFO 3956 (Lactobacillus fermentum IFO 3956)의 16S rRNA 염기서열의 유연관계를 나타내는 도이다.
도 2는, 락토바실러스 퍼멘텀 PL9119 균주의 모양을 관찰한 도이다.
도 3은, 락토바실러스 퍼멘텀 PL9119 균주의 식중독 세균에 대한 성장 억제환 크기를 확인한 도이다.
도 4는, 락토바실러스 퍼멘텀 PL9119 균주의 혐기성 세균클로스트리디움 디피실(Cllostridium difficile)에 대한 성장 억제환 크기를 확인한 도이다.
도 5는, 락토바실러스 퍼멘텀 PL9119 균주의 리파제(lipase) 생산 능력을 확인한 도이다:
윗줄 왼쪽 첫 번째: 리파제 양성 대조군인 스타필로코쿠스 호모니스(Staphylococcus homonis); 및
아래줄 왼쪽 세 번째: 락토바실러스 퍼멘텀 PL9119
도 2는, 락토바실러스 퍼멘텀 PL9119 균주의 모양을 관찰한 도이다.
도 3은, 락토바실러스 퍼멘텀 PL9119 균주의 식중독 세균에 대한 성장 억제환 크기를 확인한 도이다.
도 4는, 락토바실러스 퍼멘텀 PL9119 균주의 혐기성 세균클로스트리디움 디피실(Cllostridium difficile)에 대한 성장 억제환 크기를 확인한 도이다.
도 5는, 락토바실러스 퍼멘텀 PL9119 균주의 리파제(lipase) 생산 능력을 확인한 도이다:
윗줄 왼쪽 첫 번째: 리파제 양성 대조군인 스타필로코쿠스 호모니스(Staphylococcus homonis); 및
아래줄 왼쪽 세 번째: 락토바실러스 퍼멘텀 PL9119
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명은 신규한 락토바실러스 퍼멘텀(Lactobacillus fermentum) 균주를 제공한다.
상기 균주는 서열번호 1로 기재되는 16S rRNA 염기서열을 갖으며, 수탁번호 KCTC 13038BP로 기탁된 신규한 락토바실러스 퍼멘텀 PL9119 균주인 것이 바람직하다.
본 발명의 구체적인 실시 예에서, 본 발명자들은 인체, 식품, 환경 등에서 분리한 유산균 1000여 균주를 대상으로 80℃ 이상에서도 생존성이 우수한 한 개의 균주를 분리하여 동정한 후, 16S rRNA 염기서열 분석을 통해 락토바실러스 퍼멘텀(Lactobacillus fermentum) IFO 3956 균주와 99.0%의 상동성을 나타내는 신규한 균주를 확인하고, 그람 염색을 통해 상기 균주는 전형적인 락토바실러스 퍼멘텀 모양인 그람 양성 간균의 모습을 가지고 있음을 확인하였다(도 1 및 도 2 참조). 또한, 상기 신규한 락토바실러스 퍼멘텀 속 균주를 락토바실러스 퍼멘텀 PL9119로 명명하고 2016년 6월 9일 한국생명공학연구원 생물자원센터(Korean Collection for Type Cultures, KCTC)에 국제기탁하였다(수탁번호 KCTC 13038BP).
또한, 본 발명은 수탁번호 KCTC 13038BP로 기탁된 신규한 락토바실러스 퍼멘텀 PL9119 균주 또는 이의 배양액을 유효성분으로 함유하는 생균제 조성물을 제공한다.
상기 락토바실러스 퍼멘텀 PL9119 균주는 젠타마이신(gentamicin), 스트렙토마이신(streptomycin), 테트라사이클린(tetracycline), 암피실린(ampicillin), 에리스로마이신(erythromycin), 클린다마이신(clindamycin), 리네졸리드(linezolid), 클로람페니콜(chloramphenicol), 리팜피신(rifampicin), 시너시드(synercid, quinupristin and dalfopristin combination) 등의 항생제에 대한 내재 내성 및 외재 내성(전이 가능성)이 없으며, 내성 전이 가능성이 없는 밴코마이신(vancomycin)에 대해서는 내재 내성이 있다.
상기 균주는 내산성 및 내담즙성이 우수하고, 식중독 세균 및 혐기성 세균의 성장을 억제하며, 리파제를 생산하여 장내 건강을 증진시키고, 특히 고온에서도 생존성을 가져 각종 유산균 제제의 유효기간을 늘릴 수 있으며 이는 다양한 형태의 제품에 적용될 수 있다.
본 발명의 구체적인 실시예에서, 본 발명자들은 락토바실러스 퍼멘텀 PL9119 균주의 고온 생존성을 확인하기 위하여, 락토바실러스 퍼멘텀 PL9119 균주의 열 안정성 시험을 수행한 결과, 상기 락토바실러스 퍼멘텀 PL9119 균주는 80도 이상의 고온에서도 생존하는 우수한 열 안정성이 있음을 확인하였다(표 1 참조).
또한, 본 발명자들은 락토바실러스 퍼멘텀 PL9119 균주의 안전성을 확인하기 위하여, 용혈 현상 검사, 암모니아(urea), 인돌(indole) 및 페닐피루브산(phenylpyruvic acid) 등의 유해물질 생성 검사 및 젤라틴 액화 반응 검사를 수행한 결과, 상기 락토바실러스 퍼멘텀 PL9119 균주는 용혈 현상을 나타내지 않고, 유해물질을 생성하지 않으며, 젤라틴 액화 반응에서 음성을 나타내므로 안전성이 우수한 것을 확인하였다(표 2 참조).
또한, 본 발명자들은 락토바실러스 퍼멘텀 PL9119 균주의 항생제 감수성을 확인하기 위하여, 락토바실러스 퍼멘텀 PL9119 균주에 ISO 가이드라인에 따라 항생제인 젠타마이신, 테트라사이클린, 에리스로마이신, 클린다마이신, 클로람페니콜, 암피실린, 시너시드, 리네졸리드 및 리팜피신을 처리하고 액체희석법을 수행한 결과, 상기 락토바실러스 퍼멘텀 PL9119 균주가 항생제 모두에 대해 감수성을 가져 항생제 내성 전이의 위험이 없는 것을 확인하였다(표 4 참조).
또한, 본 발명자들은 락토바실러스 퍼멘텀 PL9119 균주의 내산성 및 내담즙성을 확인하기 위하여, 균주에 인공 위액 및 담즙을 첨가하여 배양한 후 생균수를 측정한 결과, 상기 락토바실러스 퍼멘텀 PL9119 균주는 대부분의 균주가 생존하므로, 내산성 및 내담즙성이 우수한 것을 확인하였다(표 5 참조).
또한, 본 발명자들은 락토바실러스 퍼멘텀 PL9119 균주의 식중독균 억제능을 확인하기 위하여 6가지 유해세균인 대장균주(Escherichia coli) O157:H7 ATCC 43897, 살모넬라 티피무리움(Salmonella typhimurium) CCARM 8001, 살모넬라 엔테라이티디스(Salmonella enteritidis) CCARM 8010, 엔테로코커스 패칼리스(Enterococcus faecalis) ATCC 29212, 스타필로코쿠스 아우레우스(Staphylococcus aureus) CCARM 0045, 리스테리아 모노시토제네스(Listeria monocytogenes) ATCC 19113C3a와 락토바실러스 퍼멘텀 PL9119 균주를 배양하여 억제환의 유무와 크기를 확인한 결과, 상기 락토바실러스 퍼멘텀 PL9119 균주는 상기 6 종류 유해균에 억제능을 보이는 것을 확인하였다(도 3 및 표 6 참조).
또한, 본 발명자들은 락토바실러스 퍼멘텀 PL9119 균주의 혐기성 세균 성장 억제능을 확인하기 위하여, 장내에 존재하는 혐기성 세균인 클로스트리디움 디피실(Clostridium difficile) 균주의 억제능력을 측정한 결과, 상기 락토바실러스 퍼멘텀 PL9119 균주는 클로스트리디움 디피실의 성장을 억제하는 것을 확인하였다(도 4 및 표 7 참조).
또한, 본 발명자들은 락토바실러스 퍼멘텀 PL9119 균주의 리파제 생산능력을 확인하기 위하여, 스타필로코쿠스 호모니스(Staphylococcus homonis)를 양성 대조군 균주로 사용하여 리파제 생산능력을 비교한 결과, 상기 락토바실러스 퍼멘텀 PL0110 균주가 리파제를 생산하는 것을 확인하였다(도 5 참조).
따라서, 본 발명의 신규한 락토바실러스 퍼멘텀 균주 또는 이의 배양액은 내산성 및 내담즙성이 우수하고, 항생제 내성 전이의 위험이 없으며, 장내 유해한 병원성 세균을 억제하고, 리파제를 생산하며, 특히, 락토바실러스 퍼멘텀 PL9119 균주는 생균제로서 갖추어야 할 상기 조건을 모두 유의적으로 만족하므로, 상기 신규한 락토바실러스 퍼멘텀 PL9119 또는 이의 배양액은 배변활동 및 장 건강 상태를 증진시키는 생균제 조성물로 유용하게 사용될 수 있다.
본 발명의 조성물은 통상적인 생균제 조성물 제조방법에 따라 제조될 수 있으며, 일반적으로, 배양현탁액이나 건조분말 형태일 수 있다. 또한, 주성분인 상기 락토바실러스 퍼멘텀 PL9119 균주, 또는 이의 배양액의 유효량에 1종 또는 2종 이상의 약제학적으로 허용 가능한 통상적인 담체 또는 1종 또는 2종 이상의 첨가제를 선택하여 통상적인 제형의 조성물로 제조할 수 있다.
담체는 희석제, 활택제, 결합제, 붕해제, 감미제, 안정제, 방부제 중에서 1종 또는 2종 이상을 선택하여 사용할 수 있으며, 첨가제로는 향료, 비타민류, 항산화제 중에서 1종 또는 2종 이상을 선택하여 사용할 수 있다.
본 발명에 있어서, 담체 및 첨가제는 약제학적으로 허용 가능한 것은 모두 사용이 가능하며, 구체적으로는 희석제로는 유당(lactose monohydrate), 옥수수 전분(cornstarch), 콩기름(soybean oil), 미결정 셀룰로오스(microcrystalline cellulose) 또는 만니톨(D-mannitorl)이 좋고, 활택제로는 스테아린산 마그네슘(magnesiumstearate) 또는 탈크(talc)가 바람직하며, 결합제로는 폴리비닐피롤리돈(PVP: polyvinyipyrolidone) 또는 하이드록시프로필셀룰로오스(HPC: hydroxypropylcellulose) 중에서 선택함이 바람직하다. 또한, 붕해제로는 카르복시메칠셀룰로오스칼슘(Ca-CMC: carboxymethylcellulose calcium), 전분글리콜산나트륨(sodium starchglycolate), 폴라크릴린칼륨(polacrylin potassium) 또는 크로스포비돈(cross-linked polyvinylpyrrolidone)중에서 선택함이 바람직하고, 감미제로는 백당, 과당, 소르비톨(sorbitol) 또는 아스파탐(aspartame) 중에서 선택되고, 안정제로는 카르복시메칠셀룰로오스나트륨(Na-CMC: carboxymethylcellulose sodium), 베타-싸이크로덱스트린(β-cyclodextrin), 백납(white bee's wax) 또는 잔탄검(xanthan gum) 중에서 선택되며, 방부제로는 파라옥시안식향산메칠(methyl p-hydroxy benzoate, methlparaben), 파라옥시안식향산프로필(propyl p-hydroxybenzoate, propylparaben), 또는 소르빈산칼륨(potassium sorbate) 중에서 선택하는 것이 바람직하다.
또한, 본 발명은 수탁번호 KCTC 13038BP로 기탁된 신규한 락토바실러스 퍼멘텀 PL9119 균주 또는 이들의 배양액을 유효성분으로 함유하는 건강식품을 제공한다.
상기 락토바실러스 퍼멘텀 PL9119 균주는 서열번호 1로 기재되는 16S rRNA 염기서열을 갖는다.
상기 미생물의 배양액에는 미생물이 생산하는 여러 항균성 유기산 및 비단백질성 항균물질이 포함되어 있다.
또한, 상기 본 발명에 따른 조성물은 본 발명의 유산균과 함께 섭취하기에 적합하고, 섭취시 유해 미생물의 생육을 억제하며, 장내 균총의 균형을 개선시키는 활성을 가지는 다른 종류의 공지된 미생물을 추가로 포함할 수 있다.
상기 균주는 내산성 및 내담즙성이 우수하고, 식중독 세균 및 혐기성 세균의 성장을 억제하며, 리파제를 생산하여 장내 건강을 증진시키고, 특히 고온에서도 생존성을 가져 각종 유산균 제제의 유효기간을 늘릴 수 있으며 이는 다양한 형태의 제품에 적용될 수 있다.
상기 식품은 아이스크림류, 우유, 두유, 요구르트, 치즈를 포함하는 유제품, 육류, 소세지, 빵, 초콜릿, 캔디류, 스낵류, 과자류, 피자, 라면, 기타 면류, 껌류, 각종 수프, 음료수, 차, 드링크제, 알코올 음료로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나인 것이 바람직하다.
상기 균주는 리파제 활성이 필요한 세척제, 화장품에도 적용할 수 있다.
따라서, 본 발명의 락토바실러스 퍼멘텀 균주는 내산성 및 내담즙성이 우수하고, 항생제 내성 전이의 위험이 없으며, 장내 유해한 병원성 세균을 억제하고, 리파제 생산을 하므로, 배변활동 및 장 건강 상태를 증진시키는 건강식품으로 유용하게 사용될 수 있다.
본 발명의 건강식품으로는 상기 락토바실러스 속 균주 또는 이의 배양액을 유효성분으로 하는 차, 젤리, 즙, 엑기스, 음료 등의 장 기능 개선을 목적으로 하는 민간요법제를 들 수 있다. 이와 같이 다양한 형태로 가공된 본 발명의 질환 예방용 건강식품은 인체에 부작용이 없으면서 복용이 용이하고 장기간 보관이 가능하다.
본 발명의 상기 락토바실러스 속 균주 또는 이의 배양액을 식품 첨가물로 사용할 경우, 상기 균주 또는 이의 배양액을 그대로 첨가하거나 다른 식품 또는 식품 성분과 함께 사용될 수 있고, 통상적인 방법에 따라 적절하게 사용될 수 있다. 유효성분의 혼합 양은 사용 목적(예방, 건강 또는 치료적 처치)에 따라 적합하게 결정될 수 있다. 일반적으로, 식품 또는 음료의 제조 시에는 본 발명의 상기 락토바실러스 속 균주 또는 이의 배양액 원료 100 중량부에 대하여 15 중량부 이하, 바람직하게는 10 중량부 이하의 양으로 첨가된다. 그러나 건강 및 위생을 목적으로 하거나 또는 건강 조절을 목적으로 하는 장기간 섭취의 경우에는 상기 양은 상기 범위 이하일 수 있으며, 안전성 면에서 아무런 문제가 없으므로 유효성분은 상기범위 이상의 양으로도 사용될 수 있다.
상기 식품의 종류에는 특별한 제한은 없다. 본 발명의 상기 락토바실러스 속 균주 또는 이의 배양액을 첨가할 수 있는 식품의 예로는 육류, 소세지, 빵, 쵸콜릿, 캔디류, 스낵류, 과자류, 피자, 라면, 기타 면류, 껌류, 얼음과자, 아이스크림류, 우유, 우유 대용품, 크림, 버터, 버터 밀크, 요구르트, 요거트, 치즈를 포함하는 낙농제품, 각종 수프, 음료수, 차, 드링크제, 알코올 음료 및 비타민 복합제 등이 있으며, 통상적인 의미에서의 건강식품을 모두 포함한다.
본 발명의 건강 음료 조성물은 통상의 음료와 같이 여러 가지 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로서 함유할 수 있다. 상술한 천연 탄수화물은 포도당, 과당과 같은 모노사카라이드, 말토오스, 슈크로오스와 같은 디사카라이드, 및 덱스트린, 사이클로덱스트린과 같은 폴리사카라이드, 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등의 당알코올이다. 감미제로서는 타우마틴, 스테비아 추출물과 같은 천연 감미제나 사카린, 아스파르탐과 같은 합성 감미제 등을 사용할 수 있다. 상기 천연 탄수화물의 비율은 본 발명의 상기 락토바실러스 속 균주 또는 이의 배양액 100 ㎖당 일반적으로 0.01 내지 0.04 g, 바람직하게는 약 0.02 내지 0.03 g이다.
상기 외의 본 발명의 상기 락토바실러스 속 균주 또는 이의 배양액은 여러 가지 영양제, 비타민, 전해질, 풍미제, 착색제, 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알코올, 탄산음료에 사용되는 탄산화제 등을 함유할 수 있다. 그 밖에 본 발명의 프로바이오틱스는 천연 과일 주스, 과일 주스 음료 및 야채 음료의 제조를 위한 과육을 함유할 수 있다. 이러한 성분은 독립적으로 또는 조합하여 사용할 수 있다. 이러한 첨가제의 비율은 크게 중요하지 않지만 본 발명의 균주 또는 이의 배양액은 100 중량부 당 0.01 내지 0.1 중량부의 범위에서 선택되는 것이 일반적이다.
이하, 본 발명을 실시예 및 제조예에 의하여 상세히 설명한다.
단, 하기 실시예 및 제조예는 본 발명을 구체적으로 예시하는 것이며, 본 발명의 내용이 실시예 및 제조예에 의해 한정되는 것은 아니다.
열 안정성 유산 균주의 분리
인체, 식품, 환경 등에서 분리한 유산균 1000여 균주를 대상으로 80℃에서도 생존성을 보이는 한 개의 균주를 선별하여 고온 생존성을 측정하였다.
구체적으로, 대수기의 유산균을 MRS 액체 배지에 접종하고 이를 파스퇴르 멸균법에 사용하는 온도와 처리 시간에 따라 처리한 후에 이중 100 ㎕를 취해 MRS-BPB배지에 도말하여, 37℃, 혐기적 조건에서 48시간 동안 배양한 후 생존한 유산균 수를 측정하였다. 이때 60℃에서 생존성을 보인 락토바실러스 퍼멘텀 L77과 락토바실러스 퍼멘텀의 표준균주 KCTC3112T(Lactobacillus fermentum strain KCTC3112T)의 생존성을 같이 측정하여 비교하였다.
그 결과, 표 1에 나타낸 바와 같이, 락토바실러스 퍼멘텀 PL9119는 63℃에서 30분 처리시 락토바실러스 퍼멘텀 L77과 락토바실러스 퍼멘텀의 표준균주 KCTC3112T에 비해 더 높은 생존성을 보였으며, 특히 85℃에서 5분 처리시 락토바실러스 퍼멘텀 L77과 락토바실러스 퍼멘텀의 표준균주 KCTC3112T는 생존성이 없어졌으나, 락토바실러스 퍼멘텀 PL9119는 생존성을 보였다(표 1).
| 균주 | 처리온도, 처리시간 | 균수 (CFU/mL) |
| Lactobacillus fermentum PL9119 |
63℃, 0 분 | 1.01 X 108 |
| 63℃, 30 분 | 1.10 X 107 | |
| 85℃, 0 분 | 4.60 X 107 | |
| 85℃, 5 분 | 1.57 X 102 | |
| Lactobacillus fermentum L77 |
63℃, 0 분 | 2.90 X 107 |
| 63℃, 30 분 | 2.70 X 103 | |
| 85℃, 0 분 | 1.16 X 107 | |
| 85℃, 5 분 | 0 | |
| Lactobacillus fermentum KCTC3112T | 63℃, 0 분 | 7.20 X 107 |
| 63℃, 30 분 | 9.80 X 104 | |
| 85℃, 0 분 | 2.50 X 107 | |
| 85℃, 5 분 | 0 |
균주의 동정
상기 <실시예 1>에서 분리한 균주의 동정을 위하여 16S rRNA 유전자 염기서열 분석을 수행하였다.
구체적으로, 염기서열은 EzTaxon-e server (http://eztaxon-e.ezbiocloud.net/; Kim et al., 2012)와 온라인으로 BLAST algorithm at the National Center for Biotechnology Information Web server(http://www.ncbi.nlm.nih.gov)를 사용하여 균주를 동정하였고, 16S rRNA 염기서열에 기초해 분자계통분류학적 분석을 하였다.
그 결과, 도 1에 나타낸 바와 같이, 본 발명의 락토바실러스 퍼멘텀(Lactobacillus fermentum) PL9119 균주는 서열번호 1로 기재되는 16S rRNA 염기서열을 가지며 락토바실러스 퍼멘텀의 표준 균주 CECT562(Lactobacillus fermentum strain CECT562)와 99.42%의 16S rRNA 상동성을 나타내는 신규한 균주임을 확인하였다(도 1). 또한, 상기 균주를 락토바실러스 퍼멘텀(Lactobacillus fermentum) PL9119로 명명하고 2016년 6월 9일자로 한국생명공학연구원 생물자원센터에 수탁번호 KCTC 13038BP로서 기탁하였다.
락토바실러스
퍼멘텀
PL9119 균주의 염색
상기 <실시예 1>로부터 분리한 락토바실러스 퍼멘텀 PL9119 균주의 모양을 확인하기 위하여, 그람 염색법을 수행하였다.
구체적으로, 상기 <실시예 1> 및 <실시예 2>에서 분리, 동정한 락토바실러스 퍼멘텀 PL9119 균주의 형태를 분석하기 위해 상기 균주를 MRS 평판배지에서 30℃, 24시간 동안 배양한 후, 상기 균을 글라스 슬라이드에 도말하여 현미경을 통하여 균의 형태 및 집락의 형태를 관찰하고, 시그마사에서 제조한 그람염색 키트(Sigma Diagnostics, kit HT 90-A)를 사용하여 그람염색 실험을 수행하였다.
그 결과, 도 2에 나타낸 바와 같이, 본 발명의 락토바실러스 퍼멘텀 PL9119 균주의 모양이 전형적인 락토바실러스 퍼멘텀의 모양인 그람 양성 간균의 모습임을 확인하였다(도 2).
락토바실러스
퍼멘텀
PL9119 균주의 인체 안전성 확인
상기 <실시예 2>로부터 동정한 락토바실러스 퍼멘텀 PL9119 균주의 인체 안전성을 확인하기 위하여, 용혈 현상 검사, 암모니아, 인돌, 페닐피루브산과 같은 유해물질 및 유해효소 생성 검사와 젤라틴 액화 반응 검사를 수행하였다.
<4-1> 용혈 현상 확인
적혈구가 파괴되어 가용성 성분이 용출되면 적색의 투명한 액체로 되는 현상을 용혈(hemolysis)이라 한다. 용혈은 혈액 한천 배지 상에서 나타나는 용혈 유형에 따라 α, β, γ의 유형으로 나눌 수 있다 (Isenberg, H.d. 1992. Hemolysis on sheep blood agar. Clinical Microbiology Procedures Handbook. Vol. 1, pp. 1.20.16-1.20.17. American society of Microbiology, Washington D.C., U.S.A.). α 용혈은 집락을 둘러싼 배지의 헤모글로빈이 메트헤모글로빈으로 환원되어 배지가 녹색으로 변하며, 알파 용혈된 적혈구를 현미경으로 관찰했을 때 적혈구의 막은 정상이다. β 용혈은 적혈구가 완전히 용해되어 집락 주변이 투명하고 무색이다. 용혈현상이 없고 배지 색깔 변화도 없으면 γ용혈이라고 한다.
구체적으로, 상기 <실시예 2>로부터 동정한 락토바실러스 퍼멘텀 PL9119 균주의 인체안정성을 확인하기 위해 상기 균주를 혈액 한천 배지(Sheep blood agar)에서 37℃에서 24시간 동안 배양한 후 용혈 현상이 있는지 관찰하였다.
그 결과, 표 2에 나타낸 바와 같이, 본 발명의 락토바실러스 퍼멘텀 PL9119 균주는 α, β 용혈현상이 나타나지 않는 것을 확인하였다(표 2).
<4-2> 암모니아 생성 확인
체내의 암모니아는 아미노산의 탈아미노효소에 의해 생성될 수 있으나, 요소분해효소(urease)에 의해 요소가 분해되어 생성되는 것이 많다. 간염환자의 경우 체내에 존재하는 과량의 암모니아는 혼수상태를 유발하기도 한다.
구체적으로, 상기 <실시예 2>로부터 동정한 락토바실러스 퍼멘텀 PL9119 균주의 인체안전성을 확인하기 위해 총 부피를 100 ㎖로 맞추어 증류수에 요소 20 g, 페놀레드(phenol red) 12 mg을 녹여 여과멸균하고 여기에 한천 15 g을 MRS 900㎖에 녹여 습윤멸균을 한 후 섞어서 pH가 6.9이며 총 부피가 1 ℓ인 배지를 제조하였다 (Cappucchino, J. G., and N. Sherman, 1987. Urease test. Microbiology: a laboratory manual, pp. 157-160. Benjamin/Cummings Publishing Co. Inc., Menlo Park, C.A., U.S.A.). 이와 같이 제조된 배지는 요소분해효소(urease)를 생산하면 암모니아가 생산되어 배지의 pH가 올라가고, 높아진 pH에 의해 페놀레드(phenole red)는 황색(pH 6.9)에서 적색(pH 8.1 이상)으로 바뀌게 되므로 양성의 경우 배지의 색이 노란색에서 분홍색 또는 적색으로 변한다. 이와 같이 제조된 배지에서 락토바실러스 퍼멘텀 PL9119 균주를 37℃에서 12~24시간 동안 배양한 후, 배지 색의 변화를 확인하였다.
그 결과, 표 2에 나타낸 바와 같이, 본 발명의 락토바실러스 퍼멘텀 PL9119 균주는 배지의 색이 변하지 않아 암모니아가 생성되지 않음을 확인하였다(표2).
<4-3> 인돌 생성 확인
또한, 트립토판이 트립토파나아제에 의해 분해되면, 인돌이 피부르산과 암모니아와 함께 생성된다. 인돌은 체내조직에 의해서 형성된 것이 아니라, 장내에 있는 세균의 작용에 의해 트립토판에서 생성된다. 생성된 인돌은 코박씨(Kovac)시약 (isoamyl alcohol, para-dimethylaminobenzaldehyde, concentrated hydrochloric acid)으로 검출하는데 인돌은 코박씨(Kovac)시약의 파라-다이메틸아미노벤즈알데하이드(para-dimethylaminobenzaldehyde)와 결합해서 빨간색을 나타낸다 (Isenberg, H.d. 1992. Indole test. Clinical Microbiology Procedures Handbook. Vol. 1, pp. 1.19.13-1.19.15. American Society of Microbiology, Washington D.C., U.S.A.).
구체적으로, 상기 <실시예 2>로부터 동정한 락토바실러스 퍼멘텀 PL9119 균주의 인체안전성을 확인하기 위해 트립토판이 함유된 배지 (peptong, pancreati enzymatic casein hydrolysate, trypton)에 락토바실러스 퍼멘텀 PL9119 균주를 접종하고 37℃에서 18시간 동안 배양한 후, 여기에 코박씨(Kovac)시약을 5방울 정도 가해 색의 변화를 관찰하였다. 인돌이 생성되면 30초 이내에 분홍색 또는 붉은색을 나타내게 된다.
그 결과, 표 2에 나타낸 바와 같이, 본 발명의 락토바실러스 퍼멘텀 PL9119 균주는 배지의 색이 변하지 않아 인돌이 생성되지 않음을 확인하였다(표 2).
<4-4>
페놀피루브산
생성 확인
또한, 아미노산이 효소에 의해 분해되면 유해한 아민이 생성되는 경우가 많다. 일부 장내 미생물은 티로신과 페닐알라닌으로부터 페놀성 물질을 생성하며 이것은 발암과 상관관계가 있다고 보고되어있다. 장내 미생물의 페닐알라닌 탈아민 현상의 phenylanalniase에 의해 피루브산이 생성되고, 이것이 10% 염화제2철(ferric chloride)과 반응하면 녹색으로 변하는 성질을 이용하여 페닐피루브산의 생성여부를 알 수 있게 된다 (Ishibashi N. and S. Yamazaki. 2001. Probiotics and safety. Am. J. Clin. Nutr. 73: 465S-470S).
구체적으로, MS 배지에 D, L-페닐알라닌이 2%가 되도록 첨가하여 제조한 사면배지에 락토바실러스 퍼멘텀 PL9119 균주를 접종하고 37℃, 24시간 동안 배양한 후, 여기에 10% 염화제2철을 5~10방울 떨어뜨려 사면배지 위로 흘러내리게 하여 1~5분 안에 색의 변화를 관찰하였다. 페닐피루브산이 생성되면 녹색을 나타내게 된다.
그 결과, 표 2에 나타낸 바와 같이, 본 발명의 락토바실러스 퍼멘텀 PL9119 균주는 배지의 색이 변하지 않아 페닐피루브산이 생성되지 않음을 확인하였다(표 2).
<4-5> 젤라틴 액화 반응 검사
세균의 병원성은 세포 침입능에 좌우되는 경우가 많으며, 세포 침입에는 단백질 분해 능력이 요구되므로, 단백질 분해능을 확인하기 위하여, 젤라틴 액화 반응 검사를 수행하였다 (Isenberg, H.d. 1992. Gelatin liquefaction test. Clinical Microbiology Procedures Handbook. Vol. 1, pp. 1.19.42-1.19.43. American society of Microbiology, Washington D.C., U.S.A.).
구체적으로, 0.3 g 쇠고기 추출물(beef extract), 0.5 g 펩톤(peptone), 12 g 젤라틴(gelatin) 및 100 ㎖ MRS 배지를 포함한 MRS 젤라틴 배지에 실험 균을 접종한 후 35℃에서 6주간 배양하고, 배양 후 접종하지 않은 대조군과 함께 4℃에서 4 시간 정도 식힌 후 젤라틴 액화 반응을 확인하였다. 냉장 후에도 배지가 굳지 않으면 이를 양성 반응으로 판정하였다.
그 결과, 표 2에 나타낸 바와 같이, 본 발명의 락토바실러스 퍼멘텀 PL9119 균주는 젤라틴 액화반응에서 음성을 나타내어 젤라티네이즈 생산을 하지 않는 것을 확인하였다(표 2).
| 유해물질 생성 | 유해효소 생성 | ||||
| 식별번호 | 용혈독소 | 암모니아 | 인돌 | 페닐피루브산 | 젤라티네이즈 |
| PL9119 | - | - | - | - | - |
락토바실러스
퍼멘텀
PL9119 균주의 항생제 내성 측정
상기 <실시예 2>로부터 동정한 락토바실러스 퍼멘텀 PL9119 균주의 항생제 감수성을 측정하기 위하여 액체희석법을 수행하였다.
구체적으로, 유산균의 항생제 감수성 검사는 ISO 가이드라인 (ISO10932:2010(E), Milk and milk products ◎Determination of the minimal inhibitory concentration (MIC) of antibiotics applicable to bifidobacteria and non-enterococcal lactic acid bacteria (LAB))에 따라 LSM 배지(IST broth (Iso-Sensitest, 90%; Oxoid)와 MRS broth(10%)의 혼합배지(pH 6.7))를 사용하여 액체희석법으로 수행하였다. 항생제는 ISO 가이드라인에서 제시한 암피실린(ampicillin), 젠타마이신(gentamicin), 에리스로마이신(erythromycin), 클린다마이신(clindamycin)과 추가로 테트라사이클린(tetracycline), 클로람페니콜(chloramphenicol), 밴코마이신(vancomycin), 시너시드(synercid, quinupristin and dalfopristin combination), 리네졸리드(linezolid) 및 리팜피신(rifampicin)을 사용하여 0.5 내지 256㎍/㎖ 농도 범위대로 실험하였다. 실험하고자 하는 항생제를 2 ×로 제조하여 마이크로 플레이트에 각 웰(well)당 50㎕씩 분주하여 두었다. 하룻밤 배양한 유산균을 각각 다른 농도의 항생제가 들어있는 웰에 접종한 후, 균주가 접종된 마이크로 플레이트는 37℃, 혐기적 조건에서 48시간 동안 배양하여 유산균의 성장을 억제한 가장 낮은 농도를 관찰하였다. 그리고 이 결과를 표 3의 CLSI(Clinical Laboratory Standards Institute) 가이드라인의 감수성, 내성 판정표에 따라 판단하였다(표 3).
그 결과, 표 4에 나타낸 바와 같이, 본 발명의 락토바실러스 퍼멘텀 PL9119 균주는 암피실린, 클린다마이신, 에르스로마이신, 젠타마이신, 클로람페니콜, 리네졸리드, 리팜피신, 시너시드, 테트라사이클린 항생제에 내성이 없음을 확인하였다 (표4). 락토바실러스 퍼멘텀 균주의 밴코마이신 고도 내성은 락토바실러스 퍼멘텀 균주의 두꺼운 내벽에 의한 현상으로 내성 전이 가능성이 없는 밴코마이신에 대해서는 내재내성 (intrinsic resistance)이 있다(표 4).
| CLSI 가이드라인 내성 기준표 | |||
| 항생제 | 감수성 | 중간내성 | 내성 |
| 암피실린(AMP) | ≤8 | ||
| 클린다마이신(CLI) | ≤0.5 | 0.5 | ≥4 |
| 에리스로마이신(ERY) | ≤0.5 | 0.2 | ≥8 |
| 젠타마이신(GEN) | ≤4 | 8 | ≥16 |
| 밴코마이신(VAN) | ≤4 | 8~6 | ≥32 |
| 식별 번호 | 최소저해농도(MIC) | |||||||||
| AMP | CLI | ERY | GEN | VAN | CHL | LIN | RIF | SYN | TET | |
| PL9119 | 0.5 | 0.06 | 1 | 8 | >128 | 8 | 4 | 0.5 | 1 | 8 |
AMP, 암피실린; CLI, 클린다마이신; ERY, 에르스로마이신;
GEN, 젠타마이신; VAN, 벤코마이신; CHL, 클로람페니콜;
LIN, 리네졸리드; RIF, 리팜피신; SYN 시너시드; ET, 테트라사이클린
락토바실러스
퍼멘텀
PL9119 균주의
내산성
및
내담즙성
확인
상기 <실시예 1>로부터 분리한 락토바실러스 퍼멘텀 PL9119 균주의 내산성 및 내담즙성을 측정하기 위하여, 내산성 및 내담즙성 실험을 수행하였다.
구체적으로, 내산성 실험은 소화관 조건과 유사한 환경에서 측정하기 위하여 pH 3.0 배지에 1000 U/mL의 펩신을 첨가한 인공 위액에서 실시하였다. 분리 유산균 균주를 각각 액체 배지에서 24시간 동안 배양한 후 원심 분리하여 세포를 회수하고 멸균 생리식염수로 3회 세척하였다. 상등액과 동일한 양으로 인공 위액을 첨가하여 유산균 배양 조건과 같은 조건에서 90분 동안 반응시킨 후 대조군과 비교하여 희석하여 MRS 플레이트에 도말하여 생균수를 계수하여 내산성 정도를 측정하였다.
또한, 내담즙성 실험은 인공 위액 조건에서 90 분 동안 처리된 각 유산균 배양액을 사용하였으며, pH 7.0 배지에 0.3% 담즙 (돼지 담즙 추출액, Sigma) 및 1000 U/㎖ 트립신이 첨가된 인공 담즙액에서 실시하였다. 인공 위액 처리된 배양액을 원심분리 후 상등액과 동일한 양의 인공 담즙액을 첨가하여 90 분간 더 반응시킨 후 대조군과 비교하여 희석하여 MRS 플레이트에 도말하여 생균수를 계수하여 내담즙성 정도를 측정하였다.
그 결과, 표 5에 나타낸 바와 같이, 인공 위액 및 인공 담즙액을 처리한 후에도 락토바실러스 퍼멘텀 PL9119 균주는 대부분 생존하는 것을 확인함으로써, 상기 락토바실러스 퍼멘텀 PL9119 균주는 내산성 및 내담즙성이 우수함을 확인하였다(표 5).
| 식별번호 | MRS |
Gastric juice | Bile acid | ||
| 0 분 | 90 분 | 180 분 | 90 분 | 90 분 | |
| PL9119 | 1.34 X 108 | 1.90 X 108 | 2.30 X 108 | 3.50 X 108 | 2.40 X 108 |
락토바실러스
퍼멘텀
PL9119 균주의
식중독
세균
억제능
확인
상기 <실시예 1>에서 분리한 락토바실러스 퍼멘텀 PL9119 의 균주의 식중독 세균 억제능을 측정하기 위하여 하기와 같은 실험을 수행하였다.
구체적으로, 유산균을 MRS 액체배지에서 25시간 동안 배양한 후 원심분리하여 상등액을 준비하였다. 대장균주(Escherichia coli) O157:H7 ATCC 43894, 살모넬라 티피무리움(Salmonella typhimurium) CCARM 8001, 살모넬라 엔테라이티디스(Salmonella enteritidis) CCARM 8010, 엔테로코커스 패칼리스(Enterococcus faecalis) ATCC 29212, 스타필로코쿠스 아우레우스(Staphylococcus aureus) CCARM 0045, 리스테리아 모노시토제네스(Listeria monocytogenes) ATCC 19113C3a를 포함한 6가지 유해세균은 McFaland standard 0.5로 탁도를 맞추어 MH 고체 배지에 접종하고, 멸균 시험관으로 배지에 구멍을 내어 상기 유산균 배양 상등액 1 ㎖를 3% 한천 200 ㎕와 섞어 구멍에 넣었다. 리스테리아 모노시토제네스는 30℃에서, 나머지 유해 세균은 37℃에서 배양하여 억제환의 유무와 크기를 확인하였다.
그 결과, 도 3 및 표 6에 나타낸 바와 같이, 본 발명의 락토바실러스 퍼멘텀 PL9119 균주는 6종류 유해균에 모두 억제력을 보이는 것을 확인함으로써, 상기 락토바실러스 퍼멘텀 PL9119 균주가 여러 병원균에 대한 억제능을 가짐을 확인하였다(표 6).
| 번호 | 실험 균주 | 억제환의 지름(mm) |
| 1 | Escherichia coli ATCC 43897 | 34±1.7 |
| 2 | Salmonella Typhimurium CCARM 8001 | 36.7±0.6 |
| 3 | Salmonella Enteritidis CCARM 8010 | 33.3±1.2 |
| 4 | Enterococcus faecalis ATCC 29212 | 36.3±0.6 |
| 5 | Staphylococcus aureus CCARM 0045 | 31±0 |
| 6 | Listeria monocytogenes ATCC 19113C3a | 41±0 |
락토바실러스
퍼멘텀
PL9119 균주의 혐기성 세균 성장
억제능
확인
감염증 치료를 위해 다량의 항생제 섭취나 장기간의 항생제 치료시 장내 유산균의 수가 감소하면 장내에 소수로 존재하던 혐기성 세균인 클로스트리디움 디피실(Clostridium difficile) 균주가 압도적으로 증가하게 된다. 클로스트리디움 디피실 균주는 설사 등의 장염을 유발하여 항암환자의 치료를 더욱 어렵게 만든다. 따라서 상기 <실시예 1>에서 선택한 균주 PL9199의 클로스트리디움 디피실 억제능력을 측정하기 위하여, 하기의 실험을 수행하였다.
구체적으로, 유산균을 MRS 액체배지에서 25시간 동안 배양한 후, 원심분리하여 상등액을 준비하였다. 클로스트리디움 디피실 두 균주를 5% defibrinated sheep blood를 첨가한 Trypticase soy agar에 접종하고, 멸균 시험관으로 배지에 구멍을 내어 상기 유산균 배양 상등액과 3% 한천을 3:1로 혼합하여 최종 부피가 1.2 ㎖가 되게 제조하여 구멍에 넣어 준 후, 37℃에서 48시간 동안 혐기 배양하여 억제환의 유무와 지름의 크기를 확인하였다. 혐기성 세균 성장 억제능 확인실험은 3회 실시하여 측정하였다.
그 결과, 도 4 및 표 7에 나타낸 바와 같이, 락토바실러스 퍼멘텀 PL9119 균주는 클로스트리디움 디피실 두 균주 모두의 성장에 억제력을 보이는 것을 확인하였다(표 7).
| 번호 | 실험 균주 | 억제환의 지름(mm) |
| 1 | Clostridium dfficile ATCC 9683 | 37±0 |
| 2 | Clostridium dfficile ATCC 43593 | 38±1 |
락토바실러스
퍼멘텀
PL9119 균주의
리파제
생산 능력 확인
상기 <실시예 1>에서 선택한 균주의 리파제 생산 능력을 확인하기 위하여, 하기의 실험을 수행하였다.
구체적으로, MRS 고체배지를 멸균하고 50℃로 식었을 때 1% 트리부티린(tributyrin)을 넣어 리파제 확인배지를 만든다. 이렇게 제조한 배지에 MRS 고체배지에서 2일 배양된 콜로니를 접종하여 3일 동안 배양한 후, 투명대 생산여부를 확인하였다. 이때 스타필로코쿠스 호미니스(Staphylococcus homonis )를 리파제 양성대조군 균주로 사용하였다.
그 결과, 도 5에 나타낸 바와 같이, 락토바실러스 퍼멘텀 PL9119 균주는 주위에 투명대를 형성하여 리파제를 생산하는 것을 확인하였다(도 5).
<
제제예
1>
식품의제조
본 발명의 락토바실러스 퍼멘텀 PL9119 균주 및 이의 배양액을 포함하는 식품들을 다음과 같이 제조하였다.
<1-1> 조리용 양념의 제조
조리용 양념 100 중량부에 본 발명의 락토바실러스 퍼멘텀 PL9119 균주 및 이의 배양액 1 내지 12 중량부로 혼합하여 장 기능 개선용 조리용 양념을 제조하였다.
<1-2> 스프 및 육즙(gravies)의 제조
본 발명의 락토바실러스 퍼멘텀 PL9119 균주 및 이의 배양액 1 내지 12 중량부를 스프 및 육즙 100 중량부에 첨가하여 장 기능 개선용 육가공 제품, 면류의 스프 및 육즙을 제조하였다.
<1-3> 유제품(dairy products)의 제조
본 발명의 락토바실러스 퍼멘텀 PL9119 균주 및 이의 배양액 1 내지 12 중량부를 우유 100 중량부에 첨가하고, 상기 우유를 이용하여 버터 및 아이스크림과 같은 다양한 유제품을 제조하였다.
<1-4> 선식의 제조
본 발명의 락토바실러스 퍼멘텀 PL9119 균주 및 이의 배양액을 진공 농축기에 감압, 농축하고 분무, 열풍 건조기로 건조하여 얻은 건조물을 분쇄기로 입도 60 메쉬로 분쇄하여 건조분말을 얻었다.
상기에서 제조한 곡물류, 종실류, 및 본 발명의 락토바실러스 퍼멘텀 PL9119 균주 및 이의 배양액을 배합하여 선식을 제조하였다.
<
제제예
2> 음료의 제조
<2-1> 탄산음료의 제조
설탕 5 내지 10 중량부, 구연산 0.05 내지 0.3 중량부, 카라멜 0.005 내지 0.02 중량부, 비타민 C 0.1 내지 1 중량부, 본 발명의 락토바실러스 퍼멘텀 PL9119 균주 및 이의 배양액 10 중량부의 첨가물을 혼합하고 여기에 94 중량부의 정제수를 섞어서 시럽을 만들고, 상기 시럽을 95 내지 98℃에서 20 내지 180 초간 살균하여 냉각수와 1:4의 비율로 혼합한 다음 탄산가스를 0.5 내지 0.82 중량부를 주입하여 탄산음료를 제조하였다.
<2-2> 기능성 음료의 제조
비타민 C 0.1 중량부, 과당 5.8 중량부, 백설탕 3.8 중량부, 구연산 0.12 중량부, 사과산 0.03 중량부, 구연산 나타륨 0.04 중량부 및 치자청색소 0.02 중량부에 본 발명의 락토바실러스 퍼멘텀 PL9119 균주 및 이의 배양액 10 중량부를 배합하여 계량된 물에 완전히 용해시켰다. 상기 용해된 음료를 총량이 100 중량부가 되도록 계량된 정제수로 조정하였다.
<2-3> 건강 음료의 제조
액상과당 0.5 중량부, 올리고당 2 중량부, 설탕 2 중량부, 식염 0.5 중량부, 물 75 중량부과 같은 부재료와 본 발명의 락토바실러스 퍼멘텀 PL9119 균주 및 이의 배양액 10 중량부를 균질하게 배합하여 순간 살균을 한 후 이를 유리병, 패트병 등 소포장 용기에 포장하여 건강 음료를 제조하였다.
<2-4> 야채 주스의 제조
본 발명의 락토바실러스 퍼멘텀 PL9119 균주 및 이의 배양액의 진공건조물 10 g을 토마토 또는 당근 주스 1 ℓ에 가하여 건강 증진용 야채 주스를 제조하였다.
<2-5> 과일 주스의 제조
본 발명의 락토바실러스 퍼멘텀 PL9119 균주 및 이의 배양액의 진공건조물 10 g, 을 사과 또는 포도 주스 1 ℓ에 가하여 건강 증진용 과일 주스를 제조하였다.
<제제예 3> 발효유의 제조
탈지분유를 이용하여 무지유 고형분 함량을 8 내지 20 중량부로 조정한 원료유를 72 내지 75℃에서 15초간 살균하였다. 살균된 원료유를 일정 온도까지 냉각시킨 후 락토바실러스 퍼멘텀 PL9119 균주를 106 CFU/㎖의 농도로 접종하여 pH 4 내지 5가 될 때까지 배양하였다. 배양완료 후 배양액을 냉각시켰다. 과즙농축액 0.1 내지 50 중량부, 식이섬유 0.1 내지 20 중량부, 포도당 0.5 내지 30 중량부, 올리고당 0.1 내지 15 중량부, 칼슘 0.001 내지 10 중량부, 비타민 0.0001 내지 5 중량부 등을 녹여 시럽을 제조하였다. 이렇게 제조된 시럽을 살균한 후 냉각하여 상기 배양액과 일정 비율로 혼합, 교반하여 균질화시킨 용기에 포장하여 발효유를 제조하였다.
<제제예 4> 유산균 균말의 제조
락토바실러스 퍼멘텀 PL9119 균주를 MRS 배지에 106 CFU/㎖의 농도로 접종하여 37℃에서 18 내지 24 시간 동안 pH-조절 발효(pH-control fermentation)를 실시하였다. 배양완료 후 4℃에서 10,000 ×g로 원심분리하여 균체를 회수하였다. 회수된 균체는 5% 스킴 밀크(skim milk)에 2.5% 유장(whey), 5% 수크로오스(sucrose)가 함유된 보호제와 동량으로 혼합된 후 동결건조기를 통해 분말화하였다. 이렇게 제조된 락토바실러스 퍼멘텀 PL9119의 건조분말은 모두 1 11 CFU/g 이상의 생균수를 나타내었다.
<제제예 5> 유산균 제제의 제조
<제제예 4>에서 제조한 유산균 균말을 이용하여 유산균 식품, 정장제 등의 유산균 제제를 제조하였다. 락토바실러스 퍼멘텀 PL9119의 건조 분말 20 중량부에 올리고당 10 중량부, 무수포도당 20 중량부, 결정과당 5 중량부, 비타민 C 2 중량부, 과일분말향 5 중량부, 알로에 5 중량부, 식이섬유 15 중량부, 차전자피 18 중량부를 혼합하여 스틱 또는 병에 일정량 분주하여 포자하였다. 이렇게 제조된 유산균 제제는 5 8 CFU/g 이상의 생균수를 유지하였다.
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<120> Lactobacillus fermentum PL9119 with biofunctional activities and
high heat stability as a probiotic without antibiotic resistance
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<213> Lactobacillus fermentum
<400> 1
ttgattttgg tcgccaacga gtggcggacg ggtgagtaac acgtaggtaa cctgcccaga 60
agcgggggac aacatttgga aacagatgct aataccgcat aacaacgttg ttcgcatgaa 120
caacgcttaa aagatggctt ctcgctatca cttctggatg gacctgcggt gcattagctt 180
gttggtgggg taacggccta ccaaggcgat gatgcatagc cgagttgaga gactgatcgg 240
ccacaatggg actgagacac ggcccatact cctacgggag gcagcagtag ggaatcttcc 300
acaatgggcg caagcctgat ggagcaacac cgcgtgagtg aagaagggtt tcggctcgta 360
aagctctgtt gttaaagaag aacacgtatg agagtaactg tttatacgtt gacggtattt 420
aaccagaaag tcacggctaa ctacgtgcca gcagccgcgg taatacgtag gtggcaagcg 480
ttatccggat ttattgggcg taaagagagt gcaggcggtt ttctaagtct gatgtgaaag 540
ccttcggctt aaccggagaa gtgcatcgga aactggataa cttgagtgca gaagagggta 600
gtggaactcc atgtgtagcg gtggaatgcg tagatatatg gaagaaca 648
Claims (13)
- 신규한 락토바실러스 퍼멘텀(Lactobacillus fermentum) PL9119 균주.
- 제 1항에 있어서, 상기 균주는 서열번호 1로 기재되는 16SrRNA 염기서열을 갖으며, 수탁번호 KCTC 13038BP로 기탁된 신규한 락토바실러스 퍼멘텀(Lactobacillus fermentum) PL9119인 것을 특징으로 하는 균주.
- 수탁번호 KCTC 13038BP로 기탁된 신규한 락토바실러스 퍼멘텀(Lactobacillus fermentum) PL9119 균주 또는 이의 배양액을 유효성분으로 함유하는 생균제 조성물.
- 제 3항에 있어서, 상기 균주 또는 이의 배양액은 암피실린(ampicillin), 젠타마이신(gentamicin), 에리스로마이신(erythromycin), 클린다마이신(clindamycin), 테트라사이클린(tetracycline), 클로람페니콜(chloramphenicol), 밴코마이신(vancomycin), 시너시드(synercid, quinupristin and dalfopristin combination), 리네졸리드(linezolid) 및 리팜피신(rifampicin)으로 구성된 군으로부터 선택된 어느 하나의 항생제에 대한 항생제 외재 내성이 없어 내성 전이의 위험이 없는 것을 특징으로 하는 생균제 조성물.
- 제 3항에 있어서, 상기 균주 또는 이의 배양액은 내산성 및 내담즙성이 우수한 것을 특징으로 하는 생균제 조성물.
- 제 3항에 있어서, 상기 균주 또는 이의 배양액은 대장균주(Escherichia coli) O157:H7 ATCC 43894, 살모넬라 티피무리움(Salmonella typhimurium) CCARM 8001, 살모넬라 엔테라이티디스(Salmonella enteritidis) CCARM 8010, 엔테로코커스 패칼리스(Enterococcus faecalis) ATCC 29212, 스타필로코쿠스 아우레우스(Staphylococcus aureus) CCARM 0045, 리스테리아 모노시토제네스(Listeria monocytogenes) ATCC 19113C3a로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나의 균주에 대하여 항균 활성을 가지는 것을 특징으로 하는 생균제 조성물.
- 제 3항에 있어서, 상기 균주 또는 이의 배양액은 혐기성 세균인 클로스트리디움 디피실(Clostridium difficile)에 대하여 항균 활성을 가지는 것을 특징으로 하는 생균제 조성물.
- 제 3항에 있어서, 상기 균주 또는 이의 배양액은 리파제 생산능력을 가지는 것을 특징으로 하는 생균제 조성물.
- 수탁번호 KCTC 13038BP로 기탁된 락토바실러스 퍼멘텀 PL9119 균주 또는 이의 배양액을 유효성분으로 함유하는 정장용 조성물.
- 제 9항에 있어서, 상기 균주 및 이의 배양액은 클로스트리디움 디피실에 대하여 항균 활성을 가지는 것을 특징으로 하는 정장용 조성물.
- 수탁번호 KCTC 13038BP로 기탁된 신규한 락토바실러스 퍼멘텀 PL9119 또는 이들의 배양액을 유효성분으로 함유하는 항균용 또는 정장용 건강기능식품.
- 제 11항에 있어서, 상기 균주 또는 이의 배양액은 식중독 세균 성장 억제와 리파제 생산을 통한 장 건강 활성을 증진시키는 것을 특징으로 하는 항균용 또는 정장용 건강기능식품.
- 제 11항에 있어서, 상기 식품은 아이스크림류, 우유, 두유, 요구르트, 치즈를 포함하는 유제품, 및 두유제품, 육류, 소세지, 빵, 초콜릿 캔디류, 스낵류, 과자류, 피자, 라면, 기타 면류, 껌류, 각종 수프, 음료수, 차, 드링크제, 알코올 음료, 캡슐 또는 스틱 포장의 유산균 제제로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나인 것을 특징으로 하는 건강식품.
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