KR102519164B1 - 면역증진 활성을 갖는 신규 유산균 및 이의 용도 - Google Patents
면역증진 활성을 갖는 신규 유산균 및 이의 용도 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 면역증진 활성을 갖는 신규 유산균 리모실락토바실러스 퍼멘텀(Limosilactobacillus fermentum) 및 이를 활용한 프로바이오틱스 조성물 또는 면역증진용 조성물에 관한 것이다. 본 발명에 따른 리모실락토바실러스 퍼멘텀(Limosilactobacillus fermentum) MG5159 균주는 항생제 감수성, 용혈성, 내산성 및 내담즙성 등의 프로바이오틱스 안정성을 갖춘 균주로 동시에 NK 세포(Natural killer cell) 활성 및 면역반응 활성 사이토카인 생성 증진능이 우수하여 면역증진 기능성 프로바이오틱스로 유용하며, 나아가 면역증진용 의약품, 기능성 식품, 동물사료 등의 식의약 용도에 유효성분으로 활용될 수 있다.
Description
본 발명은 면역증진 활성을 갖는 신규 유산균 리모실락토바실러스 퍼멘텀(Limosilactobacillus fermentum) 및 이를 활용한 프로바이오틱스 조성물 또는 면역증진용 조성물에 관한 것이다.
면역시스템은 내부 및 외부 병원성 물질로부터 인체를 보호하기 위해 다양한 세포로 구성된 방어 체계이며, 각각의 면역세포마다 지니고 있는 특이적 기능 및 각 세포간의 상호 교류를 통해 면역이 형성된다. 인체 면역계는 면역을 억제·조절하는 면역관용(Tolerance)과 면역을 증진하는 면역반응(Immunity)으로 구성되며 두 면역작용이 적절한 균형을 이룸으로써 면역학적 항상성 유지가 가능하고 면역 항상성 불균형은 다양한 질병을 초래한다. 즉 면역반응에 비해 면역관용 기작이 강할 경우 암의 발생이나 바이러스성 질환 유발, 반대로 면역관용에 비해 면역반응 기작이 강할 경우 자가 면역질환, 이식 거부 반응, 알러지성 질환 등 염증성 질환을 초래하게 된다.
그런데 산업화 및 서구화에 따른 생활환경의 변화와 함께 면역질환 발병률이 증가하고 있으며, 이는 사회·경제·문화적 위축으로 인해 심각한 사회 문제로 대두되고 있다. 면역 불균형으로 인한 질환은 현재까지 활발한 연구에도 불구하고 정확한 발병 원인 및 기작에 대한 이해가 부족한 실정이며 이에 치료 방법 및 치료제의 개발에 여전히 어려움이 있다.
한편, 건강기능식품은 의약품과 달리 치료가 목적이 아닌 생체기능의 활성화를 통해 질병발생 위험을 감소시키거나 건강유지·증진을 목적으로 한다. 바쁜 현대인들은 건강기능식품 섭취를 통해 건강을 관리하고자 다양한 제품을 소비하고 있으며, 수요자 중심의 ‘개인 맞춤형 건강기능식품’ 선호로 소비 트렌드가 변화하고 있다. 특히 코로나19(COVID-19·코로나바이러스감염증-19) 사태 이후 면역관리에 대한 소비자의 이해도가 높아지고 관련 제품의 소비가 증가하고 있으며, 특정 질병/질환 예방에 관련된 건강기능식품 소비가 급증하고 있다.
건강기능식품 중 홍삼, 비타민, 프로바이오틱스가 시장을 선점하고 있는데, 프로바이오틱스는 장내 미생물의 균형을 개선함으로써 숙주의 건강을 유리하게 작용하는 생균 첨가물이며 주로 장내 유익균으로 알려진 유산균이 사용되고 있다. 유산균은 오래 전부터 발효유식품에 이용되어 왔으며, 최근에는 유산균의 기능성과 그 메커니즘을 밝히기 위해 전세계적으로 많은 연구가 수행되고 있다.
특히 장관 상피세포 기능의 증진, 생리적 스트레스에 대한 보호, 사이토카인 분비의 조절, T림프구 집단에 대한 영향, 항체분비의 증진 등의 면역조절작용 효능을 보이는 등 면역 항상성 기여에 있어 상당한 잠재력이 있을 것으로 예상되고 기능성 프로바이오틱스 시장 성장은 급성장세를 보임에도 불구하고 면역 항상성 증진 효능이 규명된 프로바이오틱스 제품은 전무하며 대부분 부원료 추가를 통한 면역기능개선 제품을 선보이고 있는 실정이다.
이러한 기술적 배경하에, 본 발명자들은 프로바이오틱스 선정 기준에 적합하면서 면역체계 균형 강화 기능성을 가진 후보균을 선별하고, 그 중 리모실락토바실러스 퍼멘텀(Limosilactobacillus fermentum) MG5159 균주의 우수한 면역 항상성 증진 효능 및 메커니즘을 규명하였다. 이에 면역체계 증진 프로바이오틱스로서 활용 가능성이 높은 상기 MG5159 균주를 생물자원센터(KCTC)에 기탁하여 수탁번호 KCTC14947BP를 부여받았다.
따라서 본 발명은 수탁번호 KCTC14947BP로 기탁된 리모실락토바실러스 퍼멘텀(Limosilactobacillus fermentum) MG5159 균주 및 이를 포함하는 프로바이오틱스 조성물, 면역 증진용 조성물, 면역 증진용 건강기능식품 및 사료첨가제를 제공할 수 있다.
본 발명은 수탁번호 KCTC14947BP로 기탁된 리모실락토바실러스 퍼멘텀(Limosilactobacillus fermentum) MG5159 균주를 제공한다.
상기 균주는 면역증진 활성을 갖는 것을 특징으로 할 수 있다.
상기 균주는 항생제 감수성, γ-용혈 활성, 내산성 및 내담즙성으로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 프로바이오틱스 특성을 갖는 것일 수 있다.
상기 항생제 감수성은 암피실린(Ampicillin), 겐타마이신(Gentamicin), 카나마이신(Kanamycin), 스트렙토마이신(Streptomycin), 테트라사이클린(Tetracycline), 클로람페니콜(Chloramphenicol), 에리스로마이신(Erythromycin) 및 클린다마이신(Clindamycin)으로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상에 대한 감수성일 수 있다.
상기 균주는 D-아라비노스(L-arabinose), D-리보스(D-ribose), D-자일로스(D-xylose), D-갈락토스(D-galactose), D-글루코스(D-glucose), D-프락토스(D-fructose), D-만노스(D-mannose), L-소르보스(L-sorbose), D-만니톨(D-mannitol), D-소르비톨(D-sorbitol), 메틸-α D-글루코시드(Methyl-α D-glucoside), N-아세틸-글루코사민(N-acethyl-glucosamine), 아마이그달린(Amygdalin), 아르부틴(Arbutin), D-에스쿨린(Esculin), 살리신(Salicin), D-셀로비오스(D-cellobiose), D-말토스(D-maltose), D-락토스(D-lactose), D-멜리비오스(D-melibiose), D-슈크로스(D-sucrose), D-트레알로스(D-trehalose), 이눌린(Inulin), D-멜레지토스(D-melezitose), D-라피노스(D-raffinose), 겐티오비오스(Gentiobiose), D-투라노스(D-turanose), D-리소오스(D-lyxose), D-타가토스(D-tagatose), L-아라비톨(L-arabirol), 글루코네이트(Gluconate) 및 5-케토-글루코네이트(5-keto-gluconate)로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상을 탄소원으로 이용하는 것을 특징으로 할 수 있다.
또한 본 발명은 수탁번호 KCTC14947BP로 기탁된 리모실락토바실러스 퍼멘텀(Limosilactobacillus fermentum) MG5159 균주 또는 이의 배양물을 포함하는 프로바이오틱스 조성물을 제공한다.
상기 프로바이오틱스는 면역증진 활성, 항생제 감수성, γ-용혈 활성, 내산성 또는 내담즙성을 갖는 것을 특징으로 할 수 있다.
또한 본 발명은 수탁번호 KCTC14947BP로 기탁된 리모실락토바실러스 퍼멘텀(Limosilactobacillus fermentum) MG5159 균주, 이의 배양물 또는 이의 파쇄물을 포함하는 면역 증진용 조성물을 제공한다.
상기 조성물은 약학 조성물, 식품 조성물, 사료 조성물로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나일 수 있다.
상기 면역 증진은 식세포작용(Phagocytosis); NK 세포(Natural killer) 활성 증진; TNF-α, IL-1β, IL-6, iNOS 또는 COX-2 의 사이토카인 생성 증진; 또는 MARK/ERK 또는 NF-κB 신호전달경로 활성 증진; 을 통해 이루어지는 것을 특징으로 할 수 있다.
또한 본 발명은 수탁번호 KCTC14947BP로 기탁된 리모실락토바실러스 퍼멘텀(Limosilactobacillus fermentum) MG5159 균주, 이의 배양물 또는 이의 파쇄물을 포함하는 면역 증진용 건강기능식품을 제공한다.
또한 본 발명은 수탁번호 KCTC14947BP로 기탁된 리모실락토바실러스 퍼멘텀(Limosilactobacillus fermentum) MG5159 균주, 이의 배양물 또는 이의 파쇄물을 포함하는 면역 증진용 사료 첨가제를 제공한다.
본 발명에 따른 리모실락토바실러스 퍼멘텀(Limosilactobacillus fermentum) MG5159 균주는 항생제 감수성, 용혈성, 내산성 및 내담즙성 등의 프로바이오틱스 안정성을 갖춘 균주로 동시에 NK 세포(Natural killer cell) 활성 및 면역반응 활성 사이토카인 생성 증진능이 우수하여 면역증진 기능성 프로바이오틱스로 유용하며, 나아가 면역증진용 의약품, 기능성 식품, 동물사료 등의 식의약 용도에 유효성분으로 활용될 수 있다.
도 1은 대식세포(RAW264.7)에 유산균 배양여액 동결건조물 처리에 따른 NO 생성량(A) 및 세포생존율(B)을 나타낸 도이다(* : p<0.05)
도 2는 LPS 처리 대식세포(RAW264.7)에 유산균 배양여액 동결건조물 처리에 따른 NO 생성량(A) 및 세포생존율(B)을 나타낸 도이다(* : p<0.05).
도 3은 대식세포(RAW264.7)에 유산균 배양여액 동결건조물 처리에 따른 iNOS mRNA 발현량(A) 및 COX-2 mRNA 발현량(B)을 나타낸 도이다(* : p<0.05).
도 4는 대식세포(RAW264.7)에 유산균 배양여액 동결건조물 처리에 따른 TNF-α 생성량(A) 및 IL-6 생성량(B) 및 IL-1β 생성량(C)을 나타낸 도이다(* : p<0.05).
도 5는 대식세포(RAW264.7)에 유산균 배양여액 동결건조물 처리에 따른 ERK, NF-kB 및 TLR2 인산화(A) 및 정량그래프(B~D)를 나타낸 도이다(* : p<0.05).
도 6은 대식세포(RAW264.7)에 유산균 배양여액 동결건조물 처리에 따른 식균작용을 나타낸 도이다(* : p<0.05).
도 7은 유산균 배양여액 동결건조물 처리에 따른 NK-92 세포의 증식을 나타낸 도이다.
도 8은 유산균 배양여액 동결건조물 처리에 따른 NK-92 세포의 granzyme B 발현량을 나타낸 도이다(* : p<0.05).
도 9는 유산균 배양여액 동결건조물을 처리한 NK-92 세포의 K562 표적세포에 대한 독성을 나타낸 도이다(* : p<0.05).
도 10은 유산균의 용혈성 판독을 나타낸 도이다.
도 11은 유산균의 내산성 여부를 나타낸 도이다.
도 12는 유산균의 내담즙성 여부를 나타낸 도이다.
도 2는 LPS 처리 대식세포(RAW264.7)에 유산균 배양여액 동결건조물 처리에 따른 NO 생성량(A) 및 세포생존율(B)을 나타낸 도이다(* : p<0.05).
도 3은 대식세포(RAW264.7)에 유산균 배양여액 동결건조물 처리에 따른 iNOS mRNA 발현량(A) 및 COX-2 mRNA 발현량(B)을 나타낸 도이다(* : p<0.05).
도 4는 대식세포(RAW264.7)에 유산균 배양여액 동결건조물 처리에 따른 TNF-α 생성량(A) 및 IL-6 생성량(B) 및 IL-1β 생성량(C)을 나타낸 도이다(* : p<0.05).
도 5는 대식세포(RAW264.7)에 유산균 배양여액 동결건조물 처리에 따른 ERK, NF-kB 및 TLR2 인산화(A) 및 정량그래프(B~D)를 나타낸 도이다(* : p<0.05).
도 6은 대식세포(RAW264.7)에 유산균 배양여액 동결건조물 처리에 따른 식균작용을 나타낸 도이다(* : p<0.05).
도 7은 유산균 배양여액 동결건조물 처리에 따른 NK-92 세포의 증식을 나타낸 도이다.
도 8은 유산균 배양여액 동결건조물 처리에 따른 NK-92 세포의 granzyme B 발현량을 나타낸 도이다(* : p<0.05).
도 9는 유산균 배양여액 동결건조물을 처리한 NK-92 세포의 K562 표적세포에 대한 독성을 나타낸 도이다(* : p<0.05).
도 10은 유산균의 용혈성 판독을 나타낸 도이다.
도 11은 유산균의 내산성 여부를 나타낸 도이다.
도 12는 유산균의 내담즙성 여부를 나타낸 도이다.
달리 정의되지 않는 한, 기술적이거나 과학적인 용어를 포함해서 여기서 사용되는 모든 용어들은 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자에 의해 일반적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖고 있다.
일반적으로 사용되는 사전에 정의되어 있는 것과 같은 용어들은 관련 기술의 문맥상 갖는 의미와 일치하는 의미를 갖는 것으로 해석되어야 하며, 본 출원에서 명백하게 정의하지 않는 한, 이상적이거나 과도하게 형식적인 의미로 해석되지 않는다. 또한, 본 발명을 설명함에 있어서 관련된 공지 기술에 대한 구체적인 설명이 본 발명의 요지를 불필요하게 흐릴 수 있다고 판단되는 경우 그 상세한 설명을 생략한다.
본 발명자들은 프로바이오틱스 선정 기준에 적합하면서 면역체계 균형 강화 기능성을 가진 후보균을 선별하고, 그 중 리모실락토바실러스 퍼멘텀(Limosilactobacillus fermentum) MG5159 균주의 우수한 면역 항상성 증진 효능 및 메커니즘을 규명하였다. 이에 면역체계 증진 프로바이오틱스로서 활용 가능성이 높은 상기 MG5159 균주를 생물자원센터(KCTC)에 2022년 04월 15일에 기탁하여 수탁번호 KCTC14947BP를 부여받았다.
본 발명은 일 관점에서, 수탁번호 KCTC14947BP로 기탁된 리모실락토바실러스 퍼멘텀(Limosilactobacillus fermentum) MG5159 균주에 관한 것이다.
상기 MG5159 균주는 면역증진 활성을 갖는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 MG5159 균주를 처리한 대식세포는 LPS(Lipopolysaccharide)에 의해 선천면역 반응이 활성화된 대식세포를 양성대조군으로 비교하였을 때 유사하거나 더 우수한 선천면역 반응을 활성화하는 것으로 확인하였다.
구체적으로, 면역체계 조절(Immune modulation)에 관여하는 단백질군으로 다양한 유전자들의 발현을 조절하며 세포내 신호전달 체계의 중심축을 이루는 NF-kB 경로를 활성화하고, 이에 의해 조절되는 유도효소 iNOS 및 COX-2의 발현 증가와 사이토카인 TNF-α, IL-6 및 IL-1β의 생성량 증가에 우수한 효능을 나타냈다. 또한 MG5159 균주는 박테리아, 바이러스, 곰팡이 및 기생충을 포함한 여러 병원체에 대한 인식 분자인 Toll-like 수용체(TLR)를 활성화하여 체내 면역반응을 증진시킬 수 있음을 확인하였다.
아울러 MG5159 균주는 대식세포의 식균작용(Phagocytosis)을 증진시켰으며 NK 세포의 증식 및 활성을 증진시키는 것으로 확인하였다. NK 세포(Natural killer cell; 자연살해세포)는 항원에 의한 사전 감작 없이도 종양세포, 박테리아, 세포 내 기생생물 또는 바이러스에 감염된 숙주세포를 제거하는 기능을 수행하며, 부적절한 골수 이식을 거부하고, T 세포의 면역 반응을 조절하는 등 생체 내 면역계 방어 기작의 제 1선에서 작용하는 행동세포이다. 이러한 NK-세포의 활성 및 대식세포의 식균작용은 생체 면역 반응을 높이므로 본 발명에 따른 MG5159 균주는 면역증진 활성을 갖는 균주이다.
또한 상기 MG5159 균주는 항생제 감수성, γ-용혈 활성, 내산성 및 내담즙성으로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 프로바이오틱스 특성을 갖는 것일 수 있다.
현재 사용 중인 프로바이오틱스 개념은 국제식량기구(FAO)와 세계보건기구(WHO)에 의해 채택 권고된 것으로서 적당한 양을 섭취하였을 때 숙주 건강에 이로운 작용을 하는 생균을 의미하며 안전성, 기능성 및 기술적인 유용성을 만족해야 한다. 또한 유산균이 다양한 항생제에 내성을 가질 경우 장내 서식하는 기회 감염균 또는 병원성 미생물에 항생제 내성 유전자를 전파할 위험성이 있을 수 있으므로 생균제에 대해 항생제 내성 및 독성 인자를 평가하도록 권고하고 있다.
본 발명의 일 구현에 따르면 MG5159 균주는 인간의 장내 환경과 유사한 조건에서 내산성 및 내담즙성을 나타내 생존력을 위협받지 않았으며 용혈을 일으키지 않는 감마 용혈(γ-hemolysis)을 나타내 프로바이오틱스로서의 안정성이 확인되었다. 아울러 항생제별 내성 평가를 통해 MG5159 균주는 장내 세균에 내성 유전자를 전달할 가능성이 낮을 것으로 확인하였다. 상기 항생제는 암피실린(Ampicillin), 겐타마이신(Gentamicin), 카나마이신(Kanamycin), 스트렙토마이신(Streptomycin), 테트라사이클린(Tetracycline), 클로람페니콜(Chloramphenicol), 에리스로마이신(Erythromycin), 클린다마이신(Clindamycin)으로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
따라서 본 발명에 따른 MG5159 균주 또는 이의 배양물은 면역증진 활성으로 대표되는 기능성 및 장내 안정성을 갖춘 프로바이오틱스 조성물의 유효성분으로 이용될 수 있다.
본 발명에서 유산균의 배양물은 소정의 균주를 배지에서 배양시켜 수득한 산물로서, 상기 배지는 공지의 액체배지 또는 고체 배지에서 선택될 수 있으며, 예를 들어 MRS 액체 배지, MRS 한천 배지, BL 한천 배지일 수 있으며 이에 제한되지 않는다.
MG5159 균주를 배양하기 위해 D-아라비노스(L-arabinose), D-리보스(D-ribose), D-자일로스(D-xylose), D-갈락토스(D-galactose), D-글루코스(D-glucose), D-프락토스(D-fructose), D-만노스(D-mannose), L-소르보스(L-sorbose), D-만니톨(D-mannitol), D-소르비톨(D-sorbitol), 메틸-α D-글루코시드(Methyl-α D-glucoside), N-아세틸-글루코사민(N-acethyl-glucosamine), 아마이그달린(Amygdalin), 아르부틴(Arbutin), D-에스쿨린(Esculin), 살리신(Salicin), D-셀로비오스(D-cellobiose), D-말토스(D-maltose), D-락토스(D-lactose), D-멜리비오스(D-melibiose), D-슈크로스(D-sucrose), D-트레알로스(D-trehalose), 이눌린(Inulin), D-멜레지토스(D-melezitose), D-라피노스(D-raffinose), 겐티오비오스(Gentiobiose), D-투라노스(D-turanose), D-리소오스(D-lyxose), D-타가토스(D-tagatose), L-아라비톨(L-arabirol), 글루코네이트(Gluconate) 및 5-케토-글루코네이트(5-keto-gluconate)로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상을 탄소원으로 이용할 수 있으나 이에 제한되지는 않는다.
본 발명은 다른 관점에서, 수탁번호 KCTC14947BP로 기탁된 리모실락토바실러스 퍼멘텀(Limosilactobacillus fermentum) MG5159 균주, 이의 배양물 또는 이의 파쇄물을 포함하는 면역 증진용 조성물로서 다양한 약학, 식품, 사료 용도에 관한 것이다.
본 발명에서 상기 조성물은 사용 목적 내지 양상에 따라 약학 조성물, 식품 첨가제, 식품 조성물 또는 기능성 식품 조성물, 사료 조성물 등으로 구체화될 수 있다. 또한, 유효성분인 유산균 등의 함량도 조성물의 구체적인 형태, 사용 목적 내지 양상에 따라 다양한 범위에서 조정될 수 있다. 또한, 면역 효과의 상승 및 보강 또는 유사활성의 부가를 통한 복용이나 섭취의 편리성을 증진시키기 위하여 당업계에서 이미 안전성이 검증되고 해당 활성을 갖는 것으로 공지된 임의의 화합물이나 천연 추출물을 하나 이상 추가로 포함할 수 있다.
상기 면역 증진용 조성물은 일 양태로 약학 조성물로 제공될 수 있다.
본 발명에 따른 MG5159 균주에 의해 활성이 증진되는 것을 확인한 NK 세포는 숙주에 감염된 병원균 또는 암세포에 대항하기 위한 선천성 면역 반응과 사이토카인 분비를 통한 후천성 면역 반응에 중요한 역할을 하는데, NK 세포가 표적 세포를 살상하는데 사용하는 주된 메커니즘은 퍼포린(Perforin) 및 그랜자임(Granzyme)B와 같은 세포 용해성 과립을 면역 시냅스를 통하여 표적 세포에 분비하는 것으로, 분비된 퍼포린은 표적 세포벽에 구멍을 만들고, 구멍을 통하여 표적 세포 내로 들어간 그랜자임이 표적 세포의 세포사멸(Apoptosis)을 유도한다. 이와 같이, NK 세포는 세포가 악성으로 변형되는 발암과정이나, 바이러스 감염 초기의 방어기전에서 결정적인 역할을 하는 것으로 확인되었으며, 이러한 연구들을 바탕으로 암 또는 면역질환 치료를 위해 NK 세포 치료법이 대두되고 있다.
이러한 점에서 본 발명에 따른 MG5159 균주는 NK 세포를 활성화하고, 면역반응 관련 신호전달 활성화 및 면역반응을 유도하는 사이토카인의 생성을 증가시켜 면역 증진 효능에 따라 면역질환을 예방, 개선 또는 치료할 수 있다.
상기 면역질환은 면역기능 저하로 인해 유발되는 질환으로, 이에 제한되지는 않으나, 류마티스 관절염, 타입 I 당뇨병, 다발성 경화증 및 전신성 홍반 루푸스와 같은 자가면역질환, 천식, 엔세필리티스(Encephilitis), 염증성 장염, 만성 폐쇄성 폐질환, 알러지, 폐혈병성 쇼크증, 폐섬유증, 미분화 척추관절증, 미분화 관절병증, 관절염, 염증성 골용해, 및 만성 바이러스 또는 박테리아 감염에 의한 만성 염증과 같은 염증성 질환, 각종 암, 및 감기와 같은 바이러스 질환을 포함할 수 있다.
상기 약학 조성물에는 유효성분 이외에 해당 기술 분야에서 통상적으로 약제학적으로 허용되는 적절한 담체, 부형제 및 희석제를 더 포함할 수 있다. 또한 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형, 외용제, 좌제 및 멸균 주사용액의 형태로 제형화하여 사용될 수 있다. 해당 기술 분야에 알려진 적합한 제제는 문헌(Remington's Pharmaceutical Science, 최근, Mack Publishing Company, Easton PA)에 개시되어있는 것을 사용하는 것이 바람직하나 이에 제한되지 않는다.
상기 약학 조성물이 경구용 제형으로 제조될 경우, 공지된 적합한 담체와 함께 당업계에 공지된 방법에 따라 분말, 과립, 정제, 환제, 당의정제, 캡슐제, 액제, 겔제, 시럽제, 현탁액, 웨이퍼 등의 제형으로 제조될 수 있다.
상기 약학 조성물이 비경구용 제형으로 제조될 경우, 공지된 적합한 담체와 함께 당업계에 공지된 방법에 따라 주사제, 경피 투여제, 의약외품 제제, 비강 흡입제 및 좌제의 형태로 제제화될 수 있다.
상기 면역 증진용 조성물은 다른 양태로 식품 조성물로 제공될 수 있다. 아울러 본 발명에 따른 MG5159 균주, 이의 배양물 또는 이의 파쇄물을 포함하는 건강기능식품을 제공할 수 있다.
상기 식품 조성물은 기능성 식품(Functional food), 영양보조제(Nutritional supplement), 건강기능(성)식품(Health functional food) 및 식품 첨가제(Food additives) 등의 모든 형태를 포함한다. 상기 유형의 식품 조성물은 당업계에 공지된 통상적인 방법에 따라 다양한 형태로 제조할 수 있다.
상기 식품 조성물에는 그 유효성분 이외에 식품첨가물이 포함될 수 있다. 식품첨가물은 일반적으로 식품을 제조, 가공 또는 보존함에 있어 식품에 첨가되어 혼합되거나 침윤되는 물질로서 이해될 수 있는데, 식품과 함께 매일 그리고 장기간 섭취되므로 그 안전성이 보장되어야 한다. 식품의 제조·유통을 규율하는 각국 법률(한국에서는 「식품위생법」임)에 따른 식품첨가물공전에는 안전성이 보장된 식품첨가물이 성분 면에서 또는 기능 면에서 한정적으로 규정되어 있다. 한국 식품첨가물공전(식약처 고시 「식품첨가물 기준 및 규격」)에서는 식품첨가물이 성분 면에서 화학적 합성품, 천연 첨가물 및 혼합 제제류로 구분되어 규정되어 있는데, 이러한 식품첨가물은 기능면에 있어서는 감미제, 풍미제, 보존제, 유화제, 산미료, 점증제 등으로 구분된다. 상기 식품첨가물은 당업계에서 통상적으로 사용되는 방법에 의하여 당업자의 통상의 지식에 따라 제품 유형 및 그 첨가 목적을 달성할 수 있는 적량으로 선택되어 첨가될 수 있다. 또한 식품첨가물 이외에, 기능성과 영양성을 보충, 보강할 목적으로 당업계에 공지되고 식품첨가물로서 안정성이 보장된 생리활성 물질이나 미네랄류를 더 포함할 수 있다.
상기 면역 증진용 조성물은 다른 양태로 사료 조성물로 제공될 수 있다. 아울러 본 발명에 따른 MG5159 균주, 이의 배양물 또는 이의 파쇄물을 포함하는 사료 첨가제로 제공될 수 있다.
상기 MG5159 균주를 건조된 상태로 공급할 수도 있으며, 별도의 건조과정을 수행하지 않고 그대로 이용될 수도 있다. 상기 MG5159 균주를 단독으로 사용할 수도 있으며, 종래 공지된 사료 첨가제 또는 사료와 병용하여 사용할 수도 있다. 또한 공지된 사료 첨가제 또는 사료에 첨가되는 각종 부형제들을 통상의 기술자의 선택에 따라 포함할 수 있다.
본 발명의 사료 조성물에는 동물사료에 통상적으로 사용되는 영양제, 방부제, 보존제, 항생제, 비타민 등의 미량 영양성분 등이 더 포함될 수 있다. 상기 영양제, 방부제, 보존제, 항생제, 미량 영양 성분 등은 해당 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 당업자가 통상적으로 사료에 첨가하는 함량으로 임의 선택하여 사용할 수 있다.
본 발명에 따른 사료 첨가제는 개별적으로 사용될 수 있고 종래 공지된 사료 첨가제와 병용하여 사용될 수 있고 종래의 사료첨가제와 순차적 또는 동시에 사용될 수 있다. 그리고 단일 또는 다중 투여될 수 있다. 상기 요소를 모두 고려하여 부작용 없이 최소한의 양으로 최대 효과를 얻을 수 있는 양을 투여하는 것이 중요하며, 당업자에 의해 용이하게 결정되어 공지된 다양한 형태로 제조될 수 있다.
이하 실시예 또는 실험예를 통하여 본 발명을 더욱 상세하게 설명하기로 한다. 이들 실시예 또는 실험예는 단지 본 발명을 예시하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들에 의해 제한되는 것으로 해석되지는 않는다.
실시예: 면역체계 강화 효능을 갖는 유산균주 선별
대식세포(RAW264.7 cell)를 대상으로 ㈜메디오젠에서 보유하고 있는 다양한 유산균주의 배양여액 동결건조물(Cell Free supernatant, CFS) 처리에 따른 산화질소(Nitric Oxide, NO) 생성량 변화를 측정하고, 이 중 우수한 결과를 나타내는 유산균을 선별하였다.
사용된 보유균주는 표 1에 나타냈다.
| NO. | 균주명 | 유래 |
| 1 | 리모실락토바실러스 루테리(Limosilactobacillus reuteri) MG505 | Human |
| 2 | 리모실락토바실러스 루테리(Limosilactobacillus reuteri) MG5346 | Food |
| 3 | 락티플랜티바실러스 플란타럼(Lactiplantibacillus plantarum) MG4215 | Human |
| 4 | 락티플랜티바실러스 플란타럼(Lactiplantibacillus plantarum) MG4557 | Infant feces |
| 5 | 락티플랜티바실러스 플란타럼(Lactiplantibacillus plantarum) MG5203 | Fermented food |
| 6 | 락티플랜티바실러스 플란타럼(Lactiplantibacillus plantarum) MG5239 | Fermented food |
| 7 | 락티플랜티바실러스 플란타럼(Lactiplantibacillus plantarum) MG4604 | Infant feces |
| 8 | 락티플랜티바실러스 플란타럼(Lactiplantibacillus plantarum) MG5023 | Food |
| 9 | 락티플랜티바실러스 플란타럼(Lactiplantibacillus plantarum) MG5185 | Fermented food |
| 10 | 락티플랜티바실러스 플란타럼(Lactiplantibacillus plantarum) MG5283 | Food |
| 11 | 락티플랜티바실러스 플란타럼(Lactiplantibacillus plantarum) MG5347 | Fermented food |
| 12 | 리모실락토바실러스 퍼멘텀(Limosilactobacillus fermentum) MG4538 | Infant feces |
| 13 | 리모실락토바실러스 퍼멘텀(Limosilactobacillus fermentum) MG5091 | Food |
| 14 | 리모실락토바실러스 퍼멘텀(Limosilactobacillus fermentum) MG5159 | Fermented food |
| 15 | 락티카제이바실러스 람노서스(Lacticaseibacillus rhamnosus) MG5007 | Food |
| 16 | 락티카제이바실러스 파라카제이(Lacticaseibacillus paracasei) MG5015 | Food |
| 17 | 리질락토바실러스 살리바리우스(Ligilactobacillus salivarius) MG5212 | Food |
| 18 | 비피도박테리움 브레브(Bifidobacterium breve) MG729 | Infant feces |
| 19 | 비피도박테리움 비피덤(Bifidobacterium bifidum) MG731 | Infant feces |
| 20 | 비피도박테리움 락티스(Bifidobacterium lactis) MG741 | Infant feces |
| 21 | 스트렙토코커스 서모필러스(S. thermophilus) MG5303 | Fermented food |
RAW264.7 세포 배양 및 유산균 배양여액 동결건조물 제조
RAW264.7 세포(한국세포주은행, 한국)는 10% FBS, 1% 페니실린-스트렙토마이신이 포함된 DMEM 배지를 사용하여 37℃, 5% CO2 조건 하에서 배양하였다. 세포는 2일마다 계대 배양하여 적정수의 세포수를 유지하였다.
각 분리 동정된 균주들은 MRS broth에서 37℃에서 18시간 동안 배양 후, 원심분리(4℃, 15분, 12,000 rpm)하여 펠렛을 제외한 배양여액을 회수하였다. 회수된 배양여액은 0.22 μm 필터로 여과한 후 동결건조하였다. 배양여액 동결건조물(CFS)은 사용 전까지 냉장보관하였다.
산화질소(NO) 생성량 증가를 통한 면역증진 효과
RAW264.7 세포를 96 well plate에 1×105 cells/well이 되도록 시딩하여 37℃, 5% CO2 조건 하에서 배양하였다. 24시간 동안 배양 후 상등액을 제거한 다음, FBS free DMEM에 녹인 배양여액 동결건조물을 5 mg/mL 농도로 처리하여 24시간 배양하였다. 이후 상등액을 취하여 96웰 플레이트에 분주한 뒤 그리스 시약(Griess buffer)과 1:1로 혼합하여 상온에서 10분간 반응시킨 후 마이크로플레이트 판독기로 550 nm에서의 흡광도를 측정한 결과를 도 1A에 나타내고 세포에 LPS(0.01μg/mL)를 처리한 양성대조군은 LPS(+), 무처리 대조군은 LPS(-)로 표시하였다.
도 1A를 살펴보면, 유산균 배양여액 동결건조물을 처리한 그룹 중 MG5303을 제외한 모든 그룹에서 NO 생성량이 무처리 대조군 LPS(-)보다 유의적으로 증가하는 것으로 나타났다.
세포독성 확인
RAW264.7 세포를 96 well plate에 1×105 cells/well이 되도록 시딩하여 37℃, 5% CO2 조건 하에서 배양하였다. 24시간 동안 배양 후 상등액을 제거한 다음, FBS free DMEM에 녹인 배양여액 동결건조물을 5 mg/mL 농도로 처리하여 24시간 배양하였다. 이 후 상등액이 제거된 세포에 MTT 시약을 0.1 mg/mL 농도로 첨가하여 2시간 반응시킨 후 상등액을 제거하고 DMSO 용액을 첨가하여 dye를 녹여준 뒤 570 nm 파장에서 흡광도를 측정한 결과 도 1의 B에서 보는 바와 같이 모든 유산균주 처리 그룹에서 세포독성이 나타나지 않음을 확인하였다.
이러한 결과를 통해, 유산균 배양여액 동결건조물의 처리가, 세포 독성 없이, NO 생성을 촉진하여 면역 활성을 증진시킬 수 있음을 확인하였다.
산화질소(NO) 생성량 억제를 통한 항염증 효과
RAW264.7 세포를 96 well plate에 1×105 cells/well이 되도록 시딩하여 37℃, 5% CO2 조건 하에서 배양하였다. 24시간 동안 배양 후 상등액을 제거한 다음, FBS free DMEM에 녹인 배양여액 동결건조물을 5 mg/mL 농도로 처리하여 24시간 배양하였다. 이 때 LPS(1μg/mL)와 병용 처리하여 염증을 유도하였다. 이후 상등액을 취하여 96웰 플레이트에 분주한 뒤 그리스 시약(Griess buffer)과 1:1로 혼합하여 상온에서 10분간 반응시킨 후 마이크로플레이트 판독기로 550 nm에서의 흡광도를 측정한 결과를 도 2A에 나타내고 상등액의 일부는 MTT 시약 반응을 통한 세포생존율을 측정하여 도 2B에 나타냈다. 세포에 LPS(1μg/mL)만 처리한 양성대조군은 LPS(+), 무처리 대조군은 LPS(-)로 표시하였다.
도 2A를 살펴보면, 유산균 배양여액 동결건조물 및 LPS를 병용 처리한 모든 그룹에서 LPS만 처리한 양성대조군 LPS(+)보다 NO 생성량이 감소하는 것으로 나타났다. 또한 도 2B를 살펴보면 유산균 배양여액 동결건조물을 처리한 모든 그룹에서 세포독성이 나타나지 않아, NO 생성량의 감소는 세포 사멸(Cell death)에 의한 것이 아님을 확인하였다.
상기 NO 생성량 변화에 따른 면역증진 효과 및 항염증 효과 그리고 유산균의 생산성을 고려하여 리모실락토바실러스 루테리(Limosilactobacillus reuteri) MG505, 3종의 리모실락토바실러스 퍼멘텀(Limosilactobacillus fermentum) MG4538, MG5091, MG5159, 락티카제이바실러스 파라카제이(Lacticaseibacillus paracasei) MG5015, 비피도박테리움 비피덤(Bifidobacterium bifidum) MG731 및 비피도박테리움 락티스(Bifidobacterium lactis) MG741로 이루어진 7 균주를 선발하였다.
실험예 1: 유산균의 면역체계 강화 효능 평가
대식세포를 이용하여 상기 실시예에서 선발한 7 균주의 면역체계 강화 효능을 규명하였다.
1-1. iNOS 및 COX-2 유전자 발현에 미치는 영향
iNOS(Inducible nitric oxide synthase)는 L-아르기닌으로부터 NO를 생성하는 효소로써 정상적인 농도에서 면역세포 활성화를 일으키는 NO를 위하여 필요한 분자이다. COX-2(Cyclooxygenase-2)는 지방산인 아라키돈산을 PGE2(Prostaglandin E2)로 전환시키는 효소로 이 반응에 의해 생성된 PGE2는 사이토카인의 생성을 조절하여 면역능력을 조절하는 역할을 한다. 7 균주의 각 배양여액 동결건조물 처리에 따른 iNOS 및 COX-2 mRNA 발현량을 각각 도 3의 A 및 B에 나타냈다.
RAW264.7 세포를 6 well plate에 2×106 cells/well이 되도록 시딩하여 37℃, 5% CO2 조건 하에서 배양하였다. 24시간 동안 배양 후 상등액을 제거한 다음, FBS free DMEM에 녹인 7 균주의 각 배양여액 동결건조물을 5 mg/mL 농도로 처리하여 24시간 배양하였다. 이 후 상등액 제거후 DPBS로 2번 세척한 다음 스크래퍼를 사용하여 세포를 수득하여 2 mL 튜브에 세포를 옮긴 후 원심분리하여 DPBS를 제거하였다. 그런 다음 RNA 추출 미니키트를 사용하여 RNA를 추출하고 추출된 RNA는 나노 드롭을 사용하여 정량하였다.
이 후 표 2와 같이 시약들을 첨가하여 혼합한 후 cDNA 합성을 진행하였다. RT-PCR 분석을 위하여 사용된 프라이머는 표 3과 같다. 특정 유전자를 증폭하기 위한 RT-PCR 반응 조건은 95℃에서 45초, 60℃에서 45초, 72℃에서 60초를 한 주기로 하여 30 cycle 동안 증폭하였다. PCR 완료 후 1% 아가로스 겔에서 전기영동하여 밴드를 확인하였다. 표적 유전자 발현량은 항존 유전자(Housekeeping)에 대한 상대적인 발현량으로 정량 후 보정하였다.
| Component | Volume/Reaction (μL) |
| 10X RT buffer | 2.0 |
| 25X dNTP Mix (100 mM) | 0.8 |
| 10X RT Random Primers | 2.0 |
| Reverse Transcriptase | 1.0 |
| Nuclease-free H2O | 4.2 |
| 1 μg RNA sample | 10.0 |
| Total cDNA synthesis per Reaction | 20.0 |
| Gene code | Sequence (5'→3') | |
| iNOS | Forward | CCCTTCCGAAGTTTCTGGCAGCAGC(서열번호1) |
| Reverse | GGCTGTCAGAGCCTCGTGGCTTTGG(서열번호2) | |
| COX-2 | Forward | CACTACATCCTGACCCACTT(서열번호3) |
| Reverse | ATGCTCCTGCTTGAGTATGT(서열번호4) | |
도 3A를 살펴보면, 선별된 7 균주의 각 배양여액 동결건조물을 처리한 각각의 그룹에서 iNOS mRNA 발현량이 유의적으로 증가하였으며 특히 MG5091은 양성대조군인 LPS 처리군(LPS+)과 비슷한 발현량을 나타내었다.
또한 도 3B를 살펴보면, 7 균주의 각 배양여액 동결건조물을 처리한 각각의 그룹에서 COX-2 mRNA 발현량이 유의적으로 증가하였고, 특히 MG505, MG5015, MG4538, MG5091 및 MG5159 배양여액을 처리한 세포에서 COX-2 mRNA 발현량이 높게 나타났다.
1-2. 사이토카인 생성에 미치는 영향
7 균주가 사이토카인 생성량에 미치는 영향을 확인하기 위해 ELISA 방법으로 생성된 사이토카인을 정량하여 도 4에 나타냈다.
구체적으로, RAW 264.7 세포를 6 well plate에 2×106 cells/well이 되도록 seeding하여 37℃, 5% CO2 조건 하에서 24시간 배양하였다. 그런 다음 FBS free DMEM에 녹인 7 균주의 각 배양여액 동결건조물을 5 mg/mL 농도로 처리하여 24시간 배양한 후 상등액을 수득하였으며, 수득한 상등액은 ELISA에 사용하였다. 포획 항체(Capture antibody)가 코팅된 96 well plate에 차단 버퍼(1% BSA in PBS)를 100 μL 첨가하여 상온에서 1시간 블로킹시켰다. 블로킹 후 세척 버퍼(0.05% Tween 20 in PBS)를 사용하여 3회 세척 후 수득한 상층액을 100 μL 첨가하여 상온에서 2시간 반응시켰다. 이 후 상층액을 제거하고 세척 용액을 이용하여 3회 세척한 다음 검출 항체를 첨가한 후 상온에서 2시간 반응시켰다. 다시 한번 3회 세척 후 스트렙타비딘-HRP를 100 μL 첨가하여 상온에서 20분간 암반응시켰다. 이 후에 기질 용액 (2NH2SO4)을 첨가한 후 20분간 효소 반응시킨 뒤 정지용액을 넣어주어 반응을 종결시켰다. 종결된 반응액은 450 nm 파장에서 흡광도를 측정하였다.
도 4의 A를 살펴보면, LPS를 처리한 양성대조군의 TNF-α 발현량은 높게 나타났고 7 균주의 각 배양여액 동결건조물을 처리한 모든 그룹은 TNF-α의 생성이 대조군(LPS-)보다 유의적으로 높았다. 특히 MG505, MG5091 및 MG5159를 처리한 세포의 TNF-α 발현량이 가장 높았다. 도 4의 B를 살펴보면 IL-6 또한 LPS를 처리한 경우 높게 생성하였고, 7 균주의 각 배양여액 동결건조물을 처리한 모든 그룹에서 IL-6의 생성이 대조군(LPS-)보다 유의적으로 높았다. 도 4의 C를 살펴보면 IL-1β의 경우, 7 균주의 각 배양여액 동결건조물을 처리한 결과 대조군(LPS-)에 비해 MG505, MG4538, MG5091 및 MG5159의 IL-1β 발현량이 유의하게 증가하는 것으로 나타났다.
1-3. 면역반응 신호전달 경로에 미치는 영향
7 균주가 면역체계 강화 효능을 유도하는 메커니즘과 연관된 단백질들의 발현에 미치는 영향을 확인하기 위하여 웨스턴 블롯을 실행한 결과를 도 5에 나타냈다.
구체적으로, 7 균주의 각 배양여액 동결건조물을 24시간 처리한 후 RAW 264.7 세포를 PBS로 세척한 다음 프로테아제 칵테일을 첨가한 RIPA 용해 완충액 (0.5 M 트리스-HCl, pH 7.4, 1.5 M 염화나트륨, 2.5% 데옥시콜산, 10% NP-40, 10 mM EDTA)를 처리하여 얼음에 20분간 방치하였다. 회수한 세포를 12,000 rpm, 4℃에서 20분간 원심분리 후 상층액을 회수하여 단백질 양을 정량하였다. 각 lysate를 취하여 10% SDS 로딩버퍼(100 mM 트리스-HCl, pH 6.8, 20% 글리세롤, 200 mM β-메르캅토에탄올, 10% SDS, 0.2% (w/v) 브로모페놀 블루)와 섞어 10% SDS 폴리아크릴아마이드 겔에 전기영동하여 단백질을 분리시켰다. 분리된 단백질을 PVDF 멤브레인에 이동한 후 5% 탈지유가 첨가된 TBST(트리스 완충 식염수 트윈) 버퍼로 실온에서 블로킹시켰다. 블로킹 후 1차 항체를 1:1000 희석하여 반응시키고 TBST 버퍼로 3회 세척 후 항-염소 2차 항체(1 : 2000 희석)를 1시간 이상 반응시킨 후 TBST 버퍼로 3회 세척 후 ECL 검출 키트를 이용하여 현상하였다.
도 5의 A를 살펴보면, 7 균주의 각 배양여액 동결건조물 처리 시 대조군보다 TLR2, ERK 및 NF-kB의 인산화가 모두 높게 발현되는 것으로 나타났다. 도 5B의 ERK에서는 MG5091 및 MG5159 처리군이 높은 인산화를 유도하고, 도 5C의 NF-kB에서는 MG4538, MG5015, MG5091 및 MG5159 처리군이 대조군보다 유의적으로 높은 인산화를 나타냈으며, 양성대조군인 LPS(+)보다 더 높게 발현되었다. 도 5D의 TLR2의 발현량은 7 균주의 각 배양여액 동결건조물 처리 시 대조군에 비해 모두 증가하였으며, MG731, MG5015 및 MG5159의 발현량이 가장 높게 증가하여 양성대조군 LPS(+)보다도 높은 발현량을 나타냈다.
상기 면역반응 사이토카인 및 면역반응 신호전달 경로 활성의 결과를 종합해 보았을 때 MG4538, MG5091 및 MG5159의 높은 면역증진 효과를 기대할 수 있는 것으로 나타났다.
1-4. 식세포 작용에 미치는 영향
대식세포는 다양한 물질들에 대한 수용체를 보유하고 있으며, 이 수용체는 병원균이나 이물질 등과 반응하여 이들을 제거하기 위한 식균작용(Phagocytosis)을 일으킨다. 이러한 식균작용은 면역 반응을 높일 수 있다.
RAW264.7 세포를 24 well plate에 1×105 cells/well이 되도록 시딩하여 37℃, 5% CO2 조건 하에서 배양하였다. 24시간 동안 배양 후, FBS free DMEM에 녹인 7 균주의 각 배양여액 동결건조물을 5 mg/mL 농도로 처리하여 24시간 배양하였다. 이 후 상등액 제거후 DPBS로 2회 세척한 다음 0.01% 중성 적색 용액을 첨가하여 상온에서 2시간 반응시켰다. 염색 후 DPBS로 1회 세척한 다음 용해 완충액(아세트산:에탄올=1:1 (v/v))를 첨가하여 세포를 용해시킨 후 540 nm 파장에서 흡광도를 측정하여 도 6에 나타냈다.
도 6에서 보는 바와 같이 7 균주의 각 배양여액 동결건조물을 처리한 모든 그룹에서 식균작용이 유의적으로 증가하여 면역 기능 증진 효과를 기대할 수 있는 것으로 확인하였다. 특히 MG5015를 제외한 나머지 그룹은 양성대조군인 LPS(+)과 동등 이상의 식균작용을 나타내었다.
실험예 2: 유산균의 NK 세포 활성도 평가
인간자연살해세포(NK-92)를 이용하여 7 균주의 면역체계 강화 효능을 규명하였다.
2-1. NK-92 세포 증식 효과
NK-92 세포(ATCC, 미국)를 96 well plate에 1×104 cells/well이 되도록 시딩하여 37℃, 5% CO2 조건 하에서 24시간 배양하였다. 24시간 동안 배양 후 상등액을 제거한 다음, FBS free DMEM에 녹인 7 균주의 각 배양여액 동결건조물을 5 mg/mL 농도로 처리하여 24시간 배양하였다. 이 후 CCK-8 용액 10 μL를 첨가하여 3시간 반응시킨 후 450 nm 파장에서 흡광도를 측정한 결과를 도 7에 나타냈다. 양성대조군으로 IL-2를 처리하여 7 균주의 증식효과와 비교하였다.
도 7을 살펴보면 MG4538, MG5091 및 MG5159 처리 시 대조군(Control)보다 높은 증식 효과를 나타냈으며 특히 MG4538 및 MG5091 처리군은 양성대조군인 IL-2보다 더 높은 증식 효과를 나타냈다.
2-2. Granzyme B 발현 효과
7 균주의 각 배양여액 동결건조물을 24시간 처리한 후 NK-92 세포를 PBS로 세척한 다음 프로테아제 칵테일을 첨가한 RIPA 용해 완충액(0.5 M 트리스-HCl, pH 7.4, 1.5 M 염화나트륨, 2.5% 데옥시콜산, 10% NP-40, 10 mM EDTA)를 처리하여 얼음에 20분간 방치하였다. 회수한 세포를 4℃에서 12,000 rpm으로 20분간 원심분리 후 상층액을 회수하여 단백질을 추출하였다. 그런 다음 단백질 정량하여 웨스턴 블롯을 수행한 결과, 도 8에서 보는 바와 같이 MG5015를 제외한 유산균주가 대조군(Control)보다 유의적으로 높은 granzyme B 발현량을 나타냈으며 양성대조군인 IL-2 처리군보다도 높은 발현량을 나타냈다.
실험예 3: 유산균의 표적세포에 대한 독성 효과
NK-92 세포를 96 well plate에 1×104 cells/well이 되도록 시딩하여 37℃, 5% CO2 조건 하에서 24시간 배양하였다. 24시간 동안 배양 후 상등액을 제거한 다음, FBS free DMEM에 녹인 7 균주의 각 배양여액 동결건조물을 5 mg/mL 농도로 처리하여 16시간 배양하였다. 이 후 원심분리(4℃, 4분, 1,600 rpm)하여 기존의 배지를 제거하고 새로운 배지로 세척하였다. 그런 다음, 표적세포 K562 세포(한국세포주은행, 한국)를 96 well plate에 5×103 cells/well로 시딩 후 3시간 배양하였다. 3시간 배양 후 세포에 용해 완충액을 첨가하고 1시간 더 배양을 진행하였다. 이 후 원심분리(4℃, 4분, 1,600 rpm)하여 상층액 50 μL를 새로운 plate에 옮기고 CytoTox96ⓡ 시약 50 μL를 첨가하여 암실에서 30분간 반응시켰다. 30분 후 정지 용액 50 μL를 처리하여 반응을 종결시킨 후 490 nm 파장에서 흡광도를 측정한 결과를 도 9에 나타냈다. 양성대조군으로 IL-2를 처리한 NK-92 세포를 이용하여 7 균주의 표적세포 사멸효과와 비교하였다.
도 9를 살펴보면 MG505, MG4538, MG5015, MG5091 또는 MG5159를 처리한 NK-92 세포는 K562 세포에 대해 아무것도 처리하지 않은 NK-92 세포(Control)보다 현저히 높은 독성을 나타내었다. 상기 균주들은 실험예 2-1에서 NK-92 세포의 증식 효과가 높았던 MG4538, MG5015, MG5091 및 MG5159 처리군으로 확인되어 상기 유산균의 NK 세포 활성 증진에 의해 표적세포에 대한 사멸효과가 높게 나타난 것으로 확인되었다.
실험예 4: 유산균의 프로바이오틱스 특성 평가
선별된 7 균주를 대상으로 프로바이오틱스로서의 사용을 위하여 탄소원 이용성, 효소 활성, 항생제 감수성, 용혈성, 내산성 및 내담즙성 검사를 수행하였다.
4-1. 효소 활성
유산균이 생산하는 효소 및 효소 활성을 확인하기 위하여 총 19종의 효소활성을 측정할 수 있는 API ZYM 키트를 사용하여 분석하였다. 7 균주를 각 MRS 평판 배지에 획선도말하여 37℃에서 24시간 배양한 뒤, 생성된 집락을 MRS 액체배지에 접종하여 18시간 배양하였다. 이후 배양액을 원심분리(4000Ⅹg, 4℃, 5분)하고 균체를 수득하여, PBS로 2회 세척하였다. 세척한 균체는 2 mL 현탁배지에 재부유하고, 5-6 McFarland 탁도로 조정하여 API ZYM 스트립의 각 튜브에 60 ㎕씩 분주하고, 37℃에서 4시간 동안 배양하였다. 이후 ZYM A 및 ZYM B 시약을 각 튜브에 각각 한 방울씩 떨어뜨리고 10분간 실온에서 반응시킨 뒤 색 변화를 통해 효소 활성을 확인하였다.
효소 활성 평가는 표준 색상표를 비교하여 색의 변화 정도에 따라 0~5의 수치로 표시하였으며, 0은 음성반응, 3 이상일 경우 양성으로 판정하였다. 그 결과 표 4에 나타낸 바와 같이 선별된 7 균주 모두 상이한 효소 활성을 나타냄을 확인하였다.
| Enzyme assayed for | MG4538 | MG505 | MG731 | MG741 | MG5015 | MG5091 | MG5159 |
| Control (Negative) | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 |
| Alkaline phosphatase | 0 | 1 | 4 | 1 | 0 | 0 | 0 |
| Esterase (C4) | 1 | 1 | 1 | 0 | 0 | 1 | 2 |
| Esterase Lipase (C8) | 2 | 1 | 1 | 0 | 0 | 1 | 1 |
| Lipase (C14) | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 |
| Leucine arylamidase | 3 | 3 | 3 | 4 | 3 | 2 | 3 |
| Valine arylamidase | 1 | 2 | 0 | 0 | 3 | 0 | 0 |
| Cystine arylamidase | 1 | 0 | 0 | 1 | 0 | 1 | 0 |
| Trypsin | 0 | 0 | 1 | 0 | 0 | 0 | 0 |
| α-chymotrypsin | 0 | 0 | 0 | 1 | 0 | 0 | 0 |
| Acid phosphatase | 2 | 5 | 4 | 0 | 1 | 1 | 1 |
| Naphthol-AS-BI-phosphohydrolase | 1 | 3 | 2 | 4 | 1 | 1 | 1 |
| α-galactosidase | 5 | 0 | 3 | 2 | 0 | 5 | 3 |
| β-galactosidase | 5 | 3 | 5 | 3 | 1 | 5 | 5 |
| β-glucuronidase | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 |
| α-glucosidase | 4 | 1 | 3 | 2 | 1 | 0 | 5 |
| β- glucosidase | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 5 | 0 |
| N -acetyl -β- glucosaminidase | 0 | 0 | 5 | 0 | 0 | 0 | 0 |
| α-mannosidase | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 |
| α-fucosidase | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 |
대표적으로 MG5091 균주는 β-글루코시다아제(β- glucosidase) 효소 활성을 나타내고 α-글루코시다아제(α- glucosidase) 효소는 생산하지 않는 특성을 나타냈다.
공통적으로는 MG4538, MG731, MG5091 및 MG5159 균주는 루신 아릴아미다제(leucine arylamidase), 발린 아릴아미다제(valine arylamidase) 또는 시스틴 아릴아미다제(cystine arylamidase) 계열의 프로테아제 효소 활성 및 에스테라아제 리파아제(Esterase Lipase)( C8 ) 등의 효소 활성을 나타내고, β-갈락토시다제(β-galactosidase) 등의 효소 활성이 높게 나타나 유당을 분해하여 소화시키는 이점이 높을 것으로 확인되었다. 또한 α-갈락토시다제(α-galactosidase)의 높은 효소 활성을 나타내 난소화성 탄수화물의 분해를 용이하게 할 것으로 확인되었다.
아울러 7 균주 모두 벤조피렌(Benzopyrene)을 발암성 물질로 전환시킬 수 있는 베타-글루쿠로니다제(β-glucuronidase)를 생성하지 않는 것으로 나타나 프로바이오틱스 안정성을 확인하였다.
4-2. 항생제 감수성
선별된 7 균주를 MRS broth에 37℃에서 18시간 배양한 후 균액을 0.85% NaCl에 0.5 Mcfarland 탁도에 맞춰 희석하였다. 멸균된 면봉을 희석액에 담갔다가 꺼내어 BHI 평판배지에 균주를 도말하였다. 배지 표면을 5분간 건조시킨 다음 항생제 스트립을 평판배지 가운데에 놓은 후 37℃에서 24시간 동안 배양하였다. 배양 후 육안관찰을 통해 스트립을 따라 생성된 억제환과 스트립이 만나는 지점을 항생제 최소저해농도(MIC) 값으로 판독하였다. 판독은 EFSA (European Food Safety Authority)에서 발표한 기준에 따라 감수성이 있으면 sensitive (S), 저항성을 나타내면 resistant (R), 항생제 테스트가 필요 없는 경우는 not require (n.r.)로 표시하여 표 5에 나타냈다.
| Antimicrobials | MG4538 | MG505 | MG731 | MG741 | MG5015 | MG5091 | MG5159 |
| 암피실린 Ampicillin(AM) | S | S | S | S | S | S | S |
| 겐타마이신 Gentamicin(GM) |
S | S | R | R | S | S | S |
| 카나마이신 Kanamycin(K) |
S | S | n.r. | n.r. | S | S | S |
| 스트렙토마이신 Streptomycin(S) |
S | S | S | R | S | S | S |
| 테트라사이클린 Tetracycline(TC) |
S | R | S | S | S | S | S |
| 클로람페니콜 Chloramphenicol(C) |
S | R | S | S | S | S | S |
| 에리스로마이신 Erythromycin(E) |
S | S | S | S | S | S | S |
| 반코마이신 Vancomycin(VA) |
n.r. | n.r. | S | S | n.r. | n.r. | n.r. |
| 클린다마이신 Clindamycin |
S | S | S | S | S | S | S |
판독 결과, 테스트된 모든 항생제에 대해 감수성을 나타내는 것으로 확인된 균주는 MG4538, MG5015, MG5091 및 MG5159 균주로 나타났다. MG505 균주의 경우, 테트라사이클린 및 클로람페니콜에 대해 내성을 나타내었으며, MG731은 젠타마이신, MG741은 젠타마이신 및 스트렙토마이신에 대해 내성을 나타내었다.
4-3. 용혈성
유산균의 비병원성을 확인하기 위하여, 선별된 7 균주를 MRS 배지에서 3회 계대 배양하여 활성을 높인 후, 5%(w/v) 혈액이 함유된 Columbia 한천 배지에 획선도말 하였다. 이후, 37℃에서 48시간 배양한 후 생성된 집락 주변에 생성되는 환을 확인하였다. 용혈성은 크게 3가지로 분류되는데 베타 용혈(β-hemolysis)은 완전한 용해로 배양 후 집락 주변에 투명환을 생성하고, 알파 용혈(α-hemolysis)은 부분적 용해로 배양 후 집락 주변을 녹회색으로 변화시키며 감마 용혈(γ-hemolysis)은 용혈을 일으키지 않아 배양 후 집락 주변에 아무런 변화를 일으키지 않기 때문에 이러한 기준에 따라 용혈성을 판독하였다.
도 10에서 보는 바와 같이 7 균주 모두 용혈성 배지에서 투명환이 생성되지 않고 용혈성을 나타나지 않아 감마 용혈(γ-hemolysis)로 판정됨에 따라 프로바이오틱스로서의 안정성이 확인되었다.
4-4. 내산성 및 내담즙성
인간의 장내 환경과 유사한 조건에서 7 균주의 생존력을 평가하기 위해 내산성 및 내담즙성 시험을 진행하였다. 7 균주를 MRS 평판배지에 획선도말하여 37℃에서 24시간 배양한 뒤, 생성된 콜로니를 MRS 액체배지에 접종하고, 37℃에서 18시간 동안 배양하였다. 이후 배양액을 원심분리(4000Ⅹg, 4℃, 5분)하여 균체를 PBS (pH 7.4)로 2회 세척하였다. 세척한 균체는 PBS에 107~108 CFU/mL로 재현탁하여 균주 희석액을 제조하였다.
내산성 시험에 사용한 인공위액(SGF, Simulated Gastric Fluid)은 1 NHCl을 이용하여 pH 3.0, 4.0으로 조정한 0.1M 인산완충액(0.1M Phosphate buffer)에 펩신을 3 g/L의 농도로 첨가하여 제조하였으며, 내담즙성 시험에 사용한 인공장액(SIF, Simulated Intestinal Fluid)은 1 N NaOH를 사용하여 pH 7.0 내지 8.0으로 조정한 멸균 PBS에 최종 농도가 1 g/L가 되도록 판크레아틴(Sigma-Aldrich, 미국)을 첨가하여 제조하였다.
9 mL 인공위액 또는 인공장액에 1 mL 균주 희석액을 각각 첨가한 후, 37℃ 배양기에 정치하면서 일정시간마다 시료를 채취하였고 십진희석법으로 희석한 다음 일정농도의 희석액을 MRS 평판배지에 도말하여 생균수를 확인하는 방법으로 7균주의 생존력을 평가하여 내산성 결과는 도 11, 내담즙성 결과는 도 12에 나타냈다.
먼저 도 11을 살펴보면 pH 3 조건에서 낮은 생존율을 나타낸 MG731을 제외한 나머지 균주들은 모두 pH 3 또는 pH 4 조건에서 우수한 내산성을 나타내었다. 7 균주의 내담즙성 또한 도 12에서 보는 바와 같이 모두 우수하게 나타났다.
4-5. 탄소원 이용성
실험예 2에서 선천면역 기능 증진 효과를 확인한 MG505, MG4538, MG5015, MG5091 및 MG5159의 탄소원 이용성을 API 50 CHL Kit를 이용하여 당 발효 시험으로 분석하였다. 하기 표 6은 상기 5 균주의 탄소원 이용성 결과를 나타낸 것이다. 탄소원 이용성이 양성인 경우 ‘+’, 탄소원 이용성이 음성인 경우 ‘-’로 표시하였다.
| Substrate | MG4538 | MG505 | MG5015 | MG5091 | MG5159 | |
| 0 | Control (Negative) | - | - | - | - | - |
| 1 | Glycerol | - | - | - | - | - |
| 2 | Erythritol | - | - | - | - | - |
| 3 | D-arabinose | - | - | - | - | - |
| 4 | L-arabinose | - | + | + | + | + |
| 5 | D-ribose | + | + | + | + | + |
| 6 | D-xylose | + | - | - | - | + |
| 7 | L-xylose | - | - | - | - | - |
| 8 | D-adonitol | - | - | - | - | - |
| 9 | Methyl-β D-xylopyranoside | - | - | - | - | - |
| 10 | D-galactose | + | + | + | + | + |
| 11 | D-glucose | + | + | + | + | + |
| 12 | D-fructose | + | - | + | + | + |
| 13 | D-mannose | + | - | + | - | + |
| 14 | L-sorbose | - | - | + | - | + |
| 15 | L-rhamnose | - | - | - | - | - |
| 16 | Dulcitol | - | - | - | - | - |
| 17 | Inositol | - | - | - | - | - |
| 18 | D-mannitol | - | - | + | - | + |
| 19 | D-sorbitol | - | - | + | - | + |
| 20 | Methyl-α D-Mannoside | - | - | - | - | - |
| 21 | Methyl-α D-glucoside | - | - | - | - | + |
| 22 | N-acethyl-glucosamine | - | - | + | - | + |
| 23 | Amygdalin | - | - | + | - | + |
| 24 | Arbutin | - | - | + | - | + |
| 25 | Esculin | + | + | + | + | + |
| 26 | Salicin | - | - | + | - | + |
| 27 | D-cellobiose | - | - | + | - | + |
| 28 | D-maltose | + | + | + | + | + |
| 29 | D-lactose | + | + | + | - | + |
| 30 | D-melibiose | + | + | + | + | + |
| 31 | D-sucrose | + | + | + | + | + |
| 32 | D-trehalose | + | - | + | + | + |
| 33 | Inulin | - | - | + | - | + |
| 34 | D-melezitose | - | - | + | - | + |
| 35 | D-raffinose | + | + | + | + | + |
| 36 | Starch | - | - | - | - | - |
| 37 | Glycogen | - | - | - | - | - |
| 38 | Xylitol | - | - | - | - | - |
| 39 | Gentiobiose | - | - | + | - | + |
| 40 | D-turanose | - | - | + | - | + |
| 41 | D-lyxose | - | - | + | - | + |
| 42 | D-tagatose | - | - | + | - | + |
| 43 | D-fucose | - | - | - | - | - |
| 44 | L-fucose | - | - | - | - | - |
| 45 | D-arabitol | - | - | - | - | - |
| 46 | L-arabirol | - | - | + | - | + |
| 47 | Gluconate | + | + | + | + | + |
| 48 | 2-keto-gluconate | - | - | - | - | - |
| 49 | 5-keto-gluconate | - | - | + | + | + |
이상으로 상기 실시예 및 실험예를 통해, 선별된 7 균주의 면역반응 사이토카인 및 세포신호전달 경로의 활성, 식균작용, NK 세포 활성도로 평가된 선천면역 기능 증진성 그리고 프로바이오틱스 활용을 위한 안정성을 종합적으로 고려한 결과, 특히 Limosilactobacillus fermentum MG4538, Limosilactobacillus fermentum MG5091 및 Limosilactobacillus fermentum MG5159 균주의 높은 유용성을 확인하였다.
구체적으로 상기 세 균주는 대식세포인 RAW264.7 세포에서 선천면역에 관여하는 분자들 및 식균작용을 우수하게 유도하였으며, 인간자연살해세포인 NK-92 세포의 활성화를 유의적으로 증가시켰고 이는 NF-κB 신호전달 경로 또는 MAPK 신호전달 기전을 통해 활성화되는 것임을 확인하였다. 또한 상기 균주들은 프로바이오틱스 선정기준에 적합하면서 우수한 특성을 나타내 면역체계 증진 프로바이오틱스로서 유용하게 활용될 수 있다.
Claims (12)
- 식세포작용(Phagocytosis) 증가; NK 세포(Natural killer) 활성 증가; TNF-α, IL-1β, IL-6, iNOS 또는 COX-2 의 사이토카인 생성 증가; 및 MARK/ERK 또는 NF-κB 신호전달경로 활성 증가; 로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나 이상에 의한 면역 증진 활성을 유도하는 수탁번호 KCTC14947BP로 기탁된 리모실락토바실러스 퍼멘텀(Limosilactobacillus fermentum) MG5159 균주.
- 삭제
- 제1항에 있어서, 상기 균주는 항생제 감수성, γ-용혈 활성, 내산성 및 내담즙성으로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 프로바이오틱스 특성을 갖는 것을 특징으로 하는 리모실락토바실러스 퍼멘텀 MG5159 균주.
- 제3항에 있어서, 상기 항생제 감수성은 암피실린(Ampicillin), 겐타마이신(Gentamicin), 카나마이신(Kanamycin), 스트렙토마이신(Streptomycin), 테트라사이클린(Tetracycline), 클로람페니콜(Chloramphenicol), 에리스로마이신(Erythromycin) 및 클린다마이신(Clindamycin)으로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상에 대한 감수성인 것을 특징으로 하는 리모실락토바실러스 퍼멘텀 MG5159 균주.
- 제1항에 있어서, 상기 균주는 D-아라비노스(L-arabinose), D-리보스(D-ribose), D-자일로스(D-xylose), D-갈락토스(D-galactose), D-글루코스(D-glucose), D-프락토스(D-fructose), D-만노스(D-mannose), L-소르보스(L-sorbose), D-만니톨(D-mannitol), D-소르비톨(D-sorbitol), 메틸-α D-글루코시드(Methyl-α D-glucoside), N-아세틸-글루코사민(N-acethyl-glucosamine), 아마이그달린(Amygdalin), 아르부틴(Arbutin), D-에스쿨린(Esculin), 살리신(Salicin), D-셀로비오스(D-cellobiose), D-말토스(D-maltose), D-락토스(D-lactose), D-멜리비오스(D-melibiose), D-슈크로스(D-sucrose), D-트레알로스(D-trehalose), 이눌린(Inulin), D-멜레지토스(D-melezitose), D-라피노스(D-raffinose), 겐티오비오스(Gentiobiose), D-투라노스(D-turanose), D-리소오스(D-lyxose), D-타가토스(D-tagatose), L-아라비톨(L-arabirol), 글루코네이트(Gluconate) 및 5-케토-글루코네이트(5-keto-gluconate)로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상을 탄소원으로 이용하는 것을 특징으로 하는 리모실락토바실러스 퍼멘텀 MG5159 균주.
- 제1항에 따른 수탁번호 KCTC14947BP로 기탁된 리모실락토바실러스 퍼멘텀(Limosilactobacillus fermentum) MG5159 균주 또는 이의 배양물을 포함하는 면역 증진 활성용 프로바이오틱스 조성물.
- 제6항에 있어서, 상기 균주는 면역증진 활성, 항생제 감수성, γ-용혈 활성, 내산성 또는 내담즙성을 갖는 것을 특징으로 하는 면역 증진 활성용 프로바이오틱스 조성물.
- 제1항에 따른 수탁번호 KCTC14947BP로 기탁된 리모실락토바실러스 퍼멘텀(Limosilactobacillus fermentum) MG5159 균주, 이의 배양물 또는 이의 파쇄물을 포함하는 면역 증진용 조성물.
- 제8항에 있어서, 상기 조성물은 약학 조성물, 식품 조성물, 사료 조성물로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나인 것인 면역 증진용 조성물.
- 제8항에 있어서, 상기 면역 증진은 식세포작용(Phagocytosis) 증가; NK 세포(Natural killer) 활성 증가; TNF-α, IL-1β, IL-6, iNOS 또는 COX-2 의 사이토카인 생성 증가; 또는 MARK/ERK 또는 NF-κB 신호전달경로 활성 증가; 를 통해 이루어지는 것을 특징으로 하는 면역 증진용 조성물.
- 제1항에 따른 수탁번호 KCTC14947BP로 기탁된 리모실락토바실러스 퍼멘텀(Limosilactobacillus fermentum) MG5159 균주, 이의 배양물 또는 이의 파쇄물을 포함하는 면역 증진용 건강기능식품.
- 제1항에 따른 수탁번호 KCTC14947BP로 기탁된 리모실락토바실러스 퍼멘텀(Limosilactobacillus fermentum) MG5159 균주, 이의 배양물 또는 이의 파쇄물을 포함하는 면역 증진용 사료 첨가제.
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|---|---|---|---|---|
| KR101488770B1 (ko) * | 2013-09-12 | 2015-02-04 | (주) 피엘바이오 | 한국 장수마을의 장수인에게서 개발한 락토바실러스 퍼멘텀 ｐｌ９０３６ |
| KR20180014316A (ko) * | 2016-07-29 | 2018-02-08 | (주) 피엘바이오 | 다양한 생리활성과 열 안정성이 우수한 프로바이오틱 락토바실러스 퍼멘텀 pl9119 |
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2022
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