KR101501210B1

KR101501210B1 - 항-염증 활성이 우수한 신규 균주

Info

Publication number: KR101501210B1
Application number: KR1020120084135A
Authority: KR
Inventors: 김근배; 최재경
Original assignee: 중앙대학교 산학협력단
Priority date: 2012-07-31
Filing date: 2012-07-31
Publication date: 2015-03-11
Also published as: KR20140017754A

Abstract

본 발명은 락토바실러스 카제이 (Lactobacillus casei) MCL 균주(KCCM 11290P), 이의 배양 추출물 또는 이에 의해 발효된 우유 발효물을 유효성분으로 포함하는 염증 억제용 조성물, 상기 균주를 우유에 접촉시키는 단계를 포함하는 염증 억제 활성을 가지는 발효유 제조방법 및 상기 균주를 유효성분으로 포함하는 염증 억제 활성을 가지는 발효유 제조용 스타터 배양(starter culture) 조성물에 관한 것이다.
본 발명의 균주는 다양한 염증 유발인자의 발현을 유의하게 감소시키고 항-염증 인자의 발현을 크게 증가시킴으로써 면역조절 이상으로 인한 염증성 질환의 예방, 치료 또는 개선용 조성물로 유용하게 이용될 수 있다.

Description

항-염증 활성이 우수한 신규 균주{Novel Bacterial Strains Having Excellent Anti-inflammatory Activity}

본 발명은 항-염증 활성이 우수한 락토바실러스 카제이 (Lactobacillus casei) MCL 균주(KCCM 11290P) 및 이를 포함하는 염증 억제용 조성물에 관한 것이다.

많은 위장관 질환이 프로바이오틱스에 의한 장 점막의 기능 변화 및 장내 미생물군(microflora)의 안정성 변화와 관련되어 있다는 사실은 잘 알려져 있기 때문에, 프로바이오틱스를 함유하는 발효 유제품이 건강에 도움을 주는 새로운 기능성 식품으로 이용될 수 있을지를 조사하는 것은 흥미로운 일이다. 프로바이오틱스(Probiotics)란 살아있는 미생물 식품 성분으로, 적당량이 대상체에 투여되었을 때 대상체에 건강 상의 이점을 제공하는 성분을 의미한다(WHO/FAO 2002). 젖산-생산 박테리아는 장내 환경을 개선시킴으로써 다양한 이로운 효과를 제공하므로, 이들은 프로바이오틱스로 정의된다.

젖산 박테리아(Lactic acid bacteria, 유산균)는 장내 미생물군의 균형 유지, 혈청 콜레스테롤의 감소, 면역강화 활성 및 GABA(γ-aminobutyric acid)의 생산과 같은 건강 및 영양적 이점을 제공하므로 프로바이오틱스 미생물로 널리 사용된다(Gilliland and Walker, 1990; Fuller, 1993; Sanders, 1993). 아울러, 프로바이오틱스의 항-염증 활성에 대한 증거가 많은 연구에서 제시되고 있다(Lee et al., 2008; Menard et al., 2004 Tienet al., 2006).

프로바이오틱스 중 L. casei 균주는 발효 농산물 뿐 아니라, 천연 또는 발효 유제품, 위장관 및 인간과 동물의 생식계에서 분리된다(Kandler and Weiss, 1986). L. casei YIT 9029 균주는 전형적인 프로바이오틱스로서, 그 면역조절 활성이 심도있게 연구된 바 있다(de Waardet al., 2001; Kato et al., 1984;Matsubuchiet al., 2003; Matsumoto et al., 2005). 이 균주는 방광암 환자를 대상으로 한 임상실험에서 긍정적인 결과를 나타내었으며(Kakizoe, 2000), 정확한 기작은 밝혀지지 않았지만 직장암에서 이형성(atypia)을 억제하는 것으로 나타났다(Ishijawaet al., 2005).

염증은 개체의 면역계가 침입 병원균 같은 유해성분에 대응하고자 할 때 발생한다(Henderson et al., 1996; Ulevitch and Tobias, 1995). 면역조절 세포, 사이토카인 및 아폽토시스가 포함된 면역조절 기작은 병원균을 막기 위한 과도한 반응으로 발생하는 면역반응을 조절한다. 이러한 메카니즘이 결핍될 경우 IBD를 비롯한 다양한 염증 질환으로 나타난다. LPS(lipopolysaccharides), LTA(lipoteichoic acid) 및 펩티도글리칸과 같은 박테리아 성분에 의해 촉발된 사이토카인의 생산은 전신성 염증반응 증후군(systemic inflammatory response syndrome)에 이르게 할 수 있다. LPS는 내재 면역계의 세포들을 활성화하여 다양한 IL-1(interleukin-1), IL-6, IL-8 및 TNF-α 같은 염증성 사이토카인 및 NO를 생산하도록 한다(Waiet al., 2004). NO는 NOS(NO synthase) 동효소(isoenzyme) 패밀리에 의해 L-아르기닌으로부터 합성되는 반응성이 높은 분자이다(Coleman, 2001). 대식세포에 존재하는 동효소는 유도가능 형태(inducible NOS, iNOS)로서 박테리아 엔도톡신, LPS 또는 TNF-α, IFN-γ, IL-1 및 IL-6를 포함하는 다른 염증유발 사이토카인에 의한 자극을 통해 많은 세포에서 고농도의 NO를 생성할 수 있다(Nathan, 1994; Stuehr and Marlette, 1985; Stuehr and Marlette, 1987). 몇몇 염증성 질환 중에서, 염증성 장질환(inflammatory bowel diseases, IBD)은 유산균과 밀접한 연관이 있다(Lee et al., 2008). IBD 환자는 복부통증, 설사, 장폐색증, 및/또는 혈변을 겪을 수 있다. 지금까지, 항-염증제, 스테로이드 또는 항-TNF 제제가 효과적으로 증상을 완화하는 것으로 알려졌지만, IBD에 대한 근본적인 의학적 치료방법은 아직 알려진 바가 없다(Hanauer, 2002; Macdonald and Monteleone, 2005).

이에, 본 발명에서는 L. casei 의 NO 억제능력과 사이토카인 발현 프로파일을 조사함으로써 균주의 면역조절능력을 확인하고자 하였다.

본 명세서 전체에 걸쳐 다수의 논문 및 특허문헌이 참조되고 그 인용이 표시되어 있다. 인용된 논문 및 특허문헌의 개시 내용은 그 전체로서 본 명세서에 참조로 삽입되어 본 발명이 속하는 기술 분야의 수준 및 본 발명의 내용이 보다 명확하게 설명된다.

본 발명자들은 면역 반응을 효율적으로 조절함으로써 염증성 장질환(inflammatory bowel diseases, IBD)을 비롯한 다양한 염증성 질환에 대해 예방, 치료 또는 개선 효과를 가지는 프로바이오틱스 조성물을 발굴하기 위하여 예의 연구 노력하였다. 그 결과, 염증 유도인자의 발현을 유의하게 감소시키면서 항-염증 인자의 발현은 크게 증가시키는 신규 균주인 락토바실러스 카제이(Lactobacillus casei) MCL 균주(KCCM 11290P)를 분리해냄으로써, 본 발명을 완성하게 되었다.

따라서 본 발명의 목적은 염증 억제용 조성물을 제공하는 데 있다.

본 발명의 다른 목적은 염증 억제 활성을 가지는 발효유 제조방법을 제공하는 데 있다.

본 발명의 또 다른 목적은 염증 억제 활성을 가지는 발효유 제조용 스타터 배양(starter culture) 조성물을 제공하는 데 있다.

본 발명의 다른 목적 및 이점은 하기의 발명의 상세한 설명, 청구범위 및 도면에 의해 보다 명확하게 된다.

본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 락토바실러스 카제이 (Lactobacillus casei) MCL 균주(KCCM 11290P), 이의 배양 추출물 또는 이에 의해 발효된 우유 발효물을 유효성분으로 포함하는 염증 억제용 조성물을 제공한다.

본 발명자들은 면역 반응을 효율적으로 조절함으로써 염증성 장질환(inflammatory bowel diseases, IBD)을 비롯한 다양한 염증성 질환에 대해 예방, 치료 또는 개선 효과를 가지는 프로바이오틱스 조성물을 발굴하기 위하여 예의 연구 노력하였다. 그 결과, 염증 유도인자의 발현을 유의하게 감소시키면서 항-염증 인자의 발현은 크게 증가시키는 신규 균주인 락토바실러스 카제이(Lactobacillus casei) MCL 균주(KCCM 11290P)를 분리해냈다.

본 발명에 따르면, 본 발명자들은 200 종이 넘는 젖산(lactic acid) 박테리아를 원유(raw milk) 및 건강한 인간의 분변으로부터 분리한 뒤 이들 중 탈지유 배지에서 우수한 성장능 및 산 생산능을 가지는 균주를 선별하여, API 탄수화물 발효 패턴 및 16S rDNA 서열분석을 통해 락토바실러스 카제이(Lactobacillus casei)로 동정하였다. 최종 선별된 균주는“Lactobacillus casei MCL”이라 명명하여 한국미생물보존센터(KCCM)에 2012년 7월 2일자로 기탁하였고, 기탁번호 KCCM 11290P를 부여받았다. 상기 균주는 하기 실시예에서 보는 바와 같이 LPS (lipopolysaccharide)-자극된 RAW 264.7 세포에 의한 NO(nitric oxide) 생산을 크게 억제하였으며, COX-2, iNOS, TNF-α, IL-1β 및 IL-6의 발현을 감소시키는 한편 항-염증 사이토카인인 IL-10의 발현은 증가시켜 인간 위장관(gastrointestinal tract) 등의 면역 조절을 염증 억제용 조성물로 유용하게 이용될 수 있음을 다각적인 실험을 통해 확인하였다.

본 명세서에서 용어“염증 억제”는 개체의 면역계가 침입 유해성분에 대응하는 과정에서 과도한 면역반응으로 발생하는 염증(inflammation) 및 이에 따른 조직의 손상을 면역반응 조절을 통해 억제하는 것을 의미한다.

본 발명에서 발효 원료로 사용되는“우유 (milk)”는 다양한 동물 기원의 우유를 의미하며, 예를 들어 소의 우유(cow milk), 염소의 우유(goat milk), 또는 말의 우유(horse milk)를 포함하나 이에 한정되지 않는다. 또한 본 발명의 우유는 전우유 whole milk), 탈지 우유(skim milk) 또는 이들의 분말(powder) 형태로 사용될 수 있다.

본 발명의 명세서에서 용어“우유의 발효물”은 본 발명의 락토바실러스 카세이 균주에 의한 우유 발효후에 얻어진 모든 발효물의 혼합물(mixture)을 의미한다.

본 발명의 우유 발효물은 통상적인 유산균 발효 방법에 의해 제조될 수 있으며, 유산균 발효 방법은 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 공지되어 있다. 예를 들어, 발효 원료인 우유를 살균한 후 여기에 락토바실러스 카세이(Lactobacillus casei) 균주를 접종하고 이를 배양하여 제조한다. 발효를 위한 배양은 적합한 조건을 선택하여 행할 수 있다. 예를 들어, 유산균 균주가 혐기성(anaerobic)인 경우 배양전에 배지를 혐기성 조건으로 만들기 위해 배지의 산소를 이산화탄소(carbon dioxide)가스 또는 질소가스와 같은 불활성 가스(inert gas)로 교체하여 주거나, 산소 반응제(oxygen reaction agent)를 사용하여 배지의 산소를 제거하여 준다. 유산균 균주가 호기성(aerobic)인 경우 적합한 호기성 조건을 선택한다. 다른 배양 조건들도 사용하는 락토바실러스 카세이 (Lactobacillus casei)균주의 타입에 따라 적합하게 조절할 수 있다. 배지에는 다양한 탄수화물, 영양성분, 동식물 또는 미생물 성분들을 추가로 첨가할 수 있다. 예를 들어 글루코오스, 수크로오스, 프럭토오스-글루코오스 시럽 및 글루코오스-프럭토오스 시럽과 같은 탄수화물, 육류추출물(meat extract), 효모추출물(yeast extract), 펩타이드(peptide) 및 미네랄(mineral)과 같은 영양성분, 곡물, 곡물종자싹, 채소, 과일, 견과류 및 허브류와 같은 식물성 성분, 동물성 성분 및 미생물 배양 성분을 약 0.001-99 질량％의 범위내에서 추가로 첨가할 수도 있다. 미생물의 배양 및 발효의 상세한 내용은 Kubitschek, H. E., Introduction to Research with Continuous Cultures. Englewood Cliffs, N.J.:Prentice-Hall, Inc., 1970; Mandelstam, J., et al., Biochemistry of Bacterial Growth, 3rd ed. Oxford:Blackwell, 1982; Meynell, G.G., et al., Theory and Practice in Experimental Bacteriology, 2nd ed. Cambridge: Cambridge University Press, 1970; Gerhardt, P., ed.,Manual of Methods for General Bacteriology, Washington: Am. Soc. Microbiol, 1981에 개시되어 있다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 조성물은 염증 유발 사이토카인(pro-inflammatory cytokine), COX-2(cyclooxygenase-2) 및 iNOS(inducible nitric oxide synthase)로 구성된 군으로부터 선택되는 염증 유발 인자의 발현을 억제한다. 보다 바람직하게는, 본 발명의 조성물에 의해 발현이 억제되는 염증 유발 사이토카인은 TNF-α(Tumor necrosis factor-α), IL-1β(interleukin-1β) 및 IL-6(interleukin-6)로 구성된 군으로부터 선택된다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 조성물은 항-염증 사이토카인(anti-inflammatory cytokine)의 발현을 증가시킨다. 보다 바람직하게는, 본 발명의 조성물에 의해 발현이 증가되는 항-염증 사이토카인은 IL-10(interleukin-10)이다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 조성물은 염증성 질환의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물이다.

본 발명의 조성물은 약제학적 조성물의 형태로 제공될 수 있다. 본 발명의 약제학적 조성물은 유효성분과 약제학적으로 허용되는 담체를 포함한다. 본 발명의 약제학적 조성물에 포함되는 약제학적으로 허용되는 담체는 제제시에 통상적으로 이용되는 것으로서, 락토스, 덱스트로스, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 아카시아 고무, 인산 칼슘, 알기네이트, 젤라틴, 규산 칼슘, 미세결정성 셀룰로스, 폴리비닐피롤리돈, 셀룰로스, 물, 시럽, 메틸 셀룰로스, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 활석, 스테아르산 마그네슘 및 미네랄 오일 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 약제학적 조성물은 상기 성분들 이외에 윤활제, 습윤제, 감미제, 향미제, 유화제, 현탁제, 보존제 등을 추가로 포함할 수 있다. 적합한 약제학적으로 허용되는 담체 및 제제는 Remington's Pharmaceutical Sciences (19th ed., 1995)에 상세히 기재되어 있다.

본 발명의 약제학적 조성물의 적합한 투여량은 제제화 방법, 투여 방식, 환자의 연령, 체중, 성, 질병 증상의 정도, 음식, 투여 시간, 투여 경로, 배설 속도 및 반응 감응성과 같은 요인들에 의해 다양하며, 보통으로 숙련된 의사는 목적하는 치료에 효과적인 투여량을 용이하게 결정 및 처방할 수 있다. 한편, 본 발명의 약제학적 조성물의 투여량은 바람직하게는 1일 당 0.001-1000 mg/kg(체중)이다.

본 발명의 약제학적 조성물은 경구 또는 비경구로 투여할 수 있고, 비경구로 투여되는 경우, 정맥내 주입, 피하주입, 근육 주입, 복강 주입, 경피 투여 등으로 투여할 수 있다. 바람직하게는, 본 발명의 조성물은 경구투여된다.

본 발명의 약제학적 조성물은 당해 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있는 방법에 따라, 약제학적으로 허용되는 담체 및/또는 부형제를 이용하여 제제화함으로써 단위 용량 형태로 제조되거나 또는 다용량 용기내에 내입시켜 제조될 수 있다. 이때 제형은 오일 또는 수성 매질중의 용액, 현탁액 또는 유화액 형태이거나 엑스제, 분말제, 과립제, 정제 또는 캅셀제 형태일 수도 있으며, 분산제 또는 안정화제를 추가적으로 포함할 수 있다.

본 발명의 약제학적 조성물은 다양한 염증성 질환의 예방 또는 치료에 매우 유용하게 사용될 수 있다. 본 발명의 명세서에서 용어 “염증성 질환”은 면역조절 기능 이상으로 인해 과도한 면역반응이 발생, 조직 또는 세포가 이에 따른 염증으로 인해 손상되는 질병(disease) 또는 병적상태(pathologic condition)를 의미한다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 조성물로 예방 또는 치료되는 염증성 질환은 천식, 습진, 건선, 알러지, 류마티스 관절염, 건선 관절염(psoriatic arthritis), 아토피성 피부염, 여드름, 아토피성 비염(건초열), 알레르기성 피부염(습진), 만성 부비동염 및 지루성 피부염(seborrheic dermatitis)으로 구성된 군으로부터 선택된다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 조성물은 염증 개선용 기능성 식품 조성물이다. 본 발명의 조성물은 프로바이오틱스 제품을 포함하는 기능성 식품 조성물의 형태로 제공될 수 있다.

본 명세서의 용어 “프로바이오틱스”는 숙주 유기체에 의 건강에 도움을 주는 생균의 식품 보조물을 의미한다. 본 발명의 프로바이오틱스 조성물은 발효유 제품으로 제조될 수도 있으나 과립, 분말 등의 형태로 제조될 수도 있다.

본 발명의 조성물의 투여방법은 특별히 한정되지 않지만 환제, 정제 등으로 제조하여 경구 투여할 수도 있고, 분말형 또는 과립형으로 제조하여 음식물에 첨가하여 투여할 수도 있다. 본 발명의 조성물은 예를 들면, 의약품으로서 사용하는 경우의 제형은 각 성분의 분말을 제제화하지 않고 그 자체로 사용할 수 있지만, 산제, 과립제, 세립제, 정제, 당의정제, 캡슐제, 정제, 장용 피복제 등의 형태로 제제화할 수 있다. 희석제로서는 일반의 의약품제제에 사용되는 부형제, 결합제, 붕괴제 등이 사용되고, 이외에 착색제, 안정화제, 보존제, 윤활제 등을 첨가할 수 있다. 본 발명의 조성물을 식품으로서 사용하는 경우는 이대로 각 성분의 분말을 제제화하지 않고 사용할 수 있지만, 다른 식물섬유, 올리고당, 곡물류, 비타민류 등을 첨가하거나, 또는 향미료, 착색제, 교미제 등을 첨가하여, 섭취하기에 적합한 형태로 형성 가공하는 것도 가능하다. 또한, 식품 첨가물로서, 다른 식품에 첨가 혼합하여 사용할 수도 있다.

본 발명의 기능성 식품 조성물은 음료의 형태로 제공될 수 있으며, 이에 따라 제조된 음료에 통상적으로 첨가되는 성분들을 첨가시켜 다양한 제품을 만들 수 있다. 본 발명의 기능성 발효유 음료에는 향미제 또는 천연 탄수화물을 추가 성분으로서 포함시킬 수 있다. 예를 들어, 천연 탄수화물은 모노사카라이드(예컨대, 글루코오스, 프럭토오스 등); 디사카라이드(예컨대, 말토스, 수크로오스 등); 올리고당; 폴리사카라이드(예컨대, 덱스트린, 시클로덱스트린 등); 및 당알코올(예컨대, 자일리톨, 소르비톨, 에리쓰리톨 등)을 포함한다. 향미제로서 천연 향미제(예컨대, 타우마틴, 스테비아 추출물 등) 및 합성 향미제(예컨대, 사카린, 아스파르탐 등)를 이용할 수 있다.

본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 락토바실러스 카제이 (Lactobacillus casei) MCL 균주(KCCM 11290P)를 우유에 접촉시키는 단계를 포함하는 염증 억제 활성을 가지는 발효유 제조방법을 제공한다.

락토바실러스 카제이 MCL 균주를 이용하여 기능성 발효유를 제조하는 것은, 당업계에 공지된 통상의 발효 공정에 따라 실시할 수 있다.

본 발명의 용어“접촉”은 본 발명의 균주를 발효 원료인 우유에 접종하여 배양하는 방법 이외에도, 본 발명의 균주에 의해 우유의 발효물을 생산할 수 있는 환경을 제공하는 모든 방법을 포함한다.

본 발명의 균주를 우유에 접종하여 배양하는 과정은 당업계의 통상적인 방법에 따라 실시할 수 있다.

본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 락토바실러스 카제이 (Lactobacillus casei) MCL 균주(KCCM 11290P)를 유효성분으로 포함하는 염증 억제 활성을 가지는 발효유 제조용 스타터 배양(starter culture) 조성물을 제공한다.

본 발명에서 이용되는 락토바실러스 카제이 MCL 균주 및 발효유 제조과정은 이미 상술하였으므로 과도한 중복을 피하기 위하여 그 기재를 생략한다.

본 명세서에서 용어 “스타터 배양(starter culture)”은 발효 (fermentation)를 수행하는 미생물을 배양하는 것을 의미한다. 하기의 실시예에서 보는 바와 같이, 본 발명의 균주는 탈지유에서 배양할 경우 높은 생균수, 최적의 pH 및 적정가능 산도(titratable acidity)를 가진다는 것이 확인되어 강력한 스타터 배양 미생물로 기능할 수 있으며, 이에 염증 억제 활성을 가지는 발효유 제조를 위한 성분으로 유용하게 이용될 수 있다.

본 발명의 특징 및 이점을 요약하면 다음과 같다:

(a) 본 발명은 락토바실러스 카제이 (Lactobacillus casei) MCL 균주(KCCM 11290P), 이의 배양 추출물 또는 이에 의해 발효된 우유 발효물을 유효성분으로 포함하는 염증 억제용 조성물, 상기 균주를 우유에 접촉시키는 단계를 포함하는 염증 억제 활성을 가지는 발효유 제조방법 및 상기 균주를 유효성분으로 포함하는 염증 억제 활성을 가지는 발효유 제조용 스타터 배양(starter culture) 조성물을 제공한다.

(b) 본 발명의 균주는 다양한 염증 유발인자의 발현을 유의하게 감소시키고 항-염증 인자의 발현을 크게 증가시킴으로써 면역조절 이상으로 인한 염증성 질환의 예방, 치료 또는 개선용 조성물로 유용하게 이용될 수 있다.

도 1은 2% 글루코스가 포함된 10% 탈지유에서 L. casei MCL 및 L. casei YIT 9029의 배양특성은 나타낸 그림이다. 도 1a는 pH 및 and pH 및 적정가능 산도(titratable acidity)를, 도 1b는 박테리아 생균수(viable cell count)를 각각 나타낸다.
도 2는 7개의 L. casei 균주를 각각 처리한 RAW 264.7 세포의 NO 농도(도 2a) 및 NO 억제율(%)(도 2b)을 나타낸 그림이다.
도 3은 L. casei MCL를 처리한 RAW 264.7 세포에서 염증 유발 사이토카인인 COX-2(도 3a), iNOS(도 3b), TNF-α(도 3c), IL-1β(도 3d) 및 IL-6(도 3e)의 mRNA 발현량을 나타낸 그림이다. ^a-cp<0.05일때 유의적인 차이가 있음.
도 4는 L. casei MCL를 처리한 RAW 264.7 세포에서 항-염증 사이토카인인 IL-10(도 4a) 및 TGF-β(도 4b)의 mRNA 발현량을 나타낸 그림이다. ^a-cp<0.05일때 유의적인 차이가 있음.
도 5는 L. casei MCL로 발효시킨 우유를 처리한 RAW 264.7 세포에서 염증 유도 사이토카인인 COX-2(도 5a), iNOS(도 5b), TNF-α(도 5c), IL-1β(도 5d) 및 IL-6(도 5e)의 mRNA 발현량을 나타낸 그림이다. ^a-cp<0.05일때 유의적인 차이가 있음.
도 6은 L. casei MCL로 발효시킨 우유를 처리한 RAW 264.7 세포에서 항-염증 사이토카인인 IL-10(도 6a) 및 TGF-β(도 6b)의 mRNA 발현량을 나타낸 그림이다. ^a- ^cp<0.05일때 유의적인 차이가 있음.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.

실시예

실험방법

L. casei MCL의 동정

박테리아 16S rRNA 유전자는 DNA 중합효소, dNTP, Tris-HCl(pH9.0), KCl, MgCl₂및 pBact27F(5’-AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3’)와 pUniv 1492R (5’-GGYTACCTTGTTACGACTT-3’) 프라이머(Lane, 1991)를 포함하는 HotStarTaqPlus Master Mix Kit (Qiagen)을 이용하여 증폭하였다. PCR 산물을 PCR 정제 킷(Qiagen)을 이용하여 정제하였다. 유전자 클로닝, E. coli를 이용한 DNA 형질도입, DNA 변형 및 아가로스젤 전기영동은 Sambrooket al. (1989)이 보고한 방법에 따라 수행하였다. 16S rRNA 유전자는 Solgent Corp.(Daejeon, South Korea)에서 시퀀싱하였다.

탄수화물 발효 패턴의 조사

탄수화물 발효 패턴은 API 50 CHL 탄수화물 시험 킷(bioMerieuxCo., France)을 이용하여 측정하였다. 요약하면, 박테리아를 MRS broth (Difco, USA)에서 12시간 동안 37℃에서 배양하고, 10분 간 17,940×g로 원심분리하였다. 이후, 세포들을 1 X PBS 완충액으로 두 번 세척하였다. 탁도(Turbidity)를 McFarl 및 Standard 4를 이용하여 측정하고, 희석된 시료 3 mL를 API 50 CHL 배지에 접종하였다. 이어서, 시료 100μL를 49가지 서로 다른 탄수화물을 함유한 API 시험 웰에 각각 접종하였다. 발효 특성은 제조자의 API 웹사이트(https://apiweb.biomerieux.com)를 이용하여 확인하였다.

탈지유 배지에서의 배양특성 조사

천연 우유에서 분리한 L. casei MCL 및 한국 야쿠르트에서 분양받은 L. casei YIT 9029에 대하여 생균수(viable cell count), pH 및 산적정(acidometry) 측정을 하였다. 생균수 측정을 위하여, 세포를 MRS broth에서 두 번 배양한 후 2% 글루코스가 추가된 10% 탈지유에서 접종하였다. 세포의 숫자를 4시간 간격으로 총 36시간 동안 측정하였다. 배양된 세포는 혐기성 희석용액에서 희석하고 MRS 아가에 적용하였다. 플레이트를 인큐베이터에서 48시간동안 37℃로 배양하고, pH meter(M530P, Nova Analytics Corp., USA)를 이용하여 pH를 조사하였다.

대식세포에서의 면역기능 검사

1. 산화질소 분석을 위한 박테리아 조성물의 준비

LAB를 MRS broth에서 12시간 동안 37℃에서 배양한 후 15분간 10,000 ×g 원심분리를 통해 수집하였다. 박테리아 세포를 1X PBS 완충액으로 두 번 세척한 후, 시료를 100℃에서 10분간 가열하고 원심분리(10,000×g, 30분) 후 상층액을 여과하여 NO 분석에 사용하였다. 세포주는 37℃에서 24시간동안 탈지유에서 배양하고 10분간 100℃에서 가열한 뒤 원심분리하였다(10,000×g, 30분).

2. 세포배양

한국세포주은행(Seoul, Korea)에서 분양받은 RAW 264.7 세포를 DMEM(Dulbecco’s modified Eagle’s medium) 배지에서 10% FBS(fetal bovine serum) 및 1% 100U/mg 페니실린/스트렙토마이신과 함께 배양하였다. 모든 배지는 37℃에서 5% CO₂를 함유한 가습공기 하에서 배양하였다. 세포의 숫자 및 생존은 Neubauer hemocytometer를 이용한 트립판 블루 색소 배제법을 통해 측정하였다. 배양한 세포를 살균 조직배양 디쉬에 취합한 뒤 반복적인 피펫팅을 통해 분리하였다. 실험을 위하여, 세포를 24-웰 조직 플레이트(Nunc, Denmark)에서 5 × 10⁵밀도로 3번 배양하였다. LAB 및 LPS를 포함하는 배양액을 24시간 동안 배양하여 NO 농도를 분석하였다.

3. 산화질소 분석

L. casei MCL의 NO 생성 억제활성을 조사하기 위하여, RAW 264.7 세포(1×10⁶/mL)를 DMEM에서 먼저 배양하고 LPS(50ng/mL) 및 LAB 단편을 이용하여 24시간 동안 자극하였다. NO의 농도는 Griess 시약(Sigma, USA)을 이용하여 제조자의 지시에 따라 세포 배양액 상층액 내의 아질산염 양을 측정함으로써 조사하였다. 배양된 RAW 264.7 세포는 150 μL의 세포 배양액 상층액과 150 μL Griess 시약을 혼합하여 1,000 x g로 10분간 원심분리하였고, 이어서 상온에서 10분간 배양하였다. 흡광도는 마이크로플레이트 리더를 이용하여 540 nm에서 측정하였으며, 아질산나트륨(sodium nitrite)을 통해 형성된 검량선(calibration curve)을 기준으로 하여 비교하였다

4. 실시간 PCR 을 위한 cDNA 의 제작

자극된 세포로부터 제조자의 지시에 따라 Trisol 시약(Invitrogen, USA)을 이용하여 총 RNA를 수득하였다. RNeasy Mini Kit(Valencia, CA, USA)를 이용하여 제조자의 지시에 따라 RNA를 추가적으로 분리하였다. 추출용액 내 잔여 DNA는 DNaseI 킷(Ambion, USA)으로 제거하고, cDNA를 SuperScriptⅢ(Invitrogen, USA)를 이용하여 합성하였다. cDNA의 농도는 NanoDrop 분광광도계(Thermo Scientific, USA)를 이용하여 측정하였고 이후 100 ng/μL로 조정하였다.

5. 실시간 PCR

L. casei MCL에 노출된 RAW 264.7 세포 내에서의 사이토카인의 발현은 ABI 7900HT (Applied Biosystems)을 이용한 SYBR Green technology를 통해 실시간 정량적 PCR을 함으로써 측정하였다. PCR에 이용된 프라이머는 GAPDH (glyceraldehydes-3-phosphate dehydrogenase), COX-2, iNOS, TNF-α, IL-1β, IL-6, IL-10 및 TGF-β에 대한 프라이머가 포함되었으며, 이들의 cDNA 서열은 진뱅크(GenBank)에서 수득하였다(각각 접근번호 XM_124295.1, NM_000963, NM_010927, XM_123058.1, NM_008361.3, NM_031168.1, NM_010548.2 및 NM_011577.1) 각 프라이머 및 프로브의 뉴클레오타이드 서열은 표 1에 나타냈다.

실시간 PCR에 사용된 프라이머 서열

유전자		프라이머 서열	크기(bp)
GAPDH	F	5’-CATGGCCTTCCGTGTTCCTAC-3’	122
	R	5’-TCAGTGGGCCCTCAGATGC-3’
COX-2	F	5’-CTCAGCCATACAGCAAATCCTT-3’	101
	R	5’-GTCCGGGTACAATCGCACTTAT-3’
iNOS	F	5’-CCAGCCTGCCCCTTCAAT-3’	104
	R	5’-ATCCTTCGGCCCACTTCCT-3’
IL-1β	F	5’-TGACGGACCCCAAAAGAT-3’	122
	R	5’-GTGATACTGCCTGCCTGAAG-3’
IL-6	F	5’-CCGGAGAGGAGACTTCACAGAG-3’	107
	R	5’-TCATTTCCACGATTTCCCAGAG-3’
TNFα	F	5’-AGGCACTCCCCCAAAAGATG-3’	122
	R	5’-CACCCCGAAGTTCAGTAGACAGA-3’
IL-10	F	5’-GCTGGACAACATACTGCTAACCGACTC-3’	141
	R	5’-TCCTTGATTTCTGGGCCATGCTTCTCT-3’
TGF-β	F	5’-GCTACCATGCCAACTTCTGTCTG-3’	106
	R	5’-GAAGCGCCCGGGTTGTGTTGGTTGTAG-3’

통계적 분석

모든 시료에 대한 측정은 세 번 반복하였다. 통계적 분석은 SPSS 18.0 (SPSS for windows, Chicago, IL)를 이용하여 수행하였다. 사이토카인 발현 결과는 일원변량분석(one way ANOVA) 후 Turkey 다중비교 검정을 통해 분석하였다. 모든 시료는 P<0.05일 때 통계적으로 유의한 것으로 간주하였다.

실험결과

L. casei MCL 의 동정 및 DNA 시퀀싱

원유(raw milk)에서 분리한 MCL 균주는 카탈라아제 음성에, 자동력이 없고 그람-양성이며, 막대형인 박테리아이다. 이러한 특성은 대개 락토바실러 스(Lactobacillus) 속의 특징이다. 생화학 및 생물학적 동정이 시도되었으며, 탄수화물 발효 패턴은 API 데이터베이스에 따를 때 이 균주가 L. paracasei(99.9%)임을 보여주었다. 나아가, L. casei MCL의 16S rDNA 서열은 진뱅크(GenBank)에 JN974882의 접근번호로 기록되었다. L. casei의 균주 수준(strain level)에서의 동정은 산업적으로 유용한 특성을 가지는 특정 균주를 추적하기 쉽게 하므로 산업적 적용에 있어서 매우 중요하다.

탄수화물 발효패턴

천연 우유에서 분리된 L. casei MCL 및 L. casei YIT 9029에 대해 API 50CHL 킷을 이용하여 탄수화물 발효 패턴을 조사하였다. 조사 결과, 두 균주는 모두 리보오스, 갈락토스, D-글루코스, D-프럭토스, D-만노오즈, 만니톨, 소르비톨, N-아세틸 글루코사민, 에스쿨린, 살리신, D-셀로비오스, 말토스, 락토스, 사카로스, 트레할로스, D-투라노스, 겐타비오스, D-타가토스 및 글루코네이트의 탄수화물을 이용하는 것으로 나타났다(표 2). D-아도니톨, L-소르보스, 아미그달린 및 아르부틴은 L. casei YIT 9029에 의해서만 발효되었으며, 이눌린 및 D-멜레지토스는 L. casei MCL에 의해서만 발효되었다.

L. casei YIT 9029 및 L. casei MCL의 탄수화물 발효 특성

탄수화물	9029	MCL	탄수화물	9029	MCL
대조군	-	-	에스쿨린 페릭 시트레이트	+	+
글리세롤	-	-	살리신	+	+
에리트리톨	-	-	D-셀로비오스	+	+
D-아라비노스	-	-	D-말토스	+	+
L-아라비노스	-	-	D-락토스	+	+
D-리보오스	+	+	D-멜리비오스	-	-
D-자일로스	-	-	D-사카로스	+	+
L-자일로스	-	-	D-트레할로스	+	+
D-아도니톨	+	-	이눌린	-	+
메틸l-β-D-자일로피라노사이드	-	-	D-멜레지토스	-	+
D-갈락토스	+	+	D-라피노스	-	-
D-글루코스	+	+	아미돈	-	-
D-프럭토스	+	+	글리코겐	-	-
D-만노스	+	+	자일리톨	-	-
L-소르보스	+	-	젠티오비오스	+	+
L-람노오스	-	-	D-투라노스	+	+
둘시톨	-	-	D-릭소스	-	-
이노시톨	-	-	D-타가토스	+	+
D-만니톨	+	+	D-푸코스	-	-
D-소르비톨	+	+	L-푸코스	-	-
메틸l-α-D-만노피라노사이드	-	-	D-아라비톨	-	-
메틸l-α-D-글루코피라노사이드	-	-	L-아라비톨	-	-
N-아세틸글루코사민	+	+	포타슘 글루코네이트	+	+
아미그달린	+	-	포타슘 2-케토글루코네이트	-	-
알부틴	+	-	포타슘 5-케토글루코네이트	-	-

탈지유 배지에서의 L. casei MCL 배양 특성

최근에, L. casei 균주들은 낙농업에서 요구르트 및 다른 발효유 제품의 스타터 배양에 널리 이용되고 있다. LAB를 스타터 배양에 사용하기 위해서, 충분한 유제품 섭취를 공급하기 위한 생균 숫자는 6 log cfu/g 이상이어야 한다(Samona and Robinson,1991; Vinderolaet al., 2000). 뿐만 아니라, pH는 시큼한 맛의 감각 수용성 및 충분한 응고성을 위하여 4.2에서 4.4 사이어야 한다(Narvhus, 1996). 건강한 성인의 분변 및 천연우유에서 분리한 204개 균주 중에서, 10% 탈지유에서의 일관된 배양 가능성을 토대로 6개의 균주만이 선정되었다. 최종적으로, 천연 우유에서 분리한 L. casei MCL를 대상으로 생균수, pH 및 적정가능 산도(titratable acidity)를 측정하였다. 도 1에서 보는 바와 같이, L. casei MCL의 pH 변화는 L. casei YIT 9029보다 조금 높았다. 16시간 후에, L. casei YIT 9029의 pH는 급속히 감소한 반면 L. casei MCL의 최종 pH는 L. casei YIT 9029와 유사하였다(도 1). L. casei YIT 9029 및 L. casei MCL의 생균수는 모두 9 log cfu/g였다. 이러한 결과에 기초하여, L. casei MCL는 강력한 스타터 배양 미생물로 판명되었다.

대식세포에서의 면역효과

1. 산화 질소 생성에 대한 L. casei MCL 의 영향

NO는 암을 포함하는 만성 염증과 관련된 질환의 진행을 매개하는 것으로 생각되어진다. 실제로 모든 세포 및 수많은 면역학적 파라미터는 NO에 의해 조절된다(Cirinoet al., 2006). NO는 또한 많은 면역세포에서 대식세포의 살균(bactericidal) 활성 및 염증형성 과정에서의 신호전달을 비롯한 생물학적 기능을 가진다(Jeong et al., 2010).

L. casei 균주의 NO 억제활성은 양성 대조군의 NO 농도에 대한 상대적 비율(%)로 표현하였다. RAW264.7에서 양성 대조군은 LPS 만을 처리하였으며, 음성 대조군은 1 X PBS 완충액만을 처리하였다. 도 2에서 보는 바와 같이, L. casei MCL의 NO 억제율은 L. casei YIT 9029의 NO 억제율보다 유의하게 높았다. 나아가, L. casei MCL은 모든 L. casei 균주 중에서 가장 높은 억제율(%)을 보여주었다(도 2b). 양성 대조군(LPS-처리 시료)은 21.91μM의 NO를 생산하였으며, L. casei MCL는 13.02μM의 NO를 생산하였다(도 2a). 따라서, L. casei MCL가 NO 생산을 억제함으로써 항-염증 효과를 나타낸다는 것을 알 수 있다.

2. L. casei MCL 에서 수득한 세포 구성성분의 항-염증 효과

염증 유발 사이토카인(TNF-α, IL-1β, and IL-6) 및 NO 생산에 관여하는 효소(iNOS 및 COX-2)의 mRNA 발현을 정량적 실시간 PCR을 이용하여 측정하였다. 박테리아 엔도톡신(LPS)에 의해 자극된 대식세포에서의 NO 생산에 있어 iNOS는 핵심적 인자로서, 염증성 유발 사이토카인(TNF-α, IL-1β 및 IL-6)과 함께 염증성 반응에 참여한다(Nathan and Xie, 1994). IL-6는 강력한 분열 촉진 폴리펩타이드로서 다양한 형태의 세포에서 세포 증식을 촉진한다(Stein and Sutherland, 1998). 따라서, 염증유발 사이토카인은 염증의 중요한 척도이다. Morotomi et al.(1996)에 따르면, L. casi YIT9029 균주는 식사와 함께 투여될 경우 면역자극 활성에 의해 실험적으로 이식된 종양에 대하여 강력한 항암효과를 보인다. 유사하게, 본 발명자들의 연구결과에서도 L. casi YIT9029는 COX-2, iNOS 및 IL-1β의 발현을 증가시켰다(데이터 없음). 한편, L. casei MCL는 모든 염증 유발 사이토카인을 억제하는 것으로 나타났다(도 3). 이는 L. casei MCL이 항-염증 반응을 강화시킨다는 것을 의미한다. 모든 실험은 세 번 반복되었다. 24시간 동안 LPS로 자극하자, L. casei MCL 및 LPS를 처리한 시료에서는 RAW 264.7 세포에서 염증유도 사이토카인의 수준이 LPS 단독처리 시료에 비하여 낮아짐을 관찰하였다.

LPS에 의한 자극은 항-염증 사이토카인으로서 국부적 염증에 반응하는 IL-10의 분비를 증가시킨다(Yeganegiet al., 2010). IL-10는 레서스 원숭이에서 IL-1β, 프로스타글란딘 및 TNF-α의 생성을 억제한다(Sadowskyet al., 2003). 또한, IL-10은 인간 단핵 백혈구에서 IL-6, IL-8 및 COX-2 합성을 차단함으로써 대식세포를 강력하게 불활성화시키는 것으로 알려져 있다(Lee et al., 2009; Pena et al., 2003 Trushinet al., 2003).

Lactobacillus paracasei는 IL-10 및 TGF-β를 포함하는 조절 사이토카인을 높은 수준으로 생산하는 CD4⁺세포를 유도한다. 도 4에서 보는 바와 같이, L. casei MCL은 IL-10의 수준을 상향조절하지만, TGF-β의 발현에는 영향을 끼치지 않는다. L. casei MCL에 의한 IL-10 항-염증 사이토카인의 분비 증가는 소화관 감염 및 염증에 대한 강력한 억제 기작으로 작용할 수 있다. 결론적으로, L. casei MCL은 IL-1β, IL-6 및 TNF-α과 같은 염증유도 사이토카인의 분비를 감소시키고, IL-10과 같은 항-염증 사이토카인의 분비를 증가시킨다.

3. 발효유에서 수득한 L. casei MCL 의 항-염증 효과

L. casei MCL로 발효된 우유의 면역 효과를 확인하기 위하여, 균주를 2% 글루코스가 포함된 10% 탈지유에서 24시간 동안 배양하였다. L. casei MCL를 함유하는 발효 우유는 RAW 264.7 세포에서 COX-2, IL-6, 및 TNF-α와 같은 특정 염증유도 사이토카인의 분비를 감소시키고(P < 0.05)(도 5), TGF-β는 대조군과 유사한 수준까지 감소시키는 경향이 있었다(P < 0.05) (도 6). 그러나, 박테리아와 달리 L. casei MCL로 발효된 우유는 COX-2, TNF-α 및 IL-6의 발현 만을 억제하고(P < 0.05), TGF-β는 대조군 수준으로 감소시켰다(P < 0.05). 이러한 결과는 L. casei MCL로 발효된 우유가 특이적 면역반응 뿐 아니라 비특이적 면역반응에도 영향을 미침을 말해준다.

Lactobacillus rhamnosus GG는 우유 과민성 성인이 우유를 마신 후의 염증반응을 하향조절한다(Majamaa and Isolauri, 1997). 따라서, L. casei MCL로 발효된 우유는 염증유도 사이토카인의 분비를 감소시킴으로서 염증반응을 억제할 수 있다. 아울러, 이는 면역조절 발효유로 적용될 수도 있다.

이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 구현예일 뿐이며, 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

한국미생물보존센터(국내)

KFCC11290P

20120702

Claims

락토바실러스 카제이 (Lactobacillus casei) MCL 균주(KCCM 11290P), 이의 배양 추출물 또는 이에 의해 발효된 우유 발효물을 유효성분으로 포함하는 TNF-α(Tumor necrosis factor-α), IL-1β(interleukin-1β), IL-6(interleukin-6), COX-2(cyclooxygenase-2) 및 iNOS(inducible nitric oxide synthase)로 구성된 군으로부터 선택되는 염증 유발 인자의 발현을 억제하는 것을 특징으로 하는 염증 억제용 조성물.
삭제
삭제
제1항에 있어서, 상기 조성물은 항-염증 사이토카인(anti-inflammatory cytokine)의 발현을 증가시키는 것을 특징으로 하는 염증 억제용 조성물.
제4항에 있어서, 상기 항-염증 사이토카인은 IL-10(interleukin-10)인 것을 특징으로 하는 염증 억제용 조성물.
삭제
제1항에 따른 조성물을 포함하는 천식, 습진, 건선, 알러지, 류마티스 관절염, 건선 관절염(psoriatic arthritis), 아토피성 피부염, 여드름, 아토피성 비염(건초열), 알레르기성 피부염(습진), 만성 부비동염 및 지루성 피부염(seborrheic dermatitis)으로 구성된 군으로부터 선택되는 염증성 질환 치료용 조성물.
제1항에 따른 조성물을 포함하는 염증 개선용 기능성 식품 조성물.
락토바실러스 카제이 (Lactobacillus casei) MCL 균주(KCCM 11290P)를 우유에 접촉시키는 단계를 포함하는 염증 억제 활성을 가지는 발효유 제조방법.
락토바실러스 카제이 (Lactobacillus casei) MCL 균주(KCCM 11290P)를 유효성분으로 포함하는 염증 억제 활성을 가지는 발효유 제조용 스타터 배양(starter culture) 조성물.