KR102462392B1 - 락토바실러스 플란타럼 q1 균주를 함유하는 점막 면역 증진용 조성물 - Google Patents
락토바실러스 플란타럼 q1 균주를 함유하는 점막 면역 증진용 조성물 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 락토바실러스 플란타럼(Lactobacillus plantarum) Q1(KCTC14137BP) 균주, 상기 균주의 배양물, 상기 배양물의 농축액, 상기 배양물의 건조물, 상기 배양물의 추출물 및 상기 균주의 사균체로 이루어지는 군에서 선택된 1종 이상을 유효성분으로 함유하는 점막 면역 증진용 약학적 조성물에 관한 것으로, 본 발명의 락토바실러스 플란타럼 Q1 균주를 사균화한 후 이를 마우스에게 섭취시켜 항원을 주입한 결과, 질 점막 등에서 섭취 농도의존적으로 항체가 증가하는 것을 확인하였으며, 따라서 본 발명의 락토바실러스 플란타럼 Q1(KCTC14137BP) 균주는 점막 면역 증진용 조성물로 용이하게 사용될 수 있다.
Description
본 발명은 락토바실러스 플란타럼 Q1 균주를 유효성분으로 함유하는 점막 면역 증진용 조성물에 관한 것이다.
점막 표면은 병원체(pathogen) 공격에 가장 민감한 부위이다. 점막 백신 접종은 효과적인 백신 접종을 위하여 집중적으로 연구된 백신 접종 경로이며, 점막 경로를 통한 감염에 대하여 1차 방어선을 제공하기 위하여 권장된다. 근육내(intramuscular, IM) 또는 피하(subcutaneous, SC) 면역화와 비교하여, 점막 면역화는 비침습성(non-invasiveness), 병원체에 대한 교차 반응성(cross-reactive) IgA, 저비용, 및 혈액 매개 질병의 전염 위험 감소를 포함하나, 이에 제한되는 것은 아닌 현저한 공중 보건 이점을 제공한다.
점막 상피는 환경적 공격으로부터 신체를 보호하지만, 점막 백신 접종의 장애물이다. 효과적인 점막 면역 조절제 또는 보조제(백신용)를 설계하기 위하여, 상피 장벽에 들어가거나 우회하고, 항원의 흡수를 촉진하고, 항원제시 수지상 세포(antigen-presenting dendritic cells, DCs)를 활성화하는 능력이 필수적이다. 랑게르한스세포(미성숙 DCs)는 상피의 일반적인 거주자이다. DCs는 중층편평상피(stratified squamous epithelium) 사이에서 점막 표면까지 확장되어, 표면 수용체를 통하여 환경을 샘플링하는 가지돌기 유사 위족(dendrite-like pseudopods)을 생성한다. 이 샘플링 메커니즘은 점막 면역 조절제 및 항원에 대한 효율적인 통로를 제공하여, 랑게르한스 세포에 의한 후속적인 흡수를 촉진한다. 오늘날, 인간에게 사용할 수 있는 점막 백신은 소수에 불과하며, 이는 주로 안전하고 효과적인 점막 보조제의 결핍 때문이다.
박테리아 성분, 독소(toxins) 및 변성 독소(toxoids)는 면역 반응을 조절하며, 보조제로 적합하다. 대장균(Escherichia coli) 이열성 독소(labile toxin, LT)는 면역원성을 향상시키는 탁월한 효과로 인해 가장 많이 연구된 점막 보조제 중 하나이다.
본 발명자는 유산균 사균체를 먹이지 않은 마우스와 비교했을 때, 유산균 사균체 100ug을 먹인 마우스 혈청 내 IgA의 양이 증가하였으며, 유산균 사균체를 먹이지 않은 마우스의 질 세척액 내 IgA와 비교했을 때, 유산균 사균체 100ug를 먹인 마우스의 질 세척액 내 IgA의 양이 크게 증가하는 것을 확인하였는바, 락토바실러스 플란타럼 Q1 균주를 유효성분으로 함유하는 점막 면역 증진용 조성물을 제공하고자 한다.
상기의 해결하고자 하는 과제를 위한 본 발명에 따른 락토바실러스 플란타럼 Q1(KCTC14137BP) 균주는 혈청 및 질 내 항체의 생성을 증가시키는 효과를 나타내므로, 본 발명의 락토바실러스 플란타럼 Q1(KCTC14137BP) 균주는 점막 면역 증진용 조성물로 용이하게 사용될 수 있다.
이에 일실시예에 따르면, 락토바실러스 플란타럼(Lactobacillus plantarum) Q1(KCTC14137BP) 균주, 상기 균주의 배양물, 상기 배양물의 농축액, 상기 배양물의 건조물, 상기 배양물의 추출물 및 상기 균주의 사균체로 이루어지는 군에서 선택된 1종 이상을 유효성분으로 함유하는 점막 면역 증진용 약학적 조성물을 제공한다.
다른 실시예에 따르면, 락토바실러스 플란타럼(Lactobacillus plantarum) Q1(KCTC14137BP) 균주, 상기 균주의 배양물, 상기 배양물의 농축액, 상기 배양물의 건조물, 상기 배양물의 추출물 및 상기 균주의 사균체로 이루어지는 군에서 선택된 1종 이상을 유효성분으로 함유하는 점막 면역 증진용 건강기능식품 조성물을 제공한다.
상기 점막은 질점막인 것을 특징으로 한다.
상기 균주는 16S rRNA가 서열번호 1로 기재되는 뉴클레오티드 서열을 갖고, 단백질분해효소(protease), 전분분해효소(amylase), 섬유소분해효소(cellulase) 및 지질분해효소(lipase)의 소화 효소 생산능을 가지고, 대장균(Escherichia coli) 및 칸디다 알비칸스(Candida albicans)에 대하여 항균 활성을 갖는 것을 특징으로 한다.
상기 사균체는 1) 락토바실러스 플란타럼(Lactobacillus plantarum) Q1(KCTC14137BP) 균주를 배양하는 단계; 2) 상기 배양액을 가압멸균하는 단계; 3) 막여과 농축기로 농축 및 건조하여 분말화하는 단계를 포함하는 방법에 의하여 제조되는 것을 특징으로 한다.
상기 사균체는 4.0 X 1012 ~ 6.0 X 1012 cell/g의 농도인 것을 특징으로 한다.
상기 사균체는 1 ~ 3주간 1회 5mg/kg ~ 25mg/kg 경구투여되는 것을 특징으로 한다.
본 발명의 락토바실러스 플란타럼 Q1 균주를 사균화한 후 이를 마우스에게 섭취시켜 항원을 주입한 결과, 질 점막 등에서 섭취 농도의존적으로 항체가 증가하는 것을 확인하였으며, 따라서 본 발명의 락토바실러스 플란타럼 Q1(KCTC14137BP) 균주는 점막 면역 증진용 조성물로 용이하게 사용될 수 있다.
도 1은 본 발명에 따른 락토바실러스 플란타럼 Q1 균주 상등액의 대장균(Escherichia coli)에 대한 항균 활성을 측정한 결과를 나타낸 사진이다.
도 2는 본 발명에 따른 락토바실러스 플란타럼 Q1 균주 상등액의 칸디다 알비칸스(Candida albicans)에 대한 항균 활성을 측정한 결과를 나타낸 사진이다.
도 3는 본 발명에 따른 락토바실러스 플란타럼 Q1의 16s rRNA의 염기서열이다.
도 4는 본 발명에 따른 락토바실러스 플란타럼 Q1의 16s rRNA의 염기서열을 기초로 한 다른 세균(bacteria)과의 계통발생론적 관계를 나타내는 계통도이다.
도 5 및 6은 락토바실러스 플란타럼 Q1 사균체의 투여가 혈액내 항원특이적인 IgA에 미치는 영향을 나타내는 그래프이다.
도 7은 락토바실러스 플란타럼 Q1 사균체의 투여가 질내 항원특이적인 IgA에 미치는 영향을 나타내는 그래프이다.
도 2는 본 발명에 따른 락토바실러스 플란타럼 Q1 균주 상등액의 칸디다 알비칸스(Candida albicans)에 대한 항균 활성을 측정한 결과를 나타낸 사진이다.
도 3는 본 발명에 따른 락토바실러스 플란타럼 Q1의 16s rRNA의 염기서열이다.
도 4는 본 발명에 따른 락토바실러스 플란타럼 Q1의 16s rRNA의 염기서열을 기초로 한 다른 세균(bacteria)과의 계통발생론적 관계를 나타내는 계통도이다.
도 5 및 6은 락토바실러스 플란타럼 Q1 사균체의 투여가 혈액내 항원특이적인 IgA에 미치는 영향을 나타내는 그래프이다.
도 7은 락토바실러스 플란타럼 Q1 사균체의 투여가 질내 항원특이적인 IgA에 미치는 영향을 나타내는 그래프이다.
이하 본 발명의 실시를 위한 구체적인 실시예를 도면을 참고하여 설명한다. 예시된 도면은 발명의 명확성을 위하여 핵심적인 내용만 확대 도시하고 부수적인 것은 생략하였으므로 도면에 한정하여 해석하여서는 아니 된다.
일실시예에 따르면, 본 발명은 락토바실러스 플란타럼(Lactobacillus plantarum) Q1(KCTC14137BP) 균주, 상기 균주의 배양물, 상기 배양물의 농축액, 상기 배양물의 건조물, 상기 배양물의 추출물 및 상기 균주의 사균체로 이루어지는 군에서 선택된 1종 이상을 유효성분으로 함유하는 점막 면역 증진용 약학적 조성물을 제공한다.
본 발명의 균주인 락토바실러스 플란타럼(Lactobacillus plantarum) Q1(KCTC14137BP) 균주는 본 발명자가 동정하여, 특허(제10-2310336호)를 취득한 균주로 단백질분해효소(protease), 전분분해효소(amylase), 섬유소분해효소(cellulase) 및 지질분해효소(lipase)의 소화 효소 생산능을 가지고, 대장균(Escherichia coli) 및 칸디다 알비칸스(Candida albicans)에 대하여 항균 활성을 갖는 것을 특징으로 한다.
본 발명자의 페이퍼 디스크법에 의하면, 대장균에 항균활성이 나타나면서 투명환(clear zone)이 생성되어 락토바실러스 플란타럼(Lactobacillus plantarum) Q1(KCTC14137BP) 균주가 대장균(Escherichia coli)에 강한 항균력을 갖는 것을 확인하였다. 또한 칸디다 알비칸스(Candida albicans)에 대해서도 항균활성이 나타나면서 투명환(clear zone)이 생성됨으로서 칸디다 알비칸스(Candida albicans)에 대하여 항균 활성을 갖는 것을 확인하였다.
본 발명자가 분리하여 얻은 락토바실러스 플란타럼 Q1 균주 또는 이의 배양액은 유용미생물에는 항균활성이 나타나지 않았지만 대장균(Escherichia coli)과 칸디다 알비칸스(Candida albicans)과 같은 병원성 세균 및 진균에 대하여 특이적으로 항균활성 및 길항효과가 우수함을 알 수 있었으며 프로바이오틱스 유산균과의 복합미생물로서의 가능성을 확인하였다.
본 발명의 균주인 락토바실러스 플란타럼(Lactobacillus plantarum) Q1(KCTC14137BP) 균주는 단백질분해효소(protease), 전분분해효소(amylase), 섬유소분해효소(cellulase) 그리고 지질분해효소(lipase) 모두 생산이 가능하다는 것을 확인하였으며, 효소의 활성이 좋기 때문에 락토바실러스 플란타럼(Lactobacillus plantarum) Q1(KCTC14137BP) 균주 또는 이의 배양물을 유효성분으로 사용하여 발효 식품 또는 건강기능 식품으로 활용할 수 있다.
본 발명자는 락토바실러스 플랜타럼 Q1을 사균화한 후 이를 마우스에게 섭취시켜 항원을 주입한 결과, 질 점막 등에서 섭취 농도 의존적으로 항체가 증가하는 것을 확인하였다. 이에 상기 점막은 질점막인 것을 특징으로 한다. 락토바실러스 플랜타럼 Q1을 사균화는 질 점막의 항체 생성을 유도하여 점막 면역을 증가시키는 효과를 나타낸다.
상기 균주는 16S rRNA가 서열번호 1로 기재되는 뉴클레오티드 서열을 갖는 것을 특징으로 하며, 이는 Lactobacillus plantarum strain 8268(accession No: MT538850) 16s rRNA 유전자와 99%(1398/1400)의 유사율을 나타낸다.
또한 상기 균주는 16S rRNA가 서열번호 1로 기재되는 뉴클레오티드 서열을 갖고, 단백질분해효소(protease), 전분분해효소(amylase), 섬유소분해효소(cellulase) 및 지질분해효소(lipase)의 소화 효소 생산능을 가지고, 대장균(Escherichia coli) 및 칸디다 알비칸스(Candida albicans)에 대하여 항균 활성을 갖는 것을 특징으로 한다.
상기 사균체는 1) 락토바실러스 플란타럼(Lactobacillus plantarum) Q1(KCTC14137BP) 균주를 배양하는 단계; 2) 상기 배양액을 가압멸균하는 단계; 3) 막여과 농축기로 농축 및 건조하여 분말화하는 단계를 포함하는 방법에 의하여 제조될 수 있다.
상기 배양 단계는 멸균된 배지에 락토바실러스 플란타럼(Lactobacillus plantarum) Q1 균주를 접종하고, 12시간 이상 배양하는 것이 바람직하다.
상기 배양액은 100 ~ 121℃에서 30 ~ 60분간 가압멸균하는 것이 바람직하다.
상기 막여과 농축기는 여과막 사이즈가 0.1 ~ 1㎛일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 사균체 분말은 4.0 X 1012 ~ 6.0 X 1012 cell/g의 농도일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 사균체는 1 ~ 3주간 1회 5mg/kg ~ 25mg/kg 경구투여되는 것을 특징으로 한다. 본 발명자의 실험에 의하면, 3주 간격으로 500ug/mouse을 먹인 마우스에서 100ug을 먹인 마우스보다 점막 항체의 생성이 증가하였다. 일반적으로 마우스의 몸무게를 20g을 본다면, 본 발명 균주 사균체는 3주 간격으로 25mg/kg 투여되는 것이 바람직하다.
본 발명의 조성물은 약학적 조성물의 제조에 통상적으로 사용되는 적절한 담체, 부형제, 및 희석제를 더 포함할 수 있다.
각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 외용제 및 멸균 주사용액의 형태로 제형화하여 사용될 수 있으며, 바람직하게는 크림, 젤, 패취, 분무제, 연고제, 경고제, 로션제, 리니멘트제, 파스타제 또는 카타플라스마제의 제형을 가질 수 있다.
상기 락토바실러스 플란타럼(Lactobacillus plantarum) Q1(KCTC14137BP) 균주 사균체를 유효성분으로 포함하는 조성물에 포함될 수 있는 담체, 부형제 및 희석제로는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로스, 올리고당, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 들 수 있다. 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다. 경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 상기 추출물에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 칼슘카보네이트(calcium carbonate), 수크로스(sucrose) 또는 락토오스(lactose), 젤라틴 등을 섞어 조제된다.
또한 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스티레이트 탈크 같은 윤활제들도 사용된다. 경구를 위한 액상제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다.
비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조제제, 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜 (propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로제라틴 등이 사용될 수 있다.
본 발명의 조성물은 상기 약학적으로 허용되는 담체와 함께 당업계에 공지된 방법으로 투여경로에 따라 다양하게 제형화될 수 있다. 상기에서 "약학적으로 허용되는" 이란 생리학적으로 허용되고 인간에게 투여될 때, 활성성분의 작용을 저해하지 않으며 통상적으로 위장 장애, 현기증과 같은 알레르기 반응 또는 이와 유사한 반응을 일으키지 않는 비독성의 조성물을 말한다.
본 발명의 다른 실시예에 따르면, 락토바실러스 플란타럼(Lactobacillus plantarum) Q1(KCTC14137BP) 균주, 상기 균주의 배양물, 상기 배양물의 농축액, 상기 배양물의 건조물, 상기 배양물의 추출물 및 상기 균주의 사균체로 이루어지는 군에서 선택된 1종 이상을 유효성분으로 함유하는 점막 면역 증진용 건강기능식품용 조성물을 제공한다.
본 발명의 건강기능식품으로는 예를 들어, 차, 젤리, 즙, 엑기스, 음료 등의 장 기능 개선을 목적으로 하는 민간요법제를 들 수 있다.
이와 같이 다양한 형태로 가공된 본 발명의 건강기능식품은 인체에 부작용이 없으면서 복용이 용이하고 장기간 보관이 가능하다.
상기 식품의 종류에는 특별한 제한은 없다. 상기 식물혼합추출분말을 첨가할 수 있는 식품의 예로는 육류, 소세지, 빵, 쵸콜릿, 캔디류, 스낵류, 과자류, 피자, 라면, 기타 면류, 껌류, 얼음과자, 아이스크림류, 우유, 우유 대용품, 크림, 버터, 버터 밀크, 요구르트, 요거트, 치즈를 포함하는 낙농제품, 각종 수프, 음료수, 차, 드링크제, 알코올 음료 및 비타민 복합제 등이 있으며, 통상적인 의미에서의 건강식품을 모두 포함한다.
본 발명의 건강 음료 조성물은 통상의 음료와 같이 여러 가지 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로서 함유할 수 있다. 상술한 천연 탄수화물은 포도당, 과당과 같은 모노사카라이드, 말토오스, 슈크로오스와 같은 디사카라이드, 및 덱스트린, 사이클로덱스트린과 같은 폴리사카라이드, 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등의 당알코올이다. 감미제로서는 타우마틴, 스테비아 추출물과 같은 천연 감미제나 사카린, 아스파르탐과 같은 합성 감미제 등을 사용할 수 있다.
이하, 실험예를 기술함으로써 본 발명을 보다 상세히 설명한다.
<실시예 1> 락토바실러스 플란타럼(
Lactobacillus plantarum
) Q1 균주의 분리 및 동정
(1) 균주의 분리
락토바실러스 플란타럼(Lactobacillus plantarum) Q1 균주를 분리하기 위해서 1차적으로 멸균증류수 9 ㎖에 김치 1g을 넣은 후 10분간 섞어 준 후 나온 상등액을 멸균증류수로 희석하여 MRS agar(Lactobacilli MRS Agar, BD, USA) 고체 배지에 도말하고 37℃에서 24시간 동안 배양한 후 각각의 콜로니를 분리하였다. 선별된 균주를 MRS 고체 배지에 도말하여 순수 분리하였으며, 선별된 균주를 대상으로 효소의 분해능 실험과 항균 실험을 통해 우수한 효과를 가진 균주를 동정 분석하였다.
(2)균주의 동정
(2-1) API 50 CHL kit을 이용한 당의 이용범위 조사
생화학적 동정은 API 50 CHL kit(Biomerieux, France)을 이용하여 탄수화물의 이용성을 확인하였다. 동정하려는 균주를 MRS 고체 배지에 도말하여 37℃에서 24시간 동안 배양한 후 콜로니를 생리식염수 2 ㎖로 현탁시켜서 서스펜션 배지(suspension medium) 5 ㎖에 위 균액을 넣어 분산시킨 후 탁도를 2 맥팔런트(McFarland)로 맞춰준다. 탁도를 맞춘 균액을 API 50 CHL medium 10 ㎖에 접종하여 섞어주고 API 50 CH strip에 150 ㎕씩 접종시킨 뒤 37℃에서 24시간과 48시간 동안 배양하면서 결과를 확인한다. 확인된 결과는 API동정용 시스템(apiwebTM)을 통해 생화학적 결과를 분석하였다.
분석결과 총 49종의 탄수화물에 대한 당의 이용능력을 확인한 결과 분리균은 다양한 당류를 이용하여 산을 생성하였으며 그 특성은 표 1에 나타내었다.
그리고 순수 분리된 균주에 대한 API 50 CHB kit의 결과를 API동정용 시스템(apiwebTM)으로 확인한 결과 99.9%의 높은 유사성으로 락토바실러스 플란타럼(Lactobacillus plantarum)인 것을 확인하였다.
[표 1]
(2-2) 16s rRNA 염기서열을 이용한 균주의 분석
유전학적 동정은 미생물 내에 존재하는 genomic DNA를 추출하여 동정에 이용이 되는 16s rRNA를 PCR 방법을 이용하여 증폭한 뒤 정제 과정을 거친 PCR 단편을 유전자 분석센터인 (주)마크로젠에 염기서열 분석을 의뢰하였다.
염기서열 분석을 통해 얻은 균주의 염기서열은 National Center for Biotechnology Information(NCBI) 홈페이지 내에 존재하는 GeneBank database (http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi?PROGRAM=blastn&PAGE_TYPE=BlastSearch&LINK_LOC=blasthome)에서 BLASTN로 검색하여 기존에 보고된 미생물의 16s rRNA와 유사도를 비교하였다.
도 3는 본 발명에 따른 락토바실러스 플란타럼(Lactobacillus plantarum) Q1의 16s rRNA의 염기서열이고, 도 4는 본 발명에 따른 락토바실러스 플란타럼(Lactobacillus plantarum) Q1의 16s rRNA의 염기서열을 기초로 한 다른 세균(bacteria)과의 계통발생론적 관계를 나타내는 계통도이다.
상기 도 3 및 서열목록에 나타낸 바와 같이, 락토바실러스 플란타럼(Lactobacillus plantarum) Q1 균주의 16s rRNA 염기서열을 분석한 결과 1,400개의 염기를 확인하였다.
[서열목록 1]
AACTGGTGAGTAACACGTGGGAAACCTGCCCAGAAGCGGGGGATAACACCTGGAAACAGATGCTAATACCGCATAACAACTTGGACCGCATGGTCCGAGTTTGAAAGATGGCTTCGGCTATCACTTTTGGATGGTCCCGCGGCGTATTAGCTAGATGGTGAGGTAACGGCTCACCATGGCAATGATACGTAGCCGACCTGAGAGGGTAATCGGCCACATTGGGAСTGAGACACGGCCCAAACTCCTACGGGAGGCAGCAGTAGGGAATCTTCCACAATGGACGAAAGTCTGATGGAGCAACGCCGCGTGAGTGAAGAAGGGTTTCGGCTCGTAAAACTCTGTTGTTAAAGAAGAACATATCTGAGAGTAACTGTTCAGGTATTGACGGTATTTAACCAGAAAGCCACGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGTGGCAAGCGTTGTCCGGATTTATTGGGCGTAAAGCGAGCGCAGGCGGTTTTTTAAGTCTGATGTGAAAGCCTTCGGCTCAACCGAAGAAGTGCATCGGAAACTGGGAAACTTGAGTGCAGAAGAGGACAGTGGAACTCCATGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGATATATGGAAGAACACCAGTGGCGAAGGCGGCTGTCTGGTCTGTAACTGACGCTGAGGCTCGAAAGTATGGGTAGCAAACAGGATTAGATACGGTGGTAGTCCATACCGTAAACGATGAATGCTAAGTGTTGGAGGGTTTCCGCCCTTCAGTGCTGCAGCTAACGCATTAAGCATTCCGCCTGGGGAGTACGGCCGCAAGGCTGAAACTCAAAGGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGAAGCTACGCGAAGAACCTTACCAGGTCTTGACATACTATGCAAATCTAAGAGATTAGACGTTCCCTTCGGGGACATGGATACAGGTGGTGCATGGTTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTATTATCAGTTGCCAGCATTAAGTTGGGCACTCTGGTGAGACTGCCGGTGACAAACCGGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAAATCATCATGCCCCTTATGACCTGGGCTACACACGTGCTACAATGGATGGTACAACGAGTTGCGAACTCGCGAGAGTAAGCTAATCTCTTAAAGCCATTCTCAGTTCGGATTGTAGGCTGCAACTCGCCTACATGAAGTCGGAATCGCTAGTAATCGCGGATCAGCATGCCGCGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACACCATGAGAGTTTGTAACACCCAAAGTCGGTGGGGTAACCTTTTAGGAACCAGCCGCCTAAGGTGGGACAGATGATTAGGGTGAAGTC
상기 도 4에 나타낸 바와 같이, 16S rRNA 염기서열을 이용하여 계통발생론적으로 분석한 결과 Lactobacillus plantarum strain 8268(accession No: MT538850) 16s rRNA 유전자와 99%(1398/1400)의 유사율을 나타냈으므로 분리 균주를 락토바실러스 플란타럼(Lactobacillus plantarum) Q1로 명명하였다.
<실시예 2> 락토바실러스 플란타럼(
Lactobacillus plantarum
) Q1 균주의 사균체 제조
락토바실러스 플란타럼(Lactobacillus plantarum) Q1 균주를 새로운 배지에 접종하고 12시간 이상 충분히 배양하고, 상기 배양액을 0.15 Mpa 및 100 ~ 121℃에서 30~60분간 가압멸균하고, 여과막 사이즈가 0.1 ㎛인 막여과 농축기(DOW separation systems, Serial No.546/57 205-92.)에 통과시켜 사균체를 농축시킨 후 건조하여 5.0 X 1012 cell/g 농도의 LPQ1 유산균 사균체 분말을 제조하였다.
<실험예> 유산균 사균체의 투여가 항원특이적인 IgA 양에 미치는 영향
1. 동물의 면역
실험동물은 동물윤리위원회의 지침에 따라 SPF실험동물 사육실에서 관리하며, 생후 6주-10주령의 Balb/c mouse를 사용하며 그룹당 10마리를 사용하였다.
항체생산을 위한 항원으로서는 기존에 항체 생산 실험에서 많이 사용되는 ovalbumin(OVA)을 사용하며 면역을 위해 매회(0주, 3주, 6주) 100ug 또는 500ug을 접종하였다.
2. 항체역가 측정을 위한 시료의 채취
OVA의 항체가 측정을 위한 혈액의 채취는 1차 면역 후 2주, 4주 및 7주에 실시하였다. IgA 항체가 결정을 위한 점막분비물인 질과 분변은 최종 면역 7일 후에 준비하였다. 질 분비물은 생식기를 50 μL의 버퍼로 두 번 세척하여 수거하였고, 원심분리(1000 rpm, 10 min) 를 통해 상등액을 수집하여 -20℃에서 사용할 때까지 보관하였다.
3. 항체 역가 측정
OVA에 대한 항체 역가는 혈청과 점막 분비물에서 ELISA법을 이용하여 측정하였다. 요약하면, 96 well plate에 항원으로 사용한 OVA 5ug을 코팅한후 세척용액(PBS+0.05% Tween20)을 이용하여 plate를 세척하고 10% 탈지분유를 첨가하여 상온에서 2시간동안 blocking하고, 세척용액으로 plate를 세척 후 혈청 혹은 점막분비물을 첨가하여 2시간 동안 37℃에서 반응시켰다. 항체의 역가 혹은 항체의 isotype의 측정을 위하여 효소 HRP가 표지된 2차 항체를 첨가하여 반응시키고, HRP의 기질로는 3,3',5,5'-tetramethlybenzidine (TMB)을 사용하였다.
<실험결과>
1. 락토바실러스 플란타럼 Q1 사균체의 투여가 혈액내 항원특이적인 IgA에 미치는 영향
마우스 혈청 내에서 점막 면역 글로불린인 IgA를 측정하였다. 도 5 및 6을 참고하면, 락토바실러스 플란타럼 Q1 사균체를 먹이지 않은 마우스 혈청 내 IgA는 희석배율 40,000에서 역가가 급격히 감소하였다.
락토바실러스 플란타럼 Q1 사균체를 먹이지 않은 마우스와 비교했을 때, 락토바실러스 플란타럼(Lactobacillus plantarum) Q1 사균체 100ug을 먹인 마우스 혈청내 IgA는 증가하였으며, 락토바실러스 플란타럼 Q1 사균체 500ug을 먹인 마우스 혈청내 IgA도 역시 증가하는 것을 확인할 수 있었다.
그룹별로 비교했을 때, 락토바실러스 플란타럼 Q1 사균체 500ug을 섭취한 마우스 혈청 내 IgA 항체가 가장 증가한 것으로 보아, 락토바실러스 플란타럼 Q1 사균체가 점막 면역 글로불린인 IgA 항체 생산능을 증가시키는 것을 확인하였다.
2. 락토바실러스 플란타럼 Q1 사균체의 투여가 질내의 IgA에 미치는 영향
마우스 질 세척액에서 항원 특이적인 IgA 항체의 역가를 측정하였다. 락토바실러스 플란타럼 Q1 사균체를 먹이지 않은 마우스의 질 세척액 내 IgA와 비교했을 때, 락토바실러스 플란타럼 Q1 사균체 100ug를 먹인 마우스의 질 세척액 내 IgA의 양은 크게 증가하지 않았다.
그러나 락토바실러스 플란타럼 Q1 사균체 500ug를 먹인 마우스의 질 세척액 내 IgA의 양이 락토바실러스 플란타럼 Q1 사균체를 먹이지 않는 마우스에 비해 크게 증가하는 것을 확인할 수 있었다.
이상에서는 실시 예를 참조하여 설명하였지만, 해당 기술 분야의 숙련된 당업자는 하기의 특허청구범위에 기재된 본 발명의 사상 및 영역으로부터 벗어나지 않는 범위 내에서 본 발명을 다양하게 수정 및 변경시킬 수 있음을 이해할 수 있을 것이다.
<110> CUOME BIO Co., Ltd.
<120> LACTOBACILLUS PLANTARUM Q1 STRAIN HAVING COMPLEX DIGESTIVE
PRODUCTIVITY AND ANTIBACTERIAL ACTIVITY AND USES THEREOF
<130> Pn-2020-0328
<160> 1
<170> KoPatentIn 3.0
<210> 1
<211> 1400
<212> DNA
<213> Lactobacillus plantarum
<400> 1
aactggtgag taacacgtgg gaaacctgcc cagaagcggg ggataacacc tggaaacaga 60
tgctaatacc gcataacaac ttggaccgca tggtccgagt ttgaaagatg gcttcggcta 120
tcacttttgg atggtcccgc ggcgtattag ctagatggtg aggtaacggc tcaccatggc 180
aatgatacgt agccgacctg agagggtaat cggccacatt gggactgaga cacggcccaa 240
actcctacgg gaggcagcag tagggaatct tccacaatgg acgaaagtct gatggagcaa 300
cgccgcgtga gtgaagaagg gtttcggctc gtaaaactct gttgttaaag aagaacatat 360
ctgagagtaa ctgttcaggt attgacggta tttaaccaga aagccacggc taactacgtg 420
ccagcagccg cggtaatacg taggtggcaa gcgttgtccg gatttattgg gcgtaaagcg 480
agcgcaggcg gttttttaag tctgatgtga aagccttcgg ctcaaccgaa gaagtgcatc 540
ggaaactggg aaacttgagt gcagaagagg acagtggaac tccatgtgta gcggtgaaat 600
gcgtagatat atggaagaac accagtggcg aaggcggctg tctggtctgt aactgacgct 660
gaggctcgaa agtatgggta gcaaacagga ttagataccc tggtagtcca taccgtaaac 720
gatgaatgct aagtgttgga gggtttccgc ccttcagtgc tgcagctaac gcattaagca 780
ttccgcctgg ggagtacggc cgcaaggctg aaactcaaag gaattgacgg gggcccgcac 840
aagcggtgga gcatgtggtt taattcgaag ctacgcgaag aaccttacca ggtcttgaca 900
tactatgcaa atctaagaga ttagacgttc ccttcgggga catggataca ggtggtgcat 960
ggttgtcgtc agctcgtgtc gtgagatgtt gggttaagtc ccgcaacgag cgcaaccctt 1020
attatcagtt gccagcatta agttgggcac tctggtgaga ctgccggtga caaaccggag 1080
gaaggtgggg atgacgtcaa atcatcatgc cccttatgac ctgggctaca cacgtgctac 1140
aatggatggt acaacgagtt gcgaactcgc gagagtaagc taatctctta aagccattct 1200
cagttcggat tgtaggctgc aactcgccta catgaagtcg gaatcgctag taatcgcgga 1260
tcagcatgcc gcggtgaata cgttcccggg ccttgtacac accgcccgtc acaccatgag 1320
agtttgtaac acccaaagtc ggtggggtaa ccttttagga accagccgcc taaggtggga 1380
cagatgatta gggtgaagtc 1400
Claims (7)
- 락토바실러스 플란타럼(Lactobacillus plantarum) Q1(KCTC14137BP) 균주의 사균체를 유효성분으로 함유하는 질점막 면역 증진용 약학적 조성물로,
상기 사균체는 5.0 X 1012 cell/g의 농도로 3주마다 1회 25mg/kg 경구투여되는 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.
- 삭제
- 제1항에 있어서,
상기 균주는 16S rRNA가 서열번호 1로 기재되는 뉴클레오티드 서열을 갖고, 단백질분해효소(protease), 전분분해효소(amylase), 섬유소분해효소(cellulase) 및 지질분해효소(lipase)의 소화 효소 생산능을 가지고, 대장균(Escherichia coli) 및 칸디다 알비칸스(Candida albicans)에 대하여 항균 활성을 갖는 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.
- 제1항에 있어서,
상기 사균체는
1) 락토바실러스 플란타럼(Lactobacillus plantarum) Q1(KCTC14137BP) 균주를 배양하는 단계;
2) 상기 배양액을 가압멸균하는 단계;
3) 막여과 농축기로 농축 및 건조하여 분말화하는 단계를 포함하는 방법에 의하여 제조되는 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.
- 삭제
- 삭제
- 락토바실러스 플란타럼(Lactobacillus plantarum) Q1(KCTC14137BP) 균주의 사균체를 유효성분으로 함유하는 질점막 면역 증진용 건강기능식품 조성물로,
상기 사균체는 5.0 X 1012 cell/g의 농도로 3주마다 1회 25mg/kg 경구투여되는 것을 특징으로 하는 건강기능식품 조성물.
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| KR (1) | KR102462392B1 (ko) |
Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR20030077895A (ko) * | 2002-03-27 | 2003-10-04 | (주) 피엘바이오 | 김치에서 분리된 헬리코박터 필로리의 부착과성장억제성능 락토바실러스 플란타룸 |
| KR101095712B1 (ko) | 2003-08-21 | 2011-12-20 | 오츠카 세이야쿠 가부시키가이샤 | 점막 면역 부활 작용을 갖는 유산균 |
| KR102310336B1 (ko) * | 2020-12-04 | 2021-10-07 | 주식회사 큐옴바이오 | 복합 소화 효소 생산능 및 항균 활성을 갖는 락토바실러스 플란타럼 q1 균주 및 이의 용도 |
-
2022
- 2022-05-24 KR KR1020220063685A patent/KR102462392B1/ko active IP Right Grant
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