KR20180075463A - 프로바이오틱 활성을 갖는 신규 락토바실러스 퍼멘텀 및 이의 용도 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 프로바이오틱스 활성을 갖는 신규 락토바실러스 퍼멘텀(Lactobacillus fermentum) 균주를 제공한다. 본 발명에 따른 특정 락토바실러스 퍼멘텀(Lactobacillus fermentum) 균주는 내산성, 내담즙산성 또는 장 상피세포 부착성이 우수하여 개체에 경구투여시 대부분이 장에 도달할 수 있고, 장내에서 유해균의 번식을 효과적으로 억제할 수 있기 때문에 프로바이오틱 소재로 유용하다. 또한, 본 발명에 따른 특정 락토바실러스 퍼멘텀(Lactobacillus fermentum) 균주는 항균 활성이 우수하여 항균용 식의약 소재로 사용될 수 있다. 또한, 본 발명에 따른 특정 락토바실러스 퍼멘텀(Lactobacillus fermentum) 균주는 콜레스테롤 저하 활성이 우수하여 고콜레스테롤혈증, 고지혈증, 고중성지방혈증 또는 이상지질혈증을 예방, 개선 또는 치료하는데에 유용한 식의약 소재로 사용될 수 있다.
Description
본 발명은 신규 유산균에 관한 것으로서, 더 상세하게는 인도 전통 음식인 발효 우유 커드(fermented cow milk curd)로부터 분리되어 인체에 안전하고, 내산성, 내담즙산성, 장 부착 능력 등과 같이 프로바이오틱스로서 필요한 활성을 가지며, 항균 활성, 콜레스테롤 저하 활성 등과 같은 다양한 기능성을 가지는 신규 락토바실러스 퍼멘텀 및 이의 식의약적 용도에 관한 것이다.
인간은 미생물과 계속적인 접촉을 하며 살아가고 있는데, 수많은 미생물이 인체의 안팎에 존재하며 사람의 건강에 유익한 작용을 하거나, 때로는 질병의 원인이 되기도 한다. 이러한 미생물을 상재균이라 합니다. 인체의 상재균 중 대부분은 위장관 내에 존재한다. 인간과 공생하는 미생물의 질량은 총 1㎏이 넘으며, 수적으로는 대략 100조 개 이상이다. 이와 같은 미생물 집단을 장내세균총이라 하고 이들은 장관 내부에서 하나의 생태계를 이루고 있다. 현재까지 밝혀진 장내세균총의 역할로는 체내의 대사, 영양, 에너지 이용과 관련된 역할, 선천 면역과 적응 면역의 조절, 장관 내 점막 상피의 발달과 생성, 병원체의 침입방지 등이 알려져 있다. 장내세균총은 개개인에 따라 미생물 종(species)과 균주(strain)에 상당한 차이가 있다. 어릴 때 접촉한 환경과 모체에서 기원한 미생물, 숙주의 유전자형에 따라 개인의 고유한 장내세균총의 구성을 보이게 된다. 그 외에도 장내세균총은 식습관, 나이, 약물, 수술, 방사선 치료, 스트레스, 숙주가 가지고 있는 질병에 의해 영향을 받는다. 장내세균총에 대해 영향을 미치는 인자가 다양하기 때문에 질병과의 관계를 규명하는 것이 쉽지 않으나 과민성 대장 증후군, 염증성 장질환, 비만, 변비, 지방간, 신생아 괴사성 장염, 알레르기 질환 등이 장내세균총과 관계가 있다고 알려져 있다.
프로바이오틱스란 ‘충분한 양을 투여할 때 숙주의 건강에 유익한, 살아있는 미생물’을 말한다. 지금까지 알려져 있는 대부분의 프로바이오틱스는 우리가 흔히 유산균이라고 알고 있는 종류가 거의 대부분이다. 프로바이오틱스로 인정받기 위해서는 위산, 담즙산에서 죽지 않고 소장까지 도달하여 장에서 증식하고 정착하여야 하며 장관 내에서 유익한 효과를 나타내어야 하고 독성이 없으며 병원성이 없어야 한다. 최근 과민성 대장 증후군이나 항생제 연관 설사, 염증성 장질환, 변비 등과 같은 대장 질환의 영역에서 최근 점차 프로바이오틱스의 사용을 시도해보는 추세이다. 과민성 대장 증후군이나 항생제 연관 설사에서는 일부에서 장내세균총의 조성에 변화를 일으키는 항생제 사용이나 감염성 장염을 앓은 과거력이 관련되어 있다. 따라서 이러한 경우에 프로바이오틱스를 이용하여 장내세균총을 정상적으로 회복시키고자 하는 시도를 하고 있다. 대표적인 프로바이오틱스로서 락토바실러스 속(Lactobacillus sp.) 유산균이 있다. 락토바실러스 속 미생물은 동형 또는 이형발효를 하는 젖산 간균으로서 사람을 포함한 동물의 장관 및 유제품이나 채소의 발효과정에서 흔히 볼 수 있다. 락토바실러스 속 미생물은 장내 pH를 산성으로 유지시켜 대장균(E.coli)이나 클로스트리디움(Clostridium)과 같은 유해균의 번식을 억제하고 설사와 변비를 개선할 뿐만 아니라 비타민 합성, 항암 작용, 혈청 콜레스테롤 저하 등의 역할을 하는 것으로 알려져 있다[Michael and Philippe, Probiotics and prebiotics: Effects on diarrhea, The journal of nutrition, Volume 137, March 2007, pages 803S-811S; Roberfroid, Prebiotics and probiotics: Are they functional foods?, American journal of clinical nutrition, Volume 71, June 2000, pages 1682S-1687S].
최근 소득수준이 높아짐에 따라 식생활 문화에 있어서 고칼로리 식품의 섭취가 늘어 비만 및 각종 성인질환 발병율이 높아지고 있다. 성인성 질환을 유발시키는 요인 중에서도 가장 주된 요인은 동물성 지방의 과다한 섭취로 인한 혈중 고콜레스테롤로서 고지혈증, 동맥경화증, 지질 관련 대사증후군과 같은 질환의 위험 지표가 된다. 콜레스테롤을 저하시키는 유산균의 선발에 대한 많은 연구를 토대로, 유산균에 의한 콜레스테롤 흡수의 저하 기작을 보통 세 가지로 설명할 수 있다(대한민국 등록특허 제10-0930251호 참조). 첫번째는 유산균이 장내에 정착 증식하면서 콜레스테롤을 흡착하여 배설시키는 것이고 두번째는 유산균이 담즙산을 흡착하여 배설시키는 것이다. 이런 경우 콜레스테롤은 담즙산의 전구체이므로 부족한 담즙산을 보충하기 위해 콜레스테롤을 이용하게 되어 결과적으로 장내 콜레스테롤 농도를 감소시킬 수 있다. 그리고 세번째 기작은 유산균이 포합담즙산(conjugated bile acid)을 탈포합시키는 작용이다. 간에서 생성된 프리 담즙산(free bile acid)은 소장에서 타우린 또는 글라이신과 결합하여 포합담즙산(conjugated bile acid)이 된다. 포합담즙산은 지질 용해도가 높아 소장에서 콜레스테롤 등의 지질 흡수를 용이하게 한다. 그러므로, 포합담즙산이 많은 경우 혈중으로 흡수되는 콜레스테롤양이 많아져 혈중 콜레스테롤 농도가 높아진다. 그러나, 탈포합된 담즙산(deconjugated bile acid)은 지질용해도가 낮아 콜레스테롤 등 지질의 혈중 이행을 저하시키는 작용을 한다. 따라서, 포합담즙산을 탈포합시키는 담즙산 분해효소(bile salt hydrolase)를 갖는 균주는 지질 용해도를 낮추어 소장에서 콜레스테롤의 흡수를 저하시킬 수 있다. 따라서, 인체에 안전하면서도 콜레스테롤 저하 기능이 우수한 균주를 개발하고 이를 의약품 또는 기능성 식품으로 적용하는 것이 필요하다. 이와 관련하여 대한민국 등록특허 제10-0774969호에는 장관에서 콜레스테롤 흡수를 억제하고 혈중 HDL 지단백을 높이고 LDL 지단백을 낮춰 혈중 지질 개선을 통하여 동맥경화를 예방할 수 있는 락토바실러스 플란타럼이 개시되어 있다. 또한, 미국 공개특허 제20110117629호에는 위장관에 부착하고 콜레스테롤을 제거할 수 있는 락토바실러스 플란타룸 BB9가 개시되어 있다. 그러나 대부분의 락토바실러스 속 유산균은 내산성 또는 내담즙성이 부족하여 인체에 경구투여시 소수만이 장에 도달하여 콜레스테롤 저하 기능을 수행하는 것으로 알려져 있다. 또한, 대한민국 등록특허공보 제10-0435168호에는 서열 1로 표현되는 내산성의 유산균 돌연변이 균주인 Lactobacillus fermentum JS 균주(기탁번호 : KCCM 10499) 및 이를 함유하는 혈당강하용, 항산화용, 과산화지질 생성 억제용 및 콜레스테롤 저하용 유산균 조성물이 개시되어 있다. 또한, 대한민국 공개특허공보 제10-2003-0064030호에는 위액 및 담즙산에 대한 내성이 우수하며, β-갈락토시다제를 생산하고, 리스테리아균 및 대장균에 대하여 항균활성을 가지는 락토바실러스 퍼멘툼(Lactobacillus fermentum) HY701 균주(기탁번호 KCCM 10351)이 개시되어 있다. 또한, 대한민국 공개특허공보 제10-2007-0121185호에는 위액과 담즙액에 안정하고, 우수한 유당분해효소 활성을 갖는 락토바실러스 퍼멘텀(Lactobacillus fermentum) ET 균주(KCTC 10955BP)가 개시되어 있다.
프로바이오틱 유산균은 위장관 내성에 기초하여 선별하는 것이 중요하다. 프로바이오틱 세균이 효과를 발휘하기 위해서는 장내 환경에서 생존할 수 있어야 하고, 장내 상피세포에 부착하여 장내에서 대량으로 서식하여야 한다[Salminen, S. et al., (1996) Clinical uses of probiotics for stabilizing the gut mucosal barrier: successful strains and future challenges. Antonie Van Leeuwenhoek 70:347-358; Conway, P. (1996) Selection criteria forprobiotic microorganisms. Asia Pacific J Clin Nutr 5:10-14]. 또한, 새로운 원천으로부터 선별된 유산균이 프로바이오틱스 용도로 사용되기 위해서는 안전성 시험 및 병원성 시험이 요구된다[Holzapfel and Schillinger 2002; Ji et al. 2013]. 구체적으로 인간이나 가축에 투여되는 미생물은 및 를 사용하기 위해 생체아민(biogenic amine)을 생성하지 않아야 한다. 생체아민(biogenic amine)은 열 처리에 의해서도 실활되지 않는 것으로 알려져 있다. 또한, 프로바이오틱스 용도로 사용되기 위해서 유산균은 점막방벽(mucosal barrier)을 파괴하지 않아야 하고 뮤신(micin)을 분해하지 않아야 한다. 점막방벽(mucosal barrier)의 파괴 및 장내 뮤신의 분해에 의해 내부 기관의 전위가 일어나면 균혈증을 야기할 수 있다(Zhou et al. 2001). 또한, 프로바이오틱스 용도로 사용되기 위해서 유산균은 유전되는 약물 내성 유전자를 소유하지 않아야 한다. 유전되는 약물 내성 유전자를 소유한 유산균을 투여하는 경우 약물 내성을 가진 장내 미생물의 발달을 야기할 수 있다(Sharma et al. 2014). 그러나, 대부분의 유산균은 다양한 항생제에 대해 고유한 내성을 보유하고 있는 것으로 알려져 있다[Saarela et al. 2000; Argyri et al. 2013].
본 발명은 종래의 기술적 배경하에서 도출된 것으로서, 본 발명의 일 목적은 프로바이오틱스로서 필요한 활성과 함께 인체에 유익한 다양한 기능성을 가지면서 식품학적으로 안전한 신규 유산균을 제공하는데에 있다.
또한, 본 발명의 일 목적은 신규 유산균의 다양한 용도를 제공하는데에 있다.
본 발명의 발명자들은 인도의 전통 음식인 발효 우유 커드(fermented cow milk curd)로부터 무수한 유산균을 스크리닝하고, 이 중 특정 락토바실러스 퍼멘텀 균주가 식품학적으로 안전하고 동시에 프로바이오틱스로서 필요한 활성과 함께 인체에 유익한 다양한 기능성을 가진다는 점을 확인하고, 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 일 목적을 해결하기 위하여, 본 발명의 일 예는 16S rDNA로 서열번호 1에 기재된 염기서열을 포함하고, 내산성, 내담즙산성, 장 상피세포 부착성, 항균 활성, 담즙산염 가수분해효소 활성 또는 콜레스테롤 저하 활성에서 선택되는 1종 이상의 성질을 갖는 것을 특징으로 하는 락토바실러스 퍼멘텀(Lactobacillus fermentum) 균주를 제공한다.
본 발명의 일 목적을 해결하기 위하여, 본 발명의 일 예는 락토바실러스 퍼멘텀(Lactobacillus fermentum) MJM60397(수탁번호 : KACC 92133P) 또는 이의 배양물을 유효성분으로 포함하는 프로바이오틱 조성물을 제공한다.
본 발명의 일 목적을 해결하기 위하여, 본 발명의 일 예는 락토바실러스 퍼멘텀(Lactobacillus fermentum) MJM60397(수탁번호 : KACC 92133P), 이의 배양물, 이의 파쇄물 또는 이의 추출물을 유효성분으로 포함하는 항균용 조성물을 제공한다.
본 발명의 일 목적을 해결하기 위하여, 본 발명의 일 예는 락토바실러스 퍼멘텀(Lactobacillus fermentum) MJM60397(수탁번호 : KACC 92133P), 이의 배양물, 이의 파쇄물 또는 이의 추출물을 유효성분으로 포함하는 콜레스테롤 저하용 조성물을 제공한다.
본 발명의 일 목적을 해결하기 위하여, 본 발명의 일 예는 락토바실러스 퍼멘텀(Lactobacillus fermentum) MJM60397(수탁번호 : KACC 92133P), 이의 배양물, 이의 파쇄물 또는 이의 추출물을 유효성분으로 포함하고, 고콜레스테롤혈증, 고지혈증, 고중성지방혈증 또는 이상지질혈증을 예방 또는 치료하기 위해 사용되는 약학 조성물을 제공한다.
본 발명의 일 목적을 해결하기 위하여, 본 발명의 일 예는 락토바실러스 퍼멘텀(Lactobacillus fermentum) MJM60397(수탁번호 : KACC 92133P), 이의 배양물, 이의 파쇄물 또는 이의 추출물을 유효성분으로 포함하고, 고콜레스테롤혈증, 고지혈증, 고중성지방혈증 또는 이상지질혈증을 예방 또는 개선하기 위해 사용되는 식품 조성물을 제공한다.
본 발명에 따른 특정 락토바실러스 퍼멘텀(Lactobacillus fermentum) 균주는 내산성, 내담즙산성 또는 장 상피세포 부착성이 우수하여 개체에 경구투여시 대부분이 장에 도달할 수 있고, 장내에서 유해균의 번식을 효과적으로 억제할 수 있기 때문에 프로바이오틱 소재로 유용하다. 또한, 본 발명에 따른 특정 락토바실러스 퍼멘텀(Lactobacillus fermentum) 균주는 항균 활성이 우수하여 항균용 식의약 소재로 사용될 수 있다. 또한, 본 발명에 따른 특정 락토바실러스 퍼멘텀(Lactobacillus fermentum) 균주는 콜레스테롤 저하 활성이 우수하여 고콜레스테롤혈증, 고지혈증, 고중성지방혈증 또는 이상지질혈증을 예방, 개선 또는 치료하는데에 유용한 식의약 소재로 사용될 수 있다.
도 1은 균주 MJM60397의 진화관계도(phylogenetic tree)를 나타낸 도면이다.
도 2는 락토바실러스 퍼멘텀(Lactobacillus fermentum) MJM60397 균주의 구강-위장관 통과 모사 조건에서의 내성 평가 결과를 나타낸 그래프이다.
도 3은 락토바실러스 퍼멘텀(Lactobacillus fermentum) MJM60397 균주의 Caco-2 세포 단일층(monolayer)에 대한 부착능 실험 결과를 나타낸 그래프이다.
도 4는 락토바실러스 퍼멘텀(Lactobacillus fermentum) MJM60397 균주의 담즙산염 가수분해효소 활성 측정 결과를 나타낸 것이다.
도 5는 고콜레스테롤혈증(hypercholesterolemia) 유도 생쥐에게 락토바실러스 퍼멘텀(Lactobacillus fermentum) MJM60397 균주 등 다양한 시료를 경구투여하였을 때의 몸무게 변화를 나타낸 것이고, 도 6은 고콜레스테롤혈증(hypercholesterolemia) 유도 생쥐에게 락토바실러스 퍼멘텀(Lactobacillus fermentum) MJM60397 균주 등 다양한 시료를 경구투여하였을 때의 식이 섭취량 변화를 나타낸 것이다.
도 7은 고콜레스테롤혈증(hypercholesterolemia) 유도 생쥐에게 락토바실러스 퍼멘텀(Lactobacillus fermentum) MJM60397 균주 등 다양한 시료를 경구투여하였을 때의 혈장 총 콜레스테롤 함량을 나타낸 것이고, 도 8은 고콜레스테롤혈증(hypercholesterolemia) 유도 생쥐에게 락토바실러스 퍼멘텀(Lactobacillus fermentum) MJM60397 균주 등 다양한 시료를 경구투여하였을 때의 혈장 HDL-콜레스테롤 함량을 나타낸 것이고, 도 9는 고콜레스테롤혈증(hypercholesterolemia) 유도 생쥐에게 락토바실러스 퍼멘텀(Lactobacillus fermentum) MJM60397 균주 등 다양한 시료를 경구투여하였을 때의 혈장 LDL-콜레스테롤 함량을 나타낸 것이다.
도 10은 고콜레스테롤혈증(hypercholesterolemia) 유도 생쥐에게 락토바실러스 퍼멘텀(Lactobacillus fermentum) MJM60397 균주 등 다양한 시료를 경구투여하였을 때의 간 조직 총 콜레스테롤 함량을 나타낸 것이고, 도 11은 고콜레스테롤혈증(hypercholesterolemia) 유도 생쥐에게 락토바실러스 퍼멘텀(Lactobacillus fermentum) MJM60397 균주 등 다양한 시료를 경구투여하였을 때의 간 조직 HDL-콜레스테롤 함량을 나타낸 것이고, 도 12는 고콜레스테롤혈증(hypercholesterolemia) 유도 생쥐에게 락토바실러스 퍼멘텀(Lactobacillus fermentum) MJM60397 균주 등 다양한 시료를 경구투여하였을 때의 간 조직 LDL-콜레스테롤 함량을 나타낸 것이다.
도 13은 고콜레스테롤혈증(hypercholesterolemia) 유도 생쥐에게 락토바실러스 퍼멘텀(Lactobacillus fermentum) MJM60397 균주 등 다양한 시료를 경구투여하였을 때의 Fecal 총 콜레스테롤 함량을 나타낸 것이고, 도 14는 고콜레스테롤혈증(hypercholesterolemia) 유도 생쥐에게 락토바실러스 퍼멘텀(Lactobacillus fermentum) MJM60397 균주 등 다양한 시료를 경구투여하였을 때의 Fecal HDL-콜레스테롤 함량을 나타낸 것이고, 도 15는 고콜레스테롤혈증(hypercholesterolemia) 유도 생쥐에게 락토바실러스 퍼멘텀(Lactobacillus fermentum) MJM60397 균주 등 다양한 시료를 경구투여하였을 때의 Fecal LDL-콜레스테롤 함량을 나타낸 것이고, 도 16은 고콜레스테롤혈증(hypercholesterolemia) 유도 생쥐에게 락토바실러스 퍼멘텀(Lactobacillus fermentum) MJM60397 균주 등 다양한 시료를 경구투여하였을 때의 Fecal 총 담즙산 함량을 나타낸 것이다.
도 17은 다양한 배지에서 락토바실러스 퍼멘텀(Lactobacillus fermentum) MJM60397 균주를 배양하였을 때 락토바실러스 퍼멘텀(Lactobacillus fermentum) MJM60397 균주의 증식 곡선을 나타낸 것이다.
도 2는 락토바실러스 퍼멘텀(Lactobacillus fermentum) MJM60397 균주의 구강-위장관 통과 모사 조건에서의 내성 평가 결과를 나타낸 그래프이다.
도 3은 락토바실러스 퍼멘텀(Lactobacillus fermentum) MJM60397 균주의 Caco-2 세포 단일층(monolayer)에 대한 부착능 실험 결과를 나타낸 그래프이다.
도 4는 락토바실러스 퍼멘텀(Lactobacillus fermentum) MJM60397 균주의 담즙산염 가수분해효소 활성 측정 결과를 나타낸 것이다.
도 5는 고콜레스테롤혈증(hypercholesterolemia) 유도 생쥐에게 락토바실러스 퍼멘텀(Lactobacillus fermentum) MJM60397 균주 등 다양한 시료를 경구투여하였을 때의 몸무게 변화를 나타낸 것이고, 도 6은 고콜레스테롤혈증(hypercholesterolemia) 유도 생쥐에게 락토바실러스 퍼멘텀(Lactobacillus fermentum) MJM60397 균주 등 다양한 시료를 경구투여하였을 때의 식이 섭취량 변화를 나타낸 것이다.
도 7은 고콜레스테롤혈증(hypercholesterolemia) 유도 생쥐에게 락토바실러스 퍼멘텀(Lactobacillus fermentum) MJM60397 균주 등 다양한 시료를 경구투여하였을 때의 혈장 총 콜레스테롤 함량을 나타낸 것이고, 도 8은 고콜레스테롤혈증(hypercholesterolemia) 유도 생쥐에게 락토바실러스 퍼멘텀(Lactobacillus fermentum) MJM60397 균주 등 다양한 시료를 경구투여하였을 때의 혈장 HDL-콜레스테롤 함량을 나타낸 것이고, 도 9는 고콜레스테롤혈증(hypercholesterolemia) 유도 생쥐에게 락토바실러스 퍼멘텀(Lactobacillus fermentum) MJM60397 균주 등 다양한 시료를 경구투여하였을 때의 혈장 LDL-콜레스테롤 함량을 나타낸 것이다.
도 10은 고콜레스테롤혈증(hypercholesterolemia) 유도 생쥐에게 락토바실러스 퍼멘텀(Lactobacillus fermentum) MJM60397 균주 등 다양한 시료를 경구투여하였을 때의 간 조직 총 콜레스테롤 함량을 나타낸 것이고, 도 11은 고콜레스테롤혈증(hypercholesterolemia) 유도 생쥐에게 락토바실러스 퍼멘텀(Lactobacillus fermentum) MJM60397 균주 등 다양한 시료를 경구투여하였을 때의 간 조직 HDL-콜레스테롤 함량을 나타낸 것이고, 도 12는 고콜레스테롤혈증(hypercholesterolemia) 유도 생쥐에게 락토바실러스 퍼멘텀(Lactobacillus fermentum) MJM60397 균주 등 다양한 시료를 경구투여하였을 때의 간 조직 LDL-콜레스테롤 함량을 나타낸 것이다.
도 13은 고콜레스테롤혈증(hypercholesterolemia) 유도 생쥐에게 락토바실러스 퍼멘텀(Lactobacillus fermentum) MJM60397 균주 등 다양한 시료를 경구투여하였을 때의 Fecal 총 콜레스테롤 함량을 나타낸 것이고, 도 14는 고콜레스테롤혈증(hypercholesterolemia) 유도 생쥐에게 락토바실러스 퍼멘텀(Lactobacillus fermentum) MJM60397 균주 등 다양한 시료를 경구투여하였을 때의 Fecal HDL-콜레스테롤 함량을 나타낸 것이고, 도 15는 고콜레스테롤혈증(hypercholesterolemia) 유도 생쥐에게 락토바실러스 퍼멘텀(Lactobacillus fermentum) MJM60397 균주 등 다양한 시료를 경구투여하였을 때의 Fecal LDL-콜레스테롤 함량을 나타낸 것이고, 도 16은 고콜레스테롤혈증(hypercholesterolemia) 유도 생쥐에게 락토바실러스 퍼멘텀(Lactobacillus fermentum) MJM60397 균주 등 다양한 시료를 경구투여하였을 때의 Fecal 총 담즙산 함량을 나타낸 것이다.
도 17은 다양한 배지에서 락토바실러스 퍼멘텀(Lactobacillus fermentum) MJM60397 균주를 배양하였을 때 락토바실러스 퍼멘텀(Lactobacillus fermentum) MJM60397 균주의 증식 곡선을 나타낸 것이다.
이하, 본 발명에서 사용한 용어를 설명한다.
본 발명에서 사용되는 용어 "배양물"이란 미생물을 공지의 액체 배지 또는 고체 배지에서 배양시켜 수득한 산물을 의미하며, 미생물이 포함되는 개념이다.
본 발명에서 "약학적으로 허용가능한" 및 "식품학적으로 허용가능한"이란 생물체를 상당히 자극하지 않고 투여 활성 물질의 생물학적 활성 및 특성을 저해하지 않는 것을 의미한다.
본 발명에서 사용되는 용어 "예방"은 본 발명의 조성물의 투여로 특정 질환의 증상을 억제하거나 진행을 지연시키는 모든 행위를 의미한다.
본 발명에서 사용되는 용어 "치료"는 본 발명의 조성물의 투여로 특정 질환의 증상을 호전 또는 이롭게 변경시키는 모든 행위를 의미한다.
본 발명에서 사용되는 용어 "개선"은 치료되는 상태와 관련된 파라미터, 예를 들면 증상의 정도를 적어도 감소시키는 모든 행위를 의미한다.
본 발명에서 사용되는 용어 "투여"는 임의의 적절한 방법으로 개체에 소정의 본 발명의 조성물을 제공하는 것을 의미한다. 이 때, 개체는 본 발명의 조성물을 투여하여 특정 질환의 증상이 호전될 수 있는 질환을 가진 인간, 원숭이, 개, 염소, 돼지 또는 쥐 등 모든 동물을 의미한다.
본 발명에서 사용되는 용어 "약학적으로 유효한 양"은 의학적 치료에 적용 가능한 합리적인 수혜 또는 위험 비율로 질환을 치료하기에 충분한 양을 의미하며, 이는 개체의 질환의 종류, 중증도, 약물의 활성, 약물에 대한 민감도, 투여 시간, 투여 경로 및 배출비율, 치료기간, 동시에 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 결정될 수 있다.
이하, 본 발명을 상세하게 설명한다.
본 발명의 일 측면은 프로바이오틱스로서 필요한 활성과 함께 인체에 유익한 다양한 기능성을 가지면서 식품학적으로 안전한 신규 유산균에 관한 것이다.
본 발명의 일 예에 따른 신규 유산균은 16S rDNA로 서열번호 1에 기재된 염기서열을 포함하는 락토바실러스 퍼멘텀(Lactobacillus fermentum)이다. 또한, 상기 16S rDNA로 서열번호 1에 기재된 염기서열을 포함하는 락토바실러스 퍼멘텀(Lactobacillus fermentum)은 내산성, 내담즙산성, 장 상피세포 부착성, 항균 활성, 담즙산염 가수분해효소 활성 또는 콜레스테롤 저하 활성 등에서 선택되는 1종 이상의 성질을 갖는다. 또한, 상기 16S rDNA로 서열번호 1에 기재된 염기서열을 포함하는 락토바실러스 퍼멘텀(Lactobacillus fermentum)은 바람직하게는 락토바실러스 퍼멘텀(Lactobacillus fermentum) MJM60397(수탁번호 : KACC 92133P)이다.
본 발명의 다른 측면은 신규 락토바실러스 퍼멘텀(Lactobacillus fermentum) 균주의 다양한 용도에 관한 것이다. 본 발명은 신규 락토바실러스 퍼멘텀(Lactobacillus fermentum) 균주의 다양한 용도로 프로바이오틱 조성물, 항균용 조성물, 콜레스테롤 저하용 조성물을 제공한다. 또한, 본 발명은 신규 락토바실러스 퍼멘텀(Lactobacillus fermentum) 균주의 용도로 고콜레스테롤혈증, 고지혈증, 고중성지방혈증 또는 이상지질혈증을 예방, 개선 또는 치료하기 위해 사용되는 조성물을 제공한다.
본 발명에서 프로바이오틱(Probiotic) 조성물은 생체의 활성을 도와 건강을 증진시킬 수 있는 미생물 이용 제품을 통칭하며, 통상 증생제 또는 생균제 등으로 포함되는 제품군을 포함한다. 본 발명의 일 예에 따른 프로바이오틱 조성물은 16S rDNA로 서열번호 1에 기재된 염기서열을 포함하는 락토바실러스 퍼멘텀(Lactobacillus fermentum) 또는 이의 배양물을 유효성분으로 포함한다. 또한, 본 발명의 일 예에 따른 프로바이오틱 조성물은 바람직하게는 락토바실러스 퍼멘텀(Lactobacillus fermentum) MJM60397(수탁번호 : KACC 92133P) 또는 이의 배양물을 유효성분으로 포함한다. 본 발명의 프로바이오틱 조성물은 신규 락토바실러스 퍼멘텀(Lactobacillus fermentum) 균주의 배양액을 동결건조하여 신규 락토바실러스 퍼멘텀(Lactobacillus fermentum) 균주를 제제화하는 과정에서 생존 안정성을 향상시킬 수 있는 동해방지제(cryoprotectant)를 더 포함할 수 있다. 상기 동해방지제(cryoprotectant)의 예로는 유청 단백질 농축물, 대두 단백질 농축물, 탈지유(skim milk) 분말 또는 말토덱스트린(maltodextrin) 분말 등이 있다. 본 발명의 프로바이오틱 조성물은 바람직하게는 탈지유(skim milk) 분말 및 말토덱스트린(maltodextrin) 분말을 더 포함한다.
본 발명에서 유산균의 배양물은 락토바실러스 퍼멘텀(Lactobacillus fermentum) 균주를 배지에서 배양시켜 수득한 산물로서, 상기 배지는 공지의 액체 배지 또는 고체 배지에서 선택될 수 있으며, 예를 들어 MRS 액체 배지, MRS 한천 배지일 수 있다.
본 발명의 프로바이오틱 조성물은 유효성분으로 내산성, 내담즙산성, 장 상피세포 부착성, 항균 활성, 담즙산염 가수분해효소 활성 또는 콜레스테롤 저하 활성에서 선택되는 1종 이상의 성질을 갖는 락토바실러스 퍼멘텀(Lactobacillus fermentum)을 포함하고 있기 때문에 장내세균총의 정상화, 장 건강의 유지, 면역 기능 개선, 장내 유해세균 억제에 의한 정장작용, 혈중 콜레스테롤의 감소, 비만, 지방간, 알레르기 질환 등의 예방 또는 개선 효과를 가질 수 있다.
본 발명의 일 예에 따른 항균용 조성물은 16S rDNA로 서열번호 1에 기재된 염기서열을 포함하는 락토바실러스 퍼멘텀(Lactobacillus fermentum), 이의 배양물, 이의 파쇄물 또는 이의 추출물을 유효성분으로 포함한다. 또한, 본 발명의 일 예에 따른 항균용 조성물은 바람직하게는 락토바실러스 퍼멘텀(Lactobacillus fermentum) MJM60397(수탁번호 : KACC 92133P), 이의 배양물, 이의 파쇄물 또는 이의 추출물을 유효성분으로 포함한다. 본 발명의 항균용 조성물은 신규 락토바실러스 퍼멘텀(Lactobacillus fermentum) 균주의 배양액을 동결건조하여 신규 락토바실러스 퍼멘텀(Lactobacillus fermentum) 균주를 제제화하는 과정에서 생존 안정성을 향상시킬 수 있는 동해방지제(cryoprotectant)를 더 포함할 수 있다. 상기 동해방지제(cryoprotectant)의 예로는 유청 단백질 농축물, 대두 단백질 농축물, 탈지유(skim milk) 분말 또는 말토덱스트린(maltodextrin) 분말 등이 있다. 본 발명의 항균용 조성물은 바람직하게는 탈지유(skim milk) 분말 및 말토덱스트린(maltodextrin) 분말을 더 포함한다. 본 발명의 항균용 조성물은 다양한 유해 세균에 대한 항균 활성을 가지는 락토바실러스 퍼멘텀(Lactobacillus fermentum) 등을 포함하고 있기 때문에 유해 세균의 감염, 유해 세균의 감염에 의해 발생하는 염증반응, 유해 세균의 감염에 의해 발생하는 질환, 유해 세균에 의해 발생하는 부패 등의 예방 또는 개선 효과를 가질 수 있다. 상기 유해 세균의 예로는 항생제 내성 세균(methicillin-resistant Staphylococcus aureus), 표피포도상 구균(Staphylococcus epidermidis), 녹농균(Pseudomonas aeruginosa), Salmonella typhimurium, Salmonella choleraesuis, Salmonella gallinarum, Escherichia coli, Staphylococcus aureus 등과 같은 병원균이 있으나 반드시 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 일 예에 따른 콜레스테롤 저하용 조성물은 16S rDNA로 서열번호 1에 기재된 염기서열을 포함하는 락토바실러스 퍼멘텀(Lactobacillus fermentum), 이의 배양물, 이의 파쇄물 또는 이의 추출물을 유효성분으로 포함한다. 또한, 본 발명의 일 예에 따른 콜레스테롤 저하용 조성물은 바람직하게는 락토바실러스 퍼멘텀(Lactobacillus fermentum) MJM60397(수탁번호 : KACC 92133P), 이의 배양물, 이의 파쇄물 또는 이의 추출물을 유효성분으로 포함한다. 본 발명의 콜레스테롤 저하용 조성물은 신규 락토바실러스 퍼멘텀(Lactobacillus fermentum) 균주의 배양액을 동결건조하여 신규 락토바실러스 퍼멘텀(Lactobacillus fermentum) 균주를 제제화하는 과정에서 생존 안정성을 향상시킬 수 있는 동해방지제(cryoprotectant)를 더 포함할 수 있다. 상기 동해방지제(cryoprotectant)의 예로는 유청 단백질 농축물, 대두 단백질 농축물, 탈지유(skim milk) 분말 또는 말토덱스트린(maltodextrin) 분말 등이 있다. 본 발명의 콜레스테롤 저하용 조성물은 바람직하게는 탈지유(skim milk) 분말 및 말토덱스트린(maltodextrin) 분말을 더 포함한다.
본 발명의 일 예에 따른 고콜레스테롤혈증, 고지혈증, 고중성지방혈증 또는 이상지질혈증을 예방, 개선 또는 치료하기 위해 사용되는 조성물은 16S rDNA로 서열번호 1에 기재된 염기서열을 포함하는 락토바실러스 퍼멘텀(Lactobacillus fermentum), 이의 배양물, 이의 파쇄물 또는 이의 추출물을 유효성분으로 포함한다. 상기 고콜레스테롤혈증은 혈중에 콜레스테롤이 증가된 상태로서 총콜레스테롤과 LDL-콜레스테롤이 높게 나타난다. 상기 고지혈증은 혈중에 콜레스테롤과 중성지방을 포함한 지질이 증가된 상태를 말한다. 고지혈증은 비록 증상을 나타내지 않을지라도 동맥경화나 심근경색과 같은 관상동맥질환의 위험을 증가시킬 수가 있다. 상기 고중성지방혈증은 혈중에 중성지방이 증가된 상태를 말한다. 상기 이상지질혈증은 혈중에 총콜레스테롤, LDL-콜레스테롤, 중성지방이 증가된 상태거나 HDL-콜레스테롤이 감소된 상태를 말한다. 대부분 비만, 당뇨병, 음주와 같은 원인에 의해서 이상지질혈증이 발생할 수 있다. 또한, 본 발명의 일 예에 따른 고콜레스테롤혈증, 고지혈증, 고중성지방혈증 또는 이상지질혈증을 예방, 개선 또는 치료하기 위해 사용되는 조성물은 바람직하게는 락토바실러스 퍼멘텀(Lactobacillus fermentum) MJM60397(수탁번호 : KACC 92133P), 이의 배양물, 이의 파쇄물 또는 이의 추출물을 유효성분으로 포함한다. 본 발명의 고콜레스테롤혈증, 고지혈증, 고중성지방혈증 또는 이상지질혈증을 예방, 개선 또는 치료하기 위해 사용되는 조성물은 신규 락토바실러스 퍼멘텀(Lactobacillus fermentum) 균주의 배양액을 동결건조하여 신규 락토바실러스 퍼멘텀(Lactobacillus fermentum) 균주를 제제화하는 과정에서 생존 안정성을 향상시킬 수 있는 동해방지제(cryoprotectant)를 더 포함할 수 있다. 상기 동해방지제(cryoprotectant)의 예로는 유청 단백질 농축물, 대두 단백질 농축물, 탈지유(skim milk) 분말 또는 말토덱스트린(maltodextrin) 분말 등이 있다. 본 발명의 고콜레스테롤혈증, 고지혈증, 고중성지방혈증 또는 이상지질혈증을 예방, 개선 또는 치료하기 위해 사용되는 조성물은 바람직하게는 탈지유(skim milk) 분말 및 말토덱스트린(maltodextrin) 분말을 더 포함한다.
본 발명에서 상기 프로바이오틱 조성물, 항균용 조성물, 콜레스테롤 저하용 조성물, 고지혈증, 고중성지방혈증 또는 이상지질혈증을 예방, 개선 또는 치료하기 위해 사용되는 조성물은 사용 목적 내지 양상에 따라 약학 조성물, 식품 첨가제, 식품 조성물(특히 건강 기능 식품) 또는 사료 첨가제 등으로 구체화될 수 있다. 또한, 유효성분인 신규 락토바실러스 퍼멘텀(Lactobacillus fermentum) 등의 함량도 조성물의 구체적인 형태, 사용 목적 내지 양상에 따라 다양한 범위에서 조정될 수 있다.
본 발명에 따른 약학 조성물에서 유효성분인 신규 락토바실러스 퍼멘텀(Lactobacillus fermentum), 이의 배양물, 이의 파쇄물 또는 이의 추출물의 함량은 크게 제한되지 않으며, 예를 들어 조성물 총 중량을 기준으로 0.01~99 중량%, 바람직하게는 0.5~50 중량%, 더 바람직하게는 1~30 중량%일 수 있다. 또한, 본 발명에 따른 약학 조성물은 유효성분 외에 약학적으로 허용가능한 담체, 부형제 또는 희석제와 같은 첨가제를 더 포함할 수 있다. 본 발명의 약학 조성물에 포함될 수 있는 담체, 부형제 및 희석제로는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 들 수 있다. 또한, 본 발명의 약학 조성물은 신규 락토바실러스 퍼멘텀(Lactobacillus fermentum), 이의 배양물, 이의 파쇄물 또는 이의 추출물 외에 프로바이오틱 활성, 항균 활성 또는 콜레스테롤 저하 활성을 갖는 공지의 유효성분을 1종 이상 더 함유할 수 있다. 본 발명의 약학 조성물은 통상의 방법에 의해 경구 투여를 위한 제형 또는 비경구 투여를 위한 제형으로 제제화될 수 있고, 제제화할 경우 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제될 수 있다. 경구 투여를 위한 고형 제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형 제제는 유효성분에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 칼슘카보네이트(Calcium carbonate), 수크로스(Sucrose), 락토오스(Lactose) 또는 젤라틴 등을 섞어 조제될 수 있다. 또한, 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스티레이트 탈크 같은 윤활제들도 사용될 수 있다. 경구 투여를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제 및 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조제제, 좌제가 포함될 수 있다. 비수성용제, 현탁용제로는 프로필렌글리콜(Propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로제라틴 등이 사용될 수 있다. 더 나아가 당 분야의 적정한 방법으로 또는 Remington's Pharmaceutical Science(최근판), Mack Publishing Company, Easton PA에 개시되어 있는 방법을 이용하여 각 질환에 따라 또는 성분에 따라 바람직하게 제제화할 수 있다. 본 발명의 약학 조성물은 목적하는 방법에 따라 인간을 포함한 포유류에 경구 투여되거나 비경구 투여될 수 있으며, 비경구 투여 방식으로는 피부 외용, 복강내주사, 직장내주사, 피하주사, 정맥주사, 근육내 주사 또는 흉부내 주사 주입방식 등이 있다. 본 발명의 약학 조성물의 투여량은 약학적으로 유효한 양이라면 크게 제한되지 않으며, 환자의 체중, 연령, 성별, 건강상태, 식이, 투여시간, 투여방법, 배설율 및 질환의 중증도에 따라 그 범위가 다양하다. 본 발명의 약학 조성물의 통상적인 1일 투여량은 크게 제한되지 않으나 바람직하게는 유효성분을 기준으로 할 때 0.1 내지 3000 ㎎/㎏이고, 더 바람직하게는 1 내지 2000 ㎎/㎏이며, 하루 1회 또는 수회로 나누어 투여될 수 있다.
또한, 본 발명에 따른 식품 조성물에서 유효성분인 신규 락토바실러스 퍼멘텀(Lactobacillus fermentum), 이의 배양물, 이의 파쇄물 또는 이의 추출물의 함량은 조성물 총 중량을 기준으로 0.01~99 중량%, 바람직하게는 0.1~50 중량%, 더 바람직하게는 0.5~25 중량%이나, 이에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 식품 조성물은 환제, 분말, 과립, 침제, 정제, 캡슐, 또는 액제 등의 형태를 포함하며, 구체적인 식품의 예로는 육류, 소시지, 빵, 초콜릿, 캔디류, 스넥류, 과자류, 피자, 라면, 기타 면류, 껌류, 아이스크림류를 포함한 낙농제품, 각종 스프, 음료수, 차, 기능수, 드링크제, 알코올음료 및 비타민 복합제 등이 있으며, 통상적인 의미에서의 건강식품을 모두 포함한다. 본 발명의 식품 조성물은 유효성분 외에 식품학적으로 허용 가능한 담체, 여러 가지 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로서 함유할 수 있다. 또한, 본 발명의 식품 조성물은 여러 가지 영양제, 비타민, 전해질, 풍미제, 착색제, 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알코올, 탄산음료에 사용되는 탄산화제 등을 함유할 수 있다. 그 밖에 본 발명의 식품 조성물은 천연 과일주스, 과일주스 음료 및 야채 음료의 제조를 위한 과육을 함유할 수 있다. 이러한 성분들은 독립적으로 또는 혼합하여 사용할 수 있다. 상술한 천연 탄수화물은 포도당, 과당과 같은 모노사카라이드, 말토스, 슈크로스와 같은 디사카라이드, 및 덱스트린, 사이클로덱스트린과 같은 폴리사카라이드, 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등의 당알코올이다. 향미제로는 타우마틴, 스테비아 추출물과 같은 천연 향미제나 사카린, 아스파르탐과 같은 합성 향미제 등을 사용할 수 있다.
이하, 본 발명을 실시예를 통하여 보다 구체적으로 설명한다. 다만, 하기 실시예는 본 발명의 기술적 특징을 명확하게 예시하기 위한 것일뿐, 본 발명의 보호범위를 한정하는 것은 아니다.
1. 유산균의 분리 및 동정
(1) 프로바이오틱스 활성을 갖는 후보 유산균의 분리
후보 유산균은 발효 우유 커드(fermented cow milk curd)로부터 스크리닝 되었다. 발효 우유 커드(fermented cow milk curd)는 남쪽 인도의 전통 음식으로서 적어도 30년 이상 인간에 의해 안전하게 소비되어온 식품이다. 후보 유산균의 스크리닝은 생물 분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 알려진 방법과 유산균에 선택적인 MRS 배지(Difco, USA)를 사용하여 수행하였다. 구체적으로, 발효 우유 커드(fermented cow milk curd)의 희석액을 유산균에 선택적인 MRS 배지에 도말한 후 37℃에서 약 24시간 동안 배양하였다. 이후, 콜로니를 형성한 후보 균주들을 분리하고 해당 배지에 계대배양한 후, 해당 균주를 순수분리 하였다.
(2) 최종 유산균의 선별 및 동정
프로바이오틱 유산균은 대장균 및 다른 장내 세균(enteric bacteria)과 같은 그람 음성 세균의 성장을 억제하여야 하고, 용혈 활성(hemolytic activity), 바이오아민 생성(bioamine production), 뮤신 분해(mucin degradation), 항생제 감수성(antibiotic susceptibility)과 같은 인비트로(in vitro) 안전성 평가에서 활성을 보이지 않아야 한다. 상기 기준에 따라 최종 유산균을 선별하고, 선별된 최종 유산균의 균주 명을 "MJM60397"로 정하였다. 이후, 선별된 최종 유산균에 대해 계통학적 분석(phylogenetic analysis)을 수행하였다. 먼저, 유전체 DNA 분리 키트(genomic DNA isolation kit; GeneALL, Seoul, Republic of Korea)를 이용하여 제조자의 사용설명서에 따라 균주의 유전체 DNA를 분리하였다. 이후, 균주의 16S rDNA을 증폭시키기 위해 순방향 프라이머인 27F((5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3')와 역방향 프라이머인 1492R(5'-GGTTACCT TGTTACGACTT-3')를 이용하여 PCR을 수행하였다. 이후, 솔젠트사(SolGent sequencing company, Republic of Korea)에 의뢰하여 균주의 전장에 가까운 부분 16S rDNA 염기서열을 분석하였다. 이때, 프라이머로 27F((5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3')와 785F(5'-GGATTAGATACCCTGGTA-3')를 사용하였다. 그 결과, 균주 MJM60397의 16S rDNA는 서열번호 1의 연속 염기서열을 갖는 것으로 나타났다. 이후, 균주 MJM60397의 16S rDNA 염기서열을 BLAST 프로그램을 이용하여 EzTaxon 비교하고, MEGA 6 소프트웨어(Tamura et al. 2013)를 이용하여 균주 MJM60397의 진화관계도(phylogenetic tree)를 완성하였다.
도 1은 균주 MJM60397의 진화관계도(phylogenetic tree)를 나타낸 도면이다. 도 1에서 보이는 바와 같이 균주 MJM60397의 16S rDNA 염기서열은 락토바실러스 퍼멘텀(Lactobacillus fermentum)의 16S rDNA와 99% 이상의 상동성을 보였다. 이를 통해 균주 MJM60397의 종을 락토바실러스 퍼멘텀(Lactobacillus fermentum)으로 확정하였다.
(3) 유산균의 수탁 정보
본 발명의 발명자들은 락토바실러스 퍼멘텀(Lactobacillus fermentum) MJM60397 균주를 2016년 6월 30일에 공인기탁기관인 국립농업과학원 농업미생물은행(주소 : 대한민국 전라북도 전주시 완산구 농생명로 370)에 특허기탁 하여 수탁번호 KACC 92133P를 부여받았다.
2.
락토바실러스
퍼멘텀(
Lactobacillus
fermentum
)
MJM60397
균주의
인비트
로(in vitro) 안전성 평가
(1) 생체 유래 아민 생성 평가
L-phenlyalanine, L-lysine, L-tryptophan, L-tyrosine, L-argnine, L-ornithine, L-histidine과 같은 아미노산을 각각 추가한 decarboxylase 배지에서 시험 균주를 배양한 후, Bover-Cid와 Holzapfel의 방법(Bover-Cid S, Hozapfel WH. Improved screening procedure for biogenic amine production by lactic acid bacteria. International Journal of Food Microbiology, 1999)에 따라 생체 유래 아민 생성 여부를 확인하였다.
Composition of Bover-Cid and Holzapfel medium
Tryptone : 0.5 wt%; yeast extract : 0.5 wt%; beef extract : 0.5 wt%; sodium chloride : 0.25 wt%; glucose : 0.05 wt%; tween 80 : 0.1 wt%, MgSO4 : 0.02 wt%; MnSO4 : 0.005 wt%; FeSO4 : 0.004 wt%; Ammonium citrate : 0.2 wt%; Thiamine : 0.001 wt%; dipotassium phosphate : 0.2 wt%; calcium carbonate : 0.01 wt%; pyridoxal 5-phosphate : 0.005 wt%; Amino acid(one of the amino acid listed above) : 1 wt%; bromocresol purple : 0.006 wt%; agar 2 wt%; pH : 5.3
(2) 뮤신 분해 평가
시험 균주의 뮤신 분해 여부는 0.3% 뮤신(mucin)이 공급된 아가로스 배지를 사용하여 확인하였다. 상기 배지는 trypton 7.5 g/ℓ; casitone 7.5 g/ℓ; yeast extract 3.0 g/ℓ; meat extract 5.0 g/ℓ; NaCl 5.0 g/ℓ; K2HPO4·3H2O 3.0 g/ℓ; KH2PO4 0.5 g/ℓ; MgSO4·7H2O 0.5 g/ℓ; cysteine HCl 0.5 g/ℓ; resazurin 0.002 g/ℓ; D-(+)-glucose 3 g/ℓ; purified HGM 0.5 g/ℓ 및 agarose 1.5 g/ℓ를 기본 성분으로 포함한다. 배지의 pH는 2N NaOH 수용액을 사용하여 약 7.2로 조정하였다. 시험 균주의 24시간 배양액 10 ㎕를 페트리디쉬 안의 아가로스 배지 위에 접종하고, 37℃에서 혐기적으로 72시간 동안 배양하였다. 이후, 배지를 착색제(0.1% Amido black in 3.5 M acetic acid)로 30분 동안 착색하고 콜로니 주변에 뮤신 분해 영역(mucin lysis zone)이 나타날 때까지 1.2M 아세트산으로 세척하였다. 뮤신 분해 활성은 뮤신 분해 영역의 크기로 정의되었다.
(3) 용혈 활성 평가
시험 균주의 용혈 활성은 5% 탈섬유소 양 혈액(defibrinated sheep blood)를 포함하는 Columbia blood agar base(BD)를 사용하여 평가하였다. 혈액 한천 배지 내의 콜로니 주변에 클리어런스 영역(clearance zone)이 나타나면 용혈 활성이 양성인 경우를 의미하고 클리어런스 영역(clearance zone)이 나타나지 않으면 용혈 활성이 음성인 경우를 의미한다.
(4) 항생제 감수성 평가
시험 균주의 항생제에 대한 감수성은 다양한 항생제에 의해 균주의 성장이 저해되는지 여부에 의해 결정되었다. 몇 가지 상업적으로 사용되는 항생제를 8㎜ 직경의 필터 페이퍼 디스크(filter paper disk)에 디스크 당 100㎍의 농도가 되게 로딩하였다. 이후, 항생제가 로딩된 디스크를 시험 균주가 각각 도말된 MRS 한천 플레이트 상에 위치시키고 37℃에서 24~36 hr 동안 배양하였다. 필터 페이퍼 디스크(filter paper disk) 상에 나타난 시험 균주의 성장 저해 영역이 클수록 시험 균주의 항생제에 대한 감수성이 크다는 것을 의미한다. 항생제에 대한 감수성 여부는 유럽식품안전국(European Food Safety Authority, EFSA)의 추천 기준[EFSA (2012) Guidance on the assessment of bacterial susceptibility to antimicrobials of human and veterinary importance. EFSA Journal. 10: 2740.]에 의해 평가하였다.
하기 표 1에 시험 균주인 락토바실러스 퍼멘텀(Lactobacillus fermentum) MJM60397 균주의 안전성 평가 결과를 나타내었다.
| Safety test | 락토바실러스 퍼멘텀(Lactobacillus fermentum) MJM60397 | |
| Biogenic amine production test | L-Phenylalanine | - |
| L-Lysine | - | |
| L-Tyrosine | - | |
| L-Argnine | - | |
| L-Ornithine | - | |
| L-Tryptophan | - | |
| L-histidine | - | |
| Mucin degradation test | - | |
| Hemolytic activity test | - | |
| Susceptibility to antibiotics test | Ampicillin | 0.25 |
| Vancomycin | NR | |
| Gentamicin | 64(R) | |
| Kanamycin | 64(R) | |
| Streptomycin | 16 | |
| Erythromycin | 1 | |
| Clindamycin | 0.25 | |
| Tetracycline | 8 | |
| Chloramphenicol | 2 | |
* NR : EFSA, 2012에 의할 때 고유한 내성 때문에 항생제 감수성이 요구되지 않음(not required); R : 내성을 가짐(resistant); - : no activity
상기 표 1에서 보이는 바와 같이 락토바실러스 퍼멘텀(Lactobacillus fermentum) MJM60397 균주는 생체 유래 아민을 생성하지 않고, 뮤신 분해를 하지 않으며, 용혈 활성을 보이지 않는 것으로 확인되었다. 또한, 락토바실러스 퍼멘텀(Lactobacillus fermentum) MJM60397 균주는 유럽식품안전국(European Food Safety Authority, EFSA)의 추천 기준에 의할 때 대부분의 항생제에 대해 내성을 보이지 않는 것으로 나타났다.
3.
락토바실러스
퍼멘텀(
Lactobacillus
fermentum
)
MJM60397
균주의
항미생물
활성 검사
(1) 실험 방법
락토바실러스 퍼멘텀(Lactobacillus fermentum) MJM60397 균주의 항미생물 활성 검사는 인간, 동물 및 음식의 유해미생물을 사용하여 수행하였다. 시험 균주의 배양액을 Cellulose acetate fil㎜ter(pore size 0.2㎛)로 여과하고, 여과 배양액을 원심진공증발기(Buchi, Switzerland)를 사용하여 10배로 농축시킨 후, 상기 농축 배양액을 멸균한 증류수에 혼합하여 희석하였다. 이후, 희석된 농축 배양액 100㎕를 8㎜ 직경의 종이 디스크에 로딩하고 건조하였다. 이후, 종이 디스크를 유해 미생물이 도포된 LB 한천 플레이트 상에 위치시키고 18시간 동안 배양한 후, 저해 영역을 확인하였다. 또한, 비교 균주로 상업적인 프로바이오틱 균주인 락토바실러스 람노서스(Lactobacillus rhamnosus) GG를 사용하였고, 양성 대조 약물로 chloramphenicol, Streptomycin 및 tetracycline을 각각 사용하였다. 양성 대조 약물의 사용량은 종이 디스크 당 100㎍ 이었다. 구체적으로 chloramphenicol은 Escherichia coli O138 KCTC2615, Escherichia coli O1 KCTC2441, Escherichia coli K99, Staphylococcus aureus KCCM11335, Methicillin-resistant Staphylococcus aureus KCCM40510 및 Staphylococcus epidermidis KCTC1917의 성장 저해 시험에 적용하였고, Streptomycin은 Salmonella gallinarum KCTC2931, Salmonella typhimurium KCTC2514 및 Pseudomonas aeruginosa KCCM11802의 성장 저해 시험에 적용하였고, tetracycline은 Salmonella choleraesuis KCTC2932, Bacillus subtilis KSP12 및 Bacillus cereus KACC11240의 성장 저해 시험에 적용하였다. 실험은 재현성을 점검하기 위해 3회 반복 수행되었다.
(2) 측정 결과
하기 표 2는 락토바실러스 퍼멘텀(Lactobacillus fermentum) MJM60397 균주의 항미생물 활성에 대한 측정 결과를 나타낸 것이다. 하기 표 2에서 보이는 바와 같이 락토바실러스 퍼멘텀(Lactobacillus fermentum) MJM60397 균주는 Escherichia coli O138 KCTC2615, Escherichia coli O1 KCTC2441, Escherichia coli K99, Staphylococcus aureus KCCM11335, Methicillin-resistant Staphylococcus aureus KCCM40510, Staphylococcus epidermidis KCTC1917, Salmonella gallinarum KCTC2931, Salmonella typhimurium KCTC2514, Pseudomonas aeruginosa KCCM11802, Salmonella choleraesuis KCTC2932, Bacillus subtilis KSP12 등과 해로운 균의 성장을 효과적으로 억제하였다. 이로부터 락토바실러스 퍼멘텀(Lactobacillus fermentum) MJM60397 균주가 해로운 균의 성장을 저해하는 항미생물 물질을 생산한다는 것을 알 수 있다.
| 유해 미생물 | 시험 균주 배양액 또는 시험 약물의 유해 미생물에 대한 성장저해영역(㎝) | ||
| Lactobacillus fermentum MJM60397 | L. rhamnosus | 항생제 | |
| Staphylococcus aureus KCCM11335 | 1.6 | 1.7 | 2.6(C) |
| Salmonella gallinarum KCTC2931 | 1.8 | 2.7 | 1.4(S) |
| Methicillin-resistant Staphylococcus aureus KCCM40510 | 0.9 | 1.1 | 2.3(C) |
| Escherichia coli O138 KCTC2615 | 0.9 | 1.1 | 2.6(C) |
| Escherichia coli O1 KCTC2441 | 1.0 | 1.1 | 2.1(C) |
| Escherichia coli K99 | 0.9 | 1.1 | 2.5(C) |
| Salmonella typhimurium KCTC2514 | 1.1 | 1.6 | 1.8(S) |
| Staphylococcus epidermidis KCTC1917 | 1.3 | 1.4 | 2.6(C) |
| Salmonella choleraesuis KCTC2932 | 1.6 | 1.6 | ND(T) |
| Pseudomonas aeruginosa KCCM11802 | 1.5 | 1.6 | 2(S) |
| Bacillus subtilis KSP12 | 1.2 | 1.6 | 1.1(T) |
| Bacillus cereus KACC11240 | ND | ND | 1.0(T) |
* C : chloramphenicol; S : Streptomycin; T : tetracycline; ND : not detected
4.
락토바실러스
퍼멘텀(
Lactobacillus
fermentum
)
MJM60397
균주의 구강-위장관 통과 조건에서의 내성 평가
(1) 실험 방법
[Bove, P., Gallone, A., Russo, P., Capozzi, V., Albenzio, M., Spano, G., and Fiocco, D. 2012. Probiotic features of Lactobacillus plantarum mutant strains. Applied microbiology and biotechnology 96(2): 431-441. doi: 10.1007/s00253-012-4031-2]에 기술된 방법을 약간 수정하여 구강-위장관 통과 내성 어세이(Oro-gastrointestinal transit tolerance assay)를 수행하였다.
구강 통과 스트레스를 주기 위해, 시험 균주((1×109/㎖)를 150 ㎎/ℓ의 라이소자임(lysozyme)을 포함하는 전해질 용액(NaCl, 6.2g/ℓ; KCl, 2.2g/ℓ; CaCl2, 0.22g/ℓ; NaHCO3, 1.2g/ℓ)에서 10분 동안 배양하였다[Marteau, P., Minekus, M., Havenaar, R., and Huis in't Veild, J.H. 1997. Survival of lactic acid bacteria in a dynamic model of the stomach and small intestine: validation and the effects of bile. Journal of Diary Science 80: 1031-1037]. 이후, 구강 스트레스 조건에서 배양된 세포를 원심분리(1,800 × g, 5분)를 통해 구강 스트레스 용액으로부터 분리하고, 0.3% 펩신(pepsin)을 포함하고 pH가 3인 위 전해질 용액 또는 0.3% 펩신(pepsin)을 포함하고 pH가 2인 위 전해질 용액에서 1시간 동안 순차적으로 배양하여 위 스트레스(gastric stress)를 가하였다. 이후, 위 스트레스 조건에서 배양된 세포를 원심분리를 통해 분리하고, 0.1% 판크레아틴(pancreatin) 및 0.3% 담즙염(bile oxgall)을 포함하고 pH가 7인 소장 전해질 용액(NaCl, 5g/ℓ; KCl, 0.6g/ℓ; CaCl2, 0.25g/ℓ)에서 120분 동안 배양하였다[Marteau et al. 1997]. 또한, 비교 균주로 상업적인 프로바이오틱 균주인 락토바실러스 람노서스(Lactobacillus rhamnosus) GG를 사용하였다. 각각의 스트레스가 가해진 후에 배양액을 샘플링하고 세포의 생존능을 콜로니 형성 단위(colony forming units, CFU) 값으로 평가하였다. 구체적으로 샘플링된 세포 배양액을 적정 배수로 희석하여 현탁액을 제조하고, 상기 현탁액을 MRS 한천 배지에 깔고 37℃에서 48 hr 동안 배양하여 콜로니 형성 단위(colony forming units, CFU)를 계산하였다. 각각의 스트레스 처리 후에도 생존하는 균주의 수를 Log10CFU(logarithmic base 10 of colony forming units)의 스케일로 표시하였다.
(2) 측정 결과
도 2는 락토바실러스 퍼멘텀(Lactobacillus fermentum) MJM60397 균주의 구강-위장관 통과 모사 조건에서의 내성 평가 결과를 나타낸 그래프이다. 도 2에서 사용되는 용어인 "MJM60397"은 락토바실러스 퍼멘텀(Lactobacillus fermentum) MJM60397 균주를 나타내고, "LGG"는 락토바실러스 람노서스(Lactobacillus rhamnosus) GG를 나타낸다. 도 2에서 보이는 바와 같이 락토바실러스 퍼멘텀(Lactobacillus fermentum) MJM60397 균주는 구강-위장관 통과 조건에서 높은 내성을 보였다. 대부분의 유산균이 구강-위장관 통과 조건에서 생존하지 못하고 사멸되는 것을 고려할 때 락토바실러스 퍼멘텀(Lactobacillus fermentum) MJM60397 균주는 높은 생존율을 가진 것으로 평가된다. 또한, 락토바실러스 퍼멘텀(Lactobacillus fermentum) MJM60397 균주의 구강-위장관 통과 조건에서의 생존율은 적절한 보호제 또는 마이크로캡슐화(microencapsulation)에 의해 더 향상될 수 있다.
5.
락토바실러스
퍼멘텀(
Lactobacillus
fermentum
)
MJM60397
균주의 인간 상피조직 유사
Caco
-2 세포 라인에 대한
부착능
평가
(1) 실험 방법
Caco-2 세포 라인을 미생물자원센터(KCTC)에서 분양받아 상피세포 부착능 실험에 사용하였으며, [Tuo et al., 2013]에 기재된 방법을 참조하여 실험을 수행하였다.
먼저, 20%(v/v)의 비활성화 FBS(fetal bovine serum)와 100 유닛(U)의 페니실린-스트렙토마이신 항생제가 첨가된 MEM(Minimum Essential Media) high glucose 배지(Gibco, USA)에 Caco-2 세포를 넣고 37℃의 온도 및 5%의 CO2 농도 환경을 가진 배양기에서 21일 동안 배양하였다.
이후, 잘 분화된 Caco-2 세포를 5×102 cells/㎖ 농도로 12-웰 플레이트(Well Plates)에 분주하고 매일 배지를 교환하면서 3일 동안 배양하여 80%가 채워진 단일층(monolayer)을 형성시켰다. 단일층(monolayer)의 Caco-2 세포를 0.25% Trypsin-EDTA(Gibco, USA) 용액으로 37℃에서 5분간 반응시켜 트립신화한 후, 헤모사이토미터(Hemocytometer)를 이용하여 세포수를 측정하였다.
시험 균주의 Caco-2 세포에 대한 부착능은 Chauviere et al., 1992에 기재된 방법(약간의 수정을 가함)에 의해 결정되었다. 구체적으로, 단일층의 Caco-2 세포를 항생제가 없는 MEM 배지에서 2시간 동안 배양하였다. 이 배양액을 시험 균주가 현탁된 0.5㎖의 FBS 용액과 각각 동일 부피로 혼합하여 최종 세균 농도가 2×108 CFU/㎖이 되도록 하였다. 그리고 혼합 용액을 12-웰 플레이트(Well Plates)에 접종하고 37℃, 5% CO2 환경에서 2시간 동안 배양하였다. 이후, 단일세포층을 멸균된 PBS(pH 7.2) 용액으로 3번 세척하여 부착되지 않은 시험 균주를 제거하고, 10% 포르말린 용액으로 고정하고, 크리스털바이올렛(crystal violet)으로 염색한 후 도립현미경(inverted microscope)을 이용하여 부착된 시험 균주의 수를 측정하였다. 또한, 비교 균주로 상업적인 프로바이오틱 균주인 락토바실러스 람노서스(Lactobacillus rhamnosus) GG를 사용하였다. 시험 균주의 부착능은 부착된 시험 균주의 콜로니 형성 단위(colony forming units, CFU)를 계산하여 평가하였다. 시험 균주의 Caco-2 세포 라인에 대한 부착 %는 아래의 식을 사용하였다.
(2) 측정 결과
도 3은 락토바실러스 퍼멘텀(Lactobacillus fermentum) MJM60397 균주의 Caco-2 세포 단일층(monolayer)에 대한 부착능 실험 결과를 나타낸 그래프이다. 도 3에서 사용되는 용어인 "MJM60397"은 락토바실러스 퍼멘텀(Lactobacillus fermentum) MJM60397 균주를 나타내고, "LGG"는 락토바실러스 람노서스(Lactobacillus rhamnosus) GG를 나타낸다. 도 3에서 보이는 바와 같이 락토바실러스 퍼멘텀(Lactobacillus fermentum) MJM60397 균주는 장 상피세포 부착능이 매우 우수한 것으로 나타났으며, 이러한 결과를 통해 본 발명에 따른 신규 균주가 장 상피세포에 부착하여 장내 환경을 개선할 수 있다는 것이 확인되었다.
6.
락토바실러스
퍼멘텀(
Lactobacillus
fermentum
)
MJM60397
균주의
담즙산염
가수분해효소 활성
(1) 실험 방법
[Guo, C.F., Zhang, L.W., Han, X., Li, J.Y., Du, M., Yi, H.X., Feng, Z., Zhang, Y.C., and Xu, X.R. 2011. A sensitive method for qualitative screening of bile salt hydrolase-active lactobacilli based on thin-layer chromatography. Journal of dairy science 94(4): 1732-1737. doi: 10.3168/jds.2010-3801]에 기술된 방법을 약간 수정하여 시험 균주의 담즙산염 가수분해효소 활성(Bile salt hydrolase activity)을 정성적으로 측정하였다.
먼저, 5mM taurodeoxycholic acid (TDCA), glycocholic acid (GCA) 및 taurocholic acid (TCA)를 가진 sodium phosphate buffer(pH 7.4)를 이용하여 MRS 반응 액체 배지를 제조하였다. 또한, 시험 균주를 18 hr 동안 배양하고 PBS 용액(pH 7.2)으로 2회 세척한 후 PBS 용액(pH 7.2)에 현탁하여 시험 균주 현탁액을 제조하였다. 이후, 시험 균주 현탁액을 동일 부피의 MRS 반응 액체 배지와 혼합하고 37℃에서 16 hr 동안 배양하였다. 이후, 혼합 배양액을 동결건조하고, 메탄올 1㎖에 용해시켰다. 이후, 메탄올 현탁액 1㎕를 TLC(silica gel 60, 20㎝×20㎝) 상에 스팟팅하고, 이동상(hexane : methylethlyketone : glacial acetic acid의 부피 비가 56 : 36 : 8인 용매 시스템으로 구성됨)을 이용하여 전개하였다[Chavez, M.N., and Krone, C.L. 1976. Silicic acid thin-layer chromatography of conjugated and free bile acids. Journal of lipid research 17(5): 545-547]. 이후, TLC 판을 열풍으로 건조하고 여기에 10% phosphomolybdic acid 함유 에탄올을 분사하고 110℃에서 10분 동안 가열한 후, 자유 콜산(free cholic acid, CA) 및 데옥시콜산(deoxycholic acid, DCA)를 검출하였다. 또한, 음성 대조 균주로 상업적인 프로바이오틱 균주인 락토바실러스 람노서스(Lactobacillus rhamnosus) GG를 사용하였고 양성 대조 균주로 락토바실러스 아시도필러스(Lactobacillus acidophillus) ATCC 43121을 사용하였다.
(2) 측정 결과
도 4는 락토바실러스 퍼멘텀(Lactobacillus fermentum) MJM60397 균주의 담즙산염 가수분해효소 활성 측정 결과를 나타낸 것이다. 도 4에서 라인 1은 반응 액체 배지로 콜산을 사용한 결과이고, 라인 2는 반응 액체 배지로 MRS-TDCA를 사용한 결과이고, 라인 3은 반응 액체 배지로 MRS-TCA를 사용한 결과이고, 라인 4는 반응 액체 배지로 MRS-GCA를 사용한 결과이며, 라인 S는 반응 액체 배지로 5mM CA, DCA, TDCA, TCA 및 GCA의 표준 혼합물을 사용한 결과이다. 도 4에서 보이는 바와 같이 락토바실러스 퍼멘텀(Lactobacillus fermentum) MJM60397 균주는 담즙산염 가수분해효소 활성을 보였고, TDCA, TCA 및 GCA를 탈포합시켜 자유 콜산(free cholic acid) 또는 데옥시콜산(deoxycholic acid)으로 전환시켰다.
7.
락토바실러스
퍼멘텀(
Lactobacillus
fermentum
)
MJM60397
균주의
In vitro
콜레스테롤 저하 활성 평가
(1) 실험 방법
에탄올과 Tween 80(polyoxyethylene sorbitan mono-oleate)을 3:1의 부피비로 혼합한 용액에 콜레스테롤을 100㎍/㎖의 농도로 녹인 후, 상기 혼합액을 0.3% 담즙(bile) 함유 MRS 액체 배지 또는 0.3% 담즙(bile) 미함유 MRS 액체 배지에 첨가하여 MRS-콜레스테롤 배지 혼합액을 제조하였다. 그리고 락토바실러스 퍼멘텀(Lactobacillus fermentum) MJM60397 균주를 MRS 액체 배지에 배양하고, 이 배양액을 콜레스테롤-MRS 배지 혼합액에 1%(v/v)의 양으로 접종한 후, 미호기성 조건(microaerophilic condition) 및 37℃에서 24시간 동안 배양하였다. 이후, 상기 배양액을 4℃에서 약 10분 동안 3,000rpm의 속도로 원심분리하여 균체를 회수하였고, BCS Total cholesterol kit(Bioclinical system, Korea)을 이용하여 남은 배지의 콜레스테롤 농도를 측정하였다. 양성 대조 균주로 락토바실러스 아시도필러스(Lactobacillus acidophillus) ATCC 43121 균주를 사용하였다.
(2) 측정 결과
하기 표 3은 락토바실러스 퍼멘텀(Lactobacillus fermentum) MJM60397 균주의 In vitro 콜레스테롤 저하 활성 평가를 나타낸 것이다. 하기 표 3에서 보이는 바와 같이 0.3% 담즙(bile) 미함유 MRS 액체 배지에서는 락토바실러스 퍼멘텀(Lactobacillus fermentum) MJM60397 균주와 락토바실러스 아시도필러스(Lactobacillus acidophillus) ATCC 43121 균주의 콜레스테롤 저하 활성 간에 큰 차이가 없었으나, 0.3% 담즙(bile) 미함유 MRS 액체 배지에서는 락토바실러스 퍼멘텀(Lactobacillus fermentum) MJM60397 균주의 콜레스테롤 저하 활성이 유의적으로 크게 증가하였다.
| 시험 균주 | 콜레스테롤 저하 활성(%) | |
| with 0.3% bile | without 0.3% bile | |
| 락토바실러스 퍼멘텀(Lactobacillus fermentum) MJM60397 | 69.46 | 34.12 |
| 락토바실러스 아시도필러스(Lactobacillus acidophillus) ATCC 43121 | 59.23 | 36.70 |
7.
락토바실러스
퍼멘텀(
Lactobacillus
fermentum
)
MJM60397
균주의
In
viv
o
콜레스테롤 저하 활성 평가
(1) 실험 방법
수컷 ICR 생쥐(3주령, 30~45g; Orient Bio, Sung-Nam, South Korea)를 23±3℃, 습도 40±6% 및 명암 주기(light-dark cycle) 12시간 단위의 사육실 환경하에서 적응시켰다. 이후, 실험동물을 4개의 군(NCD, HCD, MJM60397, L.ac) 으로 나누어 정상 식이군(NCD)에는 총 칼로리의 4.5%가 지방인 일반 식이를 4주간 공급하였고 나머지 군들에는 아테롬 발생 고콜레스테롤 식이(atherogenic high cholesterol diet; 40 kcal % Fat, 1.25% cholesterol and 0.5% cholic acid, Cat #101556; Research Diets, NJ, USA)를 4주간 공급하여 고콜레스테롤혈증(hypercholesterolemia)을 유도하였다. 이후, 정상 식이군(NCD)에는 일반 식이 및 물을 7주간 공급하였고, HCD 군에는 아테롬 발생 고콜레스테롤 식이 및 물을 7주간 공급하였다. 또한, MJM60397 군에는 아테롬 발생 고콜레스테롤 식이의 공급과 함께 락토바실러스 퍼멘텀(Lactobacillus fermentum) MJM60397 균주를 물에 3×108 CFU/㎖의 농도로 현탁하여 7주간 1일 1회 경구투여하였다. 또한, L.ac 군에는 아테롬 발생 고콜레스테롤 식이의 공급과 함께 락토바실러스 아시도필러스(Lactobacillus acidophillus) ATCC 43121 균주를 물에 3×108 CFU/㎖의 농도로 현탁하여 7주간 1일 1회 경구투여하였다.
생쥐의 몸무게 7주 동안 1주일에 한번 측정하였고 평균 식이 섭취량(food intake)을 7주 동안 1주일 주기로 계산하였다. 또한, 7주 동안 식이를 공급한 후 경추파열법(cervical dislocation)에 의해 생쥐를 희생시켰다. 희생된 생쥐의 간, 부고환 백색 지방 조직(epididymal white adipose tissue)을 즉시 적출한 후 세척하였다. 희생된 생쥐의 복대동맥(abdominal aorta)으로부터 혈액 샘플을 수거하였다. 혈액 샘플을 원심분리하여 혈장(1,800 × g, 10 min, 4℃)을 수거하였다. 간 조직, 혈장(Plasma) 또는 Fecal의 총 콜레스테롤, 트리글리세라이드, HDL-콜레스테롤을 상업적인 어세이 키트(Asan Pharm, Seoul, Korea)를 이용하여 측정하였다. 또한, LDL-콜레스테롤은 Friedewald formula에 의해 계산되었다. 또한, Fecal의 총 담즙산은 total bile acids assay kit(Cell Biolabs, Inc. Catalog Number STA-631)를 이용하여 측정하였다.
(2) 측정 결과
도 5는 고콜레스테롤혈증(hypercholesterolemia) 유도 생쥐에게 락토바실러스 퍼멘텀(Lactobacillus fermentum) MJM60397 균주 등 다양한 시료를 경구투여하였을 때의 몸무게 변화를 나타낸 것이고, 도 6은 고콜레스테롤혈증(hypercholesterolemia) 유도 생쥐에게 락토바실러스 퍼멘텀(Lactobacillus fermentum) MJM60397 균주 등 다양한 시료를 경구투여하였을 때의 식이 섭취량 변화를 나타낸 것이다. 도 5 및 도 6에서 "Normal"은 정상 식이군을 나타내고, "HCD"는 아테롬 발생 고콜레스테롤 식이만을 공급한 군을 나타내고, "MJM60397"은 아테롬 발생 고콜레스테롤 식이와 함께 락토바실러스 퍼멘텀(Lactobacillus fermentum) MJM60397 균주를 공급한 군을 나타내고, "L. acidophillus"는 아테롬 발생 고콜레스테롤 식이와 함께 락토바실러스 아시도필러스(Lactobacillus acidophillus) ATCC 43121 균주를 공급한 군을 나타낸다.
도 7은 고콜레스테롤혈증(hypercholesterolemia) 유도 생쥐에게 락토바실러스 퍼멘텀(Lactobacillus fermentum) MJM60397 균주 등 다양한 시료를 경구투여하였을 때의 혈장 총 콜레스테롤 함량을 나타낸 것이고, 도 8은 고콜레스테롤혈증(hypercholesterolemia) 유도 생쥐에게 락토바실러스 퍼멘텀(Lactobacillus fermentum) MJM60397 균주 등 다양한 시료를 경구투여하였을 때의 혈장 HDL-콜레스테롤 함량을 나타낸 것이고, 도 9는 고콜레스테롤혈증(hypercholesterolemia) 유도 생쥐에게 락토바실러스 퍼멘텀(Lactobacillus fermentum) MJM60397 균주 등 다양한 시료를 경구투여하였을 때의 혈장 LDL-콜레스테롤 함량을 나타낸 것이다. 도 10은 고콜레스테롤혈증(hypercholesterolemia) 유도 생쥐에게 락토바실러스 퍼멘텀(Lactobacillus fermentum) MJM60397 균주 등 다양한 시료를 경구투여하였을 때의 간 조직 총 콜레스테롤 함량을 나타낸 것이고, 도 11은 고콜레스테롤혈증(hypercholesterolemia) 유도 생쥐에게 락토바실러스 퍼멘텀(Lactobacillus fermentum) MJM60397 균주 등 다양한 시료를 경구투여하였을 때의 간 조직 HDL-콜레스테롤 함량을 나타낸 것이고, 도 12는 고콜레스테롤혈증(hypercholesterolemia) 유도 생쥐에게 락토바실러스 퍼멘텀(Lactobacillus fermentum) MJM60397 균주 등 다양한 시료를 경구투여하였을 때의 간 조직 LDL-콜레스테롤 함량을 나타낸 것이다. 도 13은 고콜레스테롤혈증(hypercholesterolemia) 유도 생쥐에게 락토바실러스 퍼멘텀(Lactobacillus fermentum) MJM60397 균주 등 다양한 시료를 경구투여하였을 때의 Fecal 총 콜레스테롤 함량을 나타낸 것이고, 도 14는 고콜레스테롤혈증(hypercholesterolemia) 유도 생쥐에게 락토바실러스 퍼멘텀(Lactobacillus fermentum) MJM60397 균주 등 다양한 시료를 경구투여하였을 때의 Fecal HDL-콜레스테롤 함량을 나타낸 것이고, 도 15는 고콜레스테롤혈증(hypercholesterolemia) 유도 생쥐에게 락토바실러스 퍼멘텀(Lactobacillus fermentum) MJM60397 균주 등 다양한 시료를 경구투여하였을 때의 Fecal LDL-콜레스테롤 함량을 나타낸 것이고, 도 16은 고콜레스테롤혈증(hypercholesterolemia) 유도 생쥐에게 락토바실러스 퍼멘텀(Lactobacillus fermentum) MJM60397 균주 등 다양한 시료를 경구투여하였을 때의 Fecal 총 담즙산 함량을 나타낸 것이다. 도 7 내지 도 16에서 X축은 실험군을 나타낸다. 도 7 내지 도 16에서 보이는 바와 같이 락토바실러스 퍼멘텀(Lactobacillus fermentum) MJM60397 균주는 고콜레스테롤혈증(hypercholesterolemia) 유도 생쥐의 총 콜레스테롤 또는 LDL-콜레스테롤 함량을 저하시키고 총 담즙산 함량을 증가시키는 효과를 보였다.
8. 배지의 종류에 따른
락토바실러스
퍼멘텀(
Lactobacillus
fermentum
) MJM60397 균주의 증식 특성 평가
락토바실러스 퍼멘텀(Lactobacillus fermentum) MJM60397 균주를 MRS 배지(Difco)를 포함한 다양한 배지에 접종하고 37℃에서 38 hr 동안 배양하면서 1시간 단위로 배양기에 내장된 Tecan Infinite Pro Microplate reader를 이용하여 증식량을 측정하였다. 다양한 배지의 조성은 아래와 같다.
Modified
DSMZ
medium 57(
MAAM
Medium)
Composition per liter:
Glucose 15.0g, Casamino acids 7.0g, Yeast extract 7.0g, Tryptone 10.0g, Pancreatic digest of gelatin(Peptone G) 5.0g, Na-acetate 5.0g, MgSO4·7H2O 200.0mg, MnSO4·2H2O 50.0mg, Tween™ 80 1.0mL
pH 5.4 ± 0.2 at 25℃
Preparation of Medium: Add components to distilled/deionized water and bring volume to 1.0L. Mix thoroughly. Adjust pH to 5.4. Distribute into tubes or flasks. Autoclave for 15 min at 15 psi pressure and 121℃.
Modified MRS Broth
Composition per liter:
Glucose 20.0g, Peptone 20.0g, Sodium acetate 5.0g, Yeast extract 5.0g, Ammonium citrate 2.0g, Na2HPO4 2.0g, Tween™ 80 1.0g, MgSO4·7H2O 0.1g, MnSO4·5H2O 0.05g
pH 6.5 ± 0.2 at 25℃
Preparation of Medium: Add components to distilled/deionized water and bring volume to 1.0L. Mix thoroughly. Gently heat and bring to boiling. Distribute into tubes or flasks. Autoclave for 15 min at 15 psi pressure and 121℃.
Double-Strength Crude Medium for Lactobacillus(
DSC
)
Composition per liter:
Sucrose 20.0g, Yeast extract 20.0g, Casiton 15.0g, Potassium acetate 3.0g, Histidine·HCl 2.0g, Ascorbic acid 1.0g, Pyridoxamine·HCl 33.0μg, Salts solution A 20.0mL, Salts solution B 5.0mL
pH 5.4 ± 0.2 at 25℃
Salts Solution A:
Composition per 100.0mL:
KH2PO4·H2O 16.5g, K2HPO4·3H2O 16.5g
Preparation of Salts Solution A: Add components to distilled/deionized
water and bring volume to 100.0mL. Mix thoroughly.
Salts Solution B:
Composition per 100.0mL:
MgSO4·7H2O 8.0g, FeSO4·7H2O 0.4g, MnSO4·H2O 0.4g, NaCl 0.4g, HCl, concentrated 0.1mL
Preparation of Salts Solution B: Add components to distilled/deionized water and bring volume to 100.0mL. Mix thoroughly.
Preparation of Medium: Add components to distilled/deionized water and bring volume to 1.0L. Mix thoroughly. Gently heat and bring to boiling. Adjust pH to 5.4 with acetic acid. Distribute into tubes or flasks. Autoclave for 15 min at 15 psi pressure and 121℃.
Lactobacillus Medium III(modified)(
MIII
)
Composition per liter:
Casiton 20.0g, Fructose 7.0g, Glucose 7.0g, Maltose 7.0g, Sodium acetate·3H2O 5.0g, Yeast extract 10.0g, K2HPO4·3H2O 2.6g, Diammonium citrate 2.0g, Sodium gluconate 2.0g, L-Cysteine·HCl 0.5g, MgSO4·7H2O 0.1g, MnSO4·4H2O 0.05g, Tween™ 80 1.0mL
pH 6.3 ± 0.2 at 25℃
Preparation of Medium: Add components to distilled/deionized water and bring volume to 1.0L. Mix thoroughly. Adjust pH to 6.3. Distribute into tubes or flasks. Autoclave for 15 min at 15 psi pressure and 121℃.
LBS™ Broth(Lactobacillus Selection Broth)
Composition per liter:
Sodium acetate·3H2O 25.0g, Glucose 20.0g, Trypton 20.0g, KH2PO4 6.0g, Yeast extract 6.0g, Ammonium citrate 2.0g, Polysorbate 80 1.0g, MgSO4 0.575g, FeSO4 0.034g, MnSO4 0.12g, Acetic acid, glacial 1.32mL
pH 5.4 ± 0.2 at 25℃
Preparation of Medium: Add components, except acetic acid, to distilled/deionized water and bring volume to 998.7mL. Mix thoroughly. Gently heat and bring to boiling. Add glacial acetic acid. Mix thoroughly. Gently heat while stirring and bring to 90℃-100℃ for 2-3 min.
Do not autoclave. Aseptically distribute into sterile tubes.
Medium for Lactobacilli and Pediococcus(
M980
)
(ATCC Medium 980)
Composition per liter:
Peptone 12.5g, Glucose 11.0g, Sodium acetate 10.0g, Yeast extract 5.5g, KH2PO4 0.25g, K2HPO4 0.25g, MgSO4 0.1g, MnSO4·4H2O 0.05g, FeSO4·7H2O 0.05g
pH 6.8 ± 0.2 at 25℃
Preparation of Medium: Add components to distilled/deionized water and bring volume to 1.0L. Mix thoroughly. Adjust pH to 6.8. Autoclave for 10 min at 15 psi pressure and 120℃. Aseptically distribute into sterile tubes or flasks.
도 17은 다양한 배지에서 락토바실러스 퍼멘텀(Lactobacillus fermentum) MJM60397 균주를 배양하였을 때 락토바실러스 퍼멘텀(Lactobacillus fermentum) MJM60397 균주의 증식 곡선을 나타낸 것이다. 도 17에서 보이는 바와 같이 락토바실러스 퍼멘텀(Lactobacillus fermentum) MJM60397 균주의 증식을 위한 배지로 MMRS 배지, MⅢ 배지, M980 배지, MRS 배지가 적합한 것으로 나타났다.
이상에서와 같이 본 발명을 상기의 실시예를 통해 설명하였지만 본 발명이 반드시 여기에만 한정되는 것은 아니며 본 발명의 범주와 사상을 벗어나지 않는 범위 내에서 다양한 변형실시가 가능함은 물론이다. 따라서, 본 발명의 보호범위는 본 발명에 첨부된 특허청구의 범위에 속하는 모든 실시 형태를 포함하는 것으로 해석되어야 한다.
<110> Myongji University Industry and Academia Cooperation Foundation
<120> Novel Lactobacillus fermentum with probiotic activities and use
thereof
<130> ZDP-18-0267
<160> 1
<170> KoPatentIn 3.0
<210> 1
<211> 1476
<212> DNA
<213> Unknown
<220>
<223> 16S rDNA of Lactobacillus fermentum MJM60397
<400> 1
tcgaacgcgt tggcccaatt gattgatggt gcttgcacct gattgatttt ggtngccaac 60
gagtggcgga cgggtgagta acacgtaggt aacctgccca gaagcggggg acaacatttg 120
gaaacagatg ctaataccgc ataacagcgt tgttcgcatg aacaacgctt aaaagatggc 180
ttctcgctat cacttctgga tggacctgcg gtgcattagc ttgttggtgg ggtaacggcc 240
taccaaggcg atgatgcata gccgagttga gagactgatc ggccacaatg ggactgagac 300
acggcccata ctcctacggg aggcagcagt agggaatctt ccacaatggg cgcaagcctg 360
atggagcaac accgcgtgag tgaagaaggg tttcggctcg taaagctctg ttgttaaaga 420
agaacacgta tgagagtaac tgttcatacg ttgacggtat ttaaccagaa agtcacggct 480
aactacgtgc cagcagccgc ggtaatacgt aggtggcaag cgttatccgg atttattggg 540
cgtaaagaga gtgcaggcgg ttttctaagt ctgatgtgaa agccttcggc ttaaccggag 600
aagtgcatcg gaaactggat aacttgagtg cagaagaggg tagtggaact ccatgtgtag 660
cggtggaatg cgtagatata tggaagaaca ccagtggcga aggcggctac ctggtctgca 720
actgacgctg anactcgaaa gcatgggtag cgaacaggat tagataccct ggtagtccat 780
gccgtaaacg atgagtgcta ggtgttggan ggtttccgcc cttcagtgcc ggagctaacg 840
cattaagcac tccgcctggg gagtacgacc gcaaggttga aactcaaagg aattgacggg 900
ggcccgcaca agcggtggag catgtggttt aattcgaagc tacgcgaaga accttaccag 960
gtcttgacat cttgcgccaa ccctagagat agggcgtttc cttcgggaac gcaatgacag 1020
gtggtgcatg gtcgtcgtca gctcgtgtcg tgagatgttg ggttaagtcc cgcaacgagc 1080
gcaacccttg ttactagttg ccagcattaa gttgggcact ctagtgagac tgccggtgac 1140
aaaccggagg aaggtgggga cgacgtcaga tcatcatgcc ccttatgacc tgggctacac 1200
acgtgctaca atggacggta caacgagtcg cgaactcgcg agggcaagca aatctcttaa 1260
aaccgttctc agttcggact gcaggctgca actcgcctgc acgaagtcgg aatcgctagt 1320
aatcgcggat cagcatgccg cggtgaatac gttcccgggc cttgtacaca ccgcccgtca 1380
caccatgaga gtttgtaaca cccaaagtcg gtggggtaac cttttaggag ccagccgcct 1440
aaggtgggac agatgattag ggtgaagtcg taacaa 1476
Claims (6)
- 락토바실러스 퍼멘텀(Lactobacillus fermentum) MJM60397(수탁번호 : KACC 92133P).
- 락토바실러스 퍼멘텀(Lactobacillus fermentum) MJM60397(수탁번호 : KACC 92133P) 균주 또는 이의 배양물을 유효성분으로 포함하는 프로바이오틱 조성물.
- 락토바실러스 퍼멘텀(Lactobacillus fermentum) MJM60397(수탁번호 : KACC 92133P) 균주, 이의 배양물, 이의 파쇄물 또는 이의 추출물을 유효성분으로 포함하는 항균용 조성물.
- 락토바실러스 퍼멘텀(Lactobacillus fermentum) MJM60397(수탁번호 : KACC 92133P) 균주, 이의 배양물, 이의 파쇄물 또는 이의 추출물을 유효성분으로 포함하는 콜레스테롤 저하용 조성물.
- 락토바실러스 퍼멘텀(Lactobacillus fermentum) MJM60397(수탁번호 : KACC 92133P) 균주, 이의 배양물, 이의 파쇄물 또는 이의 추출물을 유효성분으로 포함하는 고콜레스테롤혈증 예방 또는 치료용 약학 조성물.
- 락토바실러스 퍼멘텀(Lactobacillus fermentum) MJM60397(수탁번호 : KACC 92133P) 균주, 이의 배양물, 이의 파쇄물 또는 이의 추출물을 유효성분으로 포함하는 고콜레스테롤혈증 예방 또는 개선용 식품 조성물.
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|---|---|---|---|
| KR1020180073972A KR20180075463A (ko) | 2018-06-27 | 2018-06-27 | 프로바이오틱 활성을 갖는 신규 락토바실러스 퍼멘텀 및 이의 용도 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
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| KR1020180073972A KR20180075463A (ko) | 2018-06-27 | 2018-06-27 | 프로바이오틱 활성을 갖는 신규 락토바실러스 퍼멘텀 및 이의 용도 |
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|---|---|
| KR (1) | KR20180075463A (ko) |
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN112272697A (zh) * | 2018-03-26 | 2021-01-26 | 韩国亿诺生物有限公司 | 新型发酵乳杆菌lm1016菌株及包含其的用于预防或治疗心血管疾病的组合物 |
| KR20210045170A (ko) | 2019-10-16 | 2021-04-26 | 한국식품연구원 | 프로바이오틱 활성을 갖는 사카로마이세스 세레비지애 보울라디０３ 신균주 및 이의 용도 |
| NL2035207A (en) * | 2022-11-22 | 2023-07-27 | Chongqing Tianyou Dairy Co Ltd | Application of lactobacillus paracasei in preparation for reducing serum cholesterol levels |
-
2018
- 2018-06-27 KR KR1020180073972A patent/KR20180075463A/ko not_active Application Discontinuation
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
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| NL2035207A (en) * | 2022-11-22 | 2023-07-27 | Chongqing Tianyou Dairy Co Ltd | Application of lactobacillus paracasei in preparation for reducing serum cholesterol levels |
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