CN101918537B - 胁迫耐性双歧杆菌 - Google Patents
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Abstract
本发明总体而言涉及双歧杆菌领域。具体而言,本发明涉及具有经调节的胁迫抗性的双歧杆菌领域。本发明的一个实施方案是具有组成型调节的DnaK、DnaJ、GrpE和/或ClpB表达的双歧杆菌。
Description
本发明一般涉及双歧杆菌(Bifidobacteria)领域。具体而言,本发明涉及具有经调节的胁迫抗性的双歧杆菌领域。
益生菌是根据其促进健康的特性选择的。益生菌作为活生物发挥其益处(Guarner,F.和G.J.Schaafsma.1998.″Probiotics″.Int.J.FoodMicrobiol.39:237-238),该细菌应该能在胃肠道条件下存活。在工业应用中,大规模生产需要益生菌具有能耐受食品加工及存储的额外能力。这些生产步骤的特征为破坏细菌良好生存的不同胁迫。其中,高温或低温、高渗透压、氧化和湿度是可能的关键因素。
特别地,已知一些益生菌物种的温度、氧化或喷雾干燥耐性很差。这些胁迫耐性差的益生菌的突出实例为例如双歧杆菌,特别是长双歧杆菌(Bifidobacterium longum)(Simpson,P.J.,C.Stanton,G.F.Fitzgerald和R.P.Ross.2005.″Intrinsic tolerance of Bifidobacterium species to heatand oxygen and survival following spray drying and storage″.J.Appl.Microbiol.99:493-501)。
为了解决这一问题并提高益生菌在食品生产中的存活率,目前已经使用了一些方法,包括微胶囊化、添加保护剂、氧不通透包装以及改进生长或加工条件。
然而,这些方法的实施复杂且费力,并且常常需要加入可具有副作用并且可能在最终食品产品中不想要的其他化合物。
另一方面,有一些应用中期望在产品中含有尽可能少的活细菌。目前,这些无菌产品通过施加高热和/或高压来制备。在这种情况下,可能期望有即便不需要高能耗处理也能有效灭活的益生菌可用。
为了克服本领域的这些问题,本发明人选择了不同的方法来调节(特别是提高或降低)产品中的活益生菌(特别是双歧杆菌)数。本发明人寻找了具有经调节的胁迫抗性的天然双歧杆菌菌株。
因此,本发明的一个目的是为本领域提供具有经调节的(特别是提高的或降低的)胁迫抗性的益生双歧杆菌,以及提供调节(特别是提高或降低)食品或药物产品中活益生菌数目的方法。
本发明的这一目的通过权利要求1的双歧杆菌、权利要求10的组合物、权利要求13的用途以及权利要求15的方法来实现。
特别地,本发明人意想不到地发现,具有组成型调节的DnaK、DnaJ、GrpE和/或ClpB表达的双歧杆菌实现了本发明的目的。
本发明人意想不到地发现,可以通过组成型调节DnaK、DnaJ、GrpE和/或ClpB的表达来调节双歧杆菌的胁迫抗性。具体地,组成型上调DnaK、DnaJ、GrpE和/或ClpB的表达将导致提高的胁迫抗性,而组成型下调DnaK、DnaJ、GrpE和/或ClpB的表达将导致降低的胁迫抗性。
因此,本发明的一个优选实施方案是组成型上调DnaK、DnaJ、GrpE和/或ClpB表达的双歧杆菌。提高的胁迫抗性具有若干优点。如果施用活细菌,则可提高双歧杆菌的益生效果,如果它们能在肠道中存活(以使其能够到达肠道并发挥其作用)则可更高。胁迫抗性双歧杆菌更可能在导致胁迫的处理下存活,例如食品或药物生产中的情况。胁迫抗性双歧杆菌还更可能在去往肠道过程中的人体条件下存活。
还可能期望有具有降低的胁迫抗性的双歧杆菌可用,例如在施用前需要使细菌完全灭活的情况。这具有可以精确且自主地定制双歧杆菌效果的优点,因为可以排除由于定殖而导致的效果增强。在无菌组合物或者用于实验或生产用途的情况下也可能期望胁迫抗性更低的双歧杆菌。
如果调节了DnaK、DnaJ、GrpE和/或ClpB的表达,那么一般而言,对双歧杆菌胁迫抗性产生影响的任何程度的调节均可考虑在内,并包括在本发明的范围中。
然而,对于上调的情况,优选本发明的双歧杆菌与标准条件下的双歧杆菌相比显示出DnaK、DnaJ、GrpE和/或ClpB表达上调约1.5-100倍。
标准条件定义如下:在37℃下在含有0.05%(重量/体积)半胱氨酸的MRS培养基(Becton Dickinson AG,Basel,Switzerland;10g酪蛋白胨,10g肉膏,5g酵母提取物,20g葡萄糖,1g tween 80,2g K2HPO4,5g乙酸钠,2g(NH4)2柠檬酸,0.2g MgSO4x 7H2O,0.05g MnSO4x H2O,1升蒸馏水,pH调节至6.2-6.5)中厌氧培养。细胞可为指数生长期(OD600nm为0.7)或稳定期。
一般地,如果蛋白质以高于标准条件下给定的天然基线产量的量或产量表达或产生,则蛋白质表达是“上调的”或者蛋白质是“过表达”的。
蛋白质的过表达可通过例如改变以下一种或多种来实现:(a)宿主细胞的生长或生存条件;(b)编码调节多肽的多核苷酸;(c)用于控制多核苷酸表达及其在细胞中的拷贝数的启动子;和(d)宿主细胞本身。
类似地,如果蛋白质以低于标准条件下给定的天然基线产量的量或产量表达或产生,则蛋白质表达是“下调的”或者蛋白质是“低表达”的。
在本文中,表达水平或产量指所表达的蛋白质或所产生的蛋白质(即表达产物)的量或浓度,无论是否为活性或功能性形式。
本发明一个优选的实施方案是这样的双歧杆菌,其中DnaK、DnaJ、GrpE和/或ClpB的表达被上调至与热激后的野生型双歧杆菌(特别是指数生长中期)大致相同的水平。
用于基因表达测量的热激定义如下:将细菌在37℃下在含有0.05%(重量/体积)半胱氨酸的MRS培养基(Becton Dickinson AG,Basel,Switzerland,组成见上文)中厌氧培养并在指数生长中期(OD600nm为0.7)收获。然后,对200ml等分试样进行离心,将沉淀重悬于90ml 50℃预温的MRS-半胱氨酸培养基中。将浓缩的细菌悬液在50℃温育7分钟。然后收集10ml样品,离心并将沉淀立即冻存中液氮中直至基因表达测量。
这可确保DnaK、DnaJ、GrpE和/或ClpB表达的上调对应于双歧杆菌通过外部刺激可达到的水平。重要的是,DnaK、DnaJ、GrpE和/或ClpB表达水平的提高将对应于可天然达到的水平,从而避免了实际上对细胞有毒的超过天然水平的过表达。
本发明对双歧杆菌中DnaK、DnaJ、GrpE和/或ClpB表达的调节可通过调节HspR表达和/或HspR功能来实现。
不限于理论,本发明人认为HspR可调节双歧杆菌中DnaK、DnaJ、GrpE和/或ClpB的表达。通过调节HspR表达和/或HspR功能来调节DnaK、DnaJ、GrpE和/或ClpB表达具有这样的优点,即可以通过影响一种分子的表达水平和/或功能,可以同时调节DnaK、DnaJ、GrpE和/或ClpB的表达。通过负调节因子HspR实现的表达控制可以是提高的或降低的,这取决于需要上调还是下调DnaK、DnaJ、GrpE和/或ClpB的表达。一般而言,降低HspR的浓度将导致DnaK、DnaJ、GrpE和/或ClpB表达的上调,因此导致提高的胁迫抗性。类似地,功能更低的HspR将导致DnaK、DnaJ、GrpE和/或ClpB表达的上调以及提高的胁迫抗性。
如果需要降低胁迫抗性,可通过提高细胞浓度(提高表达)和/或提高功能来使HspR控制更为严紧。
可通过本领域技术人员已知的任何方法来影响HspR的功能和/或表达。
例如,本发明的双歧杆菌可包含至少一种调节HspR表达和/或HspR功能的突变。这至少一种突变可位于hspR基因中。
优选所述至少一种突变位于hspR基因的编码序列中。所述突变可以是本领域技术人员已知的任何类型突变。任何类型的基因序列改变都认为是突变。优选地,所述突变选自点突变(特别是错义突变和无义突变)、插入和缺失。
在本发明的一个优选实施方案中,双歧杆菌包含hspR基因中的至少一个点突变。本文使用的术语“点突变”指核酸替换和/或缺失。所述至少一个突变可以备选地或同时地可至少部分阻碍HspR表达和/或HspR功能。
“编码序列”是在表达时导致产生蛋白质的核苷酸序列,即编码该蛋白质的氨基酸序列的核苷酸序列。优选地,编码序列是双链DNA序列,其在置于适当调节序列控制下时在体外或体内在细胞中转录并翻译成多肽。编码序列的边界由5’(氨基)端的起始密码子和3’(羧基)端的翻译终止密码子确定。编码序列可处于细胞中转录和翻译控制序列的“控制下”。
术语“基因”指编码或对应于特定氨基酸序列(其包含一种或多种蛋白质的全部或部分)的DNA序列,并可包含或不包含调节性DNA序列,如决定该基因在何种条件下表达的启动子序列。
如果突变位于DnaK、DnaJ、GrpE、ClpB和/或HspR基因编码序列中,则优选该突变改变蛋白质的功能。编码序列中的突变可用于提高或降低蛋白质的功能。
如果突变位于DnaK、DnaJ、GrpE、ClpB和/或HspR基因的调节性DNA序列中,例如位于转录和翻译控制序列中,则优选该突变调节蛋白质的表达。调节性DNA序列中的突变可用于上调或下调蛋白质的表达。
调节性DNA序列包括提供编码序列在宿主细胞中表达的转录或翻译控制序列,例如启动子、增强子、终止子。
转录或翻译控制序列包括如分别诱导、上调、下调或影响基因转录或翻译的转录因子。
“启动子”是能结合细胞中的RNA聚合酶并起始下游(3’方向)编码序列转录的DNA调节区。
本发明的双歧杆菌可选自青春双歧杆菌(Bifidobacteriumadolescentis)、角双歧杆菌(Bifidobacterium angulatum)、动物双歧杆菌(Bifidobacterium animalis)、星状双歧杆菌(Bifidobacterium asteroids)、两岐双歧杆菌(Bifidobacterium bifidum)、牛双歧杆菌(Bifidobacteriumboum)、短双歧杆菌(Bifidobacterium breve)、链状双歧杆菌(Bifidobacterium catenulatum)、豚双歧杆菌(Bifidobacteriumchoerinum)、棒状双歧杆菌(Bifidobacterium coryneforme)、兔双歧杆菌(Bifidobacterium cuniculi)、龋齿双歧杆菌(Bitidobacterium denticolens)、齿双歧杆菌(Bifidobacterium dentium)、高卢双歧杆菌(Bifidobacteriumgallicum)、鸡双歧杆菌(Bifidobacterium gallinarum)、印度双歧杆菌(Bifidobacterium indicum)、婴儿双歧杆菌(Bifidobacterium infantis)、殊形双歧杆菌(Bifidobacterium inopinatum)、乳酸双歧杆菌(Bifidobacteriumlactis)、长双歧杆菌(Bifidobacterium longum)、大双歧杆菌(Bifidobacteriummagnum)、瘤胃双歧杆菌(Bifidobacterium merycicum)、最小双歧杆菌(Bifidobacterium minimum)、假链状双歧杆菌(Bifidobacteriumpseudocatenulatum)、假长双歧杆菌(Bifidobacterium pseudolongum)、雏双歧杆菌(Bifidobacterium pullorum)、反刍双歧杆菌(Bifidobacteriumruminantium)、世纪双歧杆菌(Bifidobacterium saeculare)、细长双歧杆菌(Bifidobacterium subtile)、猪双歧杆菌(Bifidobacterium suis)、嗜酸热双歧杆菌(Bifidobacterium thermacidophilum)和嗜热双歧杆菌(Bifidobacterium thermophilum)。
优选地,所述双歧杆菌是长双歧杆菌。
通过自然选择,本发明人能够提供长双歧杆菌NCC2912、长双歧杆菌NCC2913和长双歧杆菌NCC2923菌株作为本发明特别优选的实施方案。所述菌株已根据布达佩斯条约保藏于CNCM;巴斯德研究所(InstitutPasteur),25;Rue du Docteur Roux;F-75724 Paris Cedex 15。NCC2912保藏为CNCM I-3853,NCC2913保藏为CNCM I-3854,NCC2923保藏为CNCM I-3855。通过自然选择获得的菌株具有无需基因技术手段修饰而实现本发明目的的优点。
本发明还包括含有本发明双歧杆菌的组合物。所述组合物可以为任何组合物,但优选药物或食品。
双歧杆菌在施用后赋予宿主健康益处。双歧杆菌的健康益处有许多,包括帮助消化、与变态反应的低发生率相关、防止一些形式的肿瘤生长以及体重控制。
优选地,所述药物或食品旨在用于人、宠物或家畜,宠物或家畜可选自狗、猫、豚鼠、兔、猪、牛、绵羊、山羊、马和/或家禽。
所述组合物可以是包含至少一种碳水化合物源、至少一种脂质源和/或至少一种蛋白质源的营养组合物。
任何合适的膳食蛋白均可用作蛋白质源,例如动物蛋白(如乳蛋白、肉蛋白和卵蛋白)、植物蛋白(如大豆蛋白、小麦蛋白、水稻蛋白和豌豆蛋白)、游离氨基酸混合物或其组合。乳蛋白(如酪蛋白和乳清蛋白)和大豆蛋白是尤其优选的。蛋白质可以是完整的或水解的,或者完整及水解蛋白的混合物。可能期望提供部分水解的蛋白质(水解程度2至20%),例如对于认为有发生牛奶过敏风险的动物。如果需要水解的蛋白,水解过程可如本领域所知进行。例如,可通过在一个或多个步骤中对乳清级分进行酶水解来制备乳清蛋白水解产物。如果用作起始材料的乳清级分基本不含乳糖,则发现蛋白质在水解过程中发生的赖氨酸阻断少得多。这使得赖氨酸阻断的程度从总赖氨酸的约15%(以重量计)减少至赖氨酸重量的约10%,例如赖氨酸重量的约7%,这大幅提高了蛋白质源的营养品质。
如果组合物包含脂肪源,则脂肪源优选提供该组合物5%至40%的能量,例如20%至30%的能量。合适的脂肪谱可使用芸苔油、玉米油和高油酸葵花籽油的掺合物来获得。
碳水化合物源优选提供该组合物40%至80%的能量。任何合适的碳水化合物均可使用,例如蔗糖、乳糖、葡萄糖、果糖、玉米糖浆固体、麦芽糊精及其混合物。
需要的话,还可加入膳食纤维。膳食纤维通过小肠而不被酶消化,并发挥天然湿胀剂和轻泻药的功能。膳食纤维可以是可溶或不溶的,一般优选这两种类型的掺合物。优选的膳食纤维源包括大豆、豌豆、燕麦、果胶、瓜尔胶、阿拉伯胶、果糖寡糖、半乳寡糖、唾液酰乳糖和来自动物乳的寡糖。优选的纤维掺合物是具有较短链果糖寡糖的菊糖混合物。优选地,如果存在纤维,则纤维含量为2至40g/l所摄入组合物,更优选4至10g/l。
膳食组合物还可含有矿物质和微量营养物,例如政府部门(如USRDA)推荐的微量元素和维生素。例如,组合物可在日剂量中含有以下范围的一种或多种以下微量营养物:300至500mg钙、50至100mg镁、150至250mg磷、5至20mg铁、1至7mg锌、0.1至0.3mg铜、50至200μg碘、5至15μg硒、1000至3000μgβ-胡萝ト素、10至80mg维生素C、1至2mg维生素B1、0.5至1.5mg维生素B6、0.5至2mg维生素B2、5至18mg烟酸、0.5至2.0μg维生素B12、100至800μg叶酸、30至70μg生物素、1至5μg维生素D、3至10μg维生素E。
需要时,可在组合物中掺入一种或多种食品级的乳化剂,例如甘油一酯和甘油二酯的二乙酰酒石酸酯、卵磷脂以及甘油一酯和甘油二酯。类似地,可包含合适的盐和稳定剂。
组合物可用于经口、肠胃外或局部施用。经口应用包括用于本发明肠内施用的目的。
组合物可含有一种或多种其他类型的其他食品级细菌。“食品级细菌”指用于食品并且通常认为可安全用于食品的细菌。食品级细菌可选自乳酸菌、益生菌和/或双歧杆菌。“益生菌”指对宿主的健康有益处的微生物细胞制备物或微生物细胞组分(Salminen S,Ouwehand A.Benno Y.等“Probiotics:how should they be defined”Trends Food Sci.Technol.1999:10107-10)。所述组合物还可含有至少一种益生素(prebiotic)。“益生素”指用于促进肠道中益生菌生长的食品物质。益生素可选自寡糖,并任选地包括果糖、半乳糖、甘露糖、大豆和/或菊糖和/或膳食纤维。
本发明的组合物还可含有保护性水胶体(如树胶、蛋白质、改性淀粉)、粘合剂、成膜剂、包封剂/材料、壁/壳材料、基质化合物、包衣、乳化剂、表面活性剂、增溶剂(油、脂肪、蜡、卵磷脂等)、吸附剂、载体、填充剂、共化合物、分散剂、润湿剂、加工助剂(溶剂)、助流剂、味道掩蔽剂、增重剂、成胶剂、凝胶形成剂、抗氧化剂和抗微生物剂。所述组合物还可含有常规药物添加剂和佐剂、赋形剂和稀释剂,包括但不仅限于水、任何来源的明胶、白糊精、磺酸木质素、滑石、糖、淀粉、阿拉伯胶、植物油、聚亚烷基二醇、调味剂、防腐剂、稳定剂、乳化剂、缓冲剂、乳化剂、着色剂、润湿剂、填充剂等。在所有情况下,这些其他组分均根据其对于预期受者的适用性来选择。
本发明的组合物可含有任何数目的本发明双歧杆菌。原则上讲,到达肠道并能产生菌落的单个双歧杆菌足以对宿主产生有益效果。
如果组合物是药物,则其日剂量中通常可包含103至1010cfu的至少一种本发明双歧杆菌。如果组合物是药物,其日剂量中还可包含至少一种本发明双歧杆菌的103至1010个细胞。
如果组合物是食品,其在每克干重的食品组合物中通常可含有103至1012cfu的至少一种本发明双歧杆菌。如果组合物是食品,其在每克干重的食品组合物中还可含有至少一种本发明双歧杆菌的103至1012个细胞。
本发明还涉及本发明双歧杆菌用于提高产品中活益生菌(特别是活双歧杆菌)数目的用途。类似地,本发明涉及本发明组合物用于提高产品中活益生菌数目的用途。最后,本发明还涉及本发明双歧杆菌用于制备本发明组合物以提高产品中活益生菌(特别是活双歧杆菌)数目的用途。
本发明的用途还用于在使益生菌暴露于胁迫后提高产品中益生菌(特别是双歧杆菌)数目。
胁迫可选自与约40-120℃的热接触30秒至2小时、温度改变、机械胁迫或者长期保存、低湿度保存和/或冷冻干燥或喷雾干燥。
温度改变可以是温度在-80℃至+120℃的温度范围内连续改变至少两次,幅度高于2小时内5℃。
长期保存是长于1周(优选长于1个月,甚至更优选长于6个月)的保存,水活度最高为0.33,温度为25℃至45℃。
最后,本发明涉及提高双歧杆菌胁迫抗性的方法,包括以下步骤:组成型调节DnaK、DnaJ、GrpE和/或ClpB的表达,特别是通过在双歧杆菌hspR基因中引入至少一个点突变从而阻碍HspR表达和/或HspR功能来实现。
本领域技术人员明白,他们可对本文所述本发明的任何特征进行自由组合,而不偏离本发明的范围。
本发明的其他实例和特征在以下实施例和附图中将是很明显的。
图1显示,新的长双歧杆菌隔离群NCC2912、NCC2913和NCC2923对热激的抗性显著更高。误差线显示3至15次重复的置信区间(P=0.05);*,高于检测限。
图2显示通过微阵列对其转录组进行全局分析。在全部三个菌株中,我们均发现dnaK操纵子和clpB基因发生了过表达(NCC2923的数据未显示)。每个基因的表达水平均相对于指数生长期(A和D)、指数期热激后7分钟(B和E)和稳定期(C和F)野生型长双歧杆菌NCC2705的表达水平进行表示。dnaK操纵子的基因以黑色显示(BL0516=hspR,BL0517=dnaJ,BL0519=grpE,BL0520=dnaK),clpB(=BL1250)为白色。其他基因以灰色显示。
图3显示在对编码dnaK及clpB之负调节因子的hspR基因进行测序时发现的点突变。黑框中为新长双歧杆菌菌株中的突变,下划线为放线菌亚纲中保守的残基,粗体为在此类调节因子中观察到与DNA分子相互作用的残基,HTH为螺旋-转角-螺旋基序,W1和W2为翼状螺旋基序。
图4显示了证明这些突变导致所观察到的热耐性表型的结果(NCC2912)。通过野生型调节因子HspR对突变菌株进行互补,恢复了其热敏感性。该图显示了在59℃热激13分钟后的活力损失,以及通过野生型hspR基因对热耐性菌株进行互补(complementation)的效果。Mut1=NCC2912;野生型=NCC2705,误差线显示了3次重复的标准差。
图5显示,在野生型菌株中组成型过表达HspR调节因子赋予野生型菌株提高的热敏感性。在59℃热激13分钟后的活力损失,以及通过野生型hspR基因对热耐性菌株进行互补的效果。wt=NCC2705,误差线显示了3次重复的标准差;*,高于检测限。
实施例1:分离本发明的双歧杆菌
通过对原始野生型菌株进行热抗性突变体的连续自然选择获得了新的长双歧杆菌隔离群。每个选择循环由对含有0.05%(重量/体积)半胱氨酸的MRS培养基(MSR-cys)中的5ml O/N(过夜)培养物施加13分钟热激(HS)胁迫组成。通过对培养物进行连续稀释进行HS。将培养物在45ml预热培养基中稀释10倍,并置于热水浴中。类似地,通过将50ml稀释在225ml室温培养基中进行迅速降温。在37℃下将所得培养物厌氧培养(AnaeroGen,Oxoid AG,Basel,Switzerland)16小时(直到稳定期),然后进行新一轮选择。最后,在约25个循环后,通过双划线分离克隆,以从HS后获得的菌落中产生纯培养物。
应用了相似的方法来选择对氧具有提高抗性的天然突变体。对于这一循环选择,将在可控氧浓度下将细菌种群涂板在MRS琼脂表面上:厌氧生活预孵育4-5小时后,将琼脂平板在用空气和纯氮混合物吹洗的罐中孵育。平行地厌氧培养细胞作为参照。收集来自供氧培养的菌落,在MRS-cyst液体培养基中厌氧培养,并置于下一循环的氧化胁迫。每次提高氧处理的浓度,使受氧处理平板的细胞数等于厌氧参照的细胞数。最后,分离克隆。我们获得了在15%氧压力下在MRS琼脂平板上生长而不损失存活的新的长双歧杆菌菌株。
实施例2:NCC2912、NCC2913和NCC2923的热激抗性
对NCC2912、NCC2913、NCC2923、NCC2705和NCC3001测试其热激抗性。NCC2705和NCC3001是用作参照的野生型长双歧杆菌菌株。热激如下进行:将1.5ml O/N培养物稀释在预热的13.5ml含有0.05%(重量/体积)半胱氨酸的MRS培养基(Becton Dickinson AG,Basel,Switzerland,组成见上文),孵育13分钟,然后将100μl在稀释微量滴定板中冷却。在选择过程和HS测定中,在HS之前和之后进行细胞计数。计数前将平板在37℃孵育48小时。如下表示活力损失:用HS后计数除以HS前计数,然后取对数。
图1给出了59℃热激13分钟后的活力损失(对数)。其显示,新的长双歧杆菌隔离群NCC2912、NCC2913和NCC2923对热激的抗性显著更高。
实施例3:分析热抗性菌株的转录组
如下通过微阵列对热抗性细菌菌株进行转录组全局分析。在37℃下将细菌培养在含有0.05%(重量/体积)半胱氨酸的MRS培养基(BectonDickinson AG,Basel,Switzerland,组成见上文)中。将预培养物在厌氧条件下孵育,而将用于热激实验的培养物在CO2气氛下培养在0.5升Sixfors发酵罐(Infors AG,Bottmingen,Switzerland)中,并搅拌(150rpm)。所有发酵均一式二份进行。在指数中期(OD600nm为0.7),在HS前对细菌培养物进行采样,将25ml在室温下以3600g离心5分钟。然后,将沉淀立即冻存在液氮中,并保存于-80℃。平行地,离心200ml等分试样,将沉淀悬浮于90ml 50℃预热的MRS-cys培养基中。将浓缩的细菌悬液在50℃下孵育7分钟。收集10ml样品,离心,将沉淀立即冻存在液氮中。为进行稳定期采样,监测10ml管中分批培养物的OD600nm,直至达到稳定期(16小时)。然后如上述收获细胞。如前述进行RNA提取和质量检查(Rezzonico,E.,S.Lariani,C.Barretto,G.Cuanoud,G.Giliberti,M.Delley,F.Arigoni和G.Pessi.2007.″Global transcriptome analysis of the heat shockresponse of Bifidobacterium longum″.FEMS Microbiol.Lett.271:136-145),只是在使用RNeasy试剂盒(Qiagen)之前进行额外的DNaseI处理(Ambion)。设计Agilent 60元寡聚物微阵列,每个基因4至5个探针(Agilent technologies Inc.,USA)。使用3DNA Array 900MPX Genisphere试剂盒(Genisphere Inc.,Hatfield,PA,USA)与In situ Hybridization KitPlus组合,进行RNA标记和cDNA合成。杂交条件和载玻片洗涤如下进行。向20μl cDNA(用Genisphere试剂盒获得)中加入25μl对照靶标Agilent、60μl H2O和105μl Agilent缓冲液。在80℃孵育10分钟并在65℃孵育15分钟后,将反应物装入杂交室中预热的载玻片上,并在Agilent烘箱中以4rpm在65℃孵育16小时。将cDNA杂交在42℃下在6x SSC、0.005%Triton x-100中洗涤10分钟,并在室温下在0.2x SSC、0.00016%Triton x-100中洗涤10分钟。如Genisphere方案所述进行3DNA杂交,只是将杂交体积提高至204μl,并如下进行洗涤:65℃下2x SSC、0.0016%Triton x-100中10分钟,室温下2x SSC、0.0016%Triton x-100中5分钟,和室温下0.2x SSC、0.00016%Triton x-100中10分钟。用Scanarray 4000(Packard Biochip Technologies,Billerica,MA,USA)以10μm扫描载玻片,用Imagene 5.6(Biodiscovery,El Segundo,CA,USA)提取数据。用Python语言的自制脚本(www.python.org)和本地安装的ArrayPipe网络服务器(Hokamp,K.,F.M.Roche,M.Acab,M.E.Rousseau,B.Kuo,D.Goode,D.Aeschliman,J.Bryan,L.A.Babiuk,R.E.Hancock和F.S.Brinkman.2004.ArrayPipe:a flexible processing pipeline for microarray data.Nucleic Acids Res.32:W457-W459)处理数据。显示信号小于本地背景标准差的2倍的探针被认为是无信号。从分析中弃去在两个通道中显示无信号或饱和信号的探针。推测染色信号有强度依赖性差异,因此对信号比率应用(limma)loess全局归一化。由于每个基因有数个探针,我们将每个基因的结果汇总如下。在每个杂交数据集中,基因倍数改变通过相应探针值的中值给出。基于相同的“选定”探针计算平均强度。在杂交之间基因值以每个杂交所得基因值的平均数给出。
图2显示了全局转录组分析的结果。在全部3种菌株中,我们均发现dnaK操纵子和clpB基因发生了过表达(NCC2923的数据未显示)。每个基因的表达水平均相对于指数生长期(A和D)、指数期热激后7分钟(B和E)和稳定期(C和F)野生型长双歧杆菌NCC2705的表达水平进行表示。dnaK操纵子的基因以黑色显示(BL0516=hspR,BL0517=dnaJ,BL0519=grpE,BL0520=dnaK),clpB(=BL1250)为白色。其他基因以灰色显示。
实施例4:对胁迫抗性菌株进行测序
对胁迫抗性菌株NCC2912、NCC2913、NCC2923的hspR基因进行测序,以试图鉴定其显著胁迫抗性以及dnaK操纵子和clpB基因过表达的分子原因。由Fasteris SA(Geneva)进行测序。图3显示了在对编码dnaK和clpB负调节因子的hspR基因进行测序时发现的点突变。这些点突变影响了可能负责该调节因子与启动子DNA结合的蛋白质结构域。白色为新长双歧杆菌中的突变;下划线为放线菌亚纲中保守的残基;粗体为在此类调节因子中观察到与DNA分子相互作用的残基;HTH为螺旋-转角-螺旋基序,W1和W2为翼状螺旋基序
实施例5:互补实验
我们通过基因互补证明,hspR基因中的突变导致了所观察到的热耐性表型。结果示于图4。通过野生型调节因子HspR对突变体菌株进行互补,恢复了其热敏感性。互补如下进行。使用Expand High Fidelity PCR系统(Roche,Germany)和两种引物CCCGGGCTCGAGATGGCGCGGTTAGCCAACC及CCCGGGAAGCTTTCACCAACCCCACAGGACC,从基因组DNA中扩增NCC2705的hspR基因。将600bp扩增子克隆进pGUSA质粒的XhoI及HindIII位点中。通过测序验证DNA序列(Fasteris,Geneva)。将质粒转化进NCC2912中。DNA操作、质粒分离、大肠杆菌及长双歧杆菌转化如前述进行(Klijn,A.,D.Moine,M.Delley,A.Mercenier,F.Arigoni和R.D.Pridmore.2006.″Construction of a reporter vector for the analysis ofBifidobacterium longum promoters″.Appl.Environ.Microbiol.72:7401-7405)。质粒pGUSA描述于后一参考文献中。该图显示了在59℃热激13分钟后的活力损失,以及通过野生型hspR基因对热耐性菌株进行互补的效果。Mut1=NCC2912;野生型=NCC2705,误差线显示了3次重复的标准差。
实施例6:在野生型菌株中过表达HspR调节因子赋予了野生型菌株提高的热敏感性
与实施例5相似,我们在野生型菌株NCC2705中过表达NCC2705的野生型HrpR调节因子,并显示在野生型菌株中组成型过表达HspR调节因子赋予野生型菌株提高的热敏感性。结果示于图5,其显示了59℃热激13分钟后的活力损失。wt=NCC2705。
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1 5
Claims (10)
1.长双歧杆菌CNCM I-3854。
2.含有长双歧杆菌CNCM I-3854的组合物。
3.根据权利要求2的组合物,其中所述组合物是药物或食品。
4.根据权利要求2或3的组合物,其特征在于其还含有至少一种益生素和/或膳食纤维。
5.根据权利要求4的组合物,其中所述益生素选自寡糖,并且所述益生素任选地含有果糖、半乳糖、甘露糖、大豆和/或菊粉。
6.根据权利要求3或5的组合物,其特征在于所述药物在日剂量中含有103至1010cfu和/或103至1010个细胞的长双歧杆菌CNCM I-3854,或者所述食品在每克干重的该食品组合物中含有103至1012cfu和/或103至1012个细胞的长双歧杆菌CNCM I-3854。
7.根据权利要求4的组合物,其特征在于所述药物在日剂量中含有103至1010cfu和/或103至1010个细胞的长双歧杆菌CNCM I-3854,或者所述食品在每克干重的该食品组合物中含有103至1012cfu和/或103至1012个细胞的长双歧杆菌CNCM I-3854。
8.长双歧杆菌CNCM I-3854或根据权利要求2至7中任一项的组合物用于提高产品中活的长双歧杆菌CNCM I-3854益生菌数目的用途。
9.根据权利要求8的用途,其中所述用途是在益生菌接触胁迫后提高产品中活的长双歧杆菌CNCM I-3854益生菌数目的用途。
10.根据权利要求8或9的用途,其中所述胁迫是与40至120℃的热接触30秒至2小时。
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