CN111073826B - 动物双歧杆菌a6耐酸应答机制研究 - Google Patents

动物双歧杆菌a6耐酸应答机制研究 Download PDF

Info

Publication number
CN111073826B
CN111073826B CN201811222559.3A CN201811222559A CN111073826B CN 111073826 B CN111073826 B CN 111073826B CN 201811222559 A CN201811222559 A CN 201811222559A CN 111073826 B CN111073826 B CN 111073826B
Authority
CN
China
Prior art keywords
baa6
bifidobacterium animalis
bifidobacterium
acid
seq
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
CN201811222559.3A
Other languages
English (en)
Other versions
CN111073826A (zh
Inventor
任发政
孙二娜
赵亮
张明
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
China Agricultural University
Original Assignee
China Agricultural University
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by China Agricultural University filed Critical China Agricultural University
Priority to CN201811222559.3A priority Critical patent/CN111073826B/zh
Publication of CN111073826A publication Critical patent/CN111073826A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN111073826B publication Critical patent/CN111073826B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/38—Chemical stimulation of growth or activity by addition of chemical compounds which are not essential growth factors; Stimulation of growth by removal of a chemical compound
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/74—Vectors or expression systems specially adapted for prokaryotic hosts other than E. coli, e.g. Lactobacillus, Micromonospora
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/02—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving viable microorganisms
    • C12Q1/04—Determining presence or kind of microorganism; Use of selective media for testing antibiotics or bacteriocides; Compositions containing a chemical indicator therefor

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Abstract

本发明公开了动物双歧杆菌A6耐酸应答机制研究，提供了试剂在制备试剂盒中的用途。该试剂盒用于增强动物双歧杆菌的耐酸性，该试剂用于下列的至少之一：加强脂肪酸的合成和pspA的表达；降低细胞膜的通透性；阻挡氢离子进入动物双歧杆菌细胞内；增强多糖的利用、双歧途径以及核糖的代谢；增加动物双歧杆菌细胞的胞内能量的产生；利用DnaK系统、GroES/EL系统以及ClpB减少蛋白质损伤；利用直接修复及碱基删除修复系统修复DNA损伤；通过蛋白的磷酸化、去磷酸化及群体感应系统增强信号传导；调节转录因子的水平及降低翻译水平。

Description

动物双歧杆菌A6耐酸应答机制研究
技术领域
本发明涉及生物领域，具体地，本发明涉及动物双歧杆菌A6耐酸应答机制研究，更具体地，本发明涉及试剂在制备试剂盒中的用途、增强动物双歧杆菌耐酸性的方法、微生物、食品、药品以及筛选药物的方法。
背景技术
双歧杆菌是人体肠道的原籍菌，具有多种益生功能，被广泛的应用于酸奶、发酵乳饮料等发酵乳制品中。然而，在发酵乳制品中，随着发酵过程的进行，有机酸不断积累，pH值逐渐下降至4.0左右。而且在摄入过程中还要经历胃部pH 2.0-3.0的极端酸环境。双歧杆菌对酸胁迫的耐受能力直接影响着菌体的存活。动物双歧杆菌是最为耐酸的双歧杆菌，它可以在pH 3.0的环境中处理3h后依然保持存活，而其他双歧杆菌在pH 3.0的环境中暴露30min后即全部死亡或者活菌数下降5个数量级。这暗示着动物双歧杆菌具有天然优良的耐酸体系。然而，动物双歧杆菌的耐酸应答机制尚不明确。
发明内容
本申请是基于发明人对以下事实和问题的发现和认识作出的：
细菌对于酸性胁迫环境的响应是一个全局的、多机制的复杂过程。目前，动物双歧杆菌具体以怎样的分子机制响应酸胁迫环境尚不明确。基于上述问题，发明人以动物双歧杆菌A6为例，利用比较基因组学、转录组学、基因工程等相结合的研究手段，对动物双歧杆菌耐酸应答机制进行解析，并对其中的关键基因进行验证，从而为深入研究双歧杆菌耐酸应答机制提供更多的基础信息，为提高其他双歧杆菌的耐酸性提供理论依据。
为此，在本发明的第一方面，本发明提出了试剂在制备试剂盒中的用途。根据本发明的实施例，所述试剂盒用于增强动物双歧杆菌的耐酸性，所述试剂用于下列的至少之一：加强脂肪酸的合成和pspA的表达；降低细胞膜的通透性；阻挡氢离子进入动物双歧杆菌细胞内；增强多糖的利用、双歧途径以及核糖的代谢；增加动物双歧杆菌细胞的胞内能量的产生；利用DnaK系统、GroES/EL系统以及ClpB减少蛋白质损伤；利用直接修复及碱基删除修复系统修复DNA损伤；通过蛋白的磷酸化、去磷酸化及群体感应系统增强信号传导；调节转录因子的水平及降低翻译水平。发明人通过实验发现，动物双歧杆菌通过细胞膜通透性的降低减少氢离子进入，草酸盐代谢增强增加氢离子消耗，碳水化合物代谢增强增加能量产生，分子伴侣保护蛋白质，DNA修复系统修复受损伤的DNA，信号转导、转录翻译等方面来抵御和适应酸环境。由此，用于加强脂肪酸的合成和pspA的表达；降低细胞膜的通透性；阻挡氢离子进入动物双歧杆菌细胞内；增强多糖的利用、双歧途径以及核糖的代谢；增加动物双歧杆菌细胞的胞内能量的产生；利用DnaK系统、GroES/EL系统以及ClpB减少蛋白质损伤；利用直接修复及碱基删除修复系统修复DNA损伤；通过蛋白的磷酸化、去磷酸化及群体感应系统增强信号传导；以及调节转录因子的水平及降低翻译水平的至少之一的试剂制备的根据本发明实施例的试剂盒，能够增强动物双歧杆菌的耐酸性。
根据本发明的实施例，上述用途还可进一步包括如下附加技术特征至少之一：
根据本发明的实施例，所述试剂用于过表达BAA6_RS00465、BAA6_RS00480、BAA6_RS00535、BAA6_RS00905、BAA6_RS01120、BAA6_RS02185、BAA6_RS02360、BAA6_RS02390、BAA6_RS02980、BAA6_RS03075、BAA6_RS03880、BAA6_RS03885、BAA6_RS05205、BAA6_RS05630、BAA6_RS05670、BAA6_RS06110、BAA6_RS06240、BAA6_RS06420、BAA6_RS06435、BAA6_RS06440、BAA6_RS06445、BAA6_RS06465、BAA6_RS07200或BAA6_RS07205的至少之一。对于目标基因功能的研究，仅仅通过其在组学数据中的上下调表达并不能直接说明该基因在胁迫应答中发挥重要作用，还需要分子生物学的手段进行进一步的验证。由此，发明人将上述目的基因在动物双歧杆菌中进行过表达后发现，重组菌株在致死酸环境下的存活率提高，耐酸性能增强，验证了上述目标基因在动物双歧杆菌的耐酸应答过程的确发挥了重要作用。进而，用于过表达上述24个目标基因至少之一的试剂制备的根据本发明实施例的试剂盒，能够增强动物双歧杆菌的耐酸性。
根据本发明的实施例，所述试剂用于过表达BAA6_RS00480、BAA6_RS02185、BAA6_RS02390、BAA6_RS02980、BAA6_RS03885、BAA6_RS05205、BAA6_RS06240、BAA6_RS06435、BAA6_RS06440、BAA6_RS06445的至少之一。发明人发现，用于过表达上述10个目标基因至少之一的试剂制备的试剂盒，能够进一步增强动物双歧杆菌的耐酸性。
根据本发明的实施例，所述试剂用于过表达BAA6_RS00480、BAA6_RS06240、BAA6_RS03885或BAA6_RS05205的至少之一。发明人将上述目的基因在动物双歧杆菌中进行过表达后发现，重组菌株在致死酸环境下的存活率显著提高，高达22.43倍，耐酸性能显著增强，表明上述目标基因在动物双歧杆菌的耐酸应答过程中发挥十分重要的作用。进而，用于过表达上述4个目标基因至少之一的试剂制备的试剂盒，能够显著增强动物双歧杆菌的耐酸性。
根据本发明的实施例，所述试剂具有SEQ ID NO：1～10至少之一所示的核苷酸序列。进而将上述试剂导入受体细胞后，如动物双歧杆菌细胞后，在适宜基因过表达的条件下，可实现目标基因在受体细胞中的有效过表达。
在本发明的第二方面，本发明提出了一种增强动物双歧杆菌的耐酸性的方法。根据本发明的实施例，所述方法包括：将动物双歧杆菌与试剂进行接触，所述试剂用于下列的至少之一：加强脂肪酸的合成和pspA的表达；降低细胞膜的通透性；阻挡氢离子进入动物双歧杆菌细胞内；增强多糖的利用、双歧途径以及核糖的代谢；增加动物双歧杆菌细胞的胞内能量的产生；利用DnaK系统、GroES/EL系统以及ClpB减少蛋白质损伤；利用直接修复及碱基删除修复系统修复DNA损伤；通过蛋白的磷酸化、去磷酸化及群体感应系统增强信号传导；调节转录因子的水平及降低翻译水平。如前所述，动物双歧杆菌通过细胞膜通透性的降低减少氢离子进入，草酸盐代谢增强增加氢离子消耗，碳水化合物代谢增强增加能量产生，分子伴侣保护蛋白质，DNA修复系统修复受损伤的DNA，信号转导、转录翻译等方面来抵御和适应酸环境。由此，通过加强脂肪酸的合成和pspA的表达；降低细胞膜的通透性；阻挡氢离子进入动物双歧杆菌细胞内；增强多糖的利用、双歧途径以及核糖的代谢；增加动物双歧杆菌细胞的胞内能量的产生；利用DnaK系统、GroES/EL系统以及ClpB减少蛋白质损伤；利用直接修复及碱基删除修复系统修复DNA损伤；通过蛋白的磷酸化、去磷酸化及群体感应系统增强信号传导；以及调节转录因子的水平及降低翻译水平的至少之一，能够增强动物双歧杆菌的耐酸性。
根据本发明的实施例，上述方法还可进一步包括如下附加技术特征至少之一：
根据本发明的实施例，所述试剂用于过表达BAA6_RS00465、BAA6_RS00480、BAA6_RS00535、BAA6_RS00905、BAA6_RS01120、BAA6_RS02185、BAA6_RS02360、BAA6_RS02390、BAA6_RS02980、BAA6_RS03075、BAA6_RS03880、BAA6_RS03885、BAA6_RS05205、BAA6_RS05630、BAA6_RS05670、BAA6_RS06110、BAA6_RS06240、BAA6_RS06420、BAA6_RS06435、BAA6_RS06440、BAA6_RS06445、BAA6_RS06465、BAA6_RS07200或BAA6_RS07205的至少之一。如前所述，发明人将上述目的基因在动物双歧杆菌中进行过表达后发现，重组菌株在致死酸环境下的存活率提高，耐酸性能增强。进而，通过过表达上述24个目标基因的至少之一，能够增强动物双歧杆菌的耐酸性。
根据本发明的实施例，所述试剂用于过表达BAA6_RS00480、BAA6_RS02185、BAA6_RS02390、BAA6_RS02980、BAA6_RS03885、BAA6_RS05205、BAA6_RS06240、BAA6_RS06435、BAA6_RS06440、BAA6_RS06445的至少之一。如前所述，发明人发现，通过过表达上述10个目标基因的至少之一，能够进一步增强动物双歧杆菌的耐酸性。
根据本发明的实施例，所述试剂用于过表达BAA6_RS00480、BAA6_RS06240、BAA6_RS03885或BAA6_RS05205的至少之一。如前所述，发明人将上述目的基因在动物双歧杆菌中进行过表达后发现，重组菌株在致死酸环境下的存活率显著提高，高达22.43倍，耐酸性能显著增强。进而，通过过表达上述4个目标基因的至少之一，能够显著增强动物双歧杆菌的耐酸性。
根据本发明的实施例，所述试剂具有SEQ ID NO：1～10至少之一所示的核苷酸序列。进而将上述试剂导入受体细胞后，如动物双歧杆菌细胞后，在适宜基因过表达的条件下，可实现目标基因在受体细胞中的有效过表达。
在本发明的第三方面，本发明提出了一种微生物。根据本发明的实施例，所述微生物过表达BAA6_RS00465、BAA6_RS00480、BAA6_RS00535、BAA6_RS00905、BAA6_RS01120、BAA6_RS02185、BAA6_RS02360、BAA6_RS02390、BAA6_RS02980、BAA6_RS03075、BAA6_RS03880、BAA6_RS03885、BAA6_RS05205、BAA6_RS05630、BAA6_RS05670、BAA6_RS06110、BAA6_RS06240、BAA6_RS06420、BAA6_RS06435、BAA6_RS06440、BAA6_RS06445、BAA6_RS06465、BAA6_RS07200或BAA6_RS07205的至少之一。如前所述，发明人将上述目的基因在微生物，如动物双歧杆菌中进行过表达后发现，重组菌株在致死酸环境下的存活率提高，耐酸性能增强。进而，能够过表达上述24个目标基因的至少之一的微生物的耐酸性较强。
根据本发明的实施例，上述微生物还可进一步包括如下附加技术特征至少之一：
根据本发明的实施例，所述微生物过表达BAA6_RS00480、BAA6_RS02185、BAA6_RS02390、BAA6_RS02980、BAA6_RS03885、BAA6_RS05205、BAA6_RS06240、BAA6_RS06435、BAA6_RS06440、BAA6_RS06445的至少之一。如前所述，发明人发现，能够过表达上述10个目标基因至少之一的微生物的耐酸性更强。
根据本发明的实施例，所述微生物过表达BAA6_RS00480、BAA6_RS06240、BAA6_RS03885或BAA6_RS05205的至少之一。如前所述，发明人将上述目的基因在微生物，如动物双歧杆菌中进行过表达后发现，重组菌株在致死酸环境下的存活率显著提高，高达22.43倍，耐酸性能显著增强。进而，能够过表达上述4个目标基因至少之一的微生物的耐酸性显著增强。
根据本发明的实施例，所述微生物为动物双歧杆菌。发明人发现，所述微生物为动物双歧杆菌时，耐酸性更强。
根据本发明的实施例，所述微生物为动物双歧杆菌A6。
在本发明的第四方面，本发明提出了一种食品。根据本发明的实施例，所述食品包括上述任一项所述的微生物。发明人发现，上述微生物的耐酸性较强，可以抵抗酸胁迫环境，进而，将上述微生物应用于食品方面，可以更好地发挥其益生功能。
在本发明的第五方面，本发明提出了一种药品。根据本发明的实施例，所述药品包括上述任一项所述的微生物。发明人发现，上述微生物的耐酸性较强，可以抵抗酸胁迫环境，进而，将上述微生物应用于药品方面，可以更好地发挥其益生功能。
在本发明的第六方面，本发明提出了一种筛选药物的方法。根据本发明的实施例，所述药物用于增强动物双歧杆菌的耐酸性，所述方法包括：将动物双歧杆菌与候选药物进行接触；比较接触前后动物双歧杆菌的下列的至少之一，以便确定候选药物是否为目标药物：脂肪酸的合成量和pspA的表达量，细胞膜的通透性，动物双歧杆菌细胞内的氢离子的含量，多糖的利用、双歧途径以及核糖的代谢水平，动物双歧杆菌细胞的胞内能量，蛋白质损伤水平，DNA损伤水平，信号传导水平，翻译水平，BAA6_RS00465、BAA6_RS00480、BAA6_RS00535、BAA6_RS00905、BAA6_RS01120、BAA6_RS02185、BAA6_RS02360、BAA6_RS02390、BAA6_RS02980、BAA6_RS03075、BAA6_RS03880、BAA6_RS03885、BAA6_RS05205、BAA6_RS05630、BAA6_RS05670、BAA6_RS06110、BAA6_RS06240、BAA6_RS06420、BAA6_RS06435、BAA6_RS06440、BAA6_RS06445、BAA6_RS06465、BAA6_RS07200或BAA6_RS07205的至少之一的表达量。如前所述，动物双歧杆菌通过细胞膜通透性的降低减少氢离子进入，草酸盐代谢增强增加氢离子消耗，碳水化合物代谢增强增加能量产生，分子伴侣保护蛋白质，DNA修复系统修复受损伤的DNA，信号转导、转录翻译等方面来抵御和适应酸环境。另外，发明人将上述24个目的基因在动物双歧杆菌中进行过表达后发现，重组菌株在致死酸环境下的存活率提高，耐酸性能增强。进而，通过筛选上述指标，能够有效获得增强动物双歧杆菌的耐酸性的目标药物。
根据本发明的实施例，上述方法还可进一步包括如下附加技术特征至少之一：
根据本发明的实施例，接触后相比与接触前，所述脂肪酸的合成量和pspA的表达量增加；所述细胞膜的通透性降低；所述动物双歧杆菌细胞内的氢离子的含量降低；所述多糖的利用、双歧途径以及核糖的代谢水平增强；所述动物双歧杆菌细胞的胞内能量增加；利用DnaK系统、GroES/EL系统以及ClpB降低所述蛋白质损伤水平；利用直接修复及碱基删除修复系统降低所述DNA损伤水平；通过蛋白的磷酸化、去磷酸化及群体感应系统增强所述信号传导水平；所述翻译水平降低；和/或所述BAA6_RS00465、BAA6_RS00480、BAA6_RS00535、BAA6_RS00905、BAA6_RS01120、BAA6_RS02185、BAA6_RS02360、BAA6_RS02390、BAA6_RS02980、BAA6_RS03075、BAA6_RS03880、BAA6_RS03885、BAA6_RS05205、BAA6_RS05630、BAA6_RS05670、BAA6_RS06110、BAA6_RS06240、BAA6_RS06420、BAA6_RS06435、BAA6_RS06440、BAA6_RS06445、BAA6_RS06465、BAA6_RS07200或BAA6_RS07205的至少之一的表达量升高；是所述候选药物为目标药物的指示。发明人发现，通过筛选上述指标，能够更加有效地获得增强动物双歧杆菌的耐酸性的目标药物。
附图说明
图1是根据本发明实施例的动物双歧杆菌A6生长曲线示意图；
图2是根据本发明实施例的动物双歧杆菌A6在不同pH环境下处理2h后的活菌数示意图，其中，*代表处理组与对照组之间有显著差异(p＜0.05)，CK代表对照组，即酸处理前的活菌数；
图3是根据本发明实施例的动物双歧杆菌A6在pH 2.5的环境中处理不同时间的存活率示意图，其中，*代表处理组与对照组之间有显著差异(p＜0.05)；
图4是根据本发明实施例的动物双歧杆菌A6基因组圈图；
图5是根据本发明实施例的动物双歧杆菌A6与其他双歧杆菌基因组的同源基因分析示意图，其中：
横坐标为动物双歧杆菌A6基因组中的基因，纵坐标为不同菌株，深色色块代表在该菌株中存在与动物双歧杆菌A6中基因同源的基因，浅色色块代表在该菌株中不存在与动物双歧杆菌A6中基因同源的基因；
图6是根据本发明实施例的动物双歧杆菌特异基因COG分类示意图；
图7是根据本发明实施例的动物双歧杆菌A6对照组酸处理组总RNA电泳图，其中，CK表示RNA标品，1～3指对照组，4～6指酸处理组；
图8是根据本发明实施例的耐酸应答中差异表达基因的COG功能分布示意图，其中，柱顶的数字标签代表表达量下调/上调基因数在动物双歧杆菌该COG中所占比例；
图9是根据本发明实施例的定量PCR与转录组检测基因差异表达量的相关程度示意图；
图10是根据本发明实施例的动物双歧杆菌A6酸处理后细胞膜通透性的变化示意图，其中，*代表酸处理组与对照组之间有显著差异(p＜0.05)；
图11是根据本发明实施例的动物双歧杆菌A6酸处理后胞内ATP含量的变化示意图，其中，*代表处理组与对照组之间有显著差异(p＜0.05)；
图12是根据本发明实施例的动物双歧杆菌A6酸处理后碳水化合物代谢途径中基因表达量的变化示意图，其中，空心箭头表示基因表达量显著上调，端点带菱形箭头表示基因表达量显著下调，实心箭头表示基因表达量没有显著变化；
图13是根据本发明实施例的动物双歧杆菌A6酸适应性应答机制预测示意图，其中：
实心细箭头代表基因表达水平上调，端点带菱形细箭头代表基因表达水平下调，空心细箭头代表基因表达水平没有显著变化，实心粗箭头仅代表变化过程，不代表基因表达水平的变化，
glucan/glucoside表示葡聚糖/葡聚糖甘，glucose表示葡萄糖，galactan表示半乳聚糖，galactose表示半乳糖，mannan表示甘露聚糖，mannose表示甘露糖，sucrose表示蔗糖，maltose表示麦芽糖，glucose-1-P表示葡萄糖-1-磷酸，glucose-6-P表示葡萄糖-6-磷酸，fructose-6-P表示果糖-6-磷酸，Erythrose-4-P表示赤藓糖-4-磷酸，glyceraldehyde-3-P表示3-磷酸-甘油醛，sedo-heptulose-7-P表示7-磷酸景天庚酮糖，ribose-5-P表示5-磷酸核糖，xylulose-5-P表示5-磷酸木酮糖，ribulose-5-P表示5-磷酸核酮糖，glycericacid-1，3-P表示1，3-二磷酸甘油酸，phosphoenol-pyruvate表示烯醇式丙酮酸，pyruvate表示丙酮酸，lactate表示乳酸，acetyl-CoA表示乙酰辅酶A，Malonyl-CoA表示丙二酰辅酶A，holo-ACP表示活化型酰基载体蛋白，apo-ACP表示失活型酰基载体蛋白，pspA表示噬菌体刺激蛋白A，fatty acid synthesis表示脂肪酸合成，protein表示蛋白质，damagedprotein表示受损蛋白质，DNA表示脱氧核糖核酸，damaged DNA表示受损的脱氧核糖核酸，HR表示双组份系统组氨酸激酶，RR表示双组分系统受体调节子，IHF表示整合宿主因子，QS表示群体感应，transcription regulators表示转录调节，translation表示翻译，energyproduction表示能量产生，H+blocking表示阻挡氢离子，protein protection表示蛋白保护，signal transcriptin translation表示信号转导与转录翻译，DNA repair表示DNA修复；
图14是根据本发明实施例的候选基因在pH 2.5环境中处理150min后的表达量示意图；
图15是根据本发明实施例的连接体系转化大肠杆菌DH5α的菌落PCR验证示意图；
图16是根据本发明实施例的各重组载体测序结果与相应基因和pDP152质粒序列的比对示意图，其中，A表示重组载体测序结果与基因序列的比对，B表示重组载体测序结果与pDP152质粒序列的比对，2390-6445表示对应编号的基因，color key for alignmentscores表示比对分值颜色标尺，query表示比对；
图17是根据本发明实施例的动物双歧杆菌A6重组菌株菌液PCR电泳图，其中，M表示D2000DNA Marker，K表示空载菌株菌液PCR产物，2390-6445表示各基因重组菌株菌液PCR产物；
图18是根据本发明实施例的过表达基因在重组菌株中表达量的检测结果示意图，其中，2390-6445表示各编号基因对应重组菌株；
图19是根据本发明实施例的各重组菌株在A6酸致死处理条件下存活率的测定结果示意图，其中，A6-K表示动物双歧A6空载菌株，A6-2390～A6-6445表示各编号基因对应过表达菌株，*代表重组菌株与空载对照菌株之间有显著差异(p＜0.05)；以及
图20是根据本发明实施例的pDP152质粒的质粒图谱。
具体实施方式
下面详细描述本发明的实施例，所述实施例的示例在附图中示出。下面通过参考附图描述的实施例是示例性的，旨在用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。
需要说明的是，下列实施例中动物双歧杆菌A6的所有基因名称(如BAA6_RS005565、BAA6_RS00480等)均是Genbank中的ID号。其中，动物双歧杆菌A6全基因组序列GeneBank登录号为NZ_CP010433.1。
另外，本发明中使用的缩略词的含义列举如下：
ATR Acid Tolerance Response 酸耐受反应
IBS Irritable Bowel Syndrome 肠易激综合症
RMS Restriction-Modification System 限制修饰系统
CRISPR Clustered regularly interspaced short palindromic repeats 成簇的规则分布的短回文重复序列
EDTA Ethylene Diamine Tetraacetic Acid 乙二胺四乙酸
ATP Adenosine Triphosphate 三磷酸腺苷
NH3 Ammonia 氨
CO2 Carbon Dioxide 二氧化碳
BSA Bovine serum albumin 牛血清蛋白
Tris Trihytdroxymethyl amino methane 三(羟甲基)氨基甲烷
Sp Encyclopedia 壮观霉素
dNTP Deoxyribonucleotide Triphosphate 脱氧核苷酸三磷酸
bp Base Pair 碱基对
v/v Volume per volume 体积比
CFU Colony-Forming Unit 菌落形成单位
OD Optical Density 光密度
PCR Polymerase Chain Reaction 聚合酶链式反应
RT-qPCR Real Time-quantitative PCR 实时定量PCR
HPLC High Performance Liquid Chromatography 高效液相色谱
RNA-Seq RNA sequencing RNA测序
COG Category of Othologous Group 直系同源组
KEGG Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes 东京基因与基因组百科全书
NCBI National Center for Biotechnology Information 美国国家生物技术信息中心
CDS Coding Sequence 蛋白质编码区
实施例1动物双歧杆菌A6耐酸能力评价
双歧杆菌是人体肠道菌群的重要成员，并且具有多种益生作用，如调节肠道菌群平衡，增强机体免疫力，缓解腹泻，降低胆固醇等。双歧杆菌菌株已经被广泛的应用到了食品保健品中。由于双歧杆菌产品一般都存在有机酸的积累，而且双歧杆菌进入消化道后还会遭遇胃酸的低pH环境，使得双歧杆菌从生产、销售到摄入的过程均处于酸胁迫中。双歧杆菌对酸胁迫的耐受能力直接影响着双歧杆菌的存活。
动物双歧杆菌是最耐酸的双歧杆菌。动物双歧杆菌A6是良好的研究动物双歧杆菌耐酸应答机制的模型菌株。实施例1以分离自广西巴马长寿老人肠道的动物双歧杆菌A6为例，作为研究对象，通过不同酸处理条件下活菌数的测定来评价其耐酸能力，并与其他16株双歧杆菌(涵盖了食品工业中允许应用的所有双歧杆菌种属菌株：长双歧杆菌长亚种、长双歧杆菌婴儿亚种、两歧双歧杆菌、短双歧杆菌、青春双歧杆菌)的耐酸性进行对比明确动物双歧杆菌强耐酸性的种属特性。测定菌株暴露于酸环境中不同时间下的存活率，明确其不同生理状态对应的处理时间，为后续耐酸机制应答的基因组学及转录组学研究提供基础数据。
1.1材料与方法
1.1.1菌株
所用的菌株如下表1所示。
表1：实施例1所用菌株
Figure BDA0001835140840000091
Figure BDA0001835140840000101
1.1.2主要试剂
(1)培养基：
厌氧MRS液体培养基配制(1L)：10g蛋白胨，10g牛肉膏，5g酵母浸粉，2g K2HPO4，2g柠檬酸二铵，5g乙酸钠，20g葡萄糖，0.58g MgSO4·7H2O，0.20g MnSO4·H2O，1mL吐温80，加入1L蒸馏水混合煮溶冷却至室温后，加入0.5g半胱氨酸盐酸盐，用1mol/L盐酸及1mol/LNaOH分别调pH至6.5、5.0、4.5、4.0、3.5、3.0、2.5，分装至厌氧管，10mL/管，充氮排氧后121℃灭菌15min。
厌氧MRS固体培养基配制(1L)：10g蛋白胨，10g牛肉膏，5g酵母浸粉，2g K2HPO4，2g柠檬酸二铵，5g乙酸钠，20g葡萄糖，0.58g MgSO4·7H2O，0.20g MnSO4·H2O，1mL吐温80，加入1L蒸馏水混合煮溶冷却至室温后，加入0.5g半胱氨酸盐酸盐，用1mol/L盐酸及1mol/LNaOH分别调pH至6.5，加入15g琼脂粉，分装至三角瓶中，121℃灭菌15min。
(2)稀释液(0.85％NaCl溶液)：8.5g NaCl溶解于1L蒸馏水中，分装至试管，9mL/管，121℃灭菌15min。
1.1.3主要设备
实施例1使用的主要设备如下表2所示。
表2：主要仪器设备
仪器设备 型号 产地
台式高速离心机 TL-16G 上海安亭科学仪器厂
漩涡混合器 MS2 德国IKA公司
连续可调微量移液器 1mL，200μL 德国Eppendorf公司
紫外可见分光光度计 UV-2102PC 上海UNICO公司
自动高压蒸汽灭菌器 ZDX35BI 上海申安医疗器械厂
洁净工作台 DK-98-II2KW 天津泰斯特仪器公司
酸度计 DELTA 320 瑞士梅特勒-托利多公司
电热恒温培养箱 DNP-9082 上海精宏实验设备有限公司
厌氧盒 7L 日本三菱
1.2实验方法
1.2.1菌株培养
发明人实验室用脱脂乳甘油冻存管保存菌株，购买于CGMCC及CICC的菌种为冻干菌粉。脱脂乳甘油冻存菌种的活化可将冻存的菌种取出后置于室温融化，于无菌环境中以1％的接种量接种于厌氧MRS液体培养基中进行培养。冻干菌粉状态的菌种需要在无菌环境中对安瓿管外侧进行消毒后，敲碎安瓿管上端，加入少量无菌的MRS培养基重悬菌粉，而后将菌液接种于厌氧MRS液体培养基中。37℃厌氧培养12h，连续活化两代，第三代培养液用于后续试验。
1.2.2动物双歧杆菌A6生长曲线测定
活化后的动物双歧杆菌A6，按1％接种量接种于厌氧MRS液体培养基中，37℃厌氧培养，于0，2，4，6，8，10，11，12，13，14，16，20，24h时取菌液样品3mL，用分光光度计测定菌液OD600，并用pH计测定培养液的pH值。
1.2.3动物双歧杆菌A6不同pH处理下的活菌数测定
取10mL对数期的动物双歧杆菌A6培养液，吸取1mL菌液进行10倍梯度稀释，平板计数。剩余9mL培养液8000g离心10min，弃尽上清，将菌体重悬于等体积的(9mL)的pH 5.0、pH4.5、pH 4.0、pH 3.5、pH 3.0、pH 2.5的培养基中，37℃厌氧培养2h。培养结束后，取1mL各pH条件下的处理液进行10倍梯度稀释并进行平板计数。平板倒置于厌氧盒中，加入厌氧包，37℃厌氧培养48h，待菌落长出后进行计数。每个pH处理设3个生物学重复。
1.2.4动物双歧杆菌A6与其他双歧杆菌耐酸能力比较
取10mL对数中期的各双歧杆菌培养液，吸取1mL菌液进行梯度稀释，并进行平板计数。剩余菌液8000g离心10min，弃尽上清，将菌体重悬于等体积的(9mL)的pH 2.5的培养基中，37℃厌氧培养2h。培养结束后，取各菌株酸处理后菌液1mL进行10倍梯度稀释并进行平板计数。平板倒置于厌氧盒中，加入厌氧包，37℃厌氧培养48h，待菌落长出后进行计数。每个pH处理设3个生物学重复。
1.2.5动物双歧杆菌A6不同生理状态酸处理条件确定
取对数中期的动物双歧杆菌A6菌液10mL，取1mL菌液进行梯度稀释，用MRS固体培养基进行平板计数。剩余菌液8000g离心10min，弃尽上清，将菌体重悬于等体积的(9mL)的pH 2.5的厌氧MRS培养基中，放置于37℃，在10，20，30，60，90，120，150，180，240min时取1mL菌液进行梯度稀释，用MRS固体培养基进行平板计数。存活率＝酸处理后活菌数/酸处理前活菌数。每个时间点设3个生物学重复。
1.3结果与分析
1.3.1动物双歧杆菌A6生长曲线的测定
为确定动物双歧杆菌A6的生长状况，明确后续研究的采样时间，发明人测定了动物双歧杆菌A6的生长曲线。将动物双歧杆菌A6活化后以1％接种量接种于新的厌氧MRS培养基中，于不同时间点取样测定其OD600值及pH值，绘制其生长曲线。动物双歧杆菌A6的生长曲线如图1所示，接种初始培养液的OD600值为0.058，pH值为5.98。0～2h，OD600增长缓慢，说明菌株处于迟滞期。2h后OD600出现较快增长，由迟滞期进入对数期。6h左右到达对数中期，此时培养液的OD600为0.698，pH为5.40。在12h左右OD600增长放缓，进入稳定期，此时培养液的OD600为1.792，pH为4.59；在12-24h，培养液的OD600趋于平缓，最终达到1.917，pH在24h时降至4.25。
1.3.2动物双歧杆菌A6不同pH处理下的活菌数测定
为了解动物双歧杆菌A6的耐酸能力，实施例1测定了动物双歧杆菌A6在不同pH值环境中处理2h后的活菌数(参见图2)。取动物双歧杆菌A6对数期的培养液，平板计数测定其中的活菌数作为未做酸处理的对照。剩余菌液进行离心，重悬至等体积的pH 5.0、pH 4.5、pH 4.0、pH 3.5、pH 3.0、pH 2.5、pH 2.0的厌氧MRS培养基中，37℃厌氧培养2h后梯度稀释测定其活菌数。实验结果(参见图2)表明，动物双歧杆菌A6在对数中期活菌数的对数值为9.42±0.06。在pH 5.0、pH 4.5的环境中处理2h后，活菌数略有升高，活菌数对数值分别为9.54±0.09，9.45±0.12。在pH 4.0、pH 3.5、pH 3.0、pH 2.5的环境中处理2h后，活菌数略有下降，分为别9.37±0.08、9.32±0.01、9.25±0.04、9.21±0.09，但各组与对照组之间没有显著差异。当pH下降到2.0时，A6活菌数数量级为7.81±0.05，与对照组相比，下降了1.61个数量级，出现了显著的差异。
1.3.3动物双歧杆菌A6与其他双歧杆菌菌株耐酸能力的比较
为了明确动物双歧杆菌A6的耐酸能力在双歧杆菌中的水平，测定了16株双歧杆菌的耐酸能力。将所有菌株重悬于pH 2.5的MRS培养基中处理2小时，测定酸处理前后的活菌数。实验结果如下表3所示，酸处理之前，各菌株的活菌数对数值为8.25±0.05～8.92±0.12。在pH 2.5的环境中处理2h后，9株动物双歧杆菌的活菌数与酸处理前相比没有显著下降。而长双歧杆菌BBMN68、NCC2705、BLS、7，婴儿双歧杆菌6069，短双歧杆菌6079，两歧双歧杆菌L，青春双歧杆菌42在pH 2.5的培养基中处理2h后，活菌数为0，与酸处理前相比存在极显著的差异
表3：不同种双歧杆菌在pH 2.5的环境下处理2h后的活菌数
Figure BDA0001835140840000131
*表示酸处理组与对照组相比具有显著差异(p<0.01)#表示三次重复试验活菌数均为0。
1.3.4动物双歧杆菌A6不同生理状态酸处理条件的确定
为明确动物双歧杆菌A6在不同酸处理条件下对应的生理状态，为后续转录组学酸处理条件提供参考，测定了酸处理时间对动物双歧杆菌A6存活率的影响(参见图3)。将对数中期的动物双歧杆菌A6菌体重悬于pH 2.5的厌氧MRS培养基中，在10，20，30，60，90，120，150，180，240min取样测定菌体的存活率。结果如图3所示，动物双歧杆菌A6在pH 2.5的培养基中处理10，20，30min后的存活率分别为102.60±14.80％，100.78±20.44％，97.95±12.05％，存活率没有出现显著的下降。处理60min后，动物双歧杆菌A6的存活率下降为88.67±10.04％，出现了显著的下降。随着酸处理时间的延长，存活率不断下降，在90min与120min时，存活率分别为79.94±9.13％和70.80±7.30％。当处理时间达到150min时，A6的存活率降为48.51±4.19％，为半致死状态。pH 2.5处理240min后存活率为0.62±0.32％，降至1％以下。
1.4结果分析
双歧杆菌是人体肠道的原籍菌，具有多种益生功能。双歧杆菌作为益生菌广泛的应用到了食品中。双歧杆菌应用的主要载体是酸奶等发酵乳制品。生产储藏过程中有机酸的积累使双歧杆菌长期暴露于低酸环境中。而且，在双歧杆菌摄入的过程中还要经历胃部的极端酸环境。因此，酸胁迫是贯穿双歧杆菌应用过程的重要胁迫因素。
动物双歧杆菌A6分离自广西长寿巴马老人粪便，具有多种益生功能，是潜在的益生菌。通过测定不同pH处理条件对动物双歧杆菌A6活菌数的影响发现动物双歧杆菌A6在pH5.0、pH 4.5的环境中处理2h后，活菌数与酸处理前略有上升，这说明动物双歧杆菌A6在pH5.0和pH 4.5的环境中仍然能够保持一种生长状态。这与A6生长曲线的情况是相一致的。在A6的生长曲线中，对数中期的培养液pH值在5.4左右，稳定初期pH值在4.5左右，稳定末期的pH值为4.25。酸处理中pH 5.0和pH 4.5还在A6可生长的pH范围内。当在pH低于4.0的环境中暴露2h时，动物双歧杆菌A6的活菌数停止增长或者是出现下降。当pH下降至2.5时，A6的活菌数下降了30％左右，但是仍未出现数量级的下降。当pH下降至2.0时，A6的活菌数下降了1.6个数量级，与对照组相比出现了显著的降低。这说明A6具有非常强耐酸性，而且其能够耐受的最低pH为2.5。这与Li等人报道的结果接近。在Li等人的研究中发现动物双歧杆菌BB12和动物双歧杆菌Qq08在pH 3.0的环境中暴露4h后存活率仍可到达87％。Matto等人也发现3株动物双歧杆菌在pH3.0的培养基中处理1个小时以后活菌数没有下降。这说明动物双歧杆菌的耐酸性存在一定的共性。
在与其他双歧杆菌耐酸能力的对比实验中发现，在pH 2.5的环境中处理2h后，所有动物双歧杆菌都与动物双歧杆菌A6一致，酸处理后活菌数对数值与酸处理前相比没有显著的降低。而长双歧杆菌、婴儿双歧杆菌、短双歧杆菌、两歧双歧杆菌、青春双歧杆菌在经受相同的酸处理后活菌数为0。这一现象在Mitsuharu等人的报道中也有所证明。Mitsuharu等人对收集的17株双歧杆菌(包括6株动物双歧杆菌、4株两歧双歧杆菌、1株短双歧杆菌、1株婴儿双歧杆菌、2链状双歧杆菌、2株长双歧杆菌、1株青春双歧杆菌、1株假长双歧杆菌)进行了pH 2.0、pH 3.0、pH 4.0、pH 5.0环境下0.5-3.0小时的酸处理，活菌数检测结果表明所有被试的6株动物双歧杆菌在pH 3.0-5.0的环境中处理了3小时后活菌数没有下降。当pH下降到2.0时，动物双歧杆菌才出现不同程度的活菌数下降。而受试的其他双歧杆菌在pH 3.0的环境中处理0.5h后菌体即全部死亡或者活菌数下降了5个数量级。Takahashi等人也报道了两歧双歧杆菌、婴儿双歧杆菌、短双歧杆菌、青春双歧杆菌在pH 3.0的条件下处理2小时以后，存活率都不超过1％。Valerie等人测定了9株青春双歧杆菌、11株两歧双歧杆菌、20株长双歧杆菌在pH 2.7的模拟胃液中处理60min后，活菌数下降了3个数量级以上。这说明动物双歧杆菌的强耐酸性具有一定的种属特异性。
细菌处于酸胁迫环境中时整个生理活动都在随着暴露时间的不断延长而发生变化。为明确不同生理状态对应的酸处理条件，测定了酸处理时间对于A6存活率的影响。从结果可以看出，A6在pH 2.5的培养基中处理30min后菌体存活率没有出现显著的下降，该处理时间为A6的不致死酸处理条件。在此条件下A6菌体得到充分的酸刺激而菌体活力又没有得到显著的影响，该条件可以作为后续利用转录组手段探究A6耐酸应答机制的酸处理条件。pH 2.5处理150min后，动物双歧杆菌A6的存活率为48.51％。此时的A6处于一种半致死状态，是整个酸胁迫过程的一个中间状态。当暴露时间进一步延长至240min时，其存活率下降到1％以下，可认为该条件是动物双歧杆菌A6的致死酸处理条件，可用于后续靶基因功能的验证。
1.4结论
(1)动物双歧杆菌A6在pH 5.0-2.5的环境中处理2小时后，活菌数数量级没有出现显著的下降，在pH2.0的条件下处理2小时后活菌数显著下降，说明动物双歧杆菌具有强耐酸性，其能够耐受的最低pH为2.5。
(2)不同种属的双歧杆菌在pH 2.5的环境中处理2h后，所有受试动物双歧杆菌活菌数数量级没有下降，而长双歧杆菌、婴儿双歧杆菌、两歧双歧杆菌、短双歧杆菌、青春双歧杆菌均全部死亡即下降了8个数量级，说明动物双歧杆菌的强耐酸性具有种属特异性。
(3)动物双歧杆菌A6在pH 2.5的环境中的不致死酸处理时间为30min，半致死酸处理时间为150min，致死酸处理时间为240min。
实施例2动物双歧杆菌A6全基因组测序及比较基因组分析
动物双歧杆菌是双歧杆菌中耐酸性最强的菌株。实施例1的试验证明动物双歧杆菌具有非常强的耐酸能力，在pH 2.5的环境中处理2h仍能能够保持活菌数数量级不降低。而且，通过与其他双歧杆菌耐酸性的对比发现动物双歧杆菌A6的强耐酸性并不具有菌株特异性，而是动物双歧杆菌这一种属中普遍的现象。也正是由于这种种属范围内的强耐受性，动物双歧杆菌成为了目前应用最为广泛的双歧杆菌。
实施例2利用PacBio SMRT(single molecular real-time sequencing)测序技术测定了动物双歧杆菌A6的全基因组序列，为动物双歧杆菌A6耐酸应答的遗传背景及其转录组水平的分析提供基础数据。本实施例同时测定了另外一株强耐酸性菌株唾液乳杆菌Ren的全基因组。通过将动物双歧杆菌A6与唾液乳杆菌Ren的基因组进行对比以分析其基因组中的共性。动物双歧杆菌的耐酸性强于其他种属的双歧杆菌，这预示着动物双歧杆菌中可能存在某种在动物双歧杆菌种内保守而在其他双歧杆菌中不存在的耐酸机制。通过将动物双歧杆菌的全基因组与其他弱耐酸性的双歧杆菌基因组进行对比，以期发现动物双歧杆菌中可能对耐酸发挥关键作用的特异基因。
2.1材料与试剂
2.1.1菌株与基因组数据
菌株：Bifidobacterium animalis subsp.lactis A6(分离自广西巴马长寿老人肠道，中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心CGMCC No.9273)；Lactobacillussalivarius Ren(分离自广西巴马长寿老人肠道，中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心CGMCC No.3606)。
所用到的基因组数据如下表4所示。
表4：比较基因组所用基因组数据
Figure BDA0001835140840000161
Figure BDA0001835140840000171
Figure BDA0001835140840000181
Figure BDA0001835140840000191
2.1.2主要试剂
(1)培养基的配制：
厌氧MRS液体培养基配(1L)：参见实施例1中1.1.2的内容。
好氧MRS液体培养基(1L)：10g蛋白胨，10g牛肉膏，5g酵母浸粉，2g K2HPO4，2g柠檬酸二铵，5g乙酸钠，20g葡萄糖，0.58g MgSO4·7H2O，0.25g MnSO4·4H2O，1mL吐温80，加入1L蒸馏水混合煮溶冷却至室温后，用1mol/L盐酸及1mol/L NaOH调pH至6.5，分装至三角瓶中，100mL/瓶，121℃灭菌15min。
(2)DNA提取试剂：Qiagen DNA提取试剂盒(Qiagen，德国)
(3)核酸电泳试剂：
50×TAE电泳缓冲液：242g Tris碱、57.1mL冰乙酸，0.5mol/L EDTA(pH 8.0)溶解于1L去离子水中，室温保存。
1×TAE电泳缓冲液：取40mL 50×TAE电泳缓冲液，加入1960mL去离子水，混匀。
1％(w/v)琼脂糖凝胶：1.0g琼脂糖溶于100mL 1×TAE电泳缓冲液中，加热充分溶解后倒入胶槽冷却备用。
6×DNA Loading Buffer：取1μL天根生化科技有限公司RT201。
Gel Red核酸染料染液：50mL 0.1mol/L氯化钠溶液中加入15μL Gel Red核酸染料(Biotium，美国)。
(4)PCR试剂：2×PCR Master Mix(天根，中国)，引物(上海生工生物工程有限公司合成)、ddH2O(天根，中国)。
(5)PacBio测序试剂：PacBio RS II测序平台P6-C4测序试剂盒(PacBio，美国)。
(6)主要软件：HS HGAP Assembly version 2，Rapid Annotations usingSubsystems Technology(RAST)server，InParonoid。
(7)数据库：Cluster of Orthologous Groups database(COG)、KyotoEncyclopedia of Genes and Genomes(KEGG)、National Center for BiotechnologyInformation(NCBI)
2.1.3主要设备
主要设备如下表5所示。
表5：主要仪器设备
仪器设备 型号 产地
台式高速离心机 TL-16G 上海安亭科学仪器厂
低温高速离心机 Sigma 3K30 德国Satorious公司
漩涡混合器 MS2 德国IKA公司
连续可调微量移液器 1mL,200μL 德国Eppendorf公司
紫外可见分光光度计 UV-2102PC 上海UNICO公司
自动高压蒸汽灭菌器 ZDX35BI 上海申安医疗器械厂
洁净工作台 DK-98-II2KW 天津泰斯特仪器公司
超纯水仪 UF/UVPL5124 美国Pall公司
酸度计 DELTA 320 瑞士梅特勒-托利多公司
电热恒温培养箱 DNP-9082 上海精宏实验设备有限公司
厌氧盒/厌氧包 7L 日本三菱
PCR仪 T100 美国伯乐
NanoDrop ND-ONEC-W 美国Thermo Scientific
PacBio SMRT测序仪 RS II 美国PacBio
2.2试验方法
2.2.1菌株的培养
将-80℃冻存的B.animalis A6菌种接种于厌氧MRS培养基中，置于37℃恒温培养箱中培养12h，连续活化两代后将第三代培养液作为试验用菌液。
将-80℃冻存的L.salivarius Ren菌种接种于好氧MRS培养基中，置于37℃恒温培养箱中培养12h，连续活化两代后将第三代培养液作为试验用菌液。
2.2.2基因组DNA的提取及鉴定
分别取100mL B.animalis A6和L.salivarius Ren的培养液100mL，6000×g离心10min，收集菌体。参照Qiagen DNA提取试剂盒说明书进行DNA提取。提取的DNA样品进行琼脂糖电泳检测。取部分DNA样本进行16s rRNA PCR。
PCR体系为50μL：2×PCR Master Mix 25μL，上游引物27F 1.25μL，下游引物1492R1.25μL，DNA模板2.5μL，ddH2O 20μL。上游引物27F序列：5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′(SEQID NO：11)，下游引物1492R序列：5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′(SEQ ID NO：12)。
PCR程序：95℃预变性10min，95℃变性30s，52℃退火30s，72℃延伸1min，35个循环后72℃5min，4℃保存。
PCR产物进行测序，将测序结果与NCBI数据库进行blast比对，验证菌株是否是目的菌种。
2.2.3测序文库的制备及下机数据分析
根据large SMRTbell gDNA protocol构建10kb的测序文库，而后使用PacBioSMRT测序平台进行全基因组测序。PacBio SMRT是第三代测序之一。与前两代测序技术相比最大的特点是单分子测序，测序过程无需进行PCR扩增。基本原理为：在一个纳米孔中固定一个DNA聚合酶。DNA聚合酶与模板结合，4种碱基被标记了4种不同的荧光。在DNA聚合酶合成DNA分子时，不同碱基的加入会发出不同的荧光。根据波长与峰值可以判断出该位置的碱基类型。PacBio SMRT实现超长读长的关键在于DNA聚合酶的活性，DNA聚合酶的活性保持越好其读长越长。另外，PacBio SMRT还可以通过检测相邻两个碱基之间的测序时间，来检测一些碱基修饰的情况，从而获得基因组的修饰信息。SMRT技术的测序速度很快，每秒约10个dNTP。对下机数据进行质量评估，去除测序质量低的reads，利用HS HGAP Assemblyversion 2对过滤后的数据进de novo组装。得到菌株的全基因组序列后，利用RAST onlineserver(http://rast.nmpdr.org)进行基因预测、注释和rRNA/tRNA序列识别，从而获得菌株全基因组序列的注释信息。
2.2.4比较基因组分析
从NCBI数据库(ftp.ncbi.nlm.nih.gov)下载所需基因组。利用InParanoid将所有基因组进行两两的blast比对，并计算得到两两基因组之间的同源基因组，而后利用MultiParanoid计算所有基因组的同源组。在所有动物双歧杆菌中保守出现，而在所有其他双歧杆菌中没有出现的基因被认为是动物双歧杆菌的特有基因。
2.3结果与分析
2.3.1动物双歧杆菌A6全基因组基本信息
根据PacBio测序平台文库制备试剂盒说明书将提取的动物双歧杆菌A6全基因组DNA制备成10kb的测序文库。经PacBio SMRT平台测序后得到48,851条reads，共379,789,711nt。将reads进行de novo组装，得到测序深度为200×的动物双歧杆菌A6的全基因组序列。其基因组的基本特征如下表6所示，其基因组圈图如图4所示。从基因组组装的结果可以看出，动物双歧杆菌A6的全基因组为一个环状的DNA分子，不含有质粒，共含有1,958,651bp，GC含量为60.5％。经RAST server对全基因组序列进行注释，动物双歧杆菌A6的基因组中含有1622个CDS(coding-sequence)，52个tRNA基因和16个rRNA基因。
表6：动物双歧杆菌A6基因组基本特征
Figure BDA0001835140840000211
Figure BDA0001835140840000221
2.3.2唾液乳杆菌Ren全基因组基本信息
利用唾液乳杆菌Ren全基因组DNA构建10kb的测序文库后进行PacBio SMRT测序，获得26,454reads，共171,181,295nt。将测序数据进行de novo组装得到唾液乳杆菌Ren的全基因组序列。从表7中可以看到，唾液乳杆菌Ren的基因组含有3个环状DNA分子，分别为1,751,565bp的环状染色质，176,951bp的pR1质粒和49，848bp的pR2质粒。它们的GC含量分别为33.0％，32.1％，39.2％。经过基因注释，染色质上编码了1663个CDS，21个rRNA，77个tRNA。另外两个质粒上分别编码了173个CDS和70个CDS，不编码rRNA及tRNA序列。
表7：唾液乳杆菌Ren基因组基本特征
Attribute Chromosome Plasmid pR1 Plasmid pR2
Genome size(bp) 1,751,565 176,951 49,848
DNA G+C content 33.0％ 32.1％ 39.2％
CDSs 1663 173 70
rRNA genes 21 0 0
tRNA genes 77 0 0
2.3.3动物双歧杆菌A6与唾液乳杆菌Ren的比较基因组分析
实验室前期试验数据表明唾液乳杆菌Ren具有非常强的酸耐受性。通过动物双歧杆菌A6与唾液乳杆菌Ren基因组的对比，以期通过分析动物双歧杆菌A6与唾液乳杆菌基因组中的共有基因发现可能在耐酸响应中发挥重要作用的基因。通过InParonoid软件将动物双歧杆菌A6与唾液乳杆菌Ren的基因组进行自身及互相的比对(即动物双歧杆菌A6分别与自身及唾液乳杆菌比对，唾液乳杆菌Ren分别与自身及唾液乳杆菌进行比对)，将自身基因组中的旁系同源基因及菌株之间的直系同源基因归为一个同源组。一般认为同源基因之间具有相似的生物学功能。如果某个同源组中同时含有来自于唾液乳杆菌Ren中的基因和动物双歧杆菌A6中的基因则认为它们互为同源基因，具有相似的生物学功能。比对结果发现在唾液乳杆菌的1906个蛋白中，只有613个蛋白在动物双歧杆菌A6中具有同源基因。同源基因只占整个基因组的32.16％。但是，通过对革兰氏阳性菌中已报道的耐酸相关基因进行对比，发现在动物双歧杆菌A6中缺少中和氢离子的产氨系统的关键酶(精氨酸脱氨酶、胍基丁胺脱氨酶、脲酶)和消耗氢离子的脱羧系统的关键酶(谷氨酸脱羧酶、天冬氨酸脱羧酶、组氨酸脱羧酶)的编码基因。
2.3.4动物双歧杆菌A6与其他双歧杆菌的比较基因组分析
实施例1的试验已经证明动物双歧杆菌A6具有非常强的耐酸性，并且这种强耐酸性具有种属特异性，动物双歧杆菌的耐酸性非常显著的高于长双歧杆菌、婴儿双歧杆菌、短双歧杆菌、两歧双歧杆菌、青春双歧杆菌。这预示着动物双歧杆菌中可能存在某些基因在动物双歧杆菌中保守存在而在其他双歧杆菌中不存在，并且在耐酸应答中起到关键作用。为寻找这些潜在的关键基因，本实施例将受试的6种双歧杆菌种属中所有已公布全基因组进行了比较基因组分析。这些基因组涵盖了16株动物双歧杆菌，14株长长双歧杆菌，10株短双歧杆菌，5株两歧双歧杆菌，3株婴儿双歧杆菌，3株青春双歧杆菌。通过InParanoid软件将这些基因组中编码的蛋白进行同源性分析，形成同源组(OG，ortholog group)。将比对结果以每个同源组中动物双歧杆菌A6的基因为横坐标，各菌株为纵坐标作热图。深色色块表示该菌株中含有与动物双歧杆菌A6基因相对应的同源基因，浅色色块表示在该菌株中不存在与该动物双歧杆菌A6基因对应的同源基因。同源基因的分析结果如图5所示，所有双歧杆菌的基因被分为1465个同源组。根据同源基因的分布情况对所有的双歧杆菌进行聚类，聚类树如图5下方所示，可以看到所有的双歧杆菌株被分成了两大簇，第一簇中包括所有的动物双歧杆菌，第二簇中包括所有的两歧双歧杆菌、青春双歧杆菌、短双歧杆菌、长双歧杆菌、婴儿双歧杆菌。在第二簇内部，各种属的菌株又能聚类成相对较小的簇。
在所有的1465个同源组中，共有98个同源组在所有动物双歧杆菌中保守存在，而在所有其他种属的双歧杆菌基因组中均没有出现。这些基因被认为是动物双歧杆菌这一种属的特异基因。通过与COG数据库进行对比，98个特异基因中有45个不能匹配到COG中的生物分类中。53个可以匹配到COG生物功能分类中的特异基因共涉及17个生物学功能(参见图6)。除一般预测功能基因和未知功能基因这两类以外，特异基因数量最多的生物功能为细胞壁膜的生物合成(5个)、氨基酸转运及代谢(4个)、辅酶转运及代谢(4个)、无机酸的转运及代谢(4个)。但是各生物功能中特异基因的数量差距很小。
2.4结果与分析
动物双歧杆菌A6具有非常强的耐酸能力。而且通过与其他种属双歧杆菌的耐酸能力进行对比后发现这种强耐酸性在动物双歧杆菌种内具有普遍性。为探究动物双歧杆菌耐酸性能的遗传基础，本实施例利用PacBio SMRT测序技术测定了动物双歧杆菌A6和另一强耐酸性菌株唾液乳杆菌Ren的全基因组序列。并将动物双歧杆菌A6基因组序列与强耐酸性菌株唾液乳杆菌Ren以及弱耐酸性菌株进行比对，以期发现在动物双歧杆菌强耐酸性中起关键作用的基因。
经过PacBio SMRT测序后得到动物双歧杆菌A6和唾液乳杆菌Ren的全基因组。动物双歧杆菌A6的基因组为一个1.96M的环形DNA分子，GC含量为60.5％。已经测序的17株动物双歧杆菌基因组大小在1.80-1.96M，GC含量在60.5％左右。说明动物双歧杆菌A6具有典型的动物双歧杆菌特征。
动物双歧杆菌A6与唾液乳杆菌基因组的对比中可以看到，唾液乳杆菌的1906个蛋白中只有613个在动物双歧杆菌A6中具有同源基因，只占到整个基因组的32.16％，这说明动物双歧杆菌A6与唾液乳杆菌Ren的基因组之间存在着巨大的差异。不同种属间的菌株遗传背景差异较大。通过两不同种属菌株的基因组比对来获取与生理功能相关的基因时易受到遗传背景差异带来的影响。通过对革兰氏阳性菌中已报道的耐酸相关基因进行对比，发现在动物双歧杆菌A6中缺少中和氢离子的产氨系统的关键酶(精氨酸脱氨酶、胍基丁胺脱氨酶、脲酶)和消耗氢离子的脱羧系统的关键酶(谷氨酸脱羧酶、天冬氨酸脱羧酶、组氨酸脱羧酶)的编码基因。但动物双歧杆菌仍能保持非常强的酸耐受能力，这预示着动物双歧杆菌具有特殊的酸耐受机制。
在与其他双歧杆菌基因组的对比中，通过临近种属群体的比较部分避免了遗传背景的干扰，寻找动物双歧杆菌种内的共性及与其他种属双歧杆菌之间的差异性。比对结果显示所有双歧杆菌的基因被分为1465个同源组。聚类结果中可以看到所有菌株被分成了两簇，其中一簇包括所有的动物双歧杆菌，第二簇包括所有的两歧双歧杆菌、青春双歧杆菌、短双歧杆菌、长双歧杆菌。这说明动物双歧杆菌的基因组与另外5种双歧杆菌存在明显的差异。而且，动物双歧杆菌内部基因组变异性很小，两两之间同源基因的比例都在95％以上，这也可能是动物双歧杆菌具有相似性状的原因。在所有的同源组中，在动物双歧杆菌中保守存在，而在其他双歧杆菌中未出现的同源组为98个，被认为是动物双歧杆菌的特异基因。从这98个特异基因的COG分类中可以看到，在细胞壁膜的生物合成、氨基酸的转运代谢、辅酶转运及代谢、无机酸转运与代谢等分类中出现的特异基因个数较多，但各功能之间差别不大，并没有形成显著的富集。通过对98个特异基因的具体作用进行梳理，发现主要集中在以下几方面：
信号转导在动物双歧杆菌的特异基因中有2个与信号转导相关的基因，蛋白酪氨酸磷酸酶(BAA6_RS06435)和GTP-结合蛋白(BAA6_RS02980)。蛋白酪氨酸磷酸酶参与蛋白质酪氨酸位点的去磷酸化过程。磷酸和去磷酸化是细胞中重要的蛋白质激活和去除激活形式的过程，参与细胞中多种生命活动的调节作用。GTP-结合蛋白是一种双向的分子开关，通过控制是与GTP或GDP结合来调节开关状态。
氢离子的减少特异基因中存在2个与氢离子减少相关的酶，腺苷脱氨酶(BAA6_RS04745)和甲酰-CoA转移酶(BAA6_RS07200)。腺苷脱氨酶可以将腺苷转化为肌苷和氨，氨可以中和氢离子，从而减少胞内的氢离子含量。甲酰-CoA转移酶可以将草酸转化为草酰辅酶A，在草酰辅酶A脱羧酶的作用下完成草酸降解。这个过程中产生的CO2可以与氢离子形成HCO3 -，从而消耗氢离子。
能量产生特异基因中含有4个与碳水化合物代谢相关的酶，α-淀粉酶(BAA6_RS04710)，甘露聚糖内切酶(BAA6_RS07205)、甘露糖-6-P异构酶(BAA6_RS02235)、甲酰CoA转移酶(BAA6_RS07200)。α-淀粉酶可以将淀粉分解为葡萄糖或麦芽糖供细胞利用。甘露聚糖内切酶将甘露聚糖分解为甘露糖，进入细胞磷酸化后，经甘露糖-6-P异构酶转化为6-P-果糖进入糖酵解途径。甲酰CoA转移酶可以将草酸盐转化为草酰辅酶A从而进行后续的脱羧反应。这预示着动物双歧能够利用淀粉、甘露糖/甘露聚糖、草酸作为碳源来产生能量。
大分子保护与修复特异基因中有3个与DNA修复相关的基因，尿嘧啶DNA糖基化酶(BAA6_RS03880)、DNA错配修复蛋白MutT(BAA6_RS04315)、DUF159 family protein(BAA6_RS00535)。尿嘧啶DNA糖基化酶可以与DNA解旋酶、DNA外切酶等共同作用清除DNA中的尿嘧啶。这种修复方式是属于碱基删除修复。DNA错配修复蛋白MutT可以将氧化型的dGTP水解为dGMP，从而防止氧化型dNTP掺入到DNA中引起基因突变。另外，DUF159family protein确切功能还不明确，但这一家族蛋白是SOS响应相关的一个自水解肽酶，它可以在SOS响应中召集多种修复酶与损伤DNA结合而开启DNA修复行为。
其他胁迫相关基因：在特异基因中，BAA6_RS00475,BAA6_RS00480编码了GlsB/YeaQ/YmgE家族胁迫响应膜蛋白。该蛋白的功能还不明确，但是在粪肠球菌中敲除该基因会导致菌株胆盐耐受能力的下降。另外，BAA6_RS00115编码了SAM-依赖的甲基转移酶。该酶可以利用SAM提供的甲基对多种底物进行甲基化修饰，从而参与多种生物过程的调控。在结核杆菌中敲除这个基因会造成耐酸能力的下降。BAA6_RS00585编码了醛酮还原酶。醛酮还原酶可以催化羰基化合物的还原。在糖代谢过程中产生的羰基化合物作为氧化剂会攻击蛋、DNA等大分子形成氧化损伤，醛酮还原酶可以将醛酮物质还原成对应的醇，从而阻止由活性醛酮引起的氧化损伤。
2.5结论
(1)动物双歧杆菌A6的全基因组为一个环形的DNA分子，含有1,958,651bp，GC含量为60.5％，共编码了1622个CDS，52个tRNA，16个rRNA；
(2)唾液乳杆菌Ren的全基因组中有3个环形DNA分子，分别为1,751,565bp的染色质，17,951bp的pR1质粒和49,848bp的pR2质粒，共编码了1906个CDS，77个tRNA，21个rRNA；
(3)通过与其他50株双歧杆菌基因组进行比较分析发现6种双歧杆菌中共有1465个同源基因组，其中98个基因在动物双歧杆菌中保守出现并在其他双歧杆菌中没有出现，这些基因组成动物双歧杆菌的特异基因集。
实施例3转录组及生理水平分析A6耐酸应答机制
动物双歧杆菌具有突出的耐酸性。实施例1的试验已经证明动物双歧杆菌在pH2.5的环境中处理2h后活菌数的对数值没有显著的下降，而长双歧杆菌、婴儿双歧杆菌、短双歧杆菌、两歧双歧杆菌、青春双歧杆菌在pH 2.5的环境中处理2h后菌体全部死亡。然而，动物双歧杆菌强耐酸性背后的分子机制尚不明确。目前已经在变异链球菌、干酪乳杆菌、植物乳杆菌等一些乳酸菌中开展了耐酸应答机制的研究，在双歧杆菌中关于长双歧杆菌的酸适应性应答机制也有见报道，而动物双歧杆菌的耐酸应答机制报道较少，发明人对动物双歧杆菌的耐酸途径还知之甚少。明确动物双歧杆菌的耐酸分子机制，有利于开发提高其他双歧杆菌耐酸性的策略，对提高双歧杆菌产业化应用具有重要意义。
在本实施例中，发明人以动物双歧杆菌A6为例，作为研究对象，利用Illumina高通量RNA-seq转录组测序技术，研究该菌株在耐酸应答过程中全基因组转录水平的变化，同时结合生理学手段对RNA-seq结果进行补充和验证，分析预测动物双歧杆菌的耐酸应答机制。3.1材料与试剂
3.1.1菌株
Bifidobacterium animalis subsp.lactis A6(分离自广西巴马长寿老人肠道，中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心CGMCC No.9273)
3.1.2主要试剂
(1)厌氧MRS液体培养基配制：参见实施例1中1.1.2的内容。
(2)提取RNA所需试剂：
NEAS缓冲液：50mM乙酸钠；10mM EDTA；1％SDS(w/v)；
酸性苯酚氯仿混合液：酸性苯酚与氯仿的比例为5:1；
3M乙酸钠；超纯水；异丙醇；无水乙醇；70％乙醇；氯仿；RNA非冻存保护液；DNase I(Takara，日本)；DNase I buffer(Takara，日本)；RNase Inhabitor(Takara，日本)，装有0.3g直径0.1mm玻璃珠的螺口均质管(121℃灭菌30min)。
(3)RNA-Seq所需试剂：
磁力架Ribo-Zero Magnetic kit(G+Bacteria)(EpiCentre，美国)，TruseqTM RNAsample prep Kit(Illumina，美国)，UNG酶(Illumina，美国)，TBS380Picogreen(Invitrogen，美国)，Certified Low Range Ultra Agarose(Bio-Rad，美国)，cBot TruseqPE Cluster Kit v3-cBot-HS(Illumina，美国)，Hiseq4000Truseq SBS Kit v3-HS(200cycles)(Illumina，美国)。
(4)反转录试剂：
ABM反转录试剂盒(ABM，加拿大)。
(5)定量PCR试剂：
SYBR Green I Real-time PCR Master Mix(Takara，中国)，定量PCR八连管，ddH2O(天根，中国)，引物(上海生工生物工程有限公司合成)。
(6)膜通透性测定试剂：
磷酸钠缓冲液：10mM磷酸钠溶液，pH 7.4；
ONPG溶液：1mg/mL ONPG溶液。
(7)ATP含量测定试剂：
磷酸钠缓冲液：10mM磷酸钠溶液，pH 7.4；8％高氯酸溶液：取8mL高氯酸加入92mL纯水中，混匀备用；1M碳酸氢钠溶液；50mM磷酸钾溶液(pH 6.4)：配制完成后需超声30min进行脱气处理；ATP标准溶液：配制12.5、25、50、100、200μM的ATP溶液，用于标准曲线的建立。
3.1.3主要设备
使用的设备如下表8所示：
表8：主要仪器设备
Figure BDA0001835140840000271
Figure BDA0001835140840000281
3.2实验方法
3.2.1菌株培养
将-80℃保藏菌种在改良MRS液体培养基中活化，37℃厌氧培养12h，连续活化两代作为种子培养液。第三代以1％接种量接种后，37℃厌氧培养6h左右后，用于后续试验。
3.2.2酸处理
将动物双歧杆菌A6按1％接种量接种18管10mL厌氧MRS培养基，培养至对数中期(6h，pH 5.4，OD600～0.6)，8000g离心10min，弃尽上清，将菌体分别重悬于等体积的pH 5.4和pH 2.5的改良MRS液体培养基中，37℃厌氧培养30min，作为RNA-seq的研究对象，前者作为对照组，后者作为酸处理组。每3个样品混为一个提取RNA用样品，最终获得3个对照组样品及3个酸处理组样品。
3.2.3总RNA的提取
利用Vandecasteele文献中描述的方法进行RNA的提取。按照样品菌液的五分之一体积加入细菌RNA非冻型保护液，混匀，室温放置5min后，8000g离心10min，弃尽上清。将菌体重悬于500μL的NAES缓冲液中，加入500μL的酸性苯酚(水饱和酚)氯仿混合液(5:1)。将该体系转移至均质管中(装有0.3g的0.1mm玻璃珠)，beadbeater振荡30s，冰浴2min后，12000g，4℃离心5min。取450μL上层水相于新离心管中，加入520μL异丙醇，轻轻摇匀，再加入35μL 3M乙酸钠，轻轻摇匀，12000g，4℃离心5min，弃尽上清。加入1mL 70％的乙醇，用移液枪吹洗沉淀，12000g，4℃离心5min，用枪头吸尽上清，加入100μL DNAse RNAse-freeH2O，反复吹打溶解沉淀。上样3μL电泳检测提取RNA质量。若电泳检测后证明RNA完整，则进行Dnase I处理操作。
于100μL RNA溶液中加入10μL 10×DNase I Buffer，2μL DNase I，0.5μL RNaseInhibitor后混匀，37℃放置1h。加入100μL DNAse RNAse-free H2O，加入200μL水饱和酚氯仿异戊醇混合溶液(25:24:1)，4℃12000g离心10min。取上清，加入同体积的氯仿异戊醇混合液(24:1)，12000g离心5min。取上清加入十分之一体积3M乙酸钠，加入2.5倍体积的预冷乙醇，-20℃放置30-60min，4℃12000g离心5min，弃尽上清。加入1mL预冷70％乙醇洗涤沉淀，4℃12000g离心5min弃尽上清。室温干燥5-10min，加入30μL DNAse RNAse-free H2O。利用核酸电泳及Agilent 2100检测RNA的完整性，利用Nanodrop检测核酸的浓度。最终的RNA样本需要满足OD260/OD280＝1.8～2.0，OD260/OD230>2.0，RIN>6.5,23S:16S>1.0。
3.2.4转录组RNA-Seq测序
RNA-seq文库的构建：取5μg RNA，使用链特异性转录组文库构建试剂盒TruSeqStranded mRNA Sample Prep Kit建库。首先，用Ribo-Zero Magnetic kit去除rRNA。将去除rRNA后的样本进行打断。合成双链cDNA，在第二链合成时采用dUTP代替dTTP，并在合成双链后连接index接头，加入UNG酶降解cDNA第二链。进行15个循环PCR扩增以富集文库。2％琼脂糖凝胶电泳回收目的条带，回收产物使用TBS380进行定量检测。每个样品按等摩尔比例混合后上机。cBot上进行桥式PCR扩增，形成cluster。使用Hiseq4000平台进行2×150bp测序。
数据分析：利用SeqPrep和Sickle对测序下机数据进行去接头和质量控制。质控步骤如下：1)去除reads中的adaptor序列，去除由于接头自连等原因导致没有插入片段的reads；2)将序列末端(3’端)低质量(质量值小于20)的碱基修剪掉，如剩余序列中仍有质量值小于10的碱基，则将整条序列剔除，否则保留；3)去除含N的比例超过10％的reads；4)去除经过以上步骤后长度小于30nt的序列。经过质量控制和去接头的处理后得到高质量的测序结果。利用bowtie 2将所有的clean reads匹配到动物双歧杆菌A6的基因组中。计算每个基因的FPKM(fragments per kilobase of exon per million mapped reads，FPKM＝mapped fragments of gene/(mapped reads×gene length)，使用TMM(trimmed mean ofM-values)对FPKM值进行标准化。利用EdgeR查找差异表达基因。差异表达基因标准：表达差异倍数大于2倍，其FDR值小于0.05.用Goatools和KOBAS对差异基因进行GO富集和KEGG代谢通路注释。
3.2.5定量PCR验证转录组数据
在转录组差异表达基因变化范围内选取10个基因进行定量PCR。利用定量PCR的结果验证转录组数据测序的准确性。以3.2.3中描述的方法进行RNA的提取，用ABM试剂盒对RNA样本进行反转录得到cDNA样本。以cDNA样本为模板进行定量PCR。定量PCR所用引物如下表9所示。
表9：定量PCR所用引物
Figure BDA0001835140840000291
Figure BDA0001835140840000301
PCR的反应体系为20μL：SYBR Green I Real-time PCR Master Mix 10μL，cDNA模板1μL，上下游引物各1μL，DNAse/RNAse-free去离子水7μL。
PCR程序：95℃预变性30s，95℃变性10s，引物Tm值温度退火30s，40个循环。以16srRNA基因作为内参基因。
3.2.6细胞膜通透性的测定
取对数中期(OD600～0.6)菌液，6000g离心10min收集菌体。将菌体分别重悬于pH5.4和pH 2.5的MRS培养基中，37℃静置30min。6000g离心10min收集对照组菌体及酸处理菌体。用10mM的磷酸钠缓冲液(pH 7.4)洗涤菌体两次。将菌体重悬于10mM磷酸钠缓冲液中(pH7.4)，调节OD600为1.0。向菌悬液中加入O-硝苯基-β-D-半乳糖苷(ONPG)溶液至终浓度为100μg/mL。在0，10，20，30，40，50，60min时取100μL菌悬液用微量比色皿测定菌悬液在420nm处的光吸收。
3.2.7胞内ATP含量的测定
参照文献“JIN J，QIN Q，GUO H，et al.Effect of Pre-Stressing on the Acid-Stress Response in Bifidobacterium Revealed Using Proteomic and PhysiologicalApproaches[J].PloS one,2015，10(2):e0117702.”所述方法测定动物双歧杆菌A6对照组及酸处理组菌体的胞内ATP含量。
制备样品：取10mL菌液收集菌体，PBS洗涤2次后，超纯水洗涤1次，弃尽上清，加入100μL预冷的8％(v/v)高氯酸，立即混匀，在冰浴条件下使用超声波细胞破碎仪破碎菌体，超声条件为：功率100W，超声开2s停2s，破碎15min。之后加入100μL冰冷的1M NaHCO3溶液，漩涡振荡10s混匀，4℃12000×g离心10min。取上清用于HPLC分析。
HPLC分析条件：waters T3色谱柱，以50mM磷酸钾缓冲液(pH 6.4)为流动相，紫外检测器分析样品ATP含量。分析条件为：流速1mL/min，柱温25℃，检测波长254nm，10μL上样检测。利用流动相将ATP稀释成12.5至200μmol/L系列梯度标准溶液，以相同条件进行分析，作为外标以确定ATP保留时间，并绘制浓度-峰面积标准曲线。利用标准曲线计算样品ATP含量。
3.3结果与分析
3.3.1总RNA的提取
动物双歧杆菌A6的对照组及酸处理组菌体加入非冻型细菌RNA保护液后进行总RNA的提取。提取的总RNA用1.5％琼脂糖凝胶电泳检测RNA的质量。如图7所示，23S rRNA、16S rRNA条带明亮清晰，而5S rRNA条带较暗，表明所提取的RNA完整性良好，降解少。利用NanoDrop2000和Agilent2100对RNA的浓度及质量进行进一步的检测，从下表10中可以看出所有RNA样品浓度均在500ng/μL左右，远大于测序样本200ng/μL的要求。OD260/OD280在1.90-1.99之间，OD260/OD230在2.15-2.20之间，RIN为9.9-10.0，均满足测序样本OD260/OD280需在1.8-2.0之间，OD260/OD230需大于2.0，RIN需大于6.5的要求。这说明提取的RNA样本无色素、蛋白、糖类等杂志的污染，纯度良好，可用于后续测序文库的制备。
表10：转录组测序RNA样品浓度及质量值
组别 样品名称 浓度(ng/μL) OD260/OD280 OD260/OD230 RIN
对照组 C1 497.5 1.99 2.19 10.0
C2 504.1 1.99 2.18 10.0
C3 494.6 1.99 2.17 10.0
酸处理组 A1 504.9 1.99 2.15 9.9
A2 509.6 1.96 2.19 9.9
A3 484.1 1.90 2.20 10.0
3.3.2转录组RNA-Seq测序结果
利用Illumina Hiseq4000对RNA样本制备的测序文库进行测序。得到的测序结果如下表11所示，所有测序样本均得到了15～19M的高质量测序序列，98％左右的序列能够匹配到动物双歧杆菌A6的基因组上。
表11：转录组测序结果概况
Figure BDA0001835140840000321
将所有的匹配序列用于计算基因的FPKM。通过差异表达基因分析发现在本研究中酸处理组相较于对照组而言有531个基因的表达量变化了2倍以上。在这些基因中，有234个基因表达水平显著上调，297个基因表达水平显著下调。
将动物双歧杆菌A6在酸性环境中表达量发生显著变化的531个基因进行COG功能分类。如图8所示，在531个变化的基因中有428个基因可以匹配到COG分类当中，它们涉及了18个生物功能。在这18个生物功能当中，防御机制中的基因变化比例最高，达到了53.85％，其次是碳水化合物转运及代谢相关基因(50.85％)，再次是脂质转运代谢相关基因(48.65％)。另外有103个基因没有匹配到COG生物功能分类。
3.3.3定量PCR验证转录组数据
从转录组差异表达基因中选取10个基因进行定量PCR。利用NCBI的在线引物设计软件进行引物设计，以酸处理组和对照组cDNA作为模板进行定量PCR。检测结果如图9所示，可以看到定量PCR结果和转录组测序结果有很强的相关性，相关系数R2＝0.95。
3.3.4差异表达基因参与的代谢途径分析
根据KEGG和NCBI数据库基因组注释和比对得到的差异表达基因的功能信息，根据已有研究胞内pH平衡的调节、生物大分子的损伤修复、代谢途径的适应性调整等进行整理，部分显著变化基因归类整理如下表12。在结果分析部分将详细分析动物双歧杆菌A6在酸环境中的应答策略，主要包括：细胞膜通透性的降低减少氢离子进入，草酸盐代谢增强增加氢离子消耗，碳水化合物代谢增强增加能量产生，分子伴侣保护蛋白质，DNA修复系统修复受损伤的DNA，信号转导、转录翻译等方面。
表12：动物双歧杆菌A6酸处理下部分基因的表达变化
Figure BDA0001835140840000322
Figure BDA0001835140840000331
Figure BDA0001835140840000341
Figure BDA0001835140840000351
Figure BDA0001835140840000361
Figure BDA0001835140840000371
Figure BDA0001835140840000381
Figure BDA0001835140840000391
3.3.5酸处理后细胞膜通透性的变化
通过转录组数据的分析得到，动物双歧杆菌A6在酸环境中通过增强脂肪酸合成和噬菌体侵袭蛋白A的表达来降低细胞膜的通透性。为了验证这一点，利用O-硝苯基-β-D-半乳糖苷(ONPG)作为分子探针测定细胞膜的通透性。细胞能够产生β-半乳糖苷酶，ONPG是β-半乳糖苷酶的底物。ONPG被加入细胞悬液以后，ONPG可以穿过细胞壁膜进入细胞内。在β-半乳糖苷酶的作用下ONPG被切割成为淡黄色的邻-硝基苯酚(ONP)，ONP在420nm处有特征吸收峰。当细胞膜的通透性增加时，在相同时间内就会有更多的ONPG透过细胞膜被β-半乳糖苷酶切割产生更多的ONP，其菌悬液的颜色也会相应加深。从而可以通过检测在加入ONPG之后一定时间内菌悬液的吸光值来表征细胞膜的通透性。试验结果如图10所示，在加入ONPG之后，酸处理组的OD420上升的速率要低于对照组。在60min时，酸处理组的OD420为0.063，对照组的OD420为0.035，酸处理组显著低于对照组。这说明在pH2.5处理30min后，动物双歧杆菌A6的细胞膜通透性发生了显著的降低。
3.3.6酸处理后胞内ATP含量的变化
通过转录组数据的分析得到，动物双歧杆菌A6在酸性环境下碳水化合物代谢增强可能导致能量产生的增强以保证菌体在应对酸性环境时的能量需求。为验证能量产生在动物双歧杆菌A6耐酸应答过程中的变化，本实施例测定了酸处理组菌体及对照组菌体的胞内ATP含量。如图11，在对照组菌体中胞内ATP的含量为11.11nmol/mg of protein(11.11nmolATP/毫克蛋白)。而在酸处理组的菌体中胞内ATP的含量达到32.47nmol/mg of protein(32.47nmol ATP/毫克蛋白)，显著高于对照组。这说明在酸胁迫的条件下胞内ATP的含量确实得到了提高。
3.4结果分析
本实施例通过高通量RNA-seq的手段分析了动物双歧杆菌A6在酸胁迫条件下的转录组变化。根据差异表达基因在代谢途径中的预测功能以及目前有关于革兰氏阳性菌耐酸应答机制的报道，分析差异表达基因与动物双歧杆菌A6耐酸应答之间的关系。结果表明，动物双歧杆菌A6通过细胞膜通透性的降低减少氢离子进入，草酸盐代谢增强增加氢离子消耗，碳水化合物代谢增强增加能量产生，分子伴侣保护蛋白质，DNA修复系统修复受损伤的DNA，信号转导、转录翻译等方面来抵御和适应酸环境。
3.4.1细胞膜通透性的降低阻止了H+的进入
细胞壁膜是细胞与外界环境的屏障，也是对外界环境威胁的第一道屏障。当动物双歧杆菌A6暴露于酸性环境中时，与脂肪酸合成相关的5个基因发生了显著的上调。编码酰基载体蛋白合成酶(acpS)的基因上调了3.63倍。酰基载体蛋白合成酶可以激活酰基载体蛋白使其变成其活化形式holo-酰基载体蛋白。酰基载体蛋白活化后才能加载丙酰基，从而开始脂肪酸合成的过程。编码脂肪酸合酶的基因(fas)上调了3.81倍，脂肪酸合酶是一类具有多种功能的脂肪酸合成酶，它可以催化脂肪酸合成的起始与延伸的整个过程。这两个基因的上调表达说明脂肪酸合成的增强。同时，还有三个与丙酮酸转变为乙酰辅酶A和丙二酰辅酶A这一过程有关的三个酶，甲酸酰基转移酶(pflD)，丙酮酸甲酸裂解酶激活蛋白(BAA6_RS05355)，羧胺连接酶(BAA6_RS01570)，分别上调了15.89、11.88、9.85倍。丙酮酸甲酸裂解酶激活蛋白可以激活甲酸酰基转移酶，而后在甲酸酰基转移酶的作用下丙酮酸分解为甲酸和乙酰辅酶A。在羧胺连接酶的作用下乙酰辅酶A转变为丙二酰辅酶A。乙酰辅酶A和丙二酰辅酶A作为脂肪酸合成的原料进入脂肪酸合成。丙酮酸的代谢产物更多的流向了乙酰辅酶A和丙二酰辅酶A为脂肪酸合成的增强提供了又一证据。脂肪酸合成增强的现象在其他乳杆菌中也有出现。这一变化会增强细胞膜的完整性和不透性。细胞膜是非极性的双层屏障，细胞膜的不透性增强可以增强其阻挡氢离子的能力。
另外，本实施例研究发现编码噬菌体侵袭蛋白A的基因(phage shock protein A，pspA)在受酸刺激的动物双歧杆菌A6细胞中上调2.53倍。在大肠杆菌中，PspA在多种胁迫环境下均有上调表达。该蛋白可以组装成一种棒状的复合物，可以在细胞膜完整度的维持中起到脚手架的作用，从而阻止受损细胞膜区域氢离子的渗透。
从转录组的数据可以看出，在酸性环境中，动物双歧杆菌A6通过脂肪酸合成的增加和噬菌体侵袭蛋白A的上调表达，促使细胞膜的通透性降低，从而减少氢离子的进入。在生理水平的试验中也同样证明了这一点。在利用ONPG作为分子探针检测酸处理组与对照组菌体细胞膜的通透性时发现，在菌悬液中加入ONPG后，酸处理组OD420的上升速度要小于对照组，在60min时，两组的OD420出现了显著的差异。这说明在酸处理中，动物双歧杆菌A6确实通过降低细胞膜通透性的方式来应对了酸环境。
3.4.2碳水化合物转运和代谢的增强有助于保证能量供应
在酸胁迫环境下，细胞的能量需求会增加以维持各种耐酸响应机制的运行。在动物双歧杆菌A6的耐酸响应中有很多与碳水化合物代谢相关的基因发生了显著的变化(参见图12)。研究发现编码β-葡糖苷酶(bglB)，蔗糖磷酸化酶(E2.4.1.7)，葡萄糖磷酸变位酶(pgm)，β-半乳糖苷酶(lacA)，醛糖差向异构酶(galM)，UDP-葡萄糖4-差向异构酶(galE)，甘露糖苷酶(gmuG)都发生了2.48-12.21倍的显著上调。在这些酶的作用下，葡聚糖、麦芽糖、半乳聚糖、蔗糖、甘露聚糖等双糖或多糖转化为葡萄糖或果糖，从而进入糖酵解途径。这些基因的上调表达说明动物双歧杆菌A6在酸性环境中利用多糖的能力增强了。同时，有12个编码碳水化合物转运蛋白的基因发生了2.01-17.27倍的上调表达。碳水化合物转运能力的增强为细胞内的双歧途径提供了更多的底物。而且，双歧途径中的大部分基因(gpi，talA，tktA，rpiA，gapdh，pgam，neo，pyk，ldh)都发生了2.03-3.63倍的上调。相似的碳水化合物代谢能力提高也出现在了长双歧杆菌及其他乳杆菌中。双歧途径是双歧杆菌中主要的产能途径，每个循环可以产生2分子的ATP。碳水化合物分解、转运和代谢方面众多基因的上调最终导致ATP产生的上调，这些能量为动物双歧杆菌A6在酸性环境下的生命活动的维持以及耐酸机制的运行提供了能量。
另外，除了双歧途径，还发现核糖作为碳源参与产能的途径增强。编码核苷酸水解酶的基因(BAA6_RS07145)上调了14.83倍。核苷酸水解酶可以将核苷酸水解成核糖和对应的碱基。水解出来的核糖可以由核糖-5-磷酸进入双歧途径，从而进行产能。编码磷酸核糖焦磷酸合成酶的基因(BAA6_RS07435)发生了显著的下调也佐证了这一假设。磷酸核糖焦磷酸合成酶可以催化磷酸核糖二磷酸的生成，核糖在转变为磷酸核糖二磷酸后才能进入嘌呤/嘧啶代谢。这说明，在水解出更多的核糖之后，大部分的核糖以碳源形式进入了双歧途径产能而不是经由磷酸核糖二磷酸进入嘌呤/嘧啶代谢。这为酸环境下能量的产生提供了又一途径。
3.4.3蛋白质保护
过量的氢离子进入细胞后会损坏一些蛋白质的结构，能够修复酸胁迫引起的蛋白质损伤是乳酸菌应对胁迫环境重要的应答方式。在酸性胁迫环境下，动物双歧杆菌A6中与蛋白质保护相关的一些分子伴侣发生了显著的上调。DnaK系统中的基因(dnaK，dnaJ，grpE)上调了6.41-14.42倍，groEL/groES上调了3.46-3.92倍。这些分子伴侣蛋白可以与错误折叠蛋白结合，帮助其完成重新折叠，从而恢复受损蛋白质的生理功能。另外，分子伴侣ClpB也发生了显著的上调。ClpB是一个III类热击蛋白，在E.faecalis的热击反应中会发生显著的上调。由于ClpB缺少ClpP识别的三肽位点，ClpB是作为一个分子伴侣发挥重新折叠受损蛋白的作用，而不是与ClpP结合在一起行使降解受损蛋白质的作用。
3.4.4DNA的修复
在酸处理的酸细胞中编码甲基化-DNA-蛋白半胱氨酸甲基转移酶的基因(BAA6_RS00555)上调了3.73倍。该酶可以将腺嘌呤和胸腺嘧啶上的甲基基团转移至自身的半胱氨酸残基上。甲基被转移至半胱氨酸后该酶会失活，从而以一种自杀式的方式进行DNA的直接修复。这是一种直接修复DNA的方式。两个编码尿嘧啶-DNA糖基化酶的基因(BAA6_RS03235，BAA6_RS03880)分别上调了4.32倍和2.35倍。尿嘧啶-DNA糖基化酶可以去除DNA中的尿嘧啶，从而实现DNA的碱基剪切修复。以上结果表明在酸性环境中，动物双歧杆菌A6启动了DNA的直接修复和碱基剪切修复来修复由大量氢离子涌入细胞带来的DNA损伤。
3.4.5信号转导
RNA-Seq的数据分析表明，与信号转导相关的蛋白酪氨酸磷酸酶的基因(BAA6_RS06435)、双组份系统感受器组氨酸激酶的基因(BAA6_RS04935)、整合宿主因子的基因(BAA6_RS03180)发生了显著的上调表达。蛋白酪氨酸磷酸酶参与蛋白中酪氨酸位点的去磷酸化。双组份系统感受器组氨酸激酶在接受到环境中的信号以后会发生自磷酸化，随后将磷酸基团传递给它对应的受体蛋白，受体蛋白在磷酸化后进而调控下游基因的表达从而对外界的环境变化做出响应。蛋白的磷酸化与去磷酸化是细胞中重要的调控途径。从蛋白酪氨酸磷酸酶及双组份系统感受器组氨酸激酶的上调表达可以看出动物双歧杆菌A6在酸性环境下通过蛋白磷酸化和去磷酸化的过程将外界环境中的酸信号传导给整个细胞从而做出适应性反应。另外，编码整合宿主因子的基因(BAA6_RS03180)上调了5.78倍。整合宿主因子是一个组蛋白样DNA结合蛋白。在哈氏狐菌中，整合宿主因子可以激活菌体的群体效应。而且，参与群体感应信号分子AI-2合成的基因luxS也发生了1.6倍的上调，这也为群体感应的激活提供了佐证。在变异链球菌和长双歧杆菌的耐酸应答中同样出现了群体感应的激活。这增强了群体中个体与个体之间的交流从而提高整个群体的存活率。
3.4.6转录和翻译
当动物双歧杆菌A6暴露于酸性环境中时，29个转录因子发生了显著的变化。这一结果说明转录水平的调节在耐酸应答中发挥了重要的作用。另外，RNA-seq数据显示了部分与翻译相关的基因发生了显著的下调，例如核糖体蛋白(BAA6_RS01505，01510，01810，01290)，翻译起始因子IF-3(infC)，肽链释放因子(prfA，prfB)，翻译延伸因子(BAA6_RS06385)。在长双歧杆菌、植物乳杆菌、鼠李糖乳杆菌中都发生了类似的翻译相关蛋白下调的现象。而且在长双歧杆菌BBMN68中加入氯霉素抑制蛋白质的合成之后能显著的提高其在酸胁迫环境下的存活率。但是，编码核糖体循环因子(BAA6_RS03835)的基因发生了显著的上调。它的功能主要是负责核糖体的循环。这一基因的变化也出现在了植物乳杆菌中。这说明在酸性环境中的动物双歧杆菌A6中，核糖体的合成降低，循环利用增强。这可能有助于细胞在酸性环境中节省能量。
3.4.7其他
BAA6_RS00475,BAA6_RS00480编码了GlsB/YeaQ/YmgE家族胁迫响应膜蛋白在酸性环境中上调表达了4.41倍。该蛋白的功能还不明确，但是在粪肠球菌中敲除该基因会导致菌株胆盐耐受能力的下降。该蛋白的上调表达说明它也参与了动物双歧杆菌的耐酸应答过程。另外，BAA6_RS03590编码的乙二酰还原酶上调了26.54倍。乙二酰还原酶可以将乙二酰转化为乙偶姻。乙二酰会在氨基酸代谢和糖酵解的过程中产生。这些酰基化合物具有较高的氧化性，能够攻击蛋白中的精氨酸、赖氨酸、半胱氨酸等残基从而造成蛋白的损伤。乙二酰还原酶的升高可以尽快将胞内积累的乙二酰等物质转化为没有氧化活性的乙偶姻等物质，从而降低细胞内的氧化水平，保护蛋白质等大分子物质。
3.5结论
(1)通过RNA-Seq转录组测序发现酸处理以后动物双歧杆菌A6中有531个基因表达水平发生了显著的变化，这些基因与防御机制、碳水化合物转运代谢、脂质转运与代谢等18个生物功能有关。
(2)通过对差异表达基因的功能进行分析，预测动物双歧杆菌A6耐酸应答机制主要有以下几方面(参见图13)：通过加强脂肪酸的合成和pspA的表达来降低细胞膜的通透性来阻挡氢离子，通过增强多糖的利用、双歧途径以及核糖的代谢来增加胞内能量的产生，利用DnaK系统、groES/EL系统、ClpB来保护蛋白质，利用DR及BER系统来修复损伤的DNA，通过蛋白的磷酸去磷酸化及群体感应来进行信号转导从而引发转录因子的变化及翻译水平的下降来进行酸环境中的应答。其中，图13中的基因缩写对应基因名见上表12。
实施例4耐酸关键基因筛选及其与A6耐酸性关系的验证
对于目标基因功能的研究，仅仅通过其在组学数据中的上下调表达并不能直接说明该基因在胁迫应答中发挥重要作用，还需要分子生物学的手段进行进一步的验证。验证基因功能的分子生物学手段主要是基因的过表达和基因缺失突变株的构建。
本实施例尝试通过构建将目的基因连接到大肠杆菌-双歧杆菌穿梭载体上的方式将目的基因在动物双歧杆菌A6中进行过表达，检测过表达菌株耐酸性能的变化，以验证靶基因在动物双歧杆菌A6耐酸应答中的作用。
4.1材料与方法
4.1.1菌株与质粒
菌株：Escherichia coli DH5α(天根生化科技有限公司，CB101)；
Bifidobacterium animalis subsp.lactis A6。
所用质粒如下表13所示。
表13：所用质粒列表
Figure BDA0001835140840000441
Figure BDA0001835140840000451
pDP152质粒的图谱如图20所示。BAA6_RS02390基因的序列如SEQ ID NO：1所示，BAA6_RS02980因的序列如SEQ ID NO：2所示，BAA6_RS03885因的序列如SEQ ID NO：3所示，BAA6_RS05205因的序列如SEQ ID NO：4所示，BAA6_RS06440因的序列如SEQ ID NO：5所示，BAA6_RS06240因的序列如SEQ ID NO：6所示，BAA6_RS00480因的序列如SEQ ID NO：7所示，BAA6_RS06435因的序列如SEQ ID NO：8所示，BAA6_RS02185因的序列如SEQ ID NO：9所示，BAA6_RS06445因的序列如SEQ ID NO：10所示。
ATGGCAGAAGACAAGACCAGTGATGAGCTGACCGAACGCGACATCGAGGATCTCAACGATCCAGACGACAATCCGGATGTGGCTGATGCGGATGCAACGGAACATAATCTGCGGCGTGCGGTGATCATCTGCTTCATCGTGACGAGCGTGATGTGCCTGTGCATCAATATCGTGGTGCTTCTGATGCTGCAGCGCAAGGGCAAACTCGACAAGGCGGCCGCCAATCTCGACGAGTTCAAGGAGAACATGCAGCATCTGGCCAGCGACAAGAGCCGCCAGATCGCCCGGAACAAGGACGTGCGCAAGGCAATGGACACGATTTCGCAGCATATTCGCGAGATTCCAAGCGAGGCGCAGAGCGCGGTGACCCGCGTACGCGATTCCCTCGCAAAGTAG(SEQ ID NO：1)。
ATGAAGGTGCTTTGCGCTCACGGCGTCGCATTCGTGCGTGCCTATGATGGCGTCATGGCATACGACAATGGCAATGTGATCGACGTGCGGGCGAACACGACGCTGAGCACGGAGAATGCGATCAAAGGCAACGTACTTGTATTGGGCAACTCGGGTGTGGGCAAGTCGACGTTGATCAACGCGGTGATAGGGGACACTGTGGCCAAAACGAGCTTCGGCACGCGGGGCACCACCAGTGAGCTCGCCGTCTATGAGAGCCCAACGGTGCCGTTCCGGGTCATCGATTCAATAGGGTTCGAACCGTCTCCCATCAAAAGCCTCAGAGCGGTGCATGCGGTGCGCAAATGGTCGAAGGCGAGCGCCAAGGAAGGTCATGAGCACAACAAGATCGACGTGATCTGGTTCTGCGTGGACGGGACAGCGGCAAAGCTGTTCCCGGAGACAATACGGAATCTGTCCACGGCCGTGTCGATGTGGCGGTCGGTGCCGATCATCACCGTGATCACGAAATCGTATTCGAAACCGGACCGCGAGCTGAATGTGCAGATGGTGCGGCAGGCGTTCGCGGGGCAGCGGATGGAGAGGAACCTGCGCGCGATCATACCTGTGGTGGCGCAGACCTATGTGATCGACGAAACCGCGTTCGCCGGCCCCGAGGGAATCTCCGATCTCATAGACGAGACGATGAAGGCGATGCCGGAGGGGATGCGCGGTGGCTCGCATGATCTCATGGCGTTCAAACTCACCCGCAAACGAGTGCCGCGCAAGGTCTGATCGGCGCTTGTGTGGCGGCGGGTGCCACAGTGGGCGCCGTGCCGATTCCAATCGCCGACTCCTTGGTGCTCTCCCCGCTGGAACTGGGCGAGTTGCATGGCCTGGCGCGACTGTATGGCATAGACAAGGATGAAGGGTCGAAGCAGTTCCTGGATTCCATCGTGCAGGTGGGCACGGCAAGCGTGGTGGCGCATTCCGCAATCAGCGCGGTGAAATCGATTCCGGGCGTCAACATCGCGGCCAGTGTGCTCAATGCGATTGTGGCGGCGAGCATCATCGCCGCACTCGGTGAGGGTGCCGTCATAGCCTTCGAGCAGGTGTACAGCGGCAAGCGCAGCGTGAACGACGTCACCTGGGTGCAGAATCTGATGCAGGAGCAGTTCGGCGAAGGGTTCCTCGGCAAGGTGAGCGGTGTGGCGCAGGCGTCGGCCAAGGCCGGCGATGCGAAGGACATGCGTGAGATGATCGTGGAATTGGTCAAGGCCGCGTTCATGAATCGGGGGGAGTAA(SEQ ID NO：2)。
TCAGCCGAGCTGGGTTCCGAAGCGCTCGTTGAGCTCCACCTGATCCTCGGTGGCCTTGGCTTCCTTGGCGGCTGCCTTGCCTTCGGCCTTGTCCTTCTTGTCATCGGCCTTGTCGGTGATCTTCTCGAGCTTGGCATCCGGGTCGTCAGCGGCCTTGACGATCTTCTCGTCCTCCTTGGCAATCACCTTGGCAGCATGGTCCTCGGCACGCTCGGCGCGCTTTTCGTCACGCTCCGCCTTGTGCTCCTCGTGCTTCTCCTCCATGCGATCCTTGAATTCCTCGAAATGTTCCTTGATGTCTGCCAT(SEQ ID NO：3)。
ATGGAATGGGCAGCATGCATGCATACGGCTTGCATAAATGATTTCTATGATGAGAGCAACAGCAAAAGAAAGGTCAACACCATGACTACCACAACGAACAATATGGATTCGAACAACATGAACAACGGCACGGCTAACGGAGGTTCCACGCCGGGCGCCTCCAGCGACGGCGACCTCGACTTCCAGGGCAAGGCCGACGCGCCGAGAAGGGCGAGAAGGGATGCGGCTGCAACTGCAGCGCGAAGCAGACCGAGAGCCGCGAACAGCCGAAATCGAACGAGGTTCGCCAGCCTGCAGAGCCGAGCAATCCGTTCCCGCAGTCCGAAGCCCCCAGCGGTGACGGCACGGGTATCAAGGCCGGCGGCGGGCAGGCCGAGTGA(SEQ ID NO：4)。
TCACTTGTCTTCGAGATACGGGTCTTCCCACTGGTTTTCGTTGTCGGTCTCCTCGGGGCGGTCGATTGCGAGCTCCTCGCGTTGCGCCGCATCCTGCTTGGCTTCCTTGGAGGCATCGCTCACACCCACCTCGTTTTCCGGAATGTCCTCATTCGGCTTGCCGGTGATCGGGTCGGTGTACGGATGGTCAGTGTCGCTGACAATCTGCTCCATCTGCTTGACCTGATCGGCGCTCACCGCGCCAAGGCCTTCGTGTGTGTTGGTGTCTGGAATGTTCTGTTGCTCTGCCA T(SEQID NO：5)。
ATGACCAGTATTTTCGAAAGCGTTTCCAACCAACTCTCCTCACTGCCGCATCTGATCCCCTCCTTTGTGCGCAAACCGAACGAGAACGATGAGCGGATTGACGACCTGGAGAATCAGATCGCGCGTCTCGACCGCGAATCCAAATGGTGCGATGTCGAACTCGACCGCCGAATCAAAGAGCTCACTGCCGAGGTCGACTCATTGAAGCGCACGCAGCATCATGACCGTTCGCTGCGCACGGCGGACCGTGTGCTCGCAATCGTGTTCATGTCGCTTGCCGCGCTGATTCTCGTGCCGATGTTCCTCACCCTGTTCCATGTGATCGACCCATCCGGCGAGACGATCCGCTGGGTGGTCTTCGCGCTCTTCGCCGTCGCAGGTGGCATGGGTGTGGCGATCACCATTGCACATGGCAAGCTGCCGCGCACACGCGACTCGCTCATTGTATTCGTCTGTGCGGCATTGCTGTTGCTGGTTGCCTGCCTGCTCTAG(SEQ ID NO：6)。
CTATGCGCGAACCTTCATGACGATGAAGCTGACGATGGCGACCACAATGACCGCGCCGAGGACGGACGGTACGACCGCCATGCCCCCGAGCGACGGCCCCCAGGAGCCGAAGAGTCCCTGACCAAGCGCCGAACCGGCCAATCCTGCCAGAATGTTGCTGATCCAGCCCATCGAATGCCCGTTGTTGGTAATCGCACCTGCGATCGCTCCGATGACTGCGCCTACAATAAGTGTCCAAATCCAAAACAT(SEQ ID NO：7)。
TCAGTTACTTGCGTCATCGGTGAGGTAGAAATCGCGCAGTGCACGCAGGTCGGCCTCACTGAGCCCAATCGCCGTACGCAGGTAGCCGACGGGGCCGCCGAACGATGCAGTGGCGTCGATATACGTCTGGAAATAGAGCGGCGAGGCGACGAGGAACTCGTCGATGTCCGCATGGGCCTTGGGGCCGAGCAGTGCTTCGAAGGTGTCGACGAACGCCGGCATTTCCGTGGACATGTAGAGGTTGGTCTGCAGGTAATCGTCGCGGATCACGTCTTCAGGCACTTCCAGCGCGGCCAGAATGAGTGCCGCCGCGATGCCGGTGCGATCCTTGCCCTGTGTGCAGTGGAACAGGTAGCCGCCCGGCTCGTCGATGAGCAGGCGGAACATCCGCTTCCAGCACGCGACCGCGGCGTCGTCGAGCACGAGGCGCGGGTAGAGGTCCTCGATGAACGTGCCCGGGCGGGTGACGATGTCGCGCAGCTGCAAACGCAGCGCCTTCGTCTCGCGGAACGTGGGCAGTGCGTAGAACGACCAATCCTCGAGCAAGCGGTCTGGCTTCAGGTCGCGTTCGGGATCGGTGCGCAAATCGATGACGTTCGAGATGCCCCTATGCGCCAGCGTCTCCAGGTCGTCATGGCGCGCATCGTGCAGGTTCGCCGAGCGCACCAGCAGTCCCGGGCGCACCATGCGCCCTTGCTCCGTGTGGATGCCGCCCAGATCGCGGCAGTTCTCCACGGTGGGCAACGGCAGTTTGCGTGACACTACGCGCAT(SEQ ID NO：8)。
ATGGCATTGACCAGCGAACAGCAACAGATCGTGGACAAGGCCACGCTCACGAGGATCAACGGATGGCAGTACCTGACCGTTGAGGGAAGCCCGTACGAGATCGGCTTCGAGCACGGCTACCTGCTCACCGACGAGTTTAAGGACGCCATTCGCGTCTACACGCATATGACGCTCGAGACGCTTGGCATGGATTACTCGTTCTTCGTCGATCAGGCGGTCAAACTGCACAAGGACAAGATTCCACAGGAATACATCGAGGAGATGCAGGGCATGGCCGACGGCTTCACCGCCGGCGGCTTCGAGACCAGCCTGGACGACGTCATCGGCTGGAACGACTGGATGGAACTCACCGGGTACTGGTGGCCGCAGGTCGCCGCCGAGTATTCGAACAACCCGCCGGACGGCCCCAAGGGATCGCACTGCTCGGGCTTCGTGGCCACCGGCAGTGCCACGAAGGACGGCAAGCCGGTCATAGCCCACGAGAGCTTCGACGACTTCTGGAGCGGTCAGTACTTCAACGTGTGCGAGAGCGTGAAGCCCGCCCACGGCAACAGCTTCAAGATGCAGACGGTGCCCGGCTACATCGATTCGATGACCGACTTCTATGTGACTTCGGCCGGTCTGGCCATCACCGAGACGACGATCGCCGGATTCGTCGGCTACGACGTGGACGGCATCCCCGAATTCGTCCGCGCCCGCAAGGCGACCCAGTACGCGAACAGCATCGACGAATGGGTCACGATCGTCAACGAGGGCAACAACGGCGGCTACGCCAACATCTGGCTGCTCGCCGACGCCAACACGAACGAGATCGCCCGCTACGAGCAGGGCCTCAAGCACCAGGAGCTGCTGCGCACGAAGGACGGCTCGTTCTATGGGTGCAACGCCTGCCACAATCCGCGCATTCGCAACCTCGAATGCGTCGACAACGGCTACAACGACACCCGCCAGCAGACCGGCGCCCGCCGCGCACGCTTCGAACAGCTGCTGCCGCAGCTGCACGGCACCATCGACGACGATGTGGCCAAACGAATCCTTGCCGACAAGTTCGACCCATATCTGGGTTATGTCAACGCAAGCTCGCGCAACATCTGCGCACACTACGACGTTGACCCCCAGTACTATGCGGACGATCCGCACGGTGTGTGGAACGTGCCGTTCTTCCCGGGCGGTTCCTGCGACGGCAAGTGCGCCAACGGCGACGACATCAAGGCCCTGCACATGTGGGGCATCTTCGGCCGCGCCGATGGCGAGCCGTTCGACGCCGACGAATTCATGAGGCAGCACCCGCAATGGAGCTGGCAGAAGGGGTATCTGTACGACCGCCCCA GCCAGCCCTGGACGTTGTTCGACTGA(SEQID NO：9)。
TCAGTGGGTCTGGTGGGTCTCTTCGTGCTCGGCGACTTCCTTCTTGTCGCCCTTTTCCGCACGGGAGGTCTCCCAGCCTTCCTTGACGTCCTTGAGCTTGTCGGTCAGATCGCCGACGCTCTTCTTGATGTCTTCGAAATCATCCTTGTGCTCGTCGATGCGGGCCTTGATCTCTTCGAAGTTCTCCTTCATCTTGTCGCTCATATCAACCAT(SEQ IDNO：10)。
4.1.2主要试剂
(1)培养基
MRS培养基(1L)：参见实施例1中1.1.2的内容。
LB培养基：10g蛋白胨、5g酵母浸粉，10g氯化钠，加入1L蒸馏水搅拌均匀至溶质溶解，调pH值至7.0。在高压灭菌锅中121℃灭菌15min。配制固体培养基时需要在灭菌之前加入15g琼脂。
MRSS培养基(1L)：10g蛋白胨，10g牛肉膏，5g酵母浸粉，2g K2HPO4，2g柠檬酸二铵，5g乙酸钠，20g葡萄糖，171.15g蔗糖，0.58g MgSO4·7H2O，0.20g MnSO4·H2O，1mL吐温80，加入1L蒸馏水混合煮溶冷却至室温后，加入0.5g半胱氨酸盐酸盐，用1mol/L盐酸及1mol/LNaOH分别调pH至6.5，分装至厌氧管，10mL/管，充氮排氧后121℃灭菌15min。
(2)抗生素
壮观霉素储存液(10mg/mL)：将0.10g壮观霉素溶解于10mL超纯水中，0.22μm无菌滤膜过滤除菌，分装并保存于-20℃冰箱。
(3)RNA提取所需试剂
参见实施例3中3.1.2的内容。
(4)RNA提取所需试剂
参见实施例3中3.1.2的内容。
(5)定量PCR反应
参见实施例3中3.1.2的内容。
(6)总DNA提取试剂
溶菌酶溶液(30mg/mL)：3g溶菌酶粉末溶于100mL溶菌酶缓冲溶液(20mM tris，2mMNa2EDTA,1.2％Triton)中。
细菌基因组DNA提取试剂盒，天根生化科技有限公司，DP302。
(7)PCR反应试剂
Q5High-Fidelity 2×Master Mix(NEB，美国)，引物(上海生工生物工程有限公司合成)，DNA模板，ddH2O(天根，中国)。
(8)琼脂糖凝胶电泳试剂：
50×TAE电泳缓冲液：242g Tris碱、57.1mL冰乙酸，0.5mol/L EDTA(pH 8.0)溶解于1L去离子水中，室温保存；
1×TAE电泳缓冲液：取40mL 50×TAE电泳缓冲液，加入1960mL去离子水，混匀；
1％(w/v)琼脂糖凝胶：1.0g琼脂糖溶于100mL 1×TAE电泳缓冲液中，加热充分溶解后倒入胶槽冷却备用；
6×DNA Loading Buffer：天根生化科技有限公司RT201；
Gel Red核酸染料染液：50mL 0.1mol/L氯化钠溶液中加入15μL Gel Red核酸染料(Biotium)。
(9)PCR产物及酶切产物的回收试剂
Cycle Pure Kit D6492(OMEGA，美国)。
(10)质粒提取试剂
Plasmid mini Kit II(OMEGA，美国)。
(11)载体构建试剂
Sma I限制性内切酶(Takara，日本)，Hind III限制性内切酶(Takara，日本)，NsiI限制性内切酶(NEB，美国)Cycle Pure Kit D6492(OMEGA，美国)，DNA Ligation Kit(Takara，日本)，DNase/RNase-Free去离子水。
(12)双歧杆菌感受态细胞制备试剂
Washing Buffer:0.5mol/L蔗糖，1mmol/L柠檬酸三铵，调节pH至6.0。在高温高压灭菌锅中121℃灭菌15min。
(13)耐酸能力评价试剂
稀释液(0.85％NaCl溶液)：8.5g NaCl溶解于1L蒸馏水中，分装至试管，9mL/管，121℃灭菌15min。
4.1.3仪器与设备
所用仪器设备如下表14所示。
表14：主要仪器设备
Figure BDA0001835140840000491
Figure BDA0001835140840000501
4.2实验方法
4.2.1动物双歧杆菌A6半致死酸处理状态下总RNA的提取
按1％接种量，培养动物双歧杆菌A6至对数中期(6h，pH 5.4，OD600～0.6)，取6×10mL菌液，8000g离心10min，弃尽上清。将菌体分别重悬于等体积的pH 5.4和pH 2.5的厌氧MRS液体培养基中，37℃厌氧培养150min，前者作为对照组，后者作为半致死酸处理组，每管取1mL菌液进行总RNA的提取。
总RNA提取方法参见实施例3中3.2.3的内容。
利用核酸电泳及Nanodrop检测核酸完整度及浓度。利用ABM反转录试剂盒将RNA样本反转录成cDNA样本，-20℃冻存。
4.2.2候选基因在半致死酸处理条件下表达量的测定
取实施例2中的动物双歧杆菌特异基因集和实施例3中的酸胁迫响应基因集的交集基因作为检测对象。根据目标基因的序列，使用NCBI数据库中PRIMER BLAST在线引物设计软件设计引物。引物由上海生工生物有限公司合成(见下表15)。以各样品cDNA为模板，测定各样品中目标基因的表达量。
PCR的反应体系为20μL：SYBR Green I Real-time PCR Master Mix 10μL，cDNA模板1μL，上下游引物各1μL，DNAse/RNAse-free去离子水7μL。
PCR程序：95℃预变性30s，95℃变性10s，引物Tm值温度退火30s，40个循环。以16srRNA基因作为内参基因。每个目标基因三个生物学重复。
表15：候选基因定量PCR引物
Figure BDA0001835140840000511
Figure BDA0001835140840000521
4.2.3动物双歧杆菌特异耐酸基因的PCR扩增
筛选得到动物双歧杆菌特异耐酸基因后，从NCBI数据库中下载其基因序列(动物双歧杆菌A6全基因组序列GeneBank登录号：NZ_CP010433.1)。
根据pDP152质粒中的酶切位点及过表达目的基因的序列确定使用酶切位点。利用5Primer Premier 5.0软件进行PCR引物的设计，由上海生工生物工程股份有限公司合成(见下表16)。
表16：动物双歧杆菌耐酸特异基因PCR扩增引物
Figure BDA0001835140840000522
Figure BDA0001835140840000531
Figure BDA0001835140840000541
PCR反应体系为50μL：Q5High-Fidelity 2×Master Mix 25μL，动物双歧杆菌A6基因组DNA 2.5μL，上游引物(10μmol/L)1.25μL，下游引物(10μmol/L)1.25μL，DNAse/RNAse-free H2O 20μL。
PCR反应程序：95℃预变性5min，95℃变性30s，引物退火温度退火30s，72℃延伸60s，35个循环，72℃延伸10min，4℃保存。
PCR产物检测：取3μL PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳检测(琼脂糖浓度1％)。
4.2.4PCR产物的回收与纯化
参照Cycle Pure Kit D6492(OMEGA，美国)说明书对PCR产物进行纯化。利用Nanodrop测定纯化后PCR产物浓度，-20℃冻存。
4.2.5质粒pDP152的提取
按1％接种量将携带有pDP152质粒的大肠杆菌DH5α接种于LB培养基中(加入壮观霉素储存液，使其终浓度为50μg/mL)，37℃振荡培养12h，150rpm；取10mL培养液，6000g离心10min，弃尽上清。参照Plasmid mini Kit II(OMEGA，美国)说明书进行质粒的提取。利用Nanodrop对最终质粒提取液进行定量。
4.2.6表达载体的构建
使用酶切连接的方法构建目标基因的过表达载体。首先对各基因PCR产物及pDP152质粒进行酶切。其中BAA6_RS02390、02980、3885、5205、6440、6240、0480、6445基因使用的是不相邻的酶切位点，酶切时使用双酶切体系。BAA6_RS06435、02185使用的是相邻的酶切位点，酶切时使用单酶切体系。先进行Nsi I酶切，酶切后回收酶切产物。对回收产物进行Hind III酶切。各酶切体系参照限制性内切酶说明书。将酶切体系置于37℃金属浴中反应1h，利用Cycle Pure Kit D6492(OMEGA，美国)对酶切体系进行酶切产物回收，使用Nanodrop测定酶切回收产物的浓度。
根据目的基因片段酶切产物回收浓度及pDP152质粒酶切产物回收浓度计算连接体系中基因片段及质粒的加入量。连接体系为10μL：DNA Ligation Mix 5μL，基因片段：质粒(摩尔数)＝5:1，剩余体积用DNAse/RNAse-free H2O补足，12℃连接4h。连接体系用于后续大肠杆菌DH5α的转化。
4.2.7重组载体转化大肠杆菌DH5α
取-80℃冰箱中冻存的大肠杆菌DH5α感受态细胞置于冰上，待其融化。向感受态细胞中加入10μL连接体系，轻弹混匀，在冰浴中静置30min。将离心管置于42℃金属浴中放置60-90s，然后快速将管转移到冰浴中，使细胞冷却2-3min，该过程不要摇动离心管。向每个离心管中加入900μL无菌的LB培养基(未加入抗生素)，混匀后置于37℃摇床振荡培养45min(150rpm)。将离心管内容物混匀，吸取100μL已转化的感受态细胞加到含有50μg/mL壮观霉素的固体LB培养基上，用涂布棒将细胞均匀的涂开，37℃培养16h。
4.2.8大肠杆菌阳性克隆的鉴定
待转化大肠杆菌DH5α有菌落长出后，挑取菌落进行菌落PCR验证重组质粒是否进入大肠杆菌DH5α中。吸取10μL无菌水于无菌的PCR管中，挑取LB平板上的菌落将菌落重悬于无菌水中。2μL菌悬液用于菌落PCR，8μL菌悬液用于接种。菌落PCR体系为20μL：2×PCRMaster Mix 10μL，上下游引物1μL，菌悬液2μL，无菌水6μL。
上游引物序列152F(5′-3′)：ATATGCCGAGTCCCACACGATTTCT(SEQ ID NO：101)；下游引物序列152R(5′-3′)：TCCTGCACGAAAAGCCGCTGGACGG(SEQ ID NO：102)。
菌落PCR的反应程序：95℃预变性10min，95℃变性30s，52℃退火30s，72℃延伸60s，35个循环，72℃延伸10min，4℃保存。
菌落PCR产物检测：取3μL菌落PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳检测(琼脂糖浓度1％)。
将菌落PCR结果呈阳性的菌悬液接种至含有50μg/mL壮观霉素的LB液体培养基中，37℃，150rpm摇床振荡培养12h，用于后续重组质粒的提取。
4.2.9重组质粒的提取及测序
取10mL过夜培养的菌落PCR阳性大肠杆菌菌液，6000g离心10min，弃尽上清。参照Plasmid mini Kit II(OMEGA，美国)说明书进行质粒的提取。用Nanodrop对最终质粒提取液进行定量。并送样至上海生工生物有限公司进行测序。测序引物与菌落PCR引物相同，均为152F、152R引物。
4.2.10动物双歧杆菌A6感受态细胞的制备
将过夜培养的动物双歧杆菌A6以1％(v/v)接种于50mL MRSS培养基中，置于37℃培养至OD600达到0.4。将菌液转移至无菌的50mL离心管中，4℃，8000g离心5min收集菌体，弃尽上清。加入10mL 4℃预冷的Washing Buffer洗涤菌体，4℃，8000g离心5min收集菌体。重复洗涤一次。加入200μL 4℃预冷的Washing Buffer重悬菌体，分装成80μL/管，液氮速冻后置于-80℃冰箱中保存。
4.2.11重组载体电击转化动物双歧杆菌A6
将冻存感受态细胞从-80℃冰箱中取出，置于冰上融化。加入1μg的重组质粒，混匀，冰上放置5min。将质粒与感受态细胞混合物加入到4℃预冷的1mm电击杯中进行电击，电击参数为：1.75kV，25μF，200Ω。用1mL注射器将电击后质粒与感受态细胞的混合物注射到含有2mL MRSS-2的厌氧管中，37℃培养3-4h，进行复苏。将复苏后的培养液稀释10倍，涂布于含有200μg/mL壮观霉素的MRS平板上，倒置于厌氧盒中，放入厌氧袋，37℃培养36-48h，挑取单菌落接种于含有200μg/mL壮观霉素的MRS培养基中过夜培养。
4.2.12电击转化动物双歧杆菌A6阳性菌的PCR验证
待重组载体转化后的菌落长出后，挑取菌落接种于含有200μg/mL壮观霉素的MRS培养基中过夜培养。吸取1mL菌液进行菌液PCR验证。将1mL菌液12000g离心2min，弃尽上清，加入100μL无菌水，超声30min。12000g离心2min，取上清，稀释5倍，以稀释后的上清作为PCR模板进行PCR反应。
PCR体系为20μL：2×PCR Master Mix 10μL，上游引物152F 1μL，下游引物152R 1μL，稀释后上清液1μL，ddH2O 7μL。
PCR程序：95℃预变性3min，95℃变性30s，52℃退火30s，72℃延伸60s，35个循环，72℃延伸10min，4℃保存。
PCR产物检测：取3μL PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳检测(琼脂糖浓度1％)。
PCR检测结果为阳性的菌株可用于后续试验。
4.2.13重组菌株中目的基因表达量的检测
利用定量PCR的方法检测过表达重组菌株及空载对照菌株中响应基因的表达量以确定目的基因是否在动物双歧杆菌A6中成功过表达。将各菌株按1％的接种量接种于含有200μg/mL壮观霉素的液体厌氧MRS培养基中，收集对数中期菌体。按实施例3中3.2.3中描述的方法进行RNA提取、利用ABM反转录试剂盒将RNA样本反转录成cDNA样本，-20℃冻存。
以cDNA样本为模板，测定各菌株中响应基因的表达量。各基因的定量PCR引物如下表17所示：
表17：过表达基因表达量检测引物
Figure BDA0001835140840000561
Figure BDA0001835140840000571
PCR的反应体系为20μL：SYBR Green I Real-time PCR Master Mix 10μL，cDNA模板1μL，上游引物1μL，下游引物1μL，DNAse/RNAse-free去离子水7μL。
PCR程序：95℃预变性30s，95℃变性10s，引物退火温度退火30s，40个循环。以16srRNA基因作为内参基因计算各重组菌株相对于空载对照菌株的相对表达量。
4.2.14重组菌株耐酸能力的评价
将空载对照菌株A6-K和各重组菌株1％接种量接种于200μg/mL壮观霉素的液体厌氧MRS培养基中，培养至对数中期。取1mL进行梯度稀释，采用倾注法进行平板计数，作为酸处理前活菌数。剩余9mL培养液6000g离心10min，弃尽上清，将菌体重悬于等体积的pH 2.5的厌氧MRS培养基中，37℃静置4h。酸处理结束后，取1mL菌液进行梯度稀释，进行平板计数，作为酸处理后活菌数。平板置于厌氧盒中37℃培养36-48h。存活率＝酸处理后活菌数/酸处理前活菌数×100％。
4.3结果与分析
4.3.1候选基因在半致死酸处理条件下的表达量
根据动物双歧杆菌的强耐酸性具有种属特异性这一特点，以及动物双歧杆菌在酸性环境中转录组的变化，发明人推断动物双歧杆菌特有基因集与酸胁迫响应基因集的交集基因可能在动物双歧杆菌的耐酸中发挥重要作用。如下表18所示，这两个基因集的交集共有24个基因。其中12个基因具有明确的编码产物，12个基因编码未知蛋白。
表18：动物双歧杆菌特有基因集与耐酸响应基因集的交集基因
Figure BDA0001835140840000572
Figure BDA0001835140840000581
为了进一步缩小关键耐酸基因的范围，发明人测定了这些基因在半致死酸处理条件下(pH 2.5处理150min)的表达量。有文献中提到在胁迫响应的前期以及胁迫响应的后期中都上调表达的基因可能在胁迫响应中发挥比较重要的作用。检测结果如图14所示，在24个候选基因当中，有10个基因在半致死酸处理条件下仍能保持2倍以上的上调表达，分别为BAA6_RS00480(14.93±0.37倍)、BAA6_RS02185(2.38±0.34倍)、BAA6_RS02390(3.34±0.25倍)、BAA6_RS02980(4.53±0.40倍)、BAA6_RS03885(2.99±0.31倍)、BAA6_RS05205(2.04±0.44倍)、BAA6_RS06240(2.27±0.24倍)、BAA6_RS06435(2.45±0.44倍)、BAA6_RS06440(2.20±0.24倍)、BAA6_RS06445(2.30±0.05倍)。这些基因既是动物双歧杆菌的特有基因，又同时在耐酸响应的初期(pH 2.5处理30min，不致死酸处理条件)和耐酸响应的后期(pH 2.5处理150min，半致死酸处理条件)上调变化2倍以上。将这些基因作为动物双歧杆菌的特异耐酸基因进行后续的过表达验证。
4.3.2过表达载体的构建及测序验证
为了验证关键基因在耐酸应答中的作用，以pDP152质粒为基础构建过表达载体。pDP152为大肠杆菌-双歧杆菌穿梭载体，携带有壮观霉素抗性。该质粒是在pDP870的基础上增加了一个来自于长双歧杆菌蔗糖酶的启动子而得来的。该质粒上携带有Sma I、Xho I、Nsi I、Hind III等酶切位点。通过对目的基因序列中所含酶切位点序列的分析确定各基因所使用限制性内切酶(见上表16)。根据所用酶切位点及目的基因序列设计扩增引物进行目的基因扩增。经酶切连接等步骤后转化大肠杆菌DH5α。挑取菌落进行菌落PCR验证。各基因长度分别为BAA6_RS02390(396bp)，BAA6_RS02980(1284bp)，BAA6_RS03885(306bp)，BAA6_RS05205(381bp)，BAA6_RS06440(291bp)，BAA6_RS06240(492bp)，BAA6_RS00480(249bp)，BAA6_RS06435(771bp)，BAA6_RS02185(1356bp)，BAA6_RS06445(213bp)。测序引物152F和152R分别位于质粒多克隆位点位点的上下游200bp。因此，用152F和152R对于各重组质粒进行PCR时，其产物大小应该在原基因长度的基础上加400bp左右。大肠杆菌菌落PCR电泳结果如图15所示，各载体PCR产物片段大小与预期一致，说明重组载体连接成功并转化进入大肠杆菌中。
将阳性菌株接种于含有壮观霉素的LB培养基中，提取质粒后进行3730测序。测序结果如图16所示，测序结果的上下游200bp与质粒序列相似度100％，中间部分序列与目的基因序列相似度100％，说明各基因过表达载体构建成功，可用于下一步的转化实验。
4.3.3电击转化动物双歧杆菌A6的菌液PCR验证
将测序正确的重组质粒电击转化进入动物双歧杆菌A6中。利用质粒携带的壮观霉素抗性对阳性菌株进行筛选。挑取平板上的菌落进行培养后进行菌液PCR的验证。若含有对应质粒，则在菌液PCR中即可扩增出相应的片段。PCR结果如图17所示，各重组动物双歧杆菌均能扩增出对应大小片段，说明重组质粒成功转入动物双歧杆菌A6中。
4.3.4过表达基因在重组菌株中表达量的检测
通过荧光定量PCR的方法检测各过表达基因在动物双歧杆菌A6菌株中的过表达情况。以空载菌株为对照，计算各重组菌株中过表达基因的相对表达量。试验结果如图18所示，A6-2390中BAA6_RS02390基因的表达量是空载对照菌株中的3.20±0.50倍，A6-2980中BAA6_RS02980基因的表达量是空载对照菌株中的3.17±0.28倍，A6-3885中BAA6_RS03885基因的表达量是空载对照菌株中的3.23±0.17倍，A6-5205中BAA6_RS05205基因的表达量是空载对照菌株中的2.80±0.37倍，A6-6440中BAA6_RS06440基因的表达量是空载对照菌株中的2.45±0.33倍，A6-6240中BAA6_RS06240基因的表达量是空载对照菌株中的3.05±0.08倍，A6-480中BAA6_RS00480基因的表达量是空载对照菌株中的2.85±0.06倍，A6-6435中BAA6_RS06435基因的表达量是空载对照菌株中的2.75±0.05倍，A6-2185中BAA6_RS02185基因的表达量是空载对照菌株中的3.32±0.27倍，A6-6445中BAA6_RS6445基因的表达量是空载对照菌株中的2.65±0.06倍。从表达量的检测结果可以看到所有重组菌株中目标基因的表达量与对照菌株相比都提高了2.45±0.33至3.32±0.27倍。这说明目的基因在重组菌株中成功过表达。
4.3.5过表达重组菌株耐酸能力的测定
将各基因的过表达菌株重悬于动物双歧杆菌A6的致死酸处理环境中，即pH 2.5处理4小时。通过检测过表达菌株与空载对照菌株在耐酸能力上表现出的差异来判断过表达菌株是否在动物双歧杆菌的耐酸应答中发挥作用。各菌株在经过酸处理后存活率的结果如图19所示，携带有空载质粒的动物双歧杆菌A6-K的存活率为1.34％。A6-2390的存活率为5.37±1.09％，A6-2980的存活率为4.12±2.55％，A6-3885的存活率为12.89±0.20％，A6-5205的存活率为15.11±3.36％，A6-6440的存活率为5.15±0.84％，A6-6240的存活率为12.84±0.50％，A6-480的存活率为30.06±3.89％，A6-6435的存活率为3.97±4.27％，A6-2185的存活率为1.80±0.26％，A6-6445的存活率为1.05±1.34％。与空载菌株相比，A6-3885、A6-5205、A6-6240、A6-480的存活率出现了显著的提高，分别提高了9.62倍，11.28倍，9.58倍，22.43倍。
4.4结果与分析
由实施例1的试验可知动物双歧杆菌A6具有非常强的耐酸性，而且这种耐酸性存在种属特异性。动物双歧杆菌这一种属的菌株在pH 2.5的环境中2h内可保持活菌数对数值没有显著下降，而其他双歧杆菌菌体全部死亡。动物双歧杆菌与其他双歧杆菌之间在耐酸性能上存在非常显著的差异。在实施例2中通过比较基因组的手段发明人分析了动物双歧杆菌中的特有基因，在这部分基因中可能存在在动物双歧杆菌耐酸中发挥重要作用的基因。在实施例3的研究中发明人通过RNA-seq转录组测序技术确定了动物双歧杆菌A6在酸性环境中发生差异表达的基因，以确定动物双歧杆菌中响应酸胁迫环境的基因。发明人推断同时出现在动物双歧杆菌特有基因集和动物双歧杆菌耐酸响应基因集中的基因可能在动物双歧杆菌的耐酸机制中发挥重要作用。在动物双歧杆菌的特有基因及动物双歧杆菌的耐酸响应基因的交集中有24个基因。为了进一步缩小关键基因的范围，检测了这些基因在半致死酸处理条件下的表达量。一般认为在胁迫环境前期及后期都能够上调表达的基因可能发挥比较重要的作用。在24个候选基因中，有10个基因在半致死酸处理条件下的表达量出现了2倍以上的上调。其中BAA6_RS00480上调的倍数最高，达到了14.93倍。选取这10个基因进行过表达验证。
基因的过表达是验证基因功能的重要手段。经过构建过表达载体，电击转化动物双歧杆菌A6实现了各基因在A6中的过表达。通过测定重组菌株在致死酸环境下的存活率来评价响应基因是否在耐酸应答过程中发挥作用。结果表明，BAA6_RS03885、BAA6_RS05205、BAA6_RS06240、BAA6_RS00480重组菌株的存活率显著高于对照菌株。其中，BAA6_RS00480重组菌株存活率提高最为显著，达到了22.43倍。这说明这四个基因在动物双歧杆菌的耐酸中发挥重要作用。
BAA6_RS03885、BAA6_RS05205、BAA6_RS06240、BAA6_RS00480编码的蛋白分别是未知蛋白、未知蛋白、膜蛋白、GlsB/YeaQ/YmgE家族胁迫响应膜蛋白。从编码信息可以看到这四个基因的功能都还不明确。只有GlsB/YeaQ/YmgE家族胁迫响应膜蛋白略有研究。该蛋白共含有82个氨基酸，包含3个跨膜区域，分别为6位氨基酸-24位氨基酸、36位氨基酸-54位氨基酸、60位氨基酸-81位氨基酸。在粪肠球菌(Enterococcus faecalis)中敲除该基因时，菌株会出现耐胆盐能力的下降。这说明该基因参与了粪肠球菌的胆盐胁迫应答。这也从侧面支持了本研究中该基因在耐酸应答当中发挥作用的结论。然而，该蛋白的生理功能还未见报道，其参与耐酸应答的具体机制还有待进一步的研究。
4.5结论
(1)成功构建了10个目的基因的过表达载体，这些过表达载体可以实现目的基因在动物双歧杆菌A6中的过表达。
(2)BAA6_RS03885、BAA6_RS05205、BAA6_RS06240、BAA6_RS00480在动物双歧杆菌A6中的过表达可以显著提高其在致死酸处理条件下的存活率，这说明这些基因在动物双歧杆菌A6的耐酸应答中发挥重要作用。
在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不必须针对的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。此外，在不相互矛盾的情况下，本领域的技术人员可以将本说明书中描述的不同实施例或示例以及不同实施例或示例的特征进行结合和组合。
尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例性的，不能理解为对本发明的限制，本领域的普通技术人员在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型。
SEQUENCE LISTING
<110> 中国农业大学
<120> 动物双歧杆菌A6耐酸应答机制研究
<130> PIDC3182642
<160> 102
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 396
<212> DNA
<213> Bifidobacterium animalis
<400> 1
atggcagaag acaagaccag tgatgagctg accgaacgcg acatcgagga tctcaacgat 60
ccagacgaca atccggatgt ggctgatgcg gatgcaacgg aacataatct gcggcgtgcg 120
gtgatcatct gcttcatcgt gacgagcgtg atgtgcctgt gcatcaatat cgtggtgctt 180
ctgatgctgc agcgcaaggg caaactcgac aaggcggccg ccaatctcga cgagttcaag 240
gagaacatgc agcatctggc cagcgacaag agccgccaga tcgcccggaa caaggacgtg 300
cgcaaggcaa tggacacgat ttcgcagcat attcgcgaga ttccaagcga ggcgcagagc 360
gcggtgaccc gcgtacgcga ttccctcgca aagtag 396
<210> 2
<211> 1283
<212> DNA
<213> Bifidobacterium animalis
<400> 2
atgaaggtgc tttgcgctca cggcgtcgca ttcgtgcgtg cctatgatgg cgtcatggca 60
tacgacaatg gcaatgtgat cgacgtgcgg gcgaacacga cgctgagcac ggagaatgcg 120
atcaaaggca acgtacttgt attgggcaac tcgggtgtgg gcaagtcgac gttgatcaac 180
gcggtgatag gggacactgt ggccaaaacg agcttcggca cgcggggcac caccagtgag 240
ctcgccgtct atgagagccc aacggtgccg ttccgggtca tcgattcaat agggttcgaa 300
ccgtctccca tcaaaagcct cagagcggtg catgcggtgc gcaaatggtc gaaggcgagc 360
gccaaggaag gtcatgagca caacaagatc gacgtgatct ggttctgcgt ggacgggaca 420
gcggcaaagc tgttcccgga gacaatacgg aatctgtcca cggccgtgtc gatgtggcgg 480
tcggtgccga tcatcaccgt gatcacgaaa tcgtattcga aaccggaccg cgagctgaat 540
gtgcagatgg tgcggcaggc gttcgcgggg cagcggatgg agaggaacct gcgcgcgatc 600
atacctgtgg tggcgcagac ctatgtgatc gacgaaaccg cgttcgccgg ccccgaggga 660
atctccgatc tcatagacga gacgatgaag gcgatgccgg aggggatgcg cggtggctcg 720
catgatctca tggcgttcaa actcacccgc aaacgagtgc cgcgcaaggt ctgatcggcg 780
cttgtgtggc ggcgggtgcc acagtgggcg ccgtgccgat tccaatcgcc gactccttgg 840
tgctctcccc gctggaactg ggcgagttgc atggcctggc gcgactgtat ggcatagaca 900
aggatgaagg gtcgaagcag ttcctggatt ccatcgtgca ggtgggcacg gcaagcgtgg 960
tggcgcattc cgcaatcagc gcggtgaaat cgattccggg cgtcaacatc gcggccagtg 1020
tgctcaatgc gattgtggcg gcgagcatca tcgccgcact cggtgagggt gccgtcatag 1080
ccttcgagca ggtgtacagc ggcaagcgca gcgtgaacga cgtcacctgg gtgcagaatc 1140
tgatgcagga gcagttcggc gaagggttcc tcggcaaggt gagcggtgtg gcgcaggcgt 1200
cggccaaggc cggcgatgcg aaggacatgc gtgagatgat cgtggaattg gtcaaggccg 1260
cgttcatgaa tcggggggag taa 1283
<210> 3
<211> 306
<212> DNA
<213> Bifidobacterium animalis
<400> 3
tcagccgagc tgggttccga agcgctcgtt gagctccacc tgatcctcgg tggccttggc 60
ttccttggcg gctgccttgc cttcggcctt gtccttcttg tcatcggcct tgtcggtgat 120
cttctcgagc ttggcatccg ggtcgtcagc ggccttgacg atcttctcgt cctccttggc 180
aatcaccttg gcagcatggt cctcggcacg ctcggcgcgc ttttcgtcac gctccgcctt 240
gtgctcctcg tgcttctcct ccatgcgatc cttgaattcc tcgaaatgtt ccttgatgtc 300
tgccat 306
<210> 4
<211> 380
<212> DNA
<213> Bifidobacterium animalis
<400> 4
atggaatggg cagcatgcat gcatacggct tgcataaatg atttctatga tgagagcaac 60
agcaaaagaa aggtcaacac catgactacc acaacgaaca atatggattc gaacaacatg 120
aacaacggca cggctaacgg aggttccacg ccgggcgcct ccagcgacgg cgacctcgac 180
ttccagggca aggccgacgc gccgagaagg gcgagaaggg atgcggctgc aactgcagcg 240
cgaagcagac cgagagccgc gaacagccga aatcgaacga ggttcgccag cctgcagagc 300
cgagcaatcc gttcccgcag tccgaagccc ccagcggtga cggcacgggt atcaaggccg 360
gcggcgggca ggccgagtga 380
<210> 5
<211> 291
<212> DNA
<213> Bifidobacterium animalis
<400> 5
tcacttgtct tcgagatacg ggtcttccca ctggttttcg ttgtcggtct cctcggggcg 60
gtcgattgcg agctcctcgc gttgcgccgc atcctgcttg gcttccttgg aggcatcgct 120
cacacccacc tcgttttccg gaatgtcctc attcggcttg ccggtgatcg ggtcggtgta 180
cggatggtca gtgtcgctga caatctgctc catctgcttg acctgatcgg cgctcaccgc 240
gccaaggcct tcgtgtgtgt tggtgtctgg aatgttctgt tgctctgcca t 291
<210> 6
<211> 492
<212> DNA
<213> Bifidobacterium animalis
<400> 6
atgaccagta ttttcgaaag cgtttccaac caactctcct cactgccgca tctgatcccc 60
tcctttgtgc gcaaaccgaa cgagaacgat gagcggattg acgacctgga gaatcagatc 120
gcgcgtctcg accgcgaatc caaatggtgc gatgtcgaac tcgaccgccg aatcaaagag 180
ctcactgccg aggtcgactc attgaagcgc acgcagcatc atgaccgttc gctgcgcacg 240
gcggaccgtg tgctcgcaat cgtgttcatg tcgcttgccg cgctgattct cgtgccgatg 300
ttcctcaccc tgttccatgt gatcgaccca tccggcgaga cgatccgctg ggtggtcttc 360
gcgctcttcg ccgtcgcagg tggcatgggt gtggcgatca ccattgcaca tggcaagctg 420
ccgcgcacac gcgactcgct cattgtattc gtctgtgcgg cattgctgtt gctggttgcc 480
tgcctgctct ag 492
<210> 7
<211> 249
<212> DNA
<213> Bifidobacterium animalis
<400> 7
ctatgcgcga accttcatga cgatgaagct gacgatggcg accacaatga ccgcgccgag 60
gacggacggt acgaccgcca tgcccccgag cgacggcccc caggagccga agagtccctg 120
accaagcgcc gaaccggcca atcctgccag aatgttgctg atccagccca tcgaatgccc 180
gttgttggta atcgcacctg cgatcgctcc gatgactgcg cctacaataa gtgtccaaat 240
ccaaaacat 249
<210> 8
<211> 771
<212> DNA
<213> Bifidobacterium animalis
<400> 8
tcagttactt gcgtcatcgg tgaggtagaa atcgcgcagt gcacgcaggt cggcctcact 60
gagcccaatc gccgtacgca ggtagccgac ggggccgccg aacgatgcag tggcgtcgat 120
atacgtctgg aaatagagcg gcgaggcgac gaggaactcg tcgatgtccg catgggcctt 180
ggggccgagc agtgcttcga aggtgtcgac gaacgccggc atttccgtgg acatgtagag 240
gttggtctgc aggtaatcgt cgcggatcac gtcttcaggc acttccagcg cggccagaat 300
gagtgccgcc gcgatgccgg tgcgatcctt gccctgtgtg cagtggaaca ggtagccgcc 360
cggctcgtcg atgagcaggc ggaacatccg cttccagcac gcgaccgcgg cgtcgtcgag 420
cacgaggcgc gggtagaggt cctcgatgaa cgtgcccggg cgggtgacga tgtcgcgcag 480
ctgcaaacgc agcgccttcg tctcgcggaa cgtgggcagt gcgtagaacg accaatcctc 540
gagcaagcgg tctggcttca ggtcgcgttc gggatcggtg cgcaaatcga tgacgttcga 600
gatgccccta tgcgccagcg tctccaggtc gtcatggcgc gcatcgtgca ggttcgccga 660
gcgcaccagc agtcccgggc gcaccatgcg cccttgctcc gtgtggatgc cgcccagatc 720
gcggcagttc tccacggtgg gcaacggcag tttgcgtgac actacgcgca t 771
<210> 9
<211> 1356
<212> DNA
<213> Bifidobacterium animalis
<400> 9
atggcattga ccagcgaaca gcaacagatc gtggacaagg ccacgctcac gaggatcaac 60
ggatggcagt acctgaccgt tgagggaagc ccgtacgaga tcggcttcga gcacggctac 120
ctgctcaccg acgagtttaa ggacgccatt cgcgtctaca cgcatatgac gctcgagacg 180
cttggcatgg attactcgtt cttcgtcgat caggcggtca aactgcacaa ggacaagatt 240
ccacaggaat acatcgagga gatgcagggc atggccgacg gcttcaccgc cggcggcttc 300
gagaccagcc tggacgacgt catcggctgg aacgactgga tggaactcac cgggtactgg 360
tggccgcagg tcgccgccga gtattcgaac aacccgccgg acggccccaa gggatcgcac 420
tgctcgggct tcgtggccac cggcagtgcc acgaaggacg gcaagccggt catagcccac 480
gagagcttcg acgacttctg gagcggtcag tacttcaacg tgtgcgagag cgtgaagccc 540
gcccacggca acagcttcaa gatgcagacg gtgcccggct acatcgattc gatgaccgac 600
ttctatgtga cttcggccgg tctggccatc accgagacga cgatcgccgg attcgtcggc 660
tacgacgtgg acggcatccc cgaattcgtc cgcgcccgca aggcgaccca gtacgcgaac 720
agcatcgacg aatgggtcac gatcgtcaac gagggcaaca acggcggcta cgccaacatc 780
tggctgctcg ccgacgccaa cacgaacgag atcgcccgct acgagcaggg cctcaagcac 840
caggagctgc tgcgcacgaa ggacggctcg ttctatgggt gcaacgcctg ccacaatccg 900
cgcattcgca acctcgaatg cgtcgacaac ggctacaacg acacccgcca gcagaccggc 960
gcccgccgcg cacgcttcga acagctgctg ccgcagctgc acggcaccat cgacgacgat 1020
gtggccaaac gaatccttgc cgacaagttc gacccatatc tgggttatgt caacgcaagc 1080
tcgcgcaaca tctgcgcaca ctacgacgtt gacccccagt actatgcgga cgatccgcac 1140
ggtgtgtgga acgtgccgtt cttcccgggc ggttcctgcg acggcaagtg cgccaacggc 1200
gacgacatca aggccctgca catgtggggc atcttcggcc gcgccgatgg cgagccgttc 1260
gacgccgacg aattcatgag gcagcacccg caatggagct ggcagaaggg gtatctgtac 1320
gaccgcccca gccagccctg gacgttgttc gactga 1356
<210> 10
<211> 213
<212> DNA
<213> Bifidobacterium animalis
<400> 10
tcagtgggtc tggtgggtct cttcgtgctc ggcgacttcc ttcttgtcgc ccttttccgc 60
acgggaggtc tcccagcctt ccttgacgtc cttgagcttg tcggtcagat cgccgacgct 120
cttcttgatg tcttcgaaat catccttgtg ctcgtcgatg cgggccttga tctcttcgaa 180
gttctccttc atcttgtcgc tcatatcaac cat 213
<210> 11
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> sythetic nucleotide
<400> 11
agagtttgat cctggctcag 20
<210> 12
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> sythetic nucleotide
<400> 12
ggttaccttg ttacgactt 19
<210> 13
<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> sythetic nucleotide
<400> 13
cgccattggt gttcttcc 18
<210> 14
<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic nucleotide
<400> 14
cctattgcga gcgtggga 18
<210> 15
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic nucleotide
<400> 15
cgcaatcagg ccactgccca 20
<210> 16
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic nucleotide
<400> 16
cgcgtcatca cacggccctt 20
<210> 17
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic nucleotide
<400> 17
gcgttcctgc cggagctgtt 20
<210> 18
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic nucleotide
<400> 18
tcagcaccgc aacgaggcag 20
<210> 19
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic nucleotide
<400> 19
gtcctaccgc gtcaagcccg 20
<210> 20
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic nucleotide
<400> 20
agtggccttc agggacggca 20
<210> 21
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic nucleotide
<400> 21
ccgacccctg gcgtggacta 20
<210> 22
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic nucleotide
<400> 22
agctgcacca cgatggacgc 20
<210> 23
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic nucleotide
<400> 23
ggtgagggtt tcggcctcgc 20
<210> 24
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic nucleotide
<400> 24
gcgaggacgc cgtcatggag 20
<210> 25
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic nucleotide
<400> 25
cgatgcgggc acgatcgaca 20
<210> 26
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic nucleotide
<400> 26
gccgtgccac cgacatcgaa 20
<210> 27
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic nucleotide
<400> 27
actacgtgcg cctgttgggc 20
<210> 28
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic nucleotide
<400> 28
gcgccgtaca cgaaacccca 20
<210> 29
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic nucleotide
<400> 29
ggccttggcc acttcctcgg 20
<210> 30
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic nucleotide
<400> 30
gttgactccg gcgcgttcca 20
<210> 31
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic nucleotide
<400> 31
caagcaggcc atccccaccg 20
<210> 32
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic nucleotide
<400> 32
gaggtcctga ccggaggcgt 20
<210> 33
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic nucleotide
<400> 33
gcacattgca acgcgacccc 20
<210> 34
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic nucleotide
<400> 34
atggccagca cggccacatc 20
<210> 35
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic nucleotide
<400> 35
cggtgtacaa caacaagccg 20
<210> 36
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic nucleotide
<400> 36
tagtagaacg acgcgagcac 20
<210> 37
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic nucleotide
<400> 37
gatgaagctg acgatggcga 20
<210> 38
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic nucleotide
<400> 38
gtgcgattac caacaacggg 20
<210> 39
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic nucleotide
<400> 39
cgtattcggc gttccaggta 20
<210> 40
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic nucleotide
<400> 40
ccgacagtca ggatgaccac 20
<210> 41
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic nucleotide
<400> 41
ccggaacccg agaagaagtc 20
<210> 42
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic nucleotide
<400> 42
gcgctgagat ggagacctac 20
<210> 43
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic nucleotide
<400> 43
aacatctgcg cacactacga 20
<210> 44
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic nucleotide
<400> 44
tcagtcgaac aacgtccagg 20
<210> 45
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic nucleotide
<400> 45
cgaacttctc aacgccgaac 20
<210> 46
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic nucleotide
<400> 46
agaaggacat ggatcgtgcc 20
<210> 47
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic nucleotide
<400> 47
cttgtcgagt ttgcccttgc 20
<210> 48
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic nucleotide
<400> 48
gaacgcgaca tcgaggatct 20
<210> 49
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic nucleotide
<400> 49
caaactcacc cgcaaacgag 20
<210> 50
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic nucleotide
<400> 50
ggaactgctt cgacccttca 20
<210> 51
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic nucleotide
<400> 51
gttcatcgat gtgaacggcg 20
<210> 52
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic nucleotide
<400> 52
cgcaaacaag gactccaacg 20
<210> 53
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic nucleotide
<400> 53
accgttcgat cttgaccacc 20
<210> 54
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic nucleotide
<400> 54
accggcgaca taggttttgt 20
<210> 55
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic nucleotide
<400> 55
tcgtcctcct tggcaatcac 20
<210> 56
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic nucleotide
<400> 56
gatcgcatgg aggagaagca 20
<210> 57
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic nucleotide
<400> 57
acaacatgaa caacggcacg 20
<210> 58
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic nucleotide
<400> 58
aacctcgttc gatttcggct 20
<210> 59
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic nucleotide
<400> 59
ttgacgaagt tcacggcgta 20
<210> 60
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic nucleotide
<400> 60
gatgttctcg gtgggcaaga 20
<210> 61
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic nucleotide
<400> 61
cacgcttgac gacacgattc 20
<210> 62
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic nucleotide
<400> 62
tgtcggggaa caaaccgtag 20
<210> 63
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic nucleotide
<400> 63
ttcgcgggca tcgatatgaa 20
<210> 64
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic nucleotide
<400> 64
ccgagccagc agaataccaa 20
<210> 65
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic nucleotide
<400> 65
ttcgcgggca tcgatatgaa 20
<210> 66
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic nucleotide
<400> 66
ccgagccagc agaataccaa 20
<210> 67
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic nucleotide
<400> 67
gaccgcgaat ccaaatggtg 20
<210> 68
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic nucleotide
<400> 68
gaggaacatc ggcacgagaa 20
<210> 69
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic nucleotide
<400> 69
gtctggaaat agagcggcga 20
<210> 70
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic nucleotide
<400> 70
tgatccgcga cgattacctg 20
<210> 71
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic nucleotide
<400> 71
atacgggtct tcccactggt 20
<210> 72
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic nucleotide
<400> 72
ctgaccatcc gtacaccgac 20
<210> 73
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic nucleotide
<400> 73
ctcggcgact tccttcttgt 20
<210> 74
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic nucleotide
<400> 74
gaagagatca aggcccgcat 20
<210> 75
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic nucleotide
<400> 75
tcaacagcca cggtgagttt 20
<210> 76
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic nucleotide
<400> 76
gaacatcgtt tcgtcggagc 20
<210> 77
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic nucleotide
<400> 77
ccggatctca acgaggatgg 20
<210> 78
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic nucleotide
<400> 78
ctggtaatcc ggcgcatagt 20
<210> 79
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic nucleotide
<400> 79
catcacaccc tgccaatcct 20
<210> 80
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic nucleotide
<400> 80
aacgaaccct acggcaacaa 20
<210> 81
<211> 27
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic nucleotide
<400> 81
tcccccggga tggcagaaga caagacc 27
<210> 82
<211> 26
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic nucleotide
<400> 82
cccaagcttc tactttgcga gggaat 26
<210> 83
<211> 27
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic nucleotide
<400> 83
tcccccggga tgaaggtgct ttgcgct 27
<210> 84
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic nucleotide
<400> 84
cccaagcttt tactcccccc g 21
<210> 85
<211> 28
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic nucleotide
<400> 85
tcccccggga tggcagacat caaggaac 28
<210> 86
<211> 27
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic nucleotide
<400> 86
cccaagcttt cagccgagct gggttcc 27
<210> 87
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic nucleotide
<400> 87
tcccccggga tggaatgggc agca 24
<210> 88
<211> 27
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic nucleotide
<400> 88
cccaagcttt cactcggcct gcccgcc 27
<210> 89
<211> 28
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic nucleotide
<400> 89
tcccccggga tggcagagca acagaaca 28
<210> 90
<211> 26
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic nucleotide
<400> 90
cccaagcttt cacttgtctt cgagat 26
<210> 91
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic nucleotide
<400> 91
tcccccggga tgaccagtat tttcg 25
<210> 92
<211> 28
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic nucleotide
<400> 92
cccaagcttc tagagcaggc aggcaacc 28
<210> 93
<211> 29
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic nucleotide
<400> 93
tcccccggga tgttttggat ttggacact 29
<210> 94
<211> 26
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic nucleotide
<400> 94
cccaagcttc tatgcgcgaa ccttca 26
<210> 95
<211> 28
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic nucleotide
<400> 95
ccaatgcatc gcgtagtgtc acgcaaac 28
<210> 96
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic nucleotide
<400> 96
cccaagcttt cagttacttg cgtca 25
<210> 97
<211> 27
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic nucleotide
<400> 97
ccaatgcata tggcattgac cagcgaa 27
<210> 98
<211> 27
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic nucleotide
<400> 98
cccaagcttt cagtcgaaca acgtcca 27
<210> 99
<211> 26
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic nucleotide
<400> 99
tcccccggga tggttgatat gagcga 26
<210> 100
<211> 27
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic nucleotide
<400> 100
cccaagcttt cagtgggtct ggtgggt 27
<210> 101
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic nucleotide
<400> 101
atatgccgag tcccacacga tttct 25
<210> 102
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic nucleotide
<400> 102
tcctgcacga aaagccgctg gacgg 25

Claims (8)

1.试剂在制备试剂盒中的用途，所述试剂盒用于增强动物双歧杆菌的耐酸性，所述试剂用于下列的至少之一：
加强脂肪酸的合成和pspA的表达；
降低细胞膜的通透性；
阻挡氢离子进入动物双歧杆菌细胞内；
增强多糖的利用、双歧途径以及核糖的代谢；
增加动物双歧杆菌细胞的胞内能量的产生；
利用DnaK系统、GroES/EL系统以及ClpB减少蛋白质损伤；
利用直接修复及碱基删除修复系统修复DNA损伤；
通过蛋白的磷酸化、去磷酸化及群体感应系统增强信号传导；
调节转录因子的水平及降低翻译水平，
其中，所述试剂用于过表达BAA6_RS00480、BAA6_RS06240、BAA6_RS03885或BAA6_RS05205的至少之一，
其中，
BAA6_RS00480为SEQ ID NO：7所示的核苷酸序列，
BAA6_RS06240为SEQ ID NO：6所示的核苷酸序列，
BAA6_RS03885为SEQ ID NO：3所示的核苷酸序列，
BAA6_RS05205为SEQ ID NO：4所示的核苷酸序列。
2.一种增强动物双歧杆菌的耐酸性的方法，其特征在于，将动物双歧杆菌与试剂进行接触，所述试剂用于下列的至少之一：
加强脂肪酸的合成和pspA的表达；
降低细胞膜的通透性；
阻挡氢离子进入动物双歧杆菌细胞内；
增强多糖的利用、双歧途径以及核糖的代谢；
增加动物双歧杆菌细胞的胞内能量的产生；
利用DnaK系统、GroES/EL系统以及ClpB减少蛋白质损伤；
利用直接修复及碱基删除修复系统修复DNA损伤；
通过蛋白的磷酸化、去磷酸化及群体感应系统增强信号传导；
调节转录因子的水平及降低翻译水平，
其中，所述试剂用于过表达BAA6_RS00480、BAA6_RS06240、BAA6_RS03885或BAA6_RS05205的至少之一，
其中，
BAA6_RS00480为SEQ ID NO：7所示的核苷酸序列，
BAA6_RS06240为SEQ ID NO：6所示的核苷酸序列，
BAA6_RS03885为SEQ ID NO：3所示的核苷酸序列，
BAA6_RS05205为SEQ ID NO：4所示的核苷酸序列。
3.一种微生物，其特征在于，所述微生物过表达BAA6_RS00480、BAA6_RS06240、BAA6_RS03885或BAA6_RS05205的至少之一，
其中，
BAA6_RS00480为SEQ ID NO：7所示的核苷酸序列，
BAA6_RS06240为SEQ ID NO：6所示的核苷酸序列，
BAA6_RS03885为SEQ ID NO：3所示的核苷酸序列，
BAA6_RS05205为SEQ ID NO：4所示的核苷酸序列。
4.根据权利要求3所述的微生物，其特征在于，所述微生物为动物双歧杆菌。
5.根据权利要求4所述的微生物，其特征在于，所述微生物为动物双歧杆菌A6。
6.一种食品，其特征在于，包括权利要求3～5所述的微生物。
7.一种药品，其特征在于，包括权利要求3～5所述的微生物。
8.一种筛选药物的方法，所述药物用于增强动物双歧杆菌的耐酸性，其特征在于，包括：
将动物双歧杆菌与候选药物进行接触；
比较接触前后动物双歧杆菌的下列的BAA6_RS00480、BAA6_RS06240、BAA6_RS03885或BAA6_RS05205的至少之一的表达量升高；
其中，
BAA6_RS00480为SEQ ID NO：7所示的核苷酸序列，
BAA6_RS06240为SEQ ID NO：6所示的核苷酸序列，
BAA6_RS03885为SEQ ID NO：3所示的核苷酸序列，
BAA6_RS05205为SEQ ID NO：4所示的核苷酸序列，
并且，比较接触前后动物双歧杆菌的下列的至少之一：
脂肪酸的合成量和pspA的表达量增加，
细胞膜的通透性降低，
动物双歧杆菌细胞内的氢离子的含量降低，
多糖的利用、双歧途径以及核糖的代谢水平增强，
动物双歧杆菌细胞的胞内能量增加，
蛋白质损伤水平降低，
DNA损伤水平降低，
信号传导水平增强，或
翻译水平降低，
以便确定候选药物是否为目标药物。
CN201811222559.3A 2018-10-19 2018-10-19 动物双歧杆菌a6耐酸应答机制研究 Active CN111073826B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201811222559.3A CN111073826B (zh) 2018-10-19 2018-10-19 动物双歧杆菌a6耐酸应答机制研究

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201811222559.3A CN111073826B (zh) 2018-10-19 2018-10-19 动物双歧杆菌a6耐酸应答机制研究

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN111073826A CN111073826A (zh) 2020-04-28
CN111073826B true CN111073826B (zh) 2022-02-01

Family

ID=70308471

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201811222559.3A Active CN111073826B (zh) 2018-10-19 2018-10-19 动物双歧杆菌a6耐酸应答机制研究

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN111073826B (zh)

Families Citing this family (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN114681493B (zh) * 2020-12-31 2023-09-08 杭州远大生物制药有限公司 动物双歧杆菌乳亚种的应用
CN115245198A (zh) * 2021-06-25 2022-10-28 丰宁水星乳品有限责任公司 一种具有缓解功能性便秘的杏仁粉产品

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101918537A (zh) * 2007-10-23 2010-12-15 雀巢产品技术援助有限公司 胁迫耐性双歧杆菌
CN104232515A (zh) * 2014-08-15 2014-12-24 任发政 一种动物双歧杆菌及其应用

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101918537A (zh) * 2007-10-23 2010-12-15 雀巢产品技术援助有限公司 胁迫耐性双歧杆菌
CN104232515A (zh) * 2014-08-15 2014-12-24 任发政 一种动物双歧杆菌及其应用

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Bifidobacterium animalis subsp.lactis strain HN019 chromosome，complete genome;CP031154.1;《Genbank》;20180928;全文 *
CP031154.1.Bifidobacterium animalis subsp.lactis strain HN019 chromosome，complete genome.《Genbank》.2018,全文. *
双歧杆菌对环境胁迫应答机制的研究进展;秦倩等;《中国乳业》;20130325(第135期);41-42 *

Also Published As

Publication number Publication date
CN111073826A (zh) 2020-04-28

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Crook et al. Adaptive strategies of the candidate probiotic E. coli Nissle in the mammalian gut
Andreevskaya et al. Food spoilage-associated Leuconostoc, Lactococcus, and Lactobacillus species display different survival strategies in response to competition
Wiedenbeck et al. Origins of bacterial diversity through horizontal genetic transfer and adaptation to new ecological niches
US8198430B2 (en) Immunogenic sequences
Zhao et al. Shotgun metagenomics approach reveals the bacterial community and metabolic pathways in commercial hongeo product, a traditional Korean fermented skate product
Baker et al. Transcriptional profile of glucose‐shocked and acid‐adapted strains of Streptococcus mutans
Liu et al. Global transcriptome analysis of Mesorhizobium alhagi CCNWXJ12-2 under salt stress
Kämpfer et al. Kosakonia pseudosacchari sp. nov., an endophyte of Zea mays
Kim et al. Understanding pathogenic Burkholderia glumae metabolic and signaling pathways within rice tissues through in vivo transcriptome analyses
Benslama et al. High-quality draft genome sequence of Enterobacter sp. Bisph2, a glyphosate-degrading bacterium isolated from a sandy soil of Biskra, Algeria
CN111073826B (zh) 动物双歧杆菌a6耐酸应答机制研究
Liu et al. Metagenomic and metatranscriptomic analysis of the microbial community structure and metabolic potential of fermented soybean in Yunnan Province
Sharma et al. Global gene expression analysis of the Myxococcus xanthus developmental time course
Brzuszkiewicz et al. Legionella oakridgensis ATCC 33761 genome sequence and phenotypic characterization reveals its replication capacity in amoebae
CN108220219B (zh) 一套植物乳杆菌食品级表达系统及其在异源蛋白表达中的应用
Veselovsky et al. Gene networks underlying the resistance of Bifidobacterium longum to inflammatory factors
Guglielmetti et al. Molecular characterization of Bifidobacterium longum biovar longum NAL8 plasmids and construction of a novel replicon screening system
Giotis et al. Transcriptome analysis of alkali shock and alkali adaptation in Listeria monocytogenes 10403S
Christiansen et al. Elucidation of insertion elements carried on plasmids and in vitro construction of shuttle vectors from the toxic cyanobacterium Planktothrix
Zhu et al. Global genome and comparative transcriptomic analysis reveal the inulin consumption strategy of Lactiplantibacillus plantarum QS7T
RU2508406C2 (ru) СПОСОБ ВИДОВОЙ ИДЕНТИФИКАЦИИ ЛАКТОБАЦИЛЛ L.casei/paracasei, L.fermentum, L.plantarum И L.rhamnosus
Zhang et al. Milk fat globule membrane protects Bifidobacterium longum ssp. infantis ATCC 15697 against bile stress by modifying global transcriptional responses
Averina et al. Distribution of genes of toxin-antitoxin systems of mazEF and relBE families in bifidobacteria from human intestinal microbiota
Liu et al. Production level of tetrodotoxin in Aeromonas is associated with the copy number of a plasmid
Yan et al. Adenine DNA methylation is involved in regulating ethanol and osmotic stress responses in Lacticaseibacillus paracasei Zhang

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant