CN108070542A - 一种高活性双歧杆菌菌粉喷雾干燥生产工艺及应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种高活性双歧杆菌菌粉喷雾干燥生产工艺及应用，属于食品技术领域。本发明将生物菌膜技术应用于双歧杆菌的发酵生产中，以非水溶性膳食纤维作为固形界面，使其在固相界面形成菌膜，从而显著提高双歧杆菌喷雾干燥存活率，喷雾干燥存活率可达55％以上，菌粉活菌数最高可达到5×1010cfu/g以上。本发明解决了在开发高活性双歧杆菌喷雾干燥菌粉中的关键技术问题。制备的高活性、强抗逆性双歧杆菌菌粉可用于固体饮料、发酵剂等产品中。

Description

一种高活性双歧杆菌菌粉喷雾干燥生产工艺及应用
技术领域
本发明涉及一种高活性双歧杆菌菌粉喷雾干燥生产工艺及应用，属于食品技术领域。
背景技术
双歧杆菌是人体及动物肠道内的固有菌群，在肠道微生态稳定及宿主生理功能调节方面具有重要作用。市售常见的双歧杆菌活菌产品有：双歧杆菌固体饮料、双歧杆菌发酵乳制品等，这些产品大多由双歧杆菌菌粉所制得。现阶段市售双歧杆菌菌粉多由冷冻干燥的方式来制得，冷冻干燥尽管能获得较高存活率的双歧杆菌菌粉，但冷冻干燥存在着生产设备要求高、干燥过程中耗能高、产量低等缺点，这些问题极大地提升了双歧杆菌菌粉的制备成本。喷雾干燥相比冷冻干燥具有操作简便、设备要求低，生产成本低等优点，因此喷雾干燥制备双歧杆菌菌剂比起真空冷冻干燥需要的时间更短、且更节省经济成本，故而在工业上利用喷雾干燥是益生菌制剂技术。但是由于喷雾干燥过程中溶液会充分混合高温空气，使得菌液温度急剧升高，从而导致双歧杆菌大量死亡，因此提升双歧杆菌喷雾干燥存活率显得尤为重要，如何最大程度的提高双歧杆菌存活率。
专利CN105341940A、CN1306021C及CN102210659B提高双歧杆菌干燥存活率的方法多集中于双歧杆菌干燥保护剂配方的研究，通过糖、蛋白质、盐等物质的筛选来优化干燥保护剂配方从而提高干燥存活率。干燥保护剂配方的优化、干燥工艺条件的改良、微胶囊化技术的应用尽管能一定程度上提高双歧杆菌干燥存活率，但上述方法的提高程度有限，且操作步骤繁琐，不适于大规模的工业化应用。
发明内容
本发明要解决的技术问题是克服双歧杆菌喷雾干燥存活率低，提供一种高活性、强抗逆性双歧杆菌菌粉生产工艺，能显著提高双歧杆菌的喷雾干燥存活率和胃肠道耐受性，提供一种合适的双歧杆菌菌粉制备策略。
本发明的第一个目的是提供一种双歧杆菌菌粉的制备方法，是先制备双歧杆菌生物膜，再对双歧杆菌生物膜进行喷雾干燥。
在本发明的一种实施方式中，所述生物膜是双歧杆菌菌体细胞形成的有组织的细菌群。
在本发明的一种实施方式中，所述双歧杆菌菌膜是在含有非水溶性膳食纤维的培养基中培养获得。
在本发明的一种实施方式中，所述非水溶性膳食纤维包括谷物粉、豆粉、果蔬粉、菌菇粉和膳食同源粉剂的一种或多种。
在本发明的一种实施方式中，所述非水溶性膳食纤维包括黄豆粉，燕麦麸皮粉，麦麸粉，玉米糠粉，核桃壳粉，葛根粉，猴头菇粉，木耳粉，菊芋粉和燕麦粉的一种或多种。
在本发明的一种实施方式中，所述非水溶性膳食纤维的含量为10～30g/L。
在本发明的一种实施方式中，所述双歧杆菌包括假小链双歧杆菌、长双歧杆菌长亚种、长双歧杆菌婴儿亚种、青春双歧杆菌、短双歧杆菌、两歧双歧杆菌、动物双歧杆菌动物亚种、或动物双歧杆菌乳亚种。
在本发明的一种实施方式中，所述培养基含有：酵母粉5～8g/L，无水乙酸钠5～8g/L，牛肉膏10～16g/L，无水葡萄糖20～30g/L，蛋白胨10～16g/L，七水合硫酸镁0.5～0.8g/L，磷酸氢二钾2～3g/L，一水合硫酸锰0.25～0.4g/L，柠檬酸氢二铵2～3g/L，L-半胱氨酸盐酸盐0.5～1.0g/L，吐温-801g/L，非水溶性膳食纤维10～30g/L。
在本发明的一种实施方式中，所述方法包括如下步骤：1)将双歧杆菌接种至含非水溶性膳食纤维的培养基中；(2)在氮气环境下，于pH5.8～6.2、35～37℃培养18～36h；(3)离心收集菌体；(4)按菌泥：干燥保护剂为1:1～3的质量比向菌泥中添加干燥保护剂，混匀；(5)将步骤(4)的混合物喷雾干燥。
在本发明的一种实施方式中，所述步骤(1)中的培养基含有：酵母粉5g/L，无水乙酸钠5g/L，牛肉膏10g/L，无水葡萄糖20g/L，蛋白胨10g/L，七水合硫酸镁0.5g/L，三水合磷酸氢二钾2.6g/L，一水合硫酸锰0.25g/L，柠檬酸氢二铵2g/L，L-半胱氨酸盐酸盐0.5g/L，吐温-801g/L，黄豆粉10g/L。
在本发明的一种实施方式中，所述步骤(2)将双歧杆菌活化3代，按照体积比3-5％的接种比例，转接到10L发酵罐中，持续通入氮气，37℃恒定pH(pH＝6)培养24小时。
在本发明的一种实施方式中，所述步骤(3)在4℃下对双歧杆菌生物膜发酵液进行离心收集菌泥，离心条件为：转速为6000rpm/min，离心时间为10分钟，得到双歧杆菌菌泥。
在本发明的一种实施方式中，所述步骤(4)中干燥保护剂配方为：所述保护剂剂配方为：80～120g/L脱脂乳粉、酪蛋白酸钠、大豆蛋白中的至少一种，20～40g/L海藻糖、蔗糖、水苏糖、菊粉中的至少一种，0～10g/L谷氨酸钠，0～0.5g/L半胱氨酸盐酸盐、维生素C中的至少一种，pH为6.5。
在本发明的一种实施方式中，所述步骤(5)是将将步骤(4)所得菌悬液以5ml/min的速度通过喷雾干燥机进行干燥，进口温度为130-160℃，出口温度为70-90℃。
本发明的第二个目的是提供应用所述方法制备的菌粉。
本发明的第三个目的是提供所述菌粉在食品、生物领域的应用，所述应用包括制备固体饮料、乳制品、发酵果蔬、巧克力、糖果、微生态制剂、益生菌片剂、益生菌胶囊。
在本发明的一种实施方式中，所述应用包括制备含益生元的食品所述含益生元的食品含有低聚果糖、低聚半乳糖、低聚木糖、母乳低聚糖中的至少一种。
在本发明的一种实施方式中，所述的固体饮料产品含有所述双歧杆菌冻干菌粉和益生元，所述益生元包含低聚果糖、低聚半乳糖、低聚木糖、母乳低聚糖、菊粉等中一种或多种。
在本发明的一种实施方式中，所述双歧杆菌生物膜菌粉用于发酵生产乳制品、豆制品或果蔬制品。
有益效果：本发明将生物菌膜技术应用于双歧杆菌的发酵生产中，以非水溶性膳食纤维作为固形界面，使其在固相界面形成菌膜，达到提高自身抗逆性的效果，从而显著提高双歧杆菌喷雾干燥存活率，喷雾干燥存活率可达55％以上，菌粉活菌数最高可达到5×1010cfu/g以上,将菌粉于25℃下存放12周，存活率可达50％以上。解决了在开发高活性双歧杆菌喷雾干燥菌粉中的关键技术问题。本发明制备的高活性、强抗逆性双歧杆菌菌粉可用于固体饮料、发酵剂等产品中，本发明中添加的非水溶性膳食纤维作为益生元提高了菌粉的功能。
具体实施方式
1、活菌数测定方法：待测样品梯度稀释后，取100微升涂布在固体平板，培养36小时后，计算活菌数，单位cfu/mL。
2、喷雾干燥存活率计算方法：，在喷雾干燥前测定活菌数为初始菌浓，喷雾干燥后，将菌粉用无菌生理盐水复溶至喷雾干燥前体积，测定活菌数为终浓度菌浓，计算喷雾干燥存活率。
存活率＝100％×终浓度/初始菌浓
3、菌粉于25℃下存放12周，存活率计算方法：喷雾干燥后，将菌粉用无菌生理盐水复溶至喷雾干燥前体积，测定活菌数为初始度菌浓；菌粉于25℃下存放12周，将菌粉用无菌生理盐水复溶至喷雾干燥前体积，测定活菌数为终浓度菌浓。
存活率＝100％×终浓度/初始菌浓
实施例1：假小链双歧杆菌的喷雾干燥
(1)双歧杆菌菌膜发酵培养基制备：
假小链双歧杆菌菌膜发酵培养基制备：酵母粉5g/L，无水乙酸钠5g/L，牛肉膏10g/L，无水葡萄糖20g/L，鱼粉蛋白胨10g/L，七水合硫酸镁0.5g/L，三水合磷酸氢二钾2.6g/L，一水合硫酸锰0.25g/L，柠檬酸氢二铵2g/L，L-半胱氨酸盐酸盐0.5g/L，吐温-801g/L，非水溶性纤维添加量如表1所示。
(2)双歧杆菌菌膜的发酵制备：将双歧杆菌活化3代，按照3-5％的接种比例，转接到10L发酵罐中，持续通入氮气，调整转速，37℃恒定pH(pH＝6)培养24小时。
(3)双歧杆菌菌膜的收集：在4℃下对双歧杆菌菌膜发酵液进行离心收集菌泥，离心条件为：转速为6000rpm/min，离心时间为10分钟，得到双歧杆菌菌泥。
(4)添加干燥保护剂：将所得菌泥和干燥保护剂按照重量体积比(1:1)混合均匀。上述干燥保护剂配方为：80g/L脱脂乳粉、40g/L水苏糖、40g/L蔗糖、0.5g/L维生素C，pH为6.5。
(5)喷雾干燥：将步骤(3)所得乳化液进行喷雾干燥，喷雾干燥条件为：菌悬液以5ml/min的速度通过喷雾干燥机进行干燥，进口温度为150℃，出口温度为80℃。喷雾干燥后即可获得双歧杆菌菌粉。
表1非水溶性纤维对罗伊氏双歧杆菌的喷雾干燥存活率的影响
根据表1可知，黄豆粉添加量对假小链双歧杆菌的喷雾干燥存活率的影响有很大的影响，黄豆粉添加量在10-30g/L时，假小链双歧杆菌的喷雾干燥存活率较高在45％以上，不添加黄豆粉，或黄豆粉添加量较少时，假小链双歧杆菌的喷雾干燥存活率较低。
实施例2
(1)双歧杆菌菌膜发酵培养基制备：
假小链双歧杆菌菌膜发酵培养基制备：酵母粉5g/L，无水乙酸钠5g/L，牛肉膏10g/L，无水葡萄糖20g/L，鱼粉蛋白胨10g/L，七水合硫酸镁0.5g/L，三水合磷酸氢二钾2.6g/L，一水合硫酸锰0.25g/L，柠檬酸氢二铵2g/L，L-半胱氨酸盐酸盐0.5g/L，吐温-801g/L，黄豆粉10g/L。
(2)双歧杆菌菌膜的发酵制备：将双歧杆菌活化3代，按照3-5％的接种比例，转接到10L发酵罐中，持续通入氮气，调整转速，37℃恒定pH(pH＝6)培养24小时。
(3)双歧杆菌菌膜的收集：在4℃下对双歧杆菌菌膜发酵液进行离心收集菌泥，离心条件为：转速为6000rpm/min，离心时间为10分钟，得到双歧杆菌菌泥。
(4)添加干燥保护剂：将所得菌泥和干燥保护剂按照重量体积比(1:1)混合均匀。上述干燥保护剂配方为：120g/L脱脂乳粉、20g/L岩藻糖、20g/L海藻糖、0.5g/L半胱氨酸盐酸盐，pH为6.5。
(5)喷雾干燥：将步骤(3)所得乳化液进行喷雾干燥，喷雾干燥条件为：菌悬液以5ml/min的速度通过喷雾干燥机进行干燥，进口温度为150℃，出口温度为80℃。喷雾干燥后即可获得双歧杆菌菌粉。
菌膜化假小链双歧杆菌的喷雾干燥存活率是55％，菌粉活菌数为5×1010cfu/g，显著高于非菌膜状态的菌体喷雾干燥存活率。将菌粉于25℃下存放12周，存活率为60％。
实施例3：长双歧杆菌长亚种的喷雾干燥
(1)双歧杆菌菌膜发酵培养基制备：
酵母粉6g/L，无水乙酸钠4g/L，牛肉膏12g/L，无水葡萄糖25g/L，蛋白胨12g/L，七水合硫酸镁0.5g/L，三水合磷酸氢二钾2.6g/L，一水合硫酸锰0.25g/L，柠檬酸氢二铵2g/L，L-半胱氨酸盐酸盐0.5g/L，吐温-801g/L，黄豆粉20g/L。
(2)双歧杆菌菌膜的发酵制备：将双歧杆菌活化3代，按照3-5％的接种比例，转接到10L发酵罐中，持续通入氮气，调整转速，37℃恒定pH(pH＝6)培养24小时。
(3)双歧杆菌菌膜的收集：在4℃下对双歧杆菌菌膜发酵液进行离心收集菌泥，离心条件为：转速为6000rpm/min，离心时间为10分钟，得到双歧杆菌菌泥。
(4)添加干燥保护剂：将所得菌泥和干燥保护剂按照重量体积比(1:1)混合均匀。上述干燥保护剂配方为：100g/L脱脂乳粉、30g/L海藻糖、30g/L蔗糖、0.5g/L半胱氨酸盐酸盐，pH为6.5。
(5)喷雾干燥：将步骤(3)所得菌悬液以5ml/min的速度通过喷雾干燥机进行干燥，进口温度为150℃，出口温度为80℃。喷雾干燥后即可获得双歧杆菌菌粉。
经检测，菌膜化长双歧杆菌长亚种的喷雾干燥存活率是57％。将菌粉于25℃下存放12周，存活率为49％。
实施例4
按实施例3相同的步骤进行菌粉制备，唯一区别为发酵培养基中不添加黄豆粉，其余条件与实施例3相同。发酵过程未形成菌膜，经检测，对照组喷雾干燥存活率低于1％。
实施例5
按照实施例3相同步骤进行操作，区别在于，以荞麦粉取代黄豆粉，进行菌膜发酵，喷雾干燥结果显示，以荞麦粉为固体介质形成的菌膜喷雾干燥存活率为48％，显著高于非菌膜状态的菌体喷雾干燥存活率。将菌粉于25℃下存放12周，存活率为51％。
实施例6
按照实施例3相同步骤进行操作，区别在于，将喷雾干燥保护剂替换为：120g/L脱脂乳粉、20g/L岩藻糖、20g/L海藻糖、0.5g/L半胱氨酸盐酸盐，pH为6.5。菌膜化长双歧杆菌长亚种的喷雾干燥存活率是49％，显著高于非菌膜状态的菌体喷雾干燥存活率。将菌粉于25℃下存放12周，存活率为54％。
实施例7：长双歧杆菌婴儿亚种的喷雾干燥
(1)双歧杆菌菌膜发酵培养基制备：酵母粉6g/L，无水乙酸钠5g/L，牛肉膏10g/L，无水葡萄糖25g/L，蛋白胨10g/L，七水合硫酸镁0.5g/L，三水合磷酸氢二钾2.6g/L，一水合硫酸锰0.25g/L，柠檬酸氢二铵2g/L，L-半胱氨酸盐酸盐0.5g/L，吐温-801g/L，黄豆粉20g/L。
(2)双歧杆菌菌膜的发酵制备：将双歧杆菌活化3代，按照3-5％的接种比例，转接到10L发酵罐中，持续通入氮气，调整转速，37℃恒定pH(pH＝6)培养24小时。
(3)双歧杆菌菌膜的收集：在4℃下对双歧杆菌菌膜发酵液进行离心收集菌泥，离心条件为：转速为6000rpm/min，离心时间为10分钟，得到双歧杆菌菌泥。
(4)添加干燥保护剂：将所得菌泥和干燥保护剂按照重量体积比(1:1)混合均匀。上述干燥保护剂配方为：100g/L脱脂乳粉、30g/L海藻糖、30g/L蔗糖、0.5g/L半胱氨酸盐酸盐，pH为6.5。
(5)喷雾干燥：将步骤(4)所得乳化液进行喷雾干燥，喷雾干燥条件为：菌悬液以5ml/min的速度通过喷雾干燥机进行干燥，进口温度为150℃，出口温度为80℃。喷雾干燥后即可获得双歧杆菌菌粉。
经检测，菌膜化长双歧杆菌婴儿亚种的喷雾干燥存活率是36％。将菌粉于25℃下存放12周，存活率为44％。
实施例8
按实施例7相同的步骤进行菌粉制备，唯一区别为发酵培养基中不添加黄豆粉，其余条件与实施例7相同。结果显示，发酵过程未形成生物膜，喷雾干燥后长双歧杆菌婴儿亚种的存活率是6％。将菌粉于25℃下存放12周，存活率为8％。
实施例9
按照实施例7，以玉米粉取代黄豆粉，进行菌膜发酵，喷雾干燥结果显示，以玉米粉为固体介质形成的菌膜喷雾干燥存活率为30％，显著高于非菌膜状态的菌体喷雾干燥存活率。将菌粉于25℃下存放12周，存活率为48％。
实施例10
按照实施例7，区别在于，冻干保护剂配方为：120g/L脱脂乳粉、40g/L海藻糖、0.5g/L半胱氨酸盐酸盐，pH为6.5。菌膜化长双歧杆菌婴儿亚种的喷雾干燥存活率是35％，显著高于非菌膜状态的菌体喷雾干燥存活率。将菌粉于25℃下存放12周，存活率为41％。
实施例11：两歧双歧杆菌的喷雾干燥
(1)双歧杆菌菌膜发酵培养基制备：按照重量比，菌膜发酵培养基的配方组成包括：
酵母粉5g/L，无水乙酸钠5g/L，牛肉膏10g/L，无水葡萄糖25g/L，蛋白胨10g/L，七水合硫酸镁0.5g/L，三水合磷酸氢二钾2.6g/L，一水合硫酸锰0.25g/L，柠檬酸氢二铵2g/L，L-半胱氨酸盐酸盐0.5g/L，吐温-801g/L，黄豆粉20g/L。
(2)双歧杆菌菌膜的发酵制备：将双歧杆菌活化3代，按照3-5％的接种比例，转接到10L发酵罐中，持续通入氮气，调整转速，37℃恒定pH(pH＝6)培养24小时。
(3)双歧杆菌菌膜的收集：在4℃下对双歧杆菌菌膜发酵液进行离心收集菌泥，离心条件为：转速为6000rpm/min，离心时间为10分钟，得到双歧杆菌菌泥。
(4)添加干燥保护剂：将所得菌泥和干燥保护剂按照重量体积比(1:1)混合均匀。上述干燥保护剂配方为：100g/L脱脂乳粉、30g/L海藻糖、30g/L蔗糖、0.5g/L半胱氨酸盐酸盐，pH为6.5。
(5)喷雾干燥：将步骤(4)所得乳化液进行喷雾干燥，喷雾干燥条件为：菌悬液以5ml/min的速度通过喷雾干燥机进行干燥，进口温度为150℃，出口温度为80℃。喷雾干燥后即可获得双歧杆菌菌粉。
经检测，菌膜化两歧双歧杆菌的喷雾干燥存活率是33％。将菌粉于25℃下存放12周，存活率为51％。
实施例12
按实施例11相同的步骤进行菌粉制备，唯一区别为发酵培养基中不添加黄豆粉，其余条件与实施例11相同。结果显示，发酵过程未形成菌膜，未形成菌膜的两歧双歧杆菌喷雾干燥存活率是3％。将菌粉于25℃下存放12周，存活率为11％。
实施例13
按照实施例11，以芹菜粉取代黄豆粉，进行生物膜发酵，喷雾干燥结果显示，以芹菜粉为固体介质形成的生物膜喷雾干燥存活率为30％，显著高于非生物膜状态的菌体喷雾干燥存活率。将菌粉于25℃下存放12周，存活率为43％。
实施例14
按照实施例11，更换喷雾干燥保护剂，新的喷雾干燥保护剂配方为：100g/L乳清蛋白、20g/L海藻糖、5g/L谷氨酸钠、0.5g/L半胱氨酸盐酸盐，pH为6.5。菌膜化两歧双歧杆菌的喷雾干燥存活率是28％，显著高于非菌膜状态的菌体喷雾干燥存活率。将菌粉于25℃下存放12周，存活率为46％。
实施例15：青春双歧杆菌的喷雾干燥
(1)双歧杆菌菌膜发酵培养基制备：酵母粉6g/L，无水乙酸钠5g/L，牛肉膏12g/L，无水葡萄糖25g/L，蛋白胨12g/L，七水合硫酸镁0.5g/L，三水合磷酸氢二钾2.0g/L，一水合硫酸锰0.25g/L，柠檬酸氢二铵3g/L，L-半胱氨酸盐酸盐0.5g/L，吐温-801g/L，黄豆粉20g/L。
(2)双歧杆菌菌膜的发酵制备：将双歧杆菌活化3代，按照3-5％的接种比例，转接到10L发酵罐中，持续通入氮气，调整转速，37℃恒定pH(pH＝6)培养24小时。
(3)双歧杆菌菌膜的收集：在4℃下对双歧杆菌菌膜发酵液进行离心收集菌泥，离心条件为：转速为6000rpm/min，离心时间为10分钟，得到双歧杆菌菌泥。
(4)添加干燥保护剂：将所得菌泥和干燥保护剂按照重量体积比(1:1)混合均匀。上述干燥保护剂配方为：100g/L脱脂乳粉、30g/L海藻糖、30g/L蔗糖、0.5g/L半胱氨酸盐酸盐，pH为6.5。
(5)喷雾干燥：将步骤(4)所得乳化液进行喷雾干燥，喷雾干燥条件为：菌悬液以5ml/min的速度通过喷雾干燥机进行干燥，进口温度为150℃，出口温度为80℃。喷雾干燥后即可获得双歧杆菌菌粉。
经检测，菌膜化青春双歧杆菌的喷雾干燥存活率是32％。将菌粉于25℃下存放12周，存活率为40％。
实施例16
按实施例15相同的步骤进行菌粉制备，唯一区别为发酵培养基中不添加黄豆粉，其余条件与实施例15相同。发酵过程中未形成菌膜，对喷雾干燥后的存活率进行测定，结果显示，存活率为2％。将菌粉于25℃下存放12周，存活率为6％。
实施例17
按照实施例15的步骤进行实施，区别在于，以猴头菇粉取代黄豆粉，进行菌膜发酵，喷雾干燥结果显示，以猴头菇粉为固体介质形成的菌膜喷雾干燥存活率为38％，显著高于非菌膜状态的菌体喷雾干燥存活率。将菌粉于25℃下存放12周，存活率为36％。
实施例18
按照实施例15的步骤，区别在于，喷雾干燥保护剂配方为：100g/L脱脂乳粉、20g/L海藻糖、10g/L菊粉、5g/L谷氨酸钠、0.5g/L半胱氨酸盐酸盐，pH为6.5。菌膜化青春双歧杆菌的喷雾干燥燥存活率是40％，显著高于非菌膜状态的菌体喷雾干燥存活率。将菌粉于25℃下存放12周，存活率为47％。
实施例19：短双歧杆菌的喷雾干燥
(1)双歧杆菌菌膜发酵培养基制备：酵母粉6g/L，无水乙酸钠5g/L，牛肉膏12g/L，无水葡萄糖20g/L，蛋白胨10g/L，七水合硫酸镁0.5g/L，三水合磷酸氢二钾2.6g/L，一水合硫酸锰0.25g/L，柠檬酸氢二铵2g/L，L-半胱氨酸盐酸盐0.5g/L，吐温-801g/L，黄豆粉20g/L。
(2)双歧杆菌菌膜的发酵制备：将双歧杆菌活化3代，按照3-5％的接种比例，转接到10L发酵罐中，持续通入氮气，调整转速，37℃恒定pH(pH＝6)培养24小时。
(3)双歧杆菌菌膜的收集：在4℃下对双歧杆菌菌膜发酵液进行离心收集菌泥，离心条件为：转速为6000rpm/min，离心时间为10分钟，得到双歧杆菌菌泥。
(4)添加干燥保护剂：将所得菌泥和干燥保护剂按照重量体积比(1:1)混合均匀。上述干燥保护剂配方为：100g/L脱脂乳粉、30g/L海藻糖、30g/L蔗糖、0.5g/L半胱氨酸盐酸盐，pH为6.5。
(5)喷雾干燥：将步骤(4)所得乳化液进行喷雾干燥，喷雾干燥条件为：菌悬液以5ml/min的速度通过喷雾干燥机进行干燥，进口温度为150℃，出口温度为80℃。喷雾干燥后即可获得双歧杆菌菌粉。
经检测，菌膜化短双歧杆菌的喷雾干燥存活率是35％。将菌粉于25℃下存放12周，存活率为37％。
实施例20
按实施例19相同的步骤进行菌粉制备，唯一区别为发酵培养基中不添加黄豆粉，其余条件与实施例19相同。发酵过程中未形成菌膜，喷雾干燥后的存活率是3％。将菌粉于25℃下存放12周，存活率为7％。
实施例21
按照实施例19，以木耳粉取代黄豆粉，进行菌膜发酵，喷雾干燥结果显示，以木耳粉为固体介质形成的菌膜喷雾干燥存活率为38％，显著高于非菌膜状态的菌体喷雾干燥存活率。将菌粉于25℃下存放12周，存活率为37％。
实施例22
按照实施例19，区别在于，喷雾干燥保护剂的配方为：120g/L脱脂乳粉、40g/L海藻糖、0.5g/L半胱氨酸盐酸盐，pH为6.5。菌膜化短双歧杆菌的喷雾干燥存活率是30％，显著高于非菌膜状态的菌体喷雾干燥存活率。将菌粉于25℃下存放12周，存活率为41％。
实施例23：动物双歧杆菌动物亚种的喷雾干燥
(1)双歧杆菌菌膜发酵培养基制备：酵母粉6g/L，无水乙酸钠5g/L，牛肉膏12g/L，无水葡萄糖20g/L，蛋白胨10g/L，七水合硫酸镁0.5g/L，三水合磷酸氢二钾2.6g/L，一水合硫酸锰0.25g/L，柠檬酸氢二铵2g/L，L-半胱氨酸盐酸盐0.5g/L，吐温-801g/L，黄豆粉20g/L。
(2)双歧杆菌菌膜的发酵制备：将双歧杆菌活化3代，按照3-5％的接种比例，转接到10L发酵罐中，持续通入氮气，调整转速，37℃恒定pH(pH＝6)培养24小时。
(3)双歧杆菌菌膜的收集：在4℃下对双歧杆菌菌膜发酵液进行离心收集菌泥，离心条件为：转速为6000rpm/min，离心时间为10分钟，得到双歧杆菌菌泥。
(4)添加干燥保护剂：将所得菌泥和干燥保护剂按照重量体积比(1:1)混合均匀。上述干燥保护剂配方为：100g/L脱脂乳粉、30g/L海藻糖、30g/L蔗糖、0.5g/L半胱氨酸盐酸盐，pH为6.5。
(5)喷雾干燥：将步骤(4)所得乳化液进行喷雾干燥，喷雾干燥条件为：菌悬液以5ml/min的速度通过喷雾干燥机进行干燥，进口温度为150℃，出口温度为80℃。喷雾干燥后即可获得双歧杆菌菌粉。经检测，菌膜化动物双歧杆菌的喷雾干燥存活率是38％。将菌粉于25℃下存放12周，存活率为51％。
对照例24
按实施例23相同的步骤进行菌粉制备，唯一区别为发酵培养基中不添加黄豆粉，其余条件与实施例23相同。发酵过程中未形成菌膜，喷雾干燥存活率是7％。将菌粉于25℃下存放12周，存活率为7％。
实施例25
按照实施例23，区别在于，以麦麸粉取代黄豆粉，进行菌膜发酵，喷雾干燥结果显示，以麦麸粉为固体介质形成的菌膜喷雾干燥存活率为32％，显著高于非菌膜状态的菌体喷雾干燥存活率。将菌粉于25℃下存放12周，存活率为37％。
实施例26
按照实施例23，区别在于，喷雾干燥保护剂配方为：80g/L脱脂乳粉、20g/L海藻糖、20g/L蔗糖、10g/L菊粉、5g/L谷氨酸钠、0.5g/L半胱氨酸盐酸盐，pH为6.5。菌膜化动物双歧杆菌的喷雾干燥存活率是33％，显著高于非菌膜状态的菌体喷雾干燥存活率。将菌粉于25℃下存放12周，存活率为41％。
实施例27：动物双歧杆菌乳亚种的喷雾干燥
(1)双歧杆菌菌膜发酵培养基制备：酵母粉5g/L，无水乙酸钠5g/L，牛肉膏12g/L，无水葡萄糖20g/L，蛋白胨10g/L，七水合硫酸镁0.5g/L，三水合磷酸氢二钾2.6g/L，一水合硫酸锰0.25g/L，柠檬酸氢二铵2g/L，L-半胱氨酸盐酸盐0.5g/L，吐温-801g/L，黄豆粉20g/L。(2)双歧杆菌菌膜的发酵制备：将双歧杆菌活化3代，按照3-5％的接种比例，转接到10L发酵罐中，持续通入氮气，调整转速，37℃恒定pH(pH＝6)培养24小时。
(3)双歧杆菌菌膜的收集：在4℃下对双歧杆菌菌膜发酵液进行离心收集菌泥，离心条件为：转速为6000rpm/min，离心时间为10分钟，得到双歧杆菌菌泥。
(4)添加干燥保护剂：将所得菌泥和干燥保护剂按照重量体积比(1:1)混合均匀。上述干燥保护剂配方为：100g/L脱脂乳粉、30g/L海藻糖、30g/L蔗糖、0.5g/L半胱氨酸盐酸盐，pH为6.5。
(5)喷雾干燥：将步骤(4)所得乳化液进行喷雾干燥，喷雾干燥条件为：菌悬液以5ml/min的速度通过喷雾干燥机进行干燥，进口温度为150℃，出口温度为80℃。喷雾干燥后即可获得双歧杆菌菌粉。经检测，菌膜化动物双歧杆菌的喷雾干燥存活率是32％。将菌粉于25℃下存放12周，存活率为50％。
实施例28
按实施例27相同的步骤进行菌粉制备，唯一区别为发酵培养基中不添加黄豆粉，其余条件与实施例27相同。发酵过程中未形成菌膜，喷雾干燥存活率是6％。将菌粉于25℃下存放12周，存活率降低一个数量级。
实施例29
按照实施例27，以葡萄籽粉取代黄豆粉，进行菌膜发酵，喷雾干燥结果显示，以葡萄籽粉为固体介质形成的菌膜喷雾干燥存活率为30％，显著高于非菌膜状态的菌体喷雾干燥存活率。将菌粉于25℃下存放12周，存活率为43％。
实施例30
按照实施例27，区别在于，喷雾干燥保护剂配方为：80g/L脱脂乳粉、20g/L海藻糖、20g/L蔗糖、10g/L菊粉、5g/L谷氨酸钠、0.5g/L半胱氨酸盐酸盐，pH为6.5。菌膜化动物双歧杆菌的喷雾干燥燥存活率是33％，显著高于非菌膜状态的菌体喷雾干燥存活率。将菌粉于25℃下存放12周，存活率为46％。
虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

Claims (10)

1.一种双歧杆菌菌粉的生产方法，其特征在于，以含有非水溶性膳食纤维的培养基培养双歧杆菌至形成生物膜，再收集双歧杆菌生物膜，进行喷雾干燥。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述非水溶性膳食纤维包括纤维素、木质素和半纤维以及来自食物中的谷物粉、豆粉、果蔬粉、菌菇粉和膳食同源食物粉剂的一种或多种。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述非水溶性膳食纤维包括燕麦麸皮粉、麦麸粉、玉米糠粉、核桃壳粉、葛根粉、猴头菇粉、木耳粉、菊芋粉和燕麦粉的一种或多种。
4.根据权利要1-3任一所述的方法，其特征在于，所述非水溶性膳食纤维的含量为10～30g/L。
5.根据权利要1所述的方法，其特征在于，所述双歧杆菌包括假小链双歧杆菌、长双歧杆菌长亚种、长双歧杆菌婴儿亚种、青春双歧杆菌、短双歧杆菌、两歧双歧杆菌、动物双歧杆菌动物亚种、或动物双歧杆菌乳亚种。
6.根据权利要求1-3，5任一所述的方法，其特征在于，包括如下步骤：(1)将双歧杆菌接种至含非水溶性膳食纤维的培养基中；(2)于pH5.8～6.2、35～37℃厌氧培养20～30h；(3)离心收集菌体；(4)按菌泥：冻干保护剂为1:1～3的质量比向菌泥中添加冻干保护剂；(5)将步骤(4)的混合物进行喷雾干燥，入口温度为130-160℃，出口温度为70-90℃。
7.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述步骤(4)中所述保护剂剂配方为：80～120g/L脱脂乳粉、酪蛋白酸钠、大豆蛋白中的至少一种，20～40g/L海藻糖、蔗糖、水苏糖、菊粉中的至少一种，0～10g/L谷氨酸钠，0～0.5g/L半胱氨酸盐酸盐、维生素C中的至少一种。
8.权利要求1-3，5，7任一所述方法制备的双歧杆菌菌粉。
9.应用权利要求8所述菌粉制备的固体饮料，其特征在于，所述固体饮料含≥109CFU/g双歧杆菌、低聚果糖、低聚半乳糖和菊粉。
10.权利要求8所述菌粉在食品、药品、保健品领域的应用。
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