CN105310080B - 益生菌微胶囊及其制备方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种益生菌微胶囊及其制备方法和应用。该益生菌微胶囊包括芯材和壁材，所述芯材为益生菌，所述壁材外层上涂覆有壳聚糖；所述壁材由含有天然高分子材料和冻干保护剂的水溶液制备而成，其中，所述冻干保护剂包括葡萄糖、果糖、蔗糖、乳糖、海藻糖、可溶性淀粉、甘油、甘露醇、阿拉伯胶、右旋糖酐40和脱脂牛奶中的一种或几种；所述天然高分子材料包括胶凝糖、黄原胶、k‑角叉菜胶、海藻酸钠、醋酸邻苯二甲酸纤维素或明胶中的一种或几种；在所述水溶液中，所述冻干保护剂的体积分数为4.0％‑20.0％，所述天然高分子材料的体积分数为0.5％‑5.0％。该益生菌微胶囊冻干前后都能保持优异的耐酸性能和储存稳定性能。

Description

益生菌微胶囊及其制备方法和应用
技术领域
本发明涉及益生菌制品技术领域，特别是涉及一种益生菌微胶囊及其制备方法和应用。
背景技术
益生菌制品具有广泛的市场，在食品中主要应用于酸奶发酵。乳酸菌发酵乳糖产生大量的乳酸、乙酸等有机酸，使肠道内的pH值降低，使得肠内处于酸性环境，对沙门氏菌、变形杆菌和大肠杆菌等致病菌有明显的抑制作用。除致病菌外，对肠内腐败菌抑制力也很强。低pH值有利于肠道蠕动，维持正常生理功能，组织病原菌的繁殖。如临床常使用的乳酸菌素片在治疗肠炎、调整消化力、延缓机体衰老、抗癌等方面就深受好评。
而根据益生菌应用效果的一般概念，只有活菌才能产生益生功能。因此，益生菌在被摄入时必须是活的，并且在胃肠道中保持活性。根据国家对益生菌的相关规定，益生菌产品在其保质期内活菌数目或者定植于肠道中的活菌数目不得少于106-107CFU/mL(g)。但是由于益生菌对存活条件要求较高，现今益生菌制剂仍存在一定的局限性：一方面，当活菌或辅料长期与空气中的氧直接接触时会使得活菌死亡及辅料氧化，从而会导致产品的储存稳定性差；另一方面，当益生菌制剂进入胃肠道后，因工艺保护不足导致益生菌在酸性环境下存活率低，无法达到规定活菌数目，从而导致应用效果不佳。国内对于益生菌产品主要是看重益生菌产品中所含有的活菌数量，但这样会避开了益生菌在胃部的存活率、定植于肠道的活菌数目、益生菌产品长期保存的稳定性以及菌体代谢产物功能等关键性问题，在一定程度上造成了消费者在认识上的片面性，同时也限制了更有效、更安全的益生菌产品的开发。
为了改善益生菌本身的不耐酸、长期储存稳定性差等缺点，近些年来，大量研究致力于通过微型颗粒或者微型胶囊包裹益生菌活菌，然后通过冷冻干燥或者喷雾干燥来生产相关产品。微囊化技术(microencapsulation)，是指利用性能较稳定的天然或者合成高分子材料作为壁材，将性能不稳定的固体、液体等物质包埋在一个封闭“容器”中的技术，微胶囊内部物质称为芯材，包埋基质或者包裹材料称为壁材。微囊化可以保护益生菌免受不利环境因素的影响，所用的微囊化载体材料一般都要求是食品级以上。
在制备益生菌微胶囊制剂过程中，需要对其进行干燥，其中最常用的是真空冷冻干燥法，该方法具有菌存活率高、低温等优点。菌种在真空冷冻干燥后，酶的活性丧失、冻干燥菌粉复水性好、脱水彻底、保存期长、储存运输和使用都很方便，为直投式发酵剂提供良好的基础。但是在实际操作时，冷冻干燥过程中的水结晶、细胞的失水、蛋白失活等情况使得菌体出现死亡或损伤，对于菌种的保存、生产使用非常不利。
发明内容
基于此，本发明的目的之一在于提供一种耐酸、稳定的益生菌微胶囊。
具体技术方案如下。
一种益生菌微胶囊，所述益生菌微胶囊包括芯材和壁材，所述芯材为益生菌，所述壁材外层上涂覆有壳聚糖；所述壁材由含有天然高分子材料和冻干保护剂的水溶液制备而成，其中，
所述冻干保护剂包括葡萄糖、果糖、蔗糖、乳糖、海藻糖、可溶性淀粉、甘油、甘露醇、阿拉伯胶、右旋糖酐40和脱脂牛奶中的一种或几种；
所述天然高分子材料包括胶凝糖、黄原胶、k-角叉菜胶、海藻酸钠、醋酸邻苯二甲酸纤维素或明胶中的一种或几种；
在所述水溶液中，所述冻干保护剂的体积分数为4.0％-20.0％，所述天然高分子材料的体积分数为0.5％-5.0％。
在其中一个实施例中，所述冻干保护剂包括乳糖、海藻糖、可溶性淀粉、甘油、阿拉伯胶、右旋糖酐40或脱脂牛奶中的一种或几种；所述天然高分子材料包括胶凝糖、黄原胶、k-角叉菜胶、海藻酸钠或明胶中的一种或几种。
在其中一个实施例中，在所述水溶液中，所述冻干保护剂的体积分数为8.0％-18.0％，所述天然高分子材料的体积分数为1.0％-4.0％。
在其中一个实施例中，所述冻干保护剂包括乳糖、海藻糖、可溶性淀粉、甘油、阿拉伯胶、右旋糖酐40或脱脂牛奶中的一种或几种；
所述天然高分子材料包括胶凝糖、黄原胶、k-角叉菜胶、海藻酸钠或明胶中的一种或几种；
在所述水溶液中，所述冻干保护剂的体积分数为8.0％-18.0％，所述天然高分子材料的体积分数为1.0％-4.0％。
本发明的另一目的在于提供一种上述益生菌微胶囊的制备方法。
具体方案如下。
一种上述益生菌微胶囊的制备方法，包括以下步骤：
1)将益生菌菌种接种到已灭菌的培养基中进行活化，再在与活化条件相同的条件下进行增殖培养，得到菌液；
2)将所述菌液离心处理，弃去上清液后，得到菌泥；
3)将所述菌泥与所述含有所述天然高分子材料和所述冻干保护剂的所述水溶液混合均匀，得到菌悬液，再把所述菌悬液固化，洗涤过滤；
4)将步骤3)所得物加入到所述壳聚糖溶液中进行包衣，洗涤过滤后，即得所述益生菌微胶囊。
在其中一个实施例中，步骤3)中，所述菌泥与所述水溶液的质量比为1:1-1:8；步骤4)中，在所述壳聚糖溶液中，所述壳聚糖的体积分数为1.0％-15.0％。
在其中一个实施例中，步骤3)中，所述菌泥与所述水溶液的质量比为1:2-1:6；步骤4)中，在所述壳聚糖溶液中，所述壳聚糖的体积分数为5.0％-12.0％。
在其中一个实施例中，还包括以下步骤：将所述益生菌微胶囊放入体积分数为8.0％-18.0％的所述冻干保护剂溶液中平衡30min后，再在-80.0℃下预冻1-6h，最后在-55.0℃下真空冷冻干燥18-36h。
在其中一个实施例中，所述步骤1)中，所述培养基为MRS肉汤，所述活化条件为温度35.0-38.0℃，时间22-26h，所述增殖培养中，接种比例为每100.0mL培养基中接种2.0-5.0mL菌种；所述步骤2)的所述离心处理中，温度为20.0-37.0℃，转速为3000-5000r/min，时间为10-30min；所述步骤3)中，用于固化的溶液为0.1M CaCl2溶液，固化的时间为15-60min；所述步骤4)中，包衣的时间为30-90min。
本发明的另一目的在于提供一种上述益生菌微胶囊的应用。
具体技术方案如下。
一种上述益生菌微胶囊在制备保健食品、饮料食品、临床营养制剂、药物微制剂或化妆品中的应用。
本发明与现有技术相比，具有以下有益效果：
现有技术当中的一种益生菌微胶囊，其以益生菌和保护剂(多孔淀粉和/或脱脂奶粉)为芯材，且先以海藻酸钠包埋芯材，外层再以乳清蛋白或明胶包裹。此益生菌微胶囊中的益生菌活菌数仍不够理想，且冻干后的耐酸性及稳定性也欠佳。而本发明所提供的是一种冻干保护剂“骨架型”微胶囊，以益生菌为芯材，将冻干保护剂“内嵌”在天然高分子材料凝胶内部，形成一个整体后作为壁材，再以壳聚糖进行包衣，得到壳聚糖-保护剂-天然高分子材料微胶囊。与现有技术相比，“骨架型”微胶囊的冻干保护剂是“内嵌”在天然高分子材料凝胶内部的，不直接与益生菌进行混合，在不影响微胶囊大小的同时，壁材厚度有一定增加。混合的壁材既可以在冷冻干燥过程中起到保护作用，又对益生菌的耐酸性和长期储存性有明显的改善。
而且，在本发明中，冻干保护剂与天然高分子材料在混合溶液中的浓度对微胶囊的稳定性、耐酸性也有着重大影响。冻干保护剂的浓度过低，则单体积溶液的冻干保护剂分子过少，菌体不能充分的包裹在冻干保护剂分子中，这样会达不到最佳的冻干存活率；浓度过高，其渗透压可能很大，对菌体造成不利的影响，而且，浓度过高也会造成工业成本的提高，因此最终选择8.0％-18.0％作为冻干保护剂最佳浓度。而天然高分子材料的浓度过低，则会使得微胶囊在固化过程中成球性差，导致部分益生菌未包埋在微胶囊内部；浓度过高，则天然高分子材料溶液黏度增大，挤出过程可控性低，所以选择1.0-4.0％作为天然高分子材料的最佳浓度。
而在制备过程中，益生菌菌泥与混合溶液的质量比、壳聚糖溶液的浓度也对微胶囊的性能产生影响。益生菌菌泥与混合溶液的比例中，如果混合溶液比例过低，会不足以完全包裹益生菌，使得活菌数偏低；如果比例过高，等量的菌分散在更多量的微胶囊当中，所以测得的每1.0g凝胶珠中益生菌的数量相比于低比例时就会偏低，因此最终优选1:2-1:6作为益生菌菌泥与混合溶液的质量比。壳聚糖溶液的浓度过低，会导致微胶囊耐酸性无法达到要求；而实验结果表明，当壳聚糖溶液浓度超过12.0％时，则壳聚糖盐酸盐溶液粘度太大，不利于微胶囊的分离，因此选择5.0％-12.0％作为壳聚糖溶液的最佳浓度。
此外，本发明提供的微胶囊与壁材中不含有冻干保护剂的益生菌微胶囊相比，冷冻干燥后的活菌数要提高0.8-1.2log值，明显改善了益生菌冻干存活率低的情况，并且在冻干并长期储存后，仍具有优异的稳定性和耐酸性。
本发明所提供的上述益生菌微胶囊的制备方法，操作简便、工艺参数易控、经济易行，适合工业化生产。
附图说明
图1为实施例1中预冻温度对乳酸乳球菌冻干存活率的影响图；
图2为实施例2中冷冻干燥时所用的保护剂溶液的pH值对嗜热链球菌冻干存活率的影响图；
图3为实施例3中冷冻干燥时所用的保护剂溶液与乳酸乳球菌菌泥混合的平衡时间对乳酸乳球菌冻干存活率的影响图；
图4为实施例4中海藻酸钠中G/M(海藻酸钠葡萄糖醛酸/海藻酸钠甘露糖醛酸)比例对嗜热链球菌活菌数的影响图；
图5为实施例4中制备的壁材中不含有冻干保护剂的海藻酸钠微胶囊形态图，其中，
A为微胶囊的外观图，
B为微胶囊外观的光学显微镜图，
C为微胶囊的横切面图，
D为微胶囊的外壁表面图，
E为微胶囊外观的扫描电子显微镜图，
F为冻干后的微胶囊外观图；
图6为实施例4中制备的壁材中含有冻干保护剂的海藻酸钠微胶囊形态图，其中，
G为含有阿拉伯胶的微胶囊冻干后的外观图，
H为含有脱脂牛奶的微胶囊冻干后的外观图；
图7为实施例5中不同浓度壳聚糖溶液包衣的微胶囊在人体胃液中放置不同时间后的活菌数图；
图8为实施例5中微胶囊在不同温度下储存90天后的活菌数图。
图9为实施例5中4℃下微胶囊分别在储存0、30、60、90天后的活菌数图。
图10为实施例5中25℃下微胶囊分别在储存0、30、60、90天后的活菌数变化图。
具体实施方式
以下将结合具体实施例和附图对本发明益生菌微胶囊及其制备方法和应用做进一步详细的说明。
本实施例中以益生菌为芯材，益生菌选自保加利亚乳杆菌、德氏乳杆菌、长双歧杆菌、短双歧杆菌、嗜热链球菌、乳酸乳球菌中的一种或几种；优选自长双歧杆菌、短双歧杆菌、嗜热链球菌和乳酸乳球菌中的一种或几种。
本实施例中，含有天然高分子材料和冻干保护剂的水溶液所用溶剂为无菌水，且MRS肉汤、混合溶液、壳聚糖溶液和CaCl2溶液都经过湿热灭菌，灭菌温度为121.0℃，灭菌时间为15min。
本实施例中的“冻干保护剂”是指可以在冷冻干燥过程及冻干后储存阶段保护菌体抵抗低温损害的物质。其分类方法有多种：根据物质的种类可以分为糖类、多元醇类、聚合物类、氨基酸类、盐类等；根据渗透性可以分为高渗透性物质(如甘油、DMSO)、中渗透性物质(如葡萄糖、甘氨酸)和低渗透性物质(如可溶性淀粉、HPMC)等；根据分子量可以分为高分子物质和低分子物质。
其中，海藻糖、脱脂牛奶具有非常优异的冻干保护作用。脱脂牛奶中的酪蛋白聚集在益生菌菌体的外周，在冷冻干燥的过程中，这种蛋白会抑制冰晶的形成，从而减少冰晶对菌体的损害，而且还能够在细胞表面形成保护层，减少细胞暴露在介质中的面积，起到保护作用。而且，脱脂牛奶中的高蛋白含量会影响到菌体内部的微环境，乳中乳糖可以进入细胞内与细胞内蛋白质等形成氢键，保护蛋白质酶类稳定，从而利于菌体的存活。
以下是实施例部分。
对比例1
本对比例提供一种明胶-海藻酸钠-脱脂奶粉微胶囊及其制备方法，该制备方法包括以下步骤：
1)菌种活化与增殖培养
将嗜热链球菌菌种接种到已灭菌的MRS液体培养基中，于37.0℃下培养16h，再按体积比为5.0％的比例接种于与上述MRS液体培养基相同的培养基中，即每100mL培养基中接种5mL菌种，并在相同条件下活化至第三代，得到菌液。
2)收集菌体
将菌液在20.0℃、6000rpm下离心5min，弃去上清液，获得菌泥。
3)芯材制备
加入占有嗜热链球菌菌泥总重量的2％的多孔淀粉和10％的脱脂奶粉，用高速均质机混匀后获得芯材。
4)微胶囊的制备
称取2g海藻酸钠溶于100.0mL的蒸馏水中，搅拌溶解，随后将所得溶液在121.0℃下高压灭菌15min，放置冷却后，按照质量比为2:1的比例与芯材混合均匀，通过点胶机均匀的逐滴滴入0.1M CaCl2溶液中，固化40min，洗涤过滤，备用。
5)明胶包衣
称取5.0g明胶加入到100.0mL蒸馏水中，搅拌溶解后，再在121.0℃下高压灭菌15min，放置冷却。将步骤4)所得物加入到明胶溶液中，磁力搅拌60min，洗涤过滤，得到明胶-海藻酸钠-脱脂奶粉微胶囊。
5)冷冻干燥
将步骤4)所得微胶囊放到-80.0℃冰箱中预冻1h，再在-55.0℃下真空冷冻干燥36h，得到明胶-海藻酸钠-脱脂奶粉微胶囊制剂。
检测发现，冷冻干燥后，明胶-海藻酸钠-脱脂奶粉微胶囊制剂的活菌数仅为1.2×108CFU/g。
将对比例1中制备的冻干后的微胶囊进行酸处理，酸处理方法为：放置在模拟人工胃液中2h，再分离出微胶囊，洗涤后，测定活菌数，测得活菌数为0.8×106CFU/g。
实施例1
本实施例提供一种壳聚糖-右旋糖酐40-胶凝糖-黄原胶微胶囊及其制备方法，该制备方法包括以下步骤：
1)菌种活化与增殖培养
将乳酸乳球菌菌种接种到已灭菌的MRS液体培养基中，于37.0℃下培养22h，再按体积比为5.0％的比例接种于与上述MRS液体培养基相同的培养基中，即每100mL培养基中接种5mL菌种，并在相同条件下活化至第三代，得到菌液。
2)收集菌体
将菌液在20.0℃、3000rpm下离心20min，弃去上清液，获得菌泥。
3)益生菌微胶囊的制备
称取8.0g的右旋糖酐40加入到100.0mL的蒸馏水中，搅拌溶解，再称取0.5g胶凝糖粉末和0.5g黄原胶粉末静置溶解在上述制备的右旋糖酐40溶液中，随后将所得溶液在121.0℃下高压灭菌15min，放置冷却后，按照质量比为6:1的比例与菌泥混合均匀后，通过点胶机均匀的逐滴滴入0.1M CaCl2溶液中，固化60min，洗涤过滤，备用。
4)壳聚糖包衣
称取12.0g壳聚糖盐酸盐加入到100.0mL蒸馏水中，搅拌溶解后，再在121.0℃下高压灭菌15min，放置冷却。将步骤3)所得物加入到壳聚糖溶液中，磁力搅拌60min，洗涤过滤，得到壳聚糖-右旋糖酐40-胶凝糖-黄原胶微胶囊。
5)冷冻干燥
将步骤4)所得微胶囊加入到体积分数为8.0％的右旋糖酐40溶液中，平衡30min，随后放到-80.0℃冰箱中预冻1h，再在-55.0℃下真空冷冻干燥36h，得到壳聚糖-右旋糖酐40-胶凝糖-黄原胶微胶囊制剂。
同时，按照相同条件制备得到不含右旋糖酐40的壳聚糖-胶凝糖-黄原胶微胶囊和壳聚糖-胶凝糖-黄原胶微胶囊制剂。
检测发现，冷冻干燥后，壳聚糖-胶凝糖-黄原胶微胶囊的活菌数仅为1.5×107CFU/g，而壳聚糖-右旋糖酐40-胶凝糖-黄原胶微胶囊的活菌数达到了1.9×108CFU/g，乳酸乳球菌存活率大大提高。
将步骤2)制备得到的乳酸乳球菌菌泥在不同温度下进行预冻后即测定活菌数，结果如图1所示。可见当温度为-80.0℃时，乳酸乳球菌活菌数最高，存活率最好，而且预冻时间为1-3h内的活菌数基本不变。
实施例2
本实施例提供一种壳聚糖-脱脂奶粉-k-角叉菜胶微胶囊及其制备方法，该制备方法包括以下步骤：
1)菌种活化与增殖培养
将嗜热链球菌菌种接种到已灭菌的MRS液体培养基中，于37.0℃下培养22-26h，再按体积比为3.0％的比例接种于与上述MRS液体培养基相同的培养基中，即每100.0mL培养基中接种3.0mL菌种，并在相同条件下活化至第三代，得到菌液。
2)收集菌体
将菌液在25.0℃、4000rpm下离心20min，弃去上清液，获得菌泥。
3)益生菌微胶囊的制备
称取15.0g脱脂奶粉加入到100.0mL的蒸馏水中，溶解，再称取4.0g k-角叉菜胶粉末溶解在上述制备的脱脂奶粉溶液中，静置溶解。随后将所得溶液在121.0℃下高压灭菌15min，放置冷却后，按照质量比6:1的比例与菌泥混合均匀，再通过点胶机均匀的逐滴滴入0.1M CaCl2溶液中，固化15min，洗涤过滤，备用。
4)壳聚糖包衣
称取10.0g壳聚糖盐酸盐加入到100.0mL蒸馏水中，搅拌溶解，再在121.0℃下高压灭菌15min，放置冷却后，将步骤3)所得物转移到壳聚糖溶液中，磁力搅拌60min，洗涤过滤，得到壳聚糖-脱脂奶粉-k-角叉菜胶微胶囊。
5)冷冻干燥
将步骤4)所得微胶囊加入到体积分数为15.0％的脱脂奶粉溶液中，平衡30min，随后放到-80.0℃冰箱中预冻6h，再在-55.0℃下真空冷冻干燥18h，得到壳聚糖-脱脂奶粉-k-角叉菜胶微胶囊制剂。
同时，按照相同条件制备得到不含脱脂奶粉的壳聚糖-k-角叉菜胶微胶囊和壳聚糖-k-角叉菜胶微胶囊制剂。
检测发现，冷冻干燥后，壳聚糖-k-角叉菜胶微胶囊的活菌数仅为1.8×107CFU/g，而壳聚糖-脱脂奶粉-k-角叉菜胶微胶囊的活菌数达到了2.1×108CFU/g，嗜热链球菌存活率大大提高。
观察在预冻时，不同pH的脱脂奶粉溶液对步骤2)制备得到的嗜热链球菌菌泥的活菌数影响，结果如图2所示。可见当冻干保护剂溶液——脱脂奶粉溶液的pH为6.0-7.0时，冷冻干燥后嗜热链球菌活菌数均保持在较高水平，达到9.0log CFU/mL。
实施例3
本实施例提供一种壳聚糖-甘油-海藻糖-明胶微胶囊及其制备方法，该制备方法包括以下步骤：
1)菌种活化与增殖培养
将乳酸乳球菌菌种接种到已灭菌的MRS液体培养基中，于37.0℃下培养26h，再按体积比为5.0％的比例接种于与上述MRS液体培养基相同的培养基中，即每100.0mL培养基中接种5.0mL菌种，并在相同条件下活化至第三代，得到菌液。
2)收集菌体
将菌液在28.0℃、5000rpm下离心10min，弃去上清液，获得菌泥。
3)益生菌微胶囊的制备
称取9.0g甘油和9.0g海藻糖加入到100.0mL的蒸馏水中，溶解。再称取4.0g明胶粉末溶解在上述制备的甘油-海藻糖溶液中，静置溶解。随后将所得溶液在121.0℃下高压灭菌15min，放置冷却后，按照质量比为2:1的比例与菌泥混合均匀，再通过点胶机均匀的逐滴滴入0.1M CaCl2溶液中，固化60min，洗涤过滤，备用。
4)壳聚糖包衣
称取5.0g壳聚糖盐酸盐加入到100.0mL蒸馏水中，搅拌溶解。再在121.0℃下高压灭菌15min，放置冷却后，将步骤3)所得物转移到壳聚糖溶液中，磁力搅拌60min，洗涤过滤，得到壳聚糖-甘油-海藻糖-明胶微胶囊。
5)冷冻干燥
将步骤4)所得微胶囊加入到体积分数为18％的甘油-海藻糖溶液中，平衡30min，随后放到-80.0℃冰箱中预冻1h，再在-55.0℃下真空冷冻干燥36h，得到壳聚糖-甘油-海藻糖-明胶微胶囊制剂。
同时，按照相同条件制备得到不含甘油、海藻糖的壳聚糖-明胶微胶囊和壳聚糖-明胶微胶囊制剂。
检测发现，冷冻干燥后，壳聚糖-明胶微胶囊的活菌数仅为0.7×105CFU/g，而壳聚糖-甘油-海藻糖-明胶微胶囊的活菌数达到了1.3×106CFU/g，乳酸乳球菌存活率大大提高。
观察预冻时，甘油-海藻糖溶液与乳酸乳球菌菌泥混合时的平衡时间对冷冻干燥后乳酸乳球菌存活率的影响，结果如图3所示。可见当平衡时间为30min时，干燥后的微胶囊制剂中乳酸乳球菌存活率最好，达到9.0log CFU/mL。
实施例4
本实施例提供一种壳聚糖-阿拉伯胶-海藻酸钠微胶囊及其制备方法，该制备方法包括以下步骤：
1)菌种活化与增殖培养
将嗜热链球菌菌种接种到已灭菌的MRS液体培养基中，于37.0℃下培养24h，再按体积比为5.0％的比例接种于与上述MRS液体培养基相同的培养基中，即每100.0mL培养基中接种5.0mL菌种，并在相同条件下活化至第三代，得到菌液。
2)收集菌体
将菌液在25.0℃、3500rpm下离心20min，弃去上清液，获得菌泥。
3)益生菌微胶囊的制备
称取10g的阿拉伯胶加入到100.0mL的蒸馏水中，溶解。再称取2.0g海藻酸钠粉末静置溶解在上述制备的阿拉伯胶溶液中，随后将所得溶液在121.0℃下高压灭菌15min，放置冷却后，按照5:1的比例与菌泥混合均匀后通过点胶机均匀的逐滴滴0.1M CaCl2溶液中，固化30min，洗涤过滤，备用。
4)壳聚糖包衣
称取8.0g壳聚糖盐酸盐加入到100.0mL蒸馏水中，搅拌溶解。再在121.0℃下高压灭菌15min，放置冷却后，将步骤3)所得物转移到壳聚糖溶液中，磁力搅拌60min，洗涤过滤，得到壳聚糖-阿拉伯胶-海藻酸钠微胶囊。
5)冷冻干燥
将步骤4)所得微胶囊加入到10.0％的阿拉伯胶溶液中，平衡30min，随后放到-80.0℃冰箱中预冻2h，再在-55.0℃下真空冷冻干燥24h，得到壳聚糖-阿拉伯胶-海藻酸钠微胶囊制剂。
同时，按照相同条件制备得到不含阿拉伯胶的壳聚糖-海藻酸钠微胶囊和壳聚糖-海藻酸钠微胶囊制剂。
检测发现，冷冻干燥后，壳聚糖-海藻酸钠微胶囊的活菌数仅为1.6×107CFU/g，而壳聚糖-阿拉伯胶-海藻酸钠微胶囊的活菌数达到了2.0×108CFU/g，嗜热链球菌存活率大大提高。
观察海藻酸钠中G/M(海藻酸钠葡萄糖醛酸/海藻酸钠甘露糖醛酸)质量比对壳聚糖-阿拉伯胶-海藻酸钠微胶囊的活菌数的影响，结果如图4所示。由图4可以看出，当G/M质量比分别为0.65、0.75和1.00时，冷冻干燥后的微胶囊的活菌数均有所下降，其中，当G/M质量比为1.00时，下降幅度较小。
对所制得的壳聚糖-海藻酸钠微胶囊进行形态表征，结果如图5所示。
对所制得的壳聚糖-阿拉伯胶-海藻酸钠微胶囊进行形态表征，结果如图6所示。
由图5和图6对比可以看出，与未添加冻干保护剂的情况下相比较，添加了阿拉伯胶的海藻酸钠微胶囊外表显得更加不平整，这可能是由于其是浸泡在两种冻干保护剂的溶液中进行冻干的，所以得到的微胶囊表面均被两种冻干保护剂所覆盖，形成了一种多褶皱的表面，但并不会影响微胶囊整体的一个结构。
实施例5
本实施例提供一种壳聚糖-海藻糖-海藻酸钠微胶囊及其制备方法，该制备方法包括以下步骤：
1)菌种活化与增殖培养
将双歧杆菌菌种接种到已灭菌的MRS液体培养基中，于35.0℃下培养22h，再按体积比为5.0％的比例接种于与上述MRS液体培养基相同的培养基中，即每100.0mL培养基中接种5.0mL菌种，并在相同条件下活化至第三代，得到菌液。
2)收集菌体
将菌液在25.0℃、3000rpm下离心20min，弃去上清液，获得菌泥。
3)益生菌微胶囊的制备
称取10.0g海藻糖加入到100.0mL的蒸馏水中，溶解。再称取2.0g海藻酸钠粉末静置溶解在上述海藻糖溶液中，随后将所得溶液在121.0℃下高压灭菌15min，放置冷却后，按照质量比为4:1的比例与菌泥混合均匀，再通过点胶机均匀的逐滴滴0.1MCaCl2溶液中，固化30min，洗涤过滤，备用。
4)壳聚糖包衣
称取5.0g壳聚糖盐酸盐加入到100.0mL蒸馏水中，搅拌溶解。再在121.0℃下高压灭菌15min，放置冷却后，将步骤3)所得物转移到壳聚糖溶液中，磁力搅拌60min，洗涤过滤，得到壳聚糖-海藻糖-海藻酸钠微胶囊。
5)冷冻干燥
将步骤4)所得微胶囊加入到体积分数为10.0％的海藻糖溶液中，平衡30min，随后放到-80.0℃冰箱中预冻2h，再在-55.0℃下真空冷冻干燥24h，得到壳聚糖-海藻糖-海藻酸钠微胶囊制剂。
同时，按照相同条件制备得到不含海藻糖的壳聚糖-海藻酸钠微胶囊和壳聚糖-海藻酸钠微胶囊制剂。
检测发现，冷冻干燥后，壳聚糖-海藻酸钠微胶囊的活菌数仅为2.6×107CFU/g，而壳聚糖-海藻糖-海藻酸钠微胶囊的活菌数达到了2.5×108CFU/g，双歧杆菌存活率大大提高。
在步骤4)中，用不同浓度(体积分数为1.0-12.0％)的壳聚糖溶液对微胶囊进行包衣后，得到不同的壳聚糖-海藻糖-海藻酸钠微胶囊，再分别放置在模拟人体胃液中，观察双歧杆菌的活菌数，结果如图7所示。可见当壳聚糖溶液浓度相同时，包衣后得到的壳聚糖-海藻糖-海藻酸钠微胶囊随着在模拟人体胃液中放置时间的延长，双歧杆菌活菌数均会下降，当壳聚糖溶液体积分数为12.0％时，活菌数下降幅度最小，微胶囊的耐酸性最好。
将壳聚糖-海藻糖-海藻酸钠微胶囊在不同温度下储存90天后，观察双歧杆菌活菌数，结果如图8所示。可见无论温度为4.0℃还是25.0℃时，双歧杆菌经过长时间的储存后，仍然能够保持较好的活菌数，活菌数达到7.8log CFU/g。储存后的微胶囊再在模拟人体胃液中放置2h后，活菌数也达到5.9log CFU/g。说明壳聚糖-海藻糖-海藻酸钠微胶囊具有良好的长期储存性，而且冻干后也能够保持优异的耐酸性。
将益生菌微胶囊在4℃下分别储存0d、30d、60d、90d后，检测微胶囊中的益生菌活菌数，结果如图9所示。由检测结果可以看出，随着时间的延长，微胶囊中的活菌数均有下降，但壁材中包含海藻糖和海藻酸钠的微胶囊的稳定性最佳，活菌数下降并不明显。
将益生菌微胶囊在25℃下分别储存0d、30d、60d、90d后，检测微胶囊中的益生菌活菌数，结果如图10所示。由检测结果可以看出，微胶囊中的活菌数下降趋势与4℃下一致，只是幅度较大，而同样的，壁材中包含海藻糖和海藻酸钠的微胶囊的稳定性最佳，活菌数下降并不明显。
实施例6
对实施例1-5中制备的冻干后的含有冻干保护剂的微胶囊及冻干后的不含冻干保护剂的微胶囊分别进行酸处理，酸处理方法为：放置在模拟人工胃液中2h，再分离出微胶囊，洗涤后，测定活菌数，结果如表1所示。
表1酸处理后不同微胶囊中的活菌数对比
由表1数据可以看出，在相同条件下，壳聚糖-保护剂-天然高分子材料微胶囊在经过酸处理后，活菌数能够达到(1.3-2.2)×106CFU/g，而壳聚糖-天然高分子材料微胶囊只有(0.7-2.0)×105CFU/g。说明本发明所提供的益生菌微胶囊冻干后依然能够保持优异的耐酸性能。
实施例7
将实施例1-5中制备的冻干后的含有冻干保护剂的微胶囊及冻干后的不含冻干保护剂的微胶囊分别进行稳定性测试，测试方法为：在4.0℃下储存90天，测定活菌数，结果如表2所示。
表2储存90天后不同微胶囊中的活菌数对比
由表2数据可以看出，在相同条件下，壳聚糖-保护剂-天然高分子材料微胶囊在4℃下储存90天后，活菌数仍能达到(1.1-2.2)×108CFU/g，活菌数存活率为96.20％。而壳聚糖-天然高分子材料微胶囊在4℃下储存90天后，活菌数为(2.7-4.0)×106CFU/g，存活率只有81.35％。说明本发明所提供的益生菌微胶囊具有优异的储存稳定性。
以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

Claims (10)

1.一种益生菌微胶囊，其特征在于，所述益生菌微胶囊由芯材和壁材组成，所述芯材为益生菌，所述壁材外层上涂覆有壳聚糖；所述壁材由天然高分子材料和冻干保护剂的水溶液制备而成，其中，
所述冻干保护剂包括葡萄糖、果糖、蔗糖、乳糖、海藻糖、可溶性淀粉、甘油、甘露醇、阿拉伯胶、右旋糖酐40和脱脂牛奶中的一种或几种；
所述天然高分子材料选自胶凝糖、黄原胶、k-角叉菜胶、海藻酸钠和醋酸邻苯二甲酸纤维素中的一种或几种；
在所述水溶液中，所述冻干保护剂的体积分数为4.0％-20.0％，所述天然高分子材料的体积分数为0.5％-5.0％。
2.根据权利要求1所述的益生菌微胶囊，其特征在于，所述冻干保护剂包括乳糖、海藻糖、可溶性淀粉、甘油、阿拉伯胶、右旋糖酐40和脱脂牛奶中的一种或几种；所述天然高分子材料选自胶凝糖、黄原胶、k-角叉菜胶、海藻酸钠中的一种或几种。
3.根据权利要求1所述的益生菌微胶囊，其特征在于，在所述水溶液中，所述冻干保护剂的体积分数为8.0％-18.0％，所述天然高分子材料的体积分数为1.0％-4.0％。
4.根据权利要求1所述的益生菌微胶囊，其特征在于，所述冻干保护剂包括乳糖、海藻糖、可溶性淀粉、甘油、阿拉伯胶、右旋糖酐40或脱脂牛奶中的一种或几种；
所述天然高分子材料选自胶凝糖、黄原胶、k-角叉菜胶、海藻酸钠中的一种或几种；
在所述水溶液中，所述冻干保护剂的体积分数为8.0％-18.0％，所述天然高分子材料的体积分数为1.0％-4.0％。
5.权利要求1-4任一项所述的益生菌微胶囊的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
1)将益生菌菌种接种到已灭菌的培养基中进行活化，再在与活化条件相同的条件下进行增殖培养，得到菌液；
2)将所述菌液离心处理，弃去上清液后，得到菌泥；
3)将所述菌泥与所述天然高分子材料和冻干保护剂的水溶液混合均匀，得到菌悬液，再把所述菌悬液固化，洗涤过滤；
4)将步骤3)所得物加入到所述壳聚糖溶液中进行包衣，洗涤过滤后，即得所述益生菌微胶囊。
6.根据权利要求5所述的益生菌微胶囊的制备方法，其特征在于，步骤3)中，所述菌泥与所述水溶液的质量比为1:1-1:8；步骤4)中，在所述壳聚糖溶液中，所述壳聚糖的体积分数为1.0％-15.0％。
7.根据权利要求6所述的益生菌微胶囊的制备方法，其特征在于，步骤3)中，所述菌泥与所述水溶液的质量比为1:2-1:6；步骤4)中，在所述壳聚糖溶液中，所述壳聚糖的体积分数为5.0％-12.0％。
8.根据权利要求5-7任一项所述的益生菌微胶囊的制备方法，其特征在于，还包括以下步骤：将所述步骤4)制得的所述益生菌微胶囊放入体积分数为8.0％-18.0％的冻干保护剂溶液中平衡30min后，再在-80.0℃下预冻1-6h，最后在-55.0℃下真空冷冻干燥18-36h；所述冻干保护剂溶液为右旋糖酐40溶液、脱脂奶粉溶液、甘油-海藻糖溶液、阿拉伯胶溶液或海藻糖溶液。
9.根据权利要求8所述的益生菌微胶囊的制备方法，其特征在于，所述步骤1)中，所述培养基为MRS肉汤，所述活化条件为温度35.0-38.0℃，时间22-26h，所述增殖培养中，接种比例为每100.0mL培养基中接种2.0-5.0mL菌种；所述步骤2)的所述离心处理中，温度为20.0-37.0℃，转速为3000-5000r/min，时间为10-30min；所述步骤3)中，用于固化的溶液为0.1M CaCl2溶液，固化的时间为15-60min；所述步骤4)中，包衣的时间为30-90min。
10.权利要求1-4任一项所述的益生菌微胶囊在制备保健食品、饮料食品、临床营养制剂、药物制剂或化妆品中的应用。
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