CN112206242A - 杀动物寄生虫虫卵的真菌微胶囊及其制备方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种杀动物寄生虫虫卵的真菌微胶囊及其制备方法和应用，涉及微生物学技术领域。上述杀动物寄生虫虫卵的真菌微胶囊，按重量份数计包括：厚垣普可尼亚菌菌粉8‑15份、载体18‑25份和壁材80‑95份；所述载体为硅藻土和高岭土的粉状组合物；所述壁材为海藻酸钠溶液、壳聚糖溶液和明胶溶液的液体状组合物，使得菌体免受外界环境影响，提高了稳定性，可以长期储存，可以保持菌株活性，又可以通过动物消化道，使用方便，用于兽医寄生虫的防治，具有良好的应用开发前景。

Description

杀动物寄生虫虫卵的真菌微胶囊及其制备方法和应用
技术领域
本发明涉及微生物学技术领域，具体涉及一种杀动物寄生虫虫卵的真菌微胶囊及其制备方法和应用。
背景技术
动物寄生虫病是严重危害畜牧业发展的一大类疾病。长期以来，对家畜寄生虫的防治主要依靠化学药物，并发挥了巨大的作用，但现使用的化学药品只是将虫体及虫卵驱出动物体外，虫卵不易被杀灭。同时随着化学驱虫药产生的抗药性、药物残留及环境污染等问题日益严重，已经引起人们的广泛认识，因此利用杀虫卵真菌对寄生虫的生物拮抗作用来防治动物寄生虫虫卵已备受关注。
厚垣普可尼亚菌（Pochonia chlamydosporia）是重要的线虫生防菌之一，具有巨大的生防潜力和开发前景。目前，国内主要利用该菌防治植物类寄生性线虫病，而其对动物寄生性线虫病也有较好的防治效果，国外已有用于猪蛔虫、肝片吸虫和马副蛔虫等的报道。但根据报道和先前研究表明，同种菌种不同菌株之间，其形态特性、产孢情况和杀虫卵效力等亦存在着一定的差异。所以目前在杀虫卵真菌制剂临床研究应用中所面临的重要问题是如何制备一种能应用于生产实际的杀虫卵的真菌生物制剂。
发明内容
本发明第一方面提供了一种杀动物寄生虫虫卵的真菌微胶囊，按重量份数计包括：厚垣普可尼亚菌菌粉8-15份、载体18-25份和壁材80-95份；
所述载体为硅藻土和高岭土的粉状组合物；
所述壁材为海藻酸钠溶液、壳聚糖溶液和明胶溶液的液体状组合物。
厚垣普可尼亚菌孢子粉的重量份数包括但不限于8份、9份、10份、11份、12份、13份、14份或15份。
载体的重量份数包括但不限于18份、19份、20份、21份、22份、23份、24份或25份。
壁材的重量份数包括但不限于80份、82份、85份、88份、90份、92份、94份或95份。
海藻酸钠分子中含有大量的羧基，可以与带正电的高分子化合物壳聚糖通过静电作用结合成膜；明胶来源于动物组织蛋白，形成的高粘度溶液，冷却后可成膜，具有良好的乳化性和成膜性，海藻酸钠、壳聚糖、明胶三种高分子材料配合使用，对厚垣普可尼亚菌孢子粉具有很好的保护作用。
上述真菌微胶囊，厚垣普可尼亚菌菌粉在载体中分散，载体选用硅藻土和高岭土的粉状组合物，使孢子粉的分散效果更好；以高分子材料海藻酸钠、壳聚糖和明胶的组合物作为壁材，将需要包埋的孢子粉和载体包裹在内部，形成微型胶囊，将其内部的孢子粉与外界的不利环境相隔离，这样可以避免内部物质受到外界环境的影响，以达到保持内部的孢子粉的性质稳定的效果，起到保护和控释的目的，延长储存时间，是一种可以应用于生产实际的杀虫卵的真菌生物制剂。
厚垣普可尼亚菌孢子批量培养可采用本领域常规的技术手段进行培养。
在本发明的一种实施方式中，厚垣普可尼亚菌（Pochonia chlamydosporia）ARSEF3539菌株经枸橼酸液体培养基及小麦粒固体培养基液固双相发酵培养，然后用孢子洗脱液洗脱收集孢子悬液，加入冻干保护剂，再经分装、预冻、真空冷冻干燥后获得冻干菌粉。
进一步，在本发明提供的技术方案的基础上，所述真菌微胶囊的粒径为0.3-2.5mm，活菌数为5×106-10×106个/g。
真菌微胶囊的粒径可以为但不限于0.3mm、0.5mm、0.8mm、1mm、1.3mm、1.6mm、2mm、2.3mm或2.5mm。优选真菌微胶囊的粒径粒径范围，既能包裹较多的孢子粉，又能使真菌微胶囊容易穿过动物的消化道且不损失孢子粉。
真菌微胶囊的活菌数可以为但不限于5×106个/g、6×106个/g、7×106个/g、8×106个/g、9×106个/g、10×106个/g。优选真菌微胶囊的活菌数，使其保证一定数量的活菌数，可以有效地保证厚垣普可尼亚菌真菌微胶囊的杀动物寄生虫虫卵的使用效果。
进一步，在本发明提供的技术方案的基础上，所述载体中硅藻土和高岭土的质量比为1:（0.2-2）。
硅藻土和高岭土的质量比典型但非限制性地例如为：1:0.2、1:0.4、1:0.6、1:0.8、1:1.0、1:1.2、1:1.4、1:1.6、1:1.8或1:2。
进一步，所述硅藻土的粒径为0.1-0.25mm，具体的可以为但不限于0.1mm、0.13mm、0.15mm、0.18mm、0.2mm、0.23mm或0.25mm。
进一步，所述高岭土的粒径为0.2-0.8mm，具体的可以为但不限于0.2mm、0.3mm、0.4mm、0.5mm、0.6mm、0.7mm或0.8mm。
优选硅藻土和高岭土的质量比，以及两种载体的粒径范围，可以使厚垣普可尼亚菌孢子粉在载体中的分散效果更好，进而使真菌微胶囊的效果均一和稳定。
进一步，在本发明提供的技术方案的基础上，所述壁材中海藻酸钠溶液、壳聚糖溶液和明胶溶液的质量比为（1-3）:（0.5-1）:（0.5-1）。
海藻酸钠溶液、壳聚糖溶液和明胶溶液的质量比典型但非限制性地例如为：1:1:0.5、1.5:0.9:0.6、1.8:0.8:0.7、2:0.7:0.8、2.5:0.6:0.9、3:0.5:1。
进一步，所述海藻酸钠溶液的浓度为0.75-1.25wt%；具体的可以为但不限于0.75wt%、0.85wt%、0.95wt%、1wt%、1.1wt%、1.2wt%或1.25wt%。
进一步，所述壳聚糖溶液的浓度为1-1.5wt%；具体的可以为但不限于1wt%、1.2wt%、1.3wt%、1.4wt%或1.5wt%。
进一步，所述明胶溶液的浓度为1-1.2wt%；具体的可以为但不限于1wt%、1.05wt%、1.1wt%、1.15wt%或1.2wt%。
优选藻酸钠溶液、壳聚糖溶液和明胶溶液的质量比，以及三种溶液的浓度，可以使壁材溶液的包覆性能更佳，进而提高真菌微胶囊的包埋率。
进一步，在本发明提供的技术方案的基础上，所述壳聚糖溶液中的壳聚糖为带正电的短链壳寡糖，分子量<1500Da，纯度>95%。
壳聚糖（平均摩尔质量高于10000Da）完全溶解需要低pH环境，可能会降低厚垣普可尼亚菌的活性。与长链的壳聚糖相比，带正电的短链壳寡糖（chitosan-oligosaccharides，COS）在中性环境中具有更好的水溶性；作为壁材，具有良好的生物相容性，增强微胶囊对厚垣普可尼亚菌的保护作用。
进一步，在本发明提供的技术方案的基础上，所述厚垣普可尼亚菌孢子粉为冻干菌粉，冻干菌粉的活菌数为0.5×108-0.8×108个/g。
生物保藏说明：所述厚垣普可尼亚菌（Pochonia chlamydosporia）为ARSEF3539菌株。ARSEF3539菌株的保藏日期为2020年4月20日，保藏编号为：CGMCC No.19635，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，存活，保藏单位地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，电话：(010)64807355。
ARSEF3539菌株具有如下特性：P.chlamydosporia在CMA固体培养基上生长15d后，菌落直径可达1.5cm，为白色或乳白色菌落，培养基背面呈淡黄色；该菌在SDA（沙氏葡萄糖琼脂）培养基上生长速度比在CMA（肉汤固体培养基）培养基上生长快，且菌落也更为密集。该菌瓶梗呈长锥形，基部膨大，常单生或2~3个轮生，或顶端轮生4-5个，长度为15-26μm×1.0-1.5μm，自基部向顶端渐细，顶宽0.4-0.6μm。分生孢子无色、单细胞，呈球形、卵形或椭圆形，大小为3-4.5μm×1.5-2.2μm。厚垣孢子则是由气生菌丝体细胞质浓缩、外壁增厚形成，呈砖格状，厚壁、具柄，大小为15-30μm，壁厚2-3μm。
本发明第二方面提供了所述的真菌微胶囊的制备方法，包括以下步骤：
（a）按重量份配比，将厚垣普可尼亚菌菌粉与载体混合均匀，得到混合物；
（b）按重量份配比，将步骤（a）得到的混合物与壁材混合均匀，得到混合液；
（c）将步骤（b）得到混合液采用挤压法和/或乳化法，制备得到真菌微胶囊。
进一步，所述挤压法的步骤包括：将步骤（b）得到混合液滴加入硬化剂溶液中，得到真菌微胶囊。
进一步，所述乳化法的步骤包括：将步骤（b）得到混合液滴加入乳化剂溶液中，再加入交联剂，得到真菌微胶囊。
进一步，在本发明提供的技术方案的基础上，所述硬化剂溶液为1.8-2.2%CaCl2溶液，所述乳化剂溶液为植物油，所述交联剂为1.8-2.2% CaCl2溶液。
植物油可以为但不限于大豆油、葵花油或菜籽油。
在本发明的一种实施方式中，真菌微胶囊的制备方法，包括以下步骤：
（1）按重量份配比，将厚垣普可尼亚菌菌粉与载体混合均匀，得到混合物；载体为硅藻土和高岭土的组合物，两者的质量比为1:1；
（2）按重量份配比，将步骤（1）得到的混合物与壁材混合均匀，得到混合液；壁材为海藻酸钠溶液、壳聚糖溶液和明胶溶液的组合物，三者的质量比为2:0.5:0.5；
（3）将步骤（2）得到混合液，用5mL一次性无菌注射器吸取混合液，从一定的高度快速滴入2.0wt% CaCl2溶液中，发生交联反应，制备得到真菌微胶囊。
在本发明的一种实施方式中，真菌微胶囊的制备方法，包括以下步骤：
（1）按重量份配比，将厚垣普可尼亚菌菌粉与载体混合均匀，得到混合物；载体为硅藻土和高岭土的组合物，两者的质量比为1:1.5；
（2）按重量份配比，将步骤（1）得到的混合物与壁材混合均匀，得到混合液；壁材为海藻酸钠溶液、壳聚糖溶液和明胶溶液的组合物，三者的质量比为3:0.8:0.8；
（3）将步骤（2）得到混合液快速加入到植物大豆油中，再用磁力搅拌器以400-500r/min搅拌乳化12-18min；乳化完成后，将CaCl2溶液倒入其中，静置30-40min，后以滤网收集微胶囊颗粒，并用无菌生理盐水清洗，以去除颗粒表面的大豆油，制备得到真菌微胶囊。
本发明第三方面提供了所述的真菌微胶囊，或所述的制备方法制备得到的真菌微胶囊在杀动物寄生虫虫卵中的应用。
进一步，所述动物寄生虫虫卵包括但不限于猪蛔虫虫卵、球虫卵囊、肝片吸虫和马副蛔虫。
本发明采用上述技术方案具有以下有益效果：
（1）本发明提供的真菌微胶囊，能将真菌孢子包裹在胶囊内部，使其与外界环境相隔离的特点，使得菌体免受外界环境影响，提高了稳定性，可以长期储存；
（2）本发明提供的真菌微胶囊，可以保持菌株活性，又可以通过动物消化道，使用方便，用于兽医寄生虫的防治，具有良好的应用开发前景。
附图说明
图1所示为实施例1制备的冻干菌粉。
图2所示为实施例13挤压法制得的微胶囊颗粒。
图3所示为实施例14乳化法制得的微胶囊颗粒。
图4所示为实施例14制备的微胶囊颗粒在不同温度条件下孢子的萌发率。
图5所示为实验例2对猪蛔虫感染性虫卵的侵染作用的图片。
图6所示为实验例3对鸡球虫卵囊的侵染作用的图片。
具体实施方式
除非另有定义，本发明中所使用的所有科学和技术术语具有与本发明涉及技术领域的技术人员通常理解的相同的含义。
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
本发明所用的仪器、试剂和耗材均购自市场。
实施例1：厚垣普可尼亚菌菌株的冻干孢子粉的制备
（1）培养基、孢子洗脱的制备：
1.1）小麦粒培养基的制备：将完整小麦粒清洗干净，烘干，取100g放入菌种袋中，制备30袋，再分别向其中加入100mL蒸馏水，浸泡24h，121℃高温高压灭菌20min后备用；
1.2）PDA固体培养基的制备：将新鲜马铃薯去皮，洗净后切成厘米见方的小块，称取200g加入容器中，并加入500mL蒸馏水，中火煮沸后转入小火，持续约40min，再补充蒸馏水至初始刻度线处；将煮好的马铃薯用350目纱布过滤，取滤液并加入10g无水葡萄糖和8g琼脂，定容至500mL，121℃高温高压灭菌20min后倒平板备用；
1.3）孢子洗脱液的制备：将2mL吐温-80加入到1000mL蒸馏水中，加热并搅拌混合均匀，分装后于121℃高温高压灭菌20min后备用；
（2）接种培养基：在无菌条件下，将厚垣普可尼亚菌菌株，接种于PDA固体培养基上，置于25℃恒温培养箱中培养。在已长满菌丝的PDA固体培养基上用孢子洗脱液少量多次的将孢子冲洗下来，然后按2%的接种量加入到已高温高压灭菌的枸橼酸液体培养基中，放入恒温摇床中，以28℃、150r/min的条件培养7d，然后收集菌液；另取出已经高温高压灭菌的小麦粒培养基，其中每袋含小麦粒100g，向每袋内倒入20mL的液体发酵菌液，封口并使菌液充分与小麦粒混匀，于25℃恒温培养箱中培养；
（3）收集孢子悬液及制备冻干菌粉：在孢子培养至第4周时，用孢子洗脱液少量多次的将孢子洗脱下来，并用血细胞计数板计数，最后再用无菌生理盐水稀释成1×108个/mL的孢子悬液，用冻干保护剂（10%脱脂奶粉）与孢子悬液按1：1混合装入西林瓶中，然后放入－80℃低温冰箱中预冻至少2h，打开真空冷冻干燥机，再打开冷井开关，待温度降至-50℃时，真空冷冻干燥20h。
冻干菌粉照片如图1所示，厚垣普可尼亚菌冻干菌粉保存在西林内，为疏松的海绵状物质，瓶内为真空状态，活菌数为0.6×108个/g。
实施例2：厚垣普可尼亚菌冻干菌粉的复苏效果观察
实验组：实施例1制备的P.chlamydosporia菌株孢子冻干菌粉。
对照组：自然状态下未经冻干的P.chlamydosporia菌株孢子组。
空白对照组：等量无菌注射用水组。
0.4g/L玉米粉琼脂培养基（CMA）制备：取新鲜玉米粉20g，加蒸馏水500mL，微火煮沸40min，补足水分至500mL，450目纱网过滤。取滤液4mL，加蒸馏水396mL，调节PH值为6.0-6.2，再加8g琼脂粉，经121℃高压灭菌20min后，注于灭菌的培养皿中，4℃放置备用。
实验方法：在无菌条件下，用无菌生理盐水溶解冻干后的菌株孢子粉，计数，稀释制成1×107个/mL的孢子悬液，吸取100μL接种到直径为90mm的CMA固体培养基平皿中，共接种3个，作为实验组；将同一批培养洗脱的未冻干的分生孢子，以同样的方法接种另外3个培养基，作为对照组；同时设置加无菌注射用水的空白对照组。然后放于25℃恒温培养箱中，每天定时观察并记录各组孢子的平均萌发个数，计算萌发率。结果见表1。
表1 P.chlamydosporia菌株冻干菌粉萌发率的观察结果
Figure 393078DEST_PATH_IMAGE002
实施例3
一种杀动物寄生虫虫卵的真菌微胶囊，按重量份数计包括：厚垣普可尼亚菌菌粉8份、载体25份和壁材80份；
载体为硅藻土（粒径0.1mm）和高岭土（粒径0.8mm）按质量比1:0.2混合的组合物；壁材为0.75wt%海藻酸钠溶液、1.5wt%壳聚糖溶液和1wt%明胶溶液按质量比1:1:0.5混合的组合物；壳聚糖的分子量<1500Da，纯度>95%。
实施例4
一种杀动物寄生虫虫卵的真菌微胶囊，按重量份数计包括：厚垣普可尼亚菌菌粉15份、载体18份和壁材95份；
载体为硅藻土（粒径0.25mm）和高岭土（粒径0.2mm）按质量比1:2混合的组合物；壁材为1.25wt%海藻酸钠溶液、1wt%壳聚糖溶液和1.2wt%明胶溶液按质量比3:0.5:1混合的组合物；壳聚糖的分子量<1500Da，纯度>95%。
实施例5
一种杀动物寄生虫虫卵的真菌微胶囊，按重量份数计包括：厚垣普可尼亚菌菌粉10份、载体20份和壁材90份；
载体为硅藻土（粒径0.1mm）和高岭土（粒径0.2mm）按质量比1:1混合的组合物；壁材为1wt%海藻酸钠溶液、1wt%壳聚糖溶液和1wt%明胶溶液按质量比2:1:1混合的组合物；壳聚糖的分子量<1500Da，纯度>95%。
实施例6
一种杀动物寄生虫虫卵的真菌微胶囊，与实施例5的区别在于，硅藻土的粒径为1mm，高岭土的粒径为1.5mm。
实施例7
一种杀动物寄生虫虫卵的真菌微胶囊，与实施例5的区别在于，硅藻土和高岭土的质量比为1:5。
实施例8
一种杀动物寄生虫虫卵的真菌微胶囊，与实施例5的区别在于，硅藻土和高岭土的质量比为1:0.1。
实施例9
一种杀动物寄生虫虫卵的真菌微胶囊，与实施例5的区别在于，海藻酸钠溶液、壳聚糖溶液和明胶溶液的质量比5:0.2:0.1。
实施例10
一种杀动物寄生虫虫卵的真菌微胶囊，与实施例5的区别在于，海藻酸钠溶液、壳聚糖溶液和明胶溶液的质量比0.5:3:0.1。
实施例11
一种杀动物寄生虫虫卵的真菌微胶囊，与实施例5的区别在于，海藻酸钠溶液、壳聚糖溶液和明胶溶液的质量比0.5:0.1:3。
实施例12
一种杀动物寄生虫虫卵的真菌微胶囊，与实施例5的区别在于，壳聚糖的分子量>1000Da。
实施例3-12的杀动物寄生虫虫卵的真菌微胶囊中的厚垣普可尼亚菌菌粉为实施例1的冻干菌粉。
实施例13
一种杀动物寄生虫虫卵的真菌微胶囊的制备方法，包括以下步骤：
（1）按实施例5的重量份配比，将厚垣普可尼亚菌冻干孢子粉与载体混合均匀，得到混合物；
（2）将步骤（1）得到的混合物与壁材混合均匀，得到混合液；
（3）将步骤（2）得到混合液，用5mL一次性无菌注射器吸取混合液（注意每吸一次混合液之前都要充分的搅拌混匀，避免孢子分布不均匀），从3cm的高度快速滴入2.0wt% CaCl2溶液中，发生交联反应，制备得到真菌微胶囊。
真菌微胶囊的照片参见图2，挤压法制得微胶囊大小均匀，均为2.43mm左右的白色球状颗粒。
实施例14
一种杀动物寄生虫虫卵的真菌微胶囊的制备方法，包括以下步骤：
（1）按实施例5的重量份配比，将厚垣普可尼亚菌冻干孢子粉与载体混合均匀，得到混合物；
（2）将步骤（1）得到的混合物与壁材混合均匀，得到混合液；
（3）将步骤（2）得到混合液快速加入到植物大豆油中，再用磁力搅拌器以400r/min搅拌乳化15min；乳化完成后，将CaCl2溶液倒入其中，静置30min，后以滤网收集微胶囊颗粒，并用无菌生理盐水清洗3次，以去除颗粒表面的大豆油，制备得到真菌微胶囊。
真菌微胶囊的照片参见图3，乳化法制得的微胶囊颗粒的粒径小，大小在369.1μm左右，且产量大，为白色球状颗粒。
实施例5-12的真菌微胶囊均采用本实施例中的乳化法制备。
对比例1
一种杀动物寄生虫虫卵的真菌微胶囊，与实施例5的区别在于，等量的硅藻土替代高岭土。
对比例2
一种杀动物寄生虫虫卵的真菌微胶囊，与实施例5的区别在于，等量的海藻酸钠溶液替代壳聚糖溶液。
对比例3
一种杀动物寄生虫虫卵的真菌微胶囊，与实施例5的区别在于，等量的海藻酸钠溶液替代明胶溶液。
对比例4
一种杀动物寄生虫虫卵的真菌微胶囊，与实施例5的区别在于，等量的海藻酸钠溶液替代壳聚糖溶液和明胶溶液。
对比例1-4的真菌微胶囊均采用实施例14中的乳化法制备。
实验例1 真菌微胶囊颗粒储存稳定性的检测结果
（1）实施例14制备得到的真微胶囊颗粒分装，放在4℃、-20℃、-80℃和常温下储存，分别在30d、60d、90d、120d、150d测分生孢子的萌发率。
（2）在超净工作台内，分别从4种保存条件下的冻存管中各取出1g厚垣普可尼亚微胶囊颗粒，用无菌生理盐水溶解并稀释成100个孢子/50μL，再取取50μL加到新的CMA固体培养基上，用涂布棒涂布均匀，封口膜封口后放入25℃恒温培养箱培养至第3天时记录萌发率，实验结果见图4。
实验例2 真菌微胶囊对猪蛔虫卵的作用
（1）真菌微胶囊对猪蛔虫卵杀灭作用观察
实验组：实施例5-12，对比例1-4的真菌微胶囊对猪蛔虫感染性虫卵的侵染作用。
对照组：猪蛔虫卵的形态观察。
空白对照组：等量无菌注射用水组。
感染性虫卵的获取：感染性猪蛔虫虫卵由内蒙古农业大学兽医学院寄生虫学研究室提供，于1%H2SO4溶液中10℃冰箱保存，使用时用无菌生理盐水离心洗涤5次（1500r/min，5min），至H2SO4溶液被完全替换，然后稀释成100个虫卵/10μL备用。
实验方法：厚垣普可尼亚菌新鲜菌丝对猪蛔虫虫卵的侵染作用，取已长满厚垣普可尼亚菌的PDA固体培养基，在超净工作台中，用灭菌手术刀从PDA培养基上切下5mm2大小菌丝块，接种于新制备的CMA固体培养基中央，用封口膜封口，置于25℃恒温培养箱倒置培养7d。7d后取已接种菌株的CMA培养基，在其菌落周围分散滴加100μL的感染性猪蛔虫卵，放于25℃恒温培养箱培养，分别在加入后的第7d、14d、21d和28d在光学显微镜下观察100个感染性猪蛔虫卵，统计被厚垣普可尼亚菌菌丝侵染的虫卵数，计算侵染率。
用电子天平称取实验组的真菌微胶囊1g放于10mL离心管中，然后用无菌生理盐水溶解并稀释成1×106个/mL的分生孢子悬液，取出24个新制备的CMA固体培养基随机分为12组，再各加入100μL不同浓度的分生孢子悬液到每组内2个CMA培养基上，封口膜封口后于25℃恒温培养箱培养7d。7d后向CMA培养基中逐个分散滴加100μL的上述猪蛔虫感染性虫卵，封口膜封口，再放于25℃恒温培养箱中培养，同前观察计数虫卵，侵染率见表2。实施例5的微胶囊的侵染结果见图5。
表2 真菌微胶囊对猪蛔虫感染性虫卵的侵染率
Figure 841377DEST_PATH_IMAGE004
结果表示：厚垣普可尼亚菌微胶囊（1×106个/mL）对猪蛔虫感染性虫卵鸡球虫卵囊都有明显的侵染作用。
实验例3 真菌微胶囊对鸡球虫卵囊杀灭作用观察
实验组：实施例5-12，对比例1-4的真菌微胶囊对球虫卵囊的侵染作用。
对照组：鸡球虫卵囊的形态观察。
空白对照组：等量无菌注射用水组。
球虫卵囊的收集：实验用鸡球虫卵囊由内蒙古农业大学兽医寄生虫学研究室提供，于重铬酸钾溶液中保存，用时以无菌生理盐水洗涤（2000r/min，10min），直至重铬酸钾液被完全去除，再用无菌生理盐水稀释至100个卵囊/10μL备用。
实验方法：厚垣普可尼亚菌新鲜菌丝对球虫卵囊的侵染作用，按实施例1中的方法接种和培养真菌。7d后取其中6个CMA培养基，在菌落周围分散滴加100μL的球虫卵囊，用封口膜封口，然后放入25℃恒温培养箱培养，分别在第5d、10d、15d、20d、25d和30d时显微镜下观察100个球虫卵囊，分别统计被厚垣普可尼亚菌菌丝侵染的卵囊数，计算侵染率。
用电子天平称取实验组的真菌微胶囊1g放于10mL离心管中，用无菌生理盐水溶解并稀释成1×106个/mL三种浓度梯度的分生孢子悬液；另取出24个新制备的CMA培养基，随机分为12组，再各取100μL三种浓度的微胶囊分生孢子悬液加入到CMA培养基中，每处理组接种2个，标记后用封口膜封口，再放于25℃恒温培养箱培养7d。7d后在CMA培养基内逐个分散滴加100μL的球虫卵囊，封口膜封口后继续放入25℃恒温培养箱中培养，分别在第5d、10d、15d、20d、25d和30d时在显微镜下观察100个球虫卵囊，分别统计被厚垣普可尼亚菌菌丝侵染的卵囊数，计算侵染率，侵染率见表3。
空白对照组为直接在3个CMA固体培养基中分别加入100μL的球虫卵囊，同样放于相同培养条件下于10d、15d、20d、25d时观察卵囊形态变化，实施例5真菌微胶囊的侵染结果见图6。
表3 真菌微胶囊对鸡球虫卵囊的侵染率
Figure DEST_PATH_IMAGE005
实验例4 真菌微胶囊颗粒通过家兔消化道能力的研究
取6只健康的家兔，随机分为实验组（实施例5和对比例4的真菌微胶囊）和对照组，每组各2只。实验开始后，给实验组每只兔子饲喂1g真菌微胶囊颗粒（含分生孢子1×106个），对照组每只兔子饲喂1g空白颗粒（不含厚垣普可尼亚菌），从饲喂当天开始，白天每隔5h收集一次兔子粪便，夜间的粪便第二天早上收取，将每次收集到的粪便称重并记录，然后将粪便充分的混匀，取0.1g均匀的涂布在CMA双抗培养基上，每组2个重复，封口膜封口后放于25℃恒温培养箱中培养，共收集5d兔粪便，通过观察培养基中分生孢子的萌发数来评定厚垣普可尼亚菌微胶囊颗粒通过动物消化道的能力，实验结果见表4。
表4 厚垣普可尼亚微胶囊通过兔消化道后分生孢子数及萌发率
Figure DEST_PATH_IMAGE007
同时实验组中的实施例5家兔第1d粪便中分生孢子数量最多，平均为47856个，从第2d后粪便中分生孢子数量逐渐减少，至第5d时，粪便中已无分生孢子，说明兔体内的厚垣普可尼亚菌微胶囊已全部排出。实验将家兔5d内粪便集中起来，并统计其中分生孢子总数，进而计算得分生孢子的消化道通过率（即通过率=分生孢子总数/投喂分生孢子总数×100%）。上述结果说明厚垣普可尼亚菌微胶囊中的分生孢子可以部分通过兔消化道，这也是利用真菌微胶囊防治动物寄生虫的重要前提。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种杀动物寄生虫虫卵的真菌微胶囊，其特征在于，按重量份数计包括：厚垣普可尼亚菌菌粉8-15份、载体18-25份和壁材80-95份；
所述载体为硅藻土和高岭土的粉状组合物；
所述壁材为海藻酸钠溶液、壳聚糖溶液和明胶溶液的液体状组合物。
2.根据权利要求1所述的真菌微胶囊，其特征在于，所述真菌微胶囊的粒径为0.3-2.5mm，活菌数为5×106-10×106个/g。
3.根据权利要求1所述的真菌微胶囊，其特征在于，所述载体中硅藻土和高岭土的质量比为1:（0.2-2）；
优选地，所述硅藻土的粒径为0.1-0.25mm；
优选地，所述高岭土的粒径为0.2-0.8mm。
4.根据权利要求1所述的真菌微胶囊，其特征在于，所述壁材中海藻酸钠溶液、壳聚糖溶液和明胶溶液的质量比为（1-3）:（0.5-1）:（0.5-1）；
优选地，所述海藻酸钠溶液的浓度为0.75-1.25wt%；
优选地，所述壳聚糖溶液的浓度为1-1.5wt%；
优选地，所述明胶溶液的浓度为1-1.2wt%。
5.根据权利要求4所述的真菌微胶囊，其特征在于，所述壳聚糖溶液中的壳聚糖为带正电的短链壳寡糖，分子量<1500Da，纯度>95%。
6.根据权利要求1-5任一项所述的真菌微胶囊，其特征在于，所述厚垣普可尼亚菌孢子粉为冻干菌粉，冻干菌粉的活菌数为0.5×108-0.8×108个/g；
优选地，所述厚垣普可尼亚菌为ARSEF3539菌株，其保藏号为：CGMCC No.19635。
7.权利要求1-6任一项所述的真菌微胶囊的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
按重量份配比，将厚垣普可尼亚菌菌粉与载体混合均匀，得到混合物；
按重量份配比，将步骤（a）得到的混合物与壁材混合均匀，得到混合液；
将步骤（b）得到混合液采用挤压法和/或乳化法，制备得到真菌微胶囊。
8.根据权利要求7所述的制备方法，其特征在于，所述挤压法的步骤包括：将步骤（b）得到混合液滴加入硬化剂溶液中，得到真菌微胶囊；
优选地，所述乳化法的步骤包括：将步骤（b）得到混合液滴加入乳化剂溶液中，再加入交联剂，得到真菌微胶囊。
9.根据权利要求7所述的制备方法，其特征在于，所述硬化剂溶液为1.8-2.2% CaCl2溶液，所述乳化剂溶液为植物油，所述交联剂为1.8-2.2% CaCl2溶液。
10.权利要求1-6任一项所述的真菌微胶囊，或权利要求7-9任一项所述的制备方法制备得到的真菌微胶囊在杀动物寄生虫虫卵中的应用。
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