CN110358709B

CN110358709B - 一种荧光假单胞菌微胶囊剂及其制备方法和应用

Info

Publication number: CN110358709B
Application number: CN201910665970.6A
Authority: CN
Inventors: 王伟; 王晓冰; 陈俊; 朱晓冲; 杨海军
Original assignee: East China University of Science and Technology
Current assignee: East China University of Science and Technology
Priority date: 2019-07-23
Filing date: 2019-07-23
Publication date: 2021-01-29
Anticipated expiration: 2039-07-23
Also published as: CN110358709A

Abstract

本发明公开了一种荧光假单胞菌微胶囊剂及其制备方法和应用，所述微胶囊剂包含荧光假单胞菌、明胶、海藻酸钠和可溶性淀粉。制备方法包括以下步骤：提供含荧光假单胞菌的发酵液，用偏高碘酸钠将海藻酸钠氧化，将含生防菌的发酵液与氧化海藻酸钠和明胶和淀粉混合剂混合，在氯化钙溶液中交联制得微胶囊，干燥得到所述微胶囊制剂。所述微胶囊制剂可在防治植物病害促进植物生长中应用。本发明的缓释控释微胶囊剂可用于包埋荧光假单胞菌和其发酵代谢产物，比用传统方法生产的海藻酸钠微胶囊制剂具有更强的保护力和生物相容性，更好的生物降解性和可控的缓释速率。

Description

一种荧光假单胞菌微胶囊剂及其制备方法和应用

技术领域

本发明涉及农业生物技术领域，特别涉及一种荧光假单胞菌微胶囊剂及其制备方法和应用。

背景技术

荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)是一类革兰氏阴性杆状细菌，具有分布广、繁殖快、数量多、营养需要简单、竞争定殖力强、可产生多种抗生素的特点。对植物病害，尤其是土传病害如猝倒病、根腐病、枯萎病、小麦全蚀病等都具有较好的防治效果，是一种重要的有益微生物资源。荧光假单胞菌菌剂对多种植物病原菌有很强的拮抗作用，具有繁殖速度快、适应能力强、易于人工培养、制剂稳定、施用方便等优点，更符合现代社会对农业生产及有害生物综合防治的需求。荧光假单胞菌不但可以单独使用，也可与其他拮抗菌或物质混合使用，实现多种抗生菌功能互补、兼防多种病害、作用持久的协同防治效果。

目前国内陆续出现了一些荧光假单胞菌制剂的报道，但产业化不多，剂型多集中在可湿性粉剂上，如南京农业大学郭坚华申请的“防治多种细菌性病害的生防菌株4AT8”,该发明制备的为荧光假单胞菌水剂，菌种保存液为磷酸缓冲液和吐温20；上海师范大学肖明2009年申请的“荧光假单胞菌微生物农药的制备方法”，该制剂为使用硅藻土为吸附剂的可湿性粉剂；江苏省常州兰陵制药有限公司于2009年申请的专利，PD20090001荧光假单胞菌母药总含量6000亿个/克。但是由于荧光假单胞菌在常温下不能长时间存活，因此上述专利制备的荧光假单胞菌剂，在室温下存放一定时间后，制剂的活菌含量急剧下降，几个月内便损失大多数菌体，造成菌剂的持效期短，不能长效使用。此外，生物菌剂用于防治植物病害还仍有许多问题有待解决，例如缺乏高效的菌株，防效不稳定，应用领域窄等问题，因此目前化学农药在防治植物病害中仍占主导地位。因此如能解决制剂储存时间的问题，制备一种能够使菌体在常温下稳定存活(1年以上)的制剂，开发出荧光假单胞菌的巨大应用潜力具有重要意义。

发明内容

本发明的目的在于提供一种荧光假单胞菌微胶囊剂及其制备方法和应用，以解决现有技术中荧光假单胞菌储存时间短，不能达到长效防治植物病害的技术问题。

本发明的技术方案之一在于提供一种荧光假单胞菌微胶囊剂，所述微胶囊剂包含荧光假单胞菌、交联剂和保护剂，其中荧光假单胞菌为荧光假单胞菌SN15-2，保藏编号为CGMCCNo.17211，保藏日期为：2019年01月18日，分类命名为：荧光假单胞菌Pseudomonasfluorescens；保藏地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号；

荧光假单胞菌进行微囊化可以使荧光假单胞菌与外界环境隔绝，使其能够抵御机械力和外界环境的影响，从而长时间保持其生物活性；保护剂在干燥过程中对菌体进行保护，同时在菌剂形成后对于紫外线等外部条件具有保护作用；交联剂粘结活性物质，便于加工使用。

作为本发明的进一步改进，所述交联剂选自明胶、淀粉或二者组合物，所述保护剂选自海藻酸钠、氧化海藻酸钠或二者组合物；

海藻酸钠具有良好的成囊性和生物相容性，用其包埋微生物能够在保持荧光假单胞菌具有良好的生物活性的同时保证其不被外界环境所侵害，提高荧光假单胞菌存活率，延长了菌剂的有效期。

作为本发明的进一步改进，所述氧化海藻酸钠是由偏高碘酸钠将海藻酸钠氧化得到的，所用的偏高碘酸钠的摩尔质量为海藻酸钠单元的摩尔量的5％-50％；

海藻酸钠具有良好的成囊性和生物相容性，但是以海藻酸钠作保护剂外模坚硬不易破裂，将其由偏高碘酸钠进行氧化后制得的氧化海藻酸钠作为保护剂制备的缓/控释微胶囊在自然土壤环境中能够缓慢控制包含微生物的释放，长效预防植物土传病害的发生；不同偏高碘酸钠的用量制备的氧化海藻酸钠具有不同的氧化度，氧化度的不同引起制备的微胶囊的溶胀性的差异。

作为本发明的进一步改进，氧化海藻酸钠的氧化度为30％，以其为保护剂时，微胶囊的生物降解性明显好于海藻酸钠微胶囊。

作为本发明的进一步改进，所述荧光假单胞菌含量为10⁷-10¹⁴个活细胞/克，优先为10⁸-10¹¹个细胞/克。

本发明的技术方案之二在于提供上述荧光假单胞菌微胶囊剂的制备方法，由荧光假单胞菌发酵液与交联剂、保护剂的混合物在氯化钙溶液中挤压交联得到，交联剂的用量为发酵液的0％-10％(kg/L)，保护剂的用量为1％-15％(kg/L)，氯化钙溶液浓度为1％-3％；

采用液体发酵生产荧光假单胞菌为有效成分与交联剂、保护剂和进行有机复配后在氯化钙溶液中交联成膜，有效避免菌剂在后期干燥使用过程中由于温度较高或外界机械力导致的胶囊破碎，提高菌种存活率，稳定药效期。

作为本发明的进一步改进，上述荧光假单胞菌微胶囊剂的制备方法具体包括以下步骤：

(1)制备含荧光假单胞菌的发酵液；

(2)用偏高碘酸钠将海藻酸钠氧化成海藻酸钠保护剂；

(3)将含荧光假单胞菌的发酵液与交联剂、保护剂混合，挤压在氯化钙溶液中交联制得所述微胶囊，将得到的微胶囊通过干燥得到所述微胶囊制剂。

作为本发明的进一步改进，上述步骤(1)中的发酵液用以下方法获得：将荧光假单胞菌种子液接种至发酵培养基中，温度25～33℃、种子接种量2～10％，种子浓度10⁵-10⁸个/mL，通气比1:2至2:1，罐压0.03-0.05MPa，发酵18-36小时，获得含荧光假单胞菌的发酵液；

作为本发明的进一步改进，上述发酵培养基的组成按重量计是为蔗糖0.2-1.5％，玉米粉1-5％，豆饼粉1-5％，七水硫酸镁0.05-0.25％，一水合硫酸锰0.05-0.25％，pH 7.0-8.0，硅聚醚消泡剂0.5‰-2‰，余量为水；

作为本发明的进一步改进：温度25～28℃、种子接种量6～9％、种子浓度10⁵-10⁸个/mL、通气比1:2至2:1，罐压0.03-0.05MPa下，发酵18-36小时，获得含荧光假单胞菌的发酵液，其中所述发酵培养基的组成按重量计是：蔗糖0.5％，玉米粉2.5％，豆饼粉1.8％，七水硫酸镁0.16％，一水合硫酸锰0.15％，pH 7.0-8.0，硅聚醚消泡剂1.5‰。

工业上常用的且价格低廉的碳源：可溶性淀粉、麦芽糖、蔗糖、玉米粉、甘油、红糖、乳糖、麸皮、糯米粉、高粱粉、小麦粉中，当荧光假单胞菌SN15-2利用玉米粉、蔗糖，蔗糖作为速效碳源时其发酵液的菌体生物量生长速度快，但是最后的菌体生物量没有玉米粉的多，加入蔗糖作为速效碳源，可促进菌体的前期生长，玉米粉作为迟效碳源，可以延长菌体生长时间；而工业上常用且价格低廉的氮源：酵母膏、酵母粉、花生粉、豆饼粉、黄豆粉、干酪素、尿素、硫酸铵、硝酸钾中，荧光假单胞菌SN15-2最易利用豆饼粉，黄豆粉，豆饼粉的价格相对便宜，并且豆饼粉作为迟效氮源有利于最后形成的菌体生物量大，因此从经济价格和菌体大量形成的角度考虑，采用豆饼粉作为其发酵培养基的氮源；工业上常用且价格低廉的无机盐中影响荧光假单胞菌生物量较为显著的无机盐为MnS0₄·H₂0和MgS0₄·7H₂O。

本发明的技术方案之三在于提供上述荧光假单胞菌微胶囊剂在防治植物病害促进植物生长中的应用；

作为本发明的进一步改进：上述植物病害为土传病害包括根腐病、立枯病和茄果类青枯病和植物枯萎病。

本发明至少包括以下有益效果：本发明的荧光假单胞菌微胶囊剂可用于防治多种植物土传病害，特别是对蔬菜青枯病和植物枯萎病有较好的防治效果。通过该发明生产出的荧光假单胞菌微胶囊剂比用传统方法生产的活菌制剂具有更强的生存能力和抗逆能力，更适合于生产应用。解决了目前荧光假单胞菌生物农药货架期短、加工过程死亡率高导致的无法大规模生产以及生产和应用过程中的粉尘问题。

附图说明

图1为本发明实施例1微胶囊的扫描电镜图；

图2为不同壁材组成的微胶囊的溶胀性变化图；

图3为不同壁材组成的微胶囊的生物降解性变化图；

具体实施方式

下面对本发明做进一步的详细说明，以令本领域技术人员参照说明书文字能够据以实施。

应当理解，本文所使用的诸如“具有”、“包含”以及“包括”术语并不排除一个或多个其它元件或其组合的存在或添加。

实施例1

制备氧化海藻酸钠具体方法包括以下步骤：

(1)取海藻酸钠50g放入搅拌器中，加入1L无水乙醇，搅拌半小时待分散均匀后缓慢滴入偏高碘酸溶液，加入不同量的偏高碘酸钠得到不同氧化度的海藻酸钠；

(2)避光反应12h后，将反应体系加入到分子量为6000-8000DA的透析袋中，在超纯水的环境中进行透析48h，期间每隔6h更换一次超纯水；

(3)透析完成后取出，在40℃下进行低温干燥。将得到的样品进行凝胶离子色谱确定其分子量(表1)。

表1不同氧化度的海藻酸钠的重均分子量和数均分子量

经检测，制得的按不同偏高碘酸钠量得到的不同的氧化度海藻酸钠的重均和数均分子量符合Mw/Mn＜2要求，证明得到的氧化海藻酸钠分子量分布均匀。

实施例2

(1)采用液态发酵的方法培养荧光假单胞菌：

所用菌株：荧光假单胞菌SN15-2，保藏编号为CGMCC No.17211，保藏日期为：2019年01月18日，分类命名为：荧光假单胞菌Pseudomonas fluorescens；保藏地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号；

发酵培养基：蔗糖0.5％，玉米粉2.5％，豆饼粉1.8％，七水合硫酸镁0.16％，一水合硫酸锰0.15％，磷酸氢二钾0.4％，磷酸二氢钾0.2％，pH 7.0-8.0，硅聚醚消泡剂1.5‰。

培养条件：温度28℃，种子接种量6％，种子浓度1×10⁷个/mL，通气比1：2，罐压0.04MPa，发酵时间18-38小时得荧光假单胞菌发酵液。

(2)取海藻酸钠50g放入搅拌器中，加入1L无水乙醇，搅拌半小时分散均匀后缓慢滴入偏高碘酸溶液，加入不同量的偏高碘酸钠分别得到氧化度为5％、10％、15％、20％、25、30％的氧化海藻酸钠，避光反应12h后，将反应体系加入到分子量为6000-8000DA的透析袋中，在超纯水的环境中进行透析48h，期间每隔6h更换一次超纯水，透析完成后取出在40℃下进行低温干燥；

(3)将步骤(1)发酵好的50ml荧光假单胞菌发酵液分别于氧化度为5％、10％、15％、20％、25、30％的氧化海藻酸钠和淀粉加入量为0％(DS0)、3％(DS1)、4％(DS2)、5％(DS3)、6％(DS4)和7％(DS5)进行复配不断搅拌直到完全均相溶解后用20ml注射器分别将混合液滴入到2％氯化钙溶液中，得到包含荧光假单胞菌发酵液的微胶囊，真空冷冻干燥得荧光假单胞菌微胶囊制剂；经过扫描电镜得到微胶囊的外观形态(图1)，从扫描电镜的图片结果可以看出微胶囊基本呈现不规则的圆形。

效果例1

取0.5g各样品和0.5g海藻酸钠微胶囊用1cm×1cm的尼龙袋封装，埋入5cm的自然土下，定期浇水保持土壤湿润每隔5天取出进行称量，测定不同壁材组成的微胶囊的生物降解性(图2)；根据生物降结果可以看出，以30％氧化度的海藻酸钠为保护剂制备的海藻酸钠微胶囊在自然土壤中的生物降解性明显好于未氧化的海藻酸钠微胶囊，随着淀粉含量的增加其生物降解性也随之提高。

分别取实施例2得到的保护剂为30％氧化度的海藻酸钠和淀粉加入量为0％(DS0)、2％(DS1)、4％(DS2)、6％(DS3)、8％(DS4)和10％(DS5)制备的微胶囊0.5g和与10ml无菌水封装在15ml离心管中，24h后测定其溶胀性(图3)；根据溶胀性结果可以看出在30％氧化度的海藻酸钠为保护剂时，随着添加的淀粉的含量的增加，微胶囊的溶胀性越好，导致微胶囊越容易破碎。说明以淀粉为交联剂时，不仅起到粘结活性物质，便于加工使用的作用，其还可以同氧化的海藻酸钠发生协同作用，改善其内部组织的均一性和持水作用，通过控制淀粉的加入量可以控制胶囊的破碎时间，促进有效物质的长效释放。

实施例3

(1)利用实施例2步骤(1)的方法制备荧光假单胞菌发酵液。

(2)取海藻酸钠50g放入搅拌器中，加入1L无水乙醇，搅拌半小时分散均匀后缓慢滴入偏高碘酸溶液，加入偏高碘酸钠得到氧化度30％的海藻酸钠，避光反应12h后，将反应体系加入到分子量为6000-8000DA的透析袋中，在超纯水的环境中进行透析48h，期间每隔6h更换一次超纯水，透析完成后取出在40℃下进行低温干燥。

(3)制备微胶囊制剂

将步骤(1)制得的荧光假单胞菌发酵液50ml、质量分数15％的氧化海藻酸钠、质量分数6％淀粉进行复配不断搅拌直到完全均相溶解，用20ml注射器分别将混合液滴入到2％氯化钙溶液中，得到包含荧光假单胞菌发酵液的微胶囊，真空冷冻干燥得荧光假单胞菌微胶囊制剂；

实施例4

制备方法同实施例3，区别在于步骤(1)中制备荧光假单胞菌发酵液时的发酵培养基不加入0.5％蔗糖，玉米粉加入量3.0％；

实施例5

步骤(1)、步骤(2)同实施例3，区别在将步骤(1)制得的荧光假单胞菌发酵液50ml、质量分数15％的氧化海藻酸钠、质量分数6％淀粉进行复配不断搅拌直到完全均相溶解后将混合液进行喷雾干燥制备微胶囊剂；

效果例2

将实施例3-5所制备的微胶囊剂分别进行菌含量和菌体存活率检测见表2；

菌体存活率(％)＝[制剂实际菌含量(cfu/g)/制剂理论菌含量(cfu/g)]×100

制剂理论菌含量＝[1/W(保护剂和交联剂总质量与发酵液体积百分比)]×发酵液菌含量

表2实施例3-5微胶囊中菌含量和菌体存活率

	发酵液菌含量	制剂菌含量，cfu/g	菌体存活率，％
				实施例3	2.0×10<sup>8</sup>个/mL	8.81×10<sup>8</sup>	92.5
实施例4	1.5×10<sup>8</sup>个/mL	5.95×10<sup>8</sup>	83.3
				实施例5	2.0×10<sup>8</sup>个/mL	7.23×10<sup>8</sup>	76.0

由表2可得，发酵液中加入少量的蔗糖有助于发酵液中菌种量的增加；将发酵液、保护剂和交联剂复配后在氯化钙中成膜制备微胶囊剂对囊内的菌种起到了显著的保护作用，有助于提升菌剂中的菌体存活率。

对实施例3制备的微胶囊剂按照《中华人民共和国国家标准》进行测定，pH测定GB/T 1601-1993；水分测定GB/T 1600-2001；悬浮率测定GB/T 14825-2006；润湿性测定GB/T5451-2001；细度测定GB/T 16150-1995，其他指标根据相关文献方法进行测试。结果如表3所示

应用例：微胶囊菌剂对番茄青枯病的盆栽防效分析

供药试剂：假单胞菌制剂(实施例3-5制得)，对照药剂为200PPM硫酸链霉素和清水。

供试作物：番茄。

药剂用量：实施例3假单胞菌制剂含量为8.81×10⁸cfu/克，实施例4假单胞菌制剂含量为5.95×10⁸cfu/克，实施例5假单胞菌制剂含量为7.23×10⁸cfu/克，假单胞菌制剂200倍稀释，200PPM硫酸链霉素，以清水作空白对照。

实验安排：实验在光照培养箱中进行，每天光照时间为16h，温度为25℃。非光照时间温度设为22℃，土壤湿度保存在60％左右，待幼芽长出两片子叶，灌根接种青枯病菌(1.2×106CFU/g干土)，24h后，将假单胞菌缓释颗粒埋与土壤表层下，并设置200PPM硫酸链霉素和清水作为对照。

接种病原菌15d后，按照姚协丰等提出的病害严重度标准对番茄发病情况进行分级。病害严重度和防治效果的计算公式：

假单胞菌制剂对青枯病的盆栽防效分析的结果见表4。

表4盆栽实验中假单胞菌制剂稀释液对青枯病的防治效果

	病害严重度/％	防治效果/％
			实施例3	40.55±4.20a	75.15±1.09a
实施例4	41.85±4.62a	49.08±1.27a
			实施例5	40.94±4.51a	57.13±1.15a
硫酸链霉素	52.22±5.09b	33.59±4.48b
			清水对照	75.833±6.29c	—

注：表中数据是三次重复的平均值，同列不同小写字母代表差异显著(P<0.05)。

如表4所示，实施例3-5制剂和硫酸链霉素都能够显著降低番茄青枯病病害的严重程度。但实施例3制剂的防治效果达到75.15％，显著高于硫酸链霉素的33.59％。实施例3制剂和实施例4、实施例5制剂相比，防治效果也显著提高，说明本发明的制剂能显著提高防治效果。

尽管本发明的实施方案已公开如上，但其并不仅仅限于说明书和实施方式中所列运用，它完全可以被适用于各种适合本发明的领域，对于熟悉本领域的人员而言，可容易地实现另外的修改，因此在不背离权利要求及等同范围所限定的一般概念下，本发明并不限于特定的细节和这里示出与附图。

Claims

1.一种荧光假单胞菌（Pseudomonas fluorescens）微胶囊剂，其特征在于，包含荧光假单胞菌、交联剂和保护剂，所述微胶囊剂中荧光假单胞菌为荧光假单胞菌SN15-2，保藏编号为CGMCC No.17211；

所述交联剂为淀粉；所述保护剂为氧化海藻酸钠；

所述氧化海藻酸钠是由偏高碘酸钠将海藻酸钠氧化得到的，所用的偏高碘酸钠的摩尔质量为海藻酸钠单元的摩尔量的30％；

所述荧光假单胞菌微胶囊剂由荧光假单胞菌发酵液与交联剂、保护剂的混合物在氯化钙溶液中挤压交联得到，交联剂的用量为发酵液的0％-10％kg/L，保护剂的用量为1％-15％kg/L，氯化钙溶液浓度为1％-3％。

2.如权利要求1所述的一种荧光假单胞菌微胶囊剂，其特征在于，所述荧光假单胞菌在微胶囊剂中的含量为10⁷-10¹⁴个活细胞/克。

3.如权利要求1-2任一项所述的荧光假单胞菌微胶囊剂的制备方法，其特征在于，由荧光假单胞菌发酵液与交联剂、保护剂的混合物在氯化钙溶液中挤压交联得到，交联剂的用量为发酵液的0％-10％kg/L，保护剂的用量为1％-15％kg/L，氯化钙溶液浓度为1％-3％。

4.如权利要求3所述的荧光假单胞菌微胶囊剂的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)制备含荧光假单胞菌的发酵液；

(2)用偏高碘酸钠将海藻酸钠氧化成海藻酸钠保护剂；

5.如权利要求4所述的荧光假单胞菌微胶囊剂的制备方法，其特征在于，步骤(1)中的发酵液用以下方法获得：将荧光假单胞菌种子液接种至发酵培养基中，温度25～33℃、种子接种量2～10％，种子浓度10⁵-10⁸个/mL，通气比1:2至2:1，罐压0.03-0.05MPa，发酵18-36小时，获得含荧光假单胞菌的发酵液。

6.如权利要求5所述的荧光假单胞菌微胶囊剂的制备方法，其特征在于，发酵培养基为蔗糖0.2-1.5％，玉米粉1-5％，豆饼粉1-5％，七水硫酸镁0.05-0.25％，一水合硫酸锰0.05-0.25％，硅聚醚消泡剂0.5‰-2‰，余量为水；pH 7.0-8.0。

7.如权利要求1所述的荧光假单胞菌微胶囊剂在防治青枯病中的应用。