CN107955802A - 一种厚垣孢普可尼亚菌固体发酵产孢的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种厚垣孢普可尼亚菌固体发酵产孢的方法，包括厚垣孢普可尼亚菌菌种活化、发酵液的制备以及固体发酵产孢的步骤；其中，所述固体发酵产孢中所使用的固体发酵培养基配方为（以下为重量百分比）：20~50目玉米粉60~76%，20~50目菌草20%~36%，蔗糖1.0%~5%，硝酸钠1%~5%，氯化钠1%~5%，pH自然。采用本发明提供的固体发酵方法，浅盘发酵厚垣孢普可尼亚菌，发酵培养10天，分生孢子产量达3.87×109个/g，厚垣孢子产量达1.85×106个/g，且原材料廉价易得，成本低，发酵获得的孢子‑基质混合物经干燥后可直接用于作物线虫病害的防治或加工成制剂使用。

Description

一种厚垣孢普可尼亚菌固体发酵产孢的方法
技术领域
本发明涉及一种厚垣孢普可尼亚菌固体发酵产孢的方法，属于微生物发酵领域。
背景技术
植物寄生线虫病害属于土传病害，主要采用传统化学药剂防治。厚垣孢普可尼亚菌是一种兼性寄生菌，既能寄生线虫又能在土壤中营腐生生活，广泛分布于世界各地的土壤中，其显著的特征是能形成厚壁的、砖格状的厚垣孢子，厚垣孢子对高温、干旱的耐受力强，易在极端环境下存活，具有其他线虫生防菌所没有的优势，有较大的生防潜力。
生防制剂的生产工艺主要包括菌株选育、发酵工艺和剂型研制等要素，高效、稳定的菌株是实现生防菌应用的前提，发酵工艺是生防菌大规模生产的关键。厚垣孢普可尼亚菌能在多种液体和固体基质中生长和繁殖，但在液体培养时难以产生厚垣孢子。而固体发酵能产生与自然接种体相似的气生分生孢子或厚垣孢子，且产生的孢子在常温下比液体发酵产生的孢子稳定。目前生防菌剂大规模工业化生产应用得较多的是液固双相发酵工艺，该工艺最大的特点是液体和固体培养基的配制，并且充分利用了液体发酵和固体发酵的优点，利用液体发酵快速生产大量的菌丝或孢子作为固体发酵的接种体，然后在固体基质上产生接近自然侵染体形态的气生分生孢子或厚垣孢子。
国内外研究表明厚垣孢普可尼亚菌能在麦麸、小麦、小麦杆、大麦谷粒及粗沙混合组成的培养基上生长并产生厚垣孢子；以胡萝卜块、大米粒、玉米粒、马铃薯块、小麦粒、高粱粒、麦秆、稻秆为固体培养基质培养厚垣孢普可尼亚菌，在马铃薯块上厚垣孢子产量最大，为18.75×104 个/mL，而稻秆上不产生厚垣孢子，在大米粒和高粱粒上长势最好。以高粱粒为原料大批量培养厚垣孢普可尼亚菌，以鸡粪为载体，添加适量微量元素、金属离子、氮肥制成的“豆丰”一号颗粒剂对大豆胞囊线虫有较好的持续防治效果。虽然在麦麸、小麦、玉米粒、草炭等固体培养基上都能培养厚垣孢普可尼亚菌，但没有形成大规模的发酵生产技术。
发明内容
本发明的目的是提供一种能够使厚垣孢普可尼亚菌产生大量孢子的液体和固体培养基以及固体发酵方法。
本发明所述的方法包括以下步骤：厚垣孢普可尼亚菌菌种活化、发酵液的制备以及固体发酵产孢。
步骤一，厚垣孢普可尼亚菌菌种活化：将厚垣孢普可尼亚菌菌种接种在PSA斜面培养基上活化，28℃黑暗培养5天。
步骤二，发酵液的制备：斜面菌种活化后，接种到PSA平板上，28℃黑暗培养5天，用打孔器从平板上菌落边缘打取菌碟（φ=10mm）作为接种体，按每100mL培养液接入5个菌碟，培养液为3wt.%虾壳粉培养液，28℃、150r/min摇床振荡培养48~72h，即得种子液。将种子液按10%的接种量接种至3wt.%虾壳粉培养液中，28℃、150r/min摇床振荡培养48~72h，即得发酵液。
步骤三，固体发酵产孢：固体发酵产孢所使用的培养基配方为： 20~50目玉米粉60%~76%，菌草20%~36%，蔗糖1.0%~5.0%，硝酸钠1.0%~5.0%，氯化钠 1.0%~5.0%，pH自然。
优选的，固体发酵产孢所使用的培养基配方为：30~50目玉米粉65%~75%，菌草按20%~30%的比例混合，蔗糖0.75%~3.0%，硝酸钠0.85%~3.4%，氯化钠 1.0%~3.0%，pH自然。
更为优选的，固体发酵产孢所使用的培养基配方为：30目玉米粉67.65%，菌草29.0%，蔗糖1.5%，硝酸钠0.85% ，氯化钠 1.0% ，pH自然。
固体发酵产孢的方法为组培瓶发酵或浅盘发酵。
组培瓶发酵：30目玉米粉67.65%，菌草29.0%，蔗糖1.5%，硝酸钠0.85%，氯化钠1.0%，pH自然，加入水拌匀，含水量为50%，分装于组培瓶中。每瓶装10g培养基，用纱布封口，121℃间歇湿热灭菌30min，降温后以48~60h的发酵液作为固体发酵的接种体，接种量为0.50 ~1.50mL/g。置于28℃培养箱中静置培养7天。
浅盘发酵：30目玉米粉67.65%，菌草29.0%，蔗糖1.5%，硝酸钠0.85% ，氯化钠 1.0%，pH自然，加入水拌匀，含水量为50%，用聚乙烯袋装好后，121℃间歇湿热灭菌30min。冷却后，以48~60h的发酵液作为固体发酵的接种体，接种量为0.50 ~1.50mL/g，将接种后的培养料平铺于浅盘上，厚度约3~5cm，将浅盘置于28℃、湿度为80%以上的条件下，培养10天。
优选的，固体发酵方法中，以48h的发酵液作为固态发酵的接种体，接种量为0.50mL/g。
本发明中用于固体发酵产孢的厚垣孢普可尼亚菌菌株PC152为福建地区分离的野生菌株，经对根结线虫卵的致病性筛选后获得。
本发明的优点在于：本发明提供了一种厚垣孢普可尼亚菌固体发酵产孢的方法，厚垣孢普可尼亚菌菌种活化、发酵液的制备以及固体发酵产孢。所述发酵液的制备使用的液体培养基由虾壳粉组成。所述固体发酵使用的固体培养基由玉米粉、菌草、蔗糖、硝酸钠、氯化钠组成，其中玉米粉、蔗糖作为碳源及能源物质，硝酸钠作为氮源物质，适量的氯化钠在一定程度上可提高孢子的产量，诱导厚垣孢子的形成并增加厚垣孢子的产量，菌草在培养基中起疏松、通气的作用。采用本发明提供的固体发酵方法，浅盘发酵厚垣孢普可尼亚菌，发酵培养10天，分生孢子产量达3.87×109个/g，厚垣孢子产量达1.85×106个/g，且原材料廉价易得，成本低，发酵获得的孢子-基质混合物经干燥后可直接用于作物线虫病害的防治或加工成制剂使用。
具体实施方式
以下是本发明的具体实施例，但本发明的内容并不局限于此。
实施例一 玉米粉与菌草不同配比的培养基对厚垣孢普可尼亚菌产孢的影响
1.厚垣孢普可尼亚菌菌种活化
将厚垣孢普可尼亚菌菌种接种在PSA斜面培养基上活化，28℃黑暗培养5天。
2.发酵液的制备
斜面菌种活化后，接种到PSA平板上，28℃黑暗培养5天，用打孔器从平板上菌落边缘打取菌碟（φ=10mm）作为接种体，按每100mL培养液接入5个菌碟接入3%虾壳粉培养液中，28℃、150r/min摇床振荡培养48h，即得种子液。将种子液按10%的接种量接种至3%虾壳粉培养液中，28℃、150r/min摇床振荡培养48h，即得发酵液。
3. 固体发酵产孢
将玉米粉与菌草按6：4、7：3、8：2的比例混合，加入适量水拌匀，含水量为50%，pH自然，分装于组培瓶中。每瓶装10g培养基，121℃间歇湿热灭菌30min，降温后以48h的发酵液作为固体发酵的接种体，接种量0.50 mL/g，置于28℃培养箱中静置培养7天。每处理重复3次。
4.固体发酵产孢量测定
培养结束后，无菌条件下，用镊子夹出一定量的发酵产物于装有若干个玻璃珠的三角瓶中，加入100mL 0.15%(V/V)吐温-80溶液，置于150r/min摇床上充分振荡30min，获得的孢子悬浮液稀释一定倍数后，用血球计数板计数，计算其产分生孢子量(个/g)。
厚垣孢子由于其直径（20~25μm）较大，不易用血球计数板计数，故用此法计数：用移液枪吸取定量的（20μL）孢子悬浮液于载玻片上，盖上盖玻片，在光学显微镜下逐一计数，3次重复。
5.试验结果
从表1可见玉米粉与菌草的比例在7：3~8：2间产厚垣孢子量及分生孢子量均无显著差异。培养基中菌草含量高会影响该菌的生长及产孢，因菌草在培养基中不提供营养，只是起疏松、通气的作用；菌草含量低，玉米粉培养基易结块，影响培养基中氧的供应，从而影响微生物的生长。综合产厚垣孢子、分生孢子数量情况，确定培养基中玉米粉与菌草的比例为7：3。
表1玉米粉与菌草不同比例培养基对厚垣孢普可尼亚菌产孢的影响
实施例二 营养因素对厚垣孢普可尼亚菌产孢的影响
选取蔗糖(A)、硝酸钠(B)、氯化钠(C)为变量，分别以分生孢子产量、厚垣孢子产量为指标进行L9(34)正交试验，各因素、水平见表2。
表2正交试验因素水平设计
步骤1、2：同实施例一。
3.固体发酵产孢
在玉米粉（30目）与菌草的比例为7：3的培养基中根据正交试验因素水平设计表添加不同重量百分比的蔗糖、硝酸钠、氯化钠，配制成不同营养含量的培养基，加入适量水拌匀，含水量为50%，pH自然，分装于组培瓶中。每瓶装10g培养基， 121℃间歇湿热灭菌30min，降温后以48h的发酵液作为固体发酵的接种体，接种量0.50 mL/g，置于28℃培养箱中静置培养7天。每处理重复3次。
4.固体发酵产孢量测定 同实施例一。
5.试验结果
以厚垣孢子产量为指标的正交试验结果表明， C (氯化钠)因素的极差最大，其次为B(硝酸钠)因素，A (蔗糖)因素的极差最小，即影响厚垣孢子产量的因素大小顺序为：C>B>A，最佳组合为A2B1C1，即蔗糖1.5%、硝酸钠0.85%、氯化钠 1.0%，培养7天厚垣孢子产量为8.42×105个/g。以分生孢子产量为指标的正交试验结果表明，影响分生孢子的因素大小为：B>A>C，最佳组合为A2B1C2，即蔗糖1.5%、硝酸钠0.85%、氯化钠 2.0%，培养7天分生孢子产量为1.03×109个/g。根据正交试验所获得的结果，按配方A2B1C1配伍进行试验，固体培养10天，厚垣孢子产量为1.46×106个/g，比最初的培养基配方提高了近5倍，分生孢子产量达3.27×109个/g。
综合以上结果培养基中以添加蔗糖1.5%、硝酸钠0.85%、氯化钠 1.0%为宜，利于产厚垣孢子和分生孢子。
实施例三 浅盘发酵
步骤1、2：同实施例一。
3. 固体发酵产孢
30目玉米粉67.65%，菌草29.0%，蔗糖1.5%，硝酸钠0.85% ，氯化钠 1.0% ，加入适量水拌匀，含水量为50%，pH自然，用聚乙烯袋装好后，121℃间歇湿热灭菌30min。冷却后，以48h的发酵液作为固态发酵的接种体，接种量为0.50mL/g。接种后分装于浅盘进行发酵10天。自接种之日起，每隔24h取样用于参数测定，重复3次。
4. 固体发酵产孢量测定 同实施例一。
5. 试验结果
培养1天后，培养基表面仅可看到少量白色的菌丝，随着发酵时间的延长，菌丝生长旺盛，2~4天时，菌体处于快速生长期，在这期间菌体产孢还处于较低水平。发酵5~7天，培养基中菌丝旺盛，培养基表面、中间及底部都长满菌丝。发酵7天时，分生孢子产量达2.10×109个/g，厚垣孢子产量达5.10×105个/g。培养结束时(10天)，分生孢子产量达3.87×109个/g，厚垣孢子产量达1.85×106个/g。
虽然上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

Claims (8)

1.一种厚垣孢普可尼亚菌固体发酵产孢的方法，其特征在于，包括厚垣孢普可尼亚菌菌种活化、发酵液的制备以及固体发酵产孢的步骤；
其中，所述固体发酵产孢中所使用的固体发酵培养基配方以质量百分比为：20~50目玉米粉60%~76%， 20~50目菌草20%~36%，蔗糖1.0%~5.0%，硝酸钠1.0%~5.0%，氯化钠 1.0%~5.0%，pH自然。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述固体发酵产孢步骤中所使用的固体发酵培养基配方为：30~50目玉米粉65%~75%，30~50目菌草20%~30%，蔗糖0.75%~3.0%，硝酸钠0.85%~3.4%，氯化钠 1.0%~3.0%，pH自然。
3. 根据权利要求1所述的一种厚垣孢普可尼亚菌固体发酵产孢的方法，其特征在于，所述固体发酵产孢步骤中所使用的固体发酵培养基配方为：30目玉米粉67.65%，菌草29.0%，蔗糖1.5%，硝酸钠0.85% ，氯化钠 1.0%，pH自然。
4.根据权利要求1所述的一种厚垣孢普可尼亚菌固体发酵产孢的方法，其特征在于，所述厚垣孢普可尼亚菌菌种活化步骤为：将厚垣孢普可尼亚菌菌种接种在PSA斜面培养基上活化，28℃黑暗培养5天。
5.根据权利要求1所述的一种厚垣孢普可尼亚菌固体发酵产孢的方法，其特征在于，所述发酵液的制备方法为：斜面菌种活化后，接种到PSA平板上，28℃黑暗培养5天，用打孔器从平板上菌落边缘打取φ=10mm菌碟作为接种体，按每100mL培养液接入5个菌碟，培养液为3wt.%虾壳粉培养液，28℃、150r/min摇床振荡培养48~72h，即得种子液；将种子液按10%的接种量接种至3wt.%虾壳粉培养液中，28℃、150r/min摇床振荡培养48~72h，即得发酵液。
6. 根据权利要求1所述的一种厚垣孢普可尼亚菌固体发酵产孢的方法，其特征在于，所述固体发酵产孢的方法为：组培瓶发酵：30目玉米粉67.65%，菌草29.0%，蔗糖1.5%，硝酸钠0.85%，氯化钠 1.0%，pH自然，加入水拌匀，含水量50%，分装于组培瓶中；每瓶装10g培养基，用纱布封口，121℃间歇湿热灭菌30min，降温后以48~60h的发酵液作为固体发酵的接种体，接种量为0.50 ~1.50mL/g；置于28℃培养箱中静置培养7天。
7. 根据权利要求1所述的一种厚垣孢普可尼亚菌固体发酵产孢的方法，其特征在于，所述固体发酵产孢的方法为：浅盘发酵：30目玉米粉67.65%，菌草29.0%，蔗糖1.5%，硝酸钠0.85% ，氯化钠 1.0% ，pH自然，加入水拌匀，含水量50%，用聚乙烯袋装好后，121℃间歇湿热灭菌30min，冷却后，以48~60h的发酵液作为固体发酵的接种体，接种量为0.50 ~1.50mL/g，将接种后的培养料平铺于浅盘上，厚度3~5cm，将浅盘置于28℃、湿度为80%以上的条件下，培养10天。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，固体发酵产孢接种时以48h的发酵液作为固态发酵的接种体，接种量为0.50mL/g。
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