CN109321482B - 一种环保用复合微生物菌剂固体颗粒产品及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及生物发酵技术领域，尤其一种环保用复合微生物菌剂固体颗粒产品及其制备方法，该方法包括以下步骤：（1）进行环保用复合微生物的高密度发酵培养，得到高密度发酵液，调整高密度发酵液中微生物的固含量；（2）往调整后的高密度发酵液中添加干燥保护剂，干燥保护剂的加入量为调整后高密度发酵液重量的0.1‑10%，混合均匀，获得菌浆；（3）将菌浆和辅料混合造粒，得到固体颗粒；（4）将固体颗粒在25‑80℃温度下烘干，烘干时间为8‑48h，得到环保用复合微生物菌剂固体颗粒产品。本发明的制备方法所使用的原料价格低廉，工艺操作简单，生产效率高，可为环保产业提供经济、高效的复合微生物菌剂固体颗粒产品。

Description

一种环保用复合微生物菌剂固体颗粒产品及其制备方法
技术领域
本发明涉及生物发酵技术领域，尤其一种环保用复合微生物菌剂固体颗粒产品及其制备方法。
背景技术
随着我国工业的快速发展，环境污染越来越严重，环境污染治理也越来越难，传统物理、化学处理难以达标排放，应用具有针对性的微生物菌剂来治理环境污染处理效果好，运行稳定，越来越受到人们的重视，环保微生物菌剂的使用量也逐年增多。
现有的环保微生物菌剂产品通常具有很大的生产局限性，主要表现为：生产过程中机械化程度低，难以实现过程控制；发酵周期长，产量低；由于条件限制，不适合大规模生产；由于灭菌不彻底，经常有杂菌污染，从而影响产品功效，使功效不稳定或不明显，甚至无效，且现在的环保微生物菌剂产品主要为液体产品，产品性能不稳定，保质期短，运输不方便，从而影响其应用。
发明内容
本发明的目的是针对现有技术中的上述不足，提供一种环保用复合微生物菌剂固体颗粒产品及其制备方法，该方法所使用的原料价格低廉，工艺操作简单，生产效率高，可为环保产业提供经济、高效的复合微生物菌剂固体颗粒产品。
本发明的目的通过以下技术方案实现：
一种环保用复合微生物菌剂固体颗粒产品的制备方法，包括以下步骤：
（1）进行环保用复合微生物的高密度发酵培养，得到高密度发酵液，调整高密度发酵液中微生物的固含量为20-70%；
（2）往调整后的高密度发酵液中添加干燥保护剂，干燥保护剂的加入量为调整后高密度发酵液重量的0.1-10%，混合均匀，获得菌浆；
（3）将菌浆和辅料按质量比1:1-5混合造粒，得到固体颗粒；
（4）将固体颗粒在25-80℃下烘干，烘干时间为8-48h，得到环保用复合微生物菌剂固体颗粒产品。进一步地，经检测，经烘干后确保产品水分去除率达85%~98.5%，有效微生物含量达109CFU/g以上。
优选地，所述干燥保护剂为麦芽糖、碳酸钙、可溶性淀粉、明胶、麦芽糊精、聚乙烯比咯烷酮和甘油中的至少一种。
优选地，所述辅料为草木灰、草炭粉、青玉米秸秆粉、珍珠岩、细粘土、膨润土、硅藻土、蛭石粉和黄绵土中的至少一种，所述辅料细度≥80目。
优选地，所述步骤（1）中，环保用复合微生物的高密度发酵培养包括以下步骤：
步骤A：将环保用复合微生物菌种接种于含基础培养基的摇瓶中，在15-39℃下震荡培养10-24 h，震荡培养转速为50-300rpm，得一级种子液；
步骤B：将步骤A得到的一级种子液按0.5-20%的接种量转接于一级种子罐中，培养10-24h，培养温度为15-39℃，罐压为0.02-0.08MPa，溶解氧浓度为5-65%，得二级种子液；
步骤C：将步骤B得到的二级种子液按5-25%的接种量转接于发酵罐中进行分段发酵，各段发酵的pH依次调整为7.4-7.8、6.8-7.2、6.2-6.6和5.2-5.8，各段的发酵时间均为5-12.5 h，发酵温度均为15-39℃，罐压均为0.02-0.08MPa，溶解氧浓度均为5-65%。
分段发酵过程中根据pH和溶解氧含量的变化，流加碳源和氮源。优选地，所述碳源为葡萄糖、蔗糖和糖蜜中的至少一种；所述氮源为氯化铵、硫酸铵、玉米浆、玉米浆干粉和酵母粉中的至少一种。发酵过程中检测pH和溶解氧含量的变化，当发酵过程pH、溶解氧骤然上升，即碳源不足时，流加发酵液体积2-10%的碳源；当发酵过程pH骤然下降、溶解氧骤然上升，即氮源不足时，流加发酵液体积0.5-2%的氮源。进一步地，所述碳源的质量百分比浓度为40-60%；氮源的质量百分比浓度为10-20%。
本发明采用多菌混合高密度液体发酵的工艺来生产复合环保微生物菌剂，生产过程能够严格控制，产品效果稳定；物质传递充分，缩短发酵周期，提高生产效率；可实现全过程大规模的自动化和连续化生产；该混合发酵方式具有多菌共生、酶系互补、作用全面、省工节能、简化工艺的特点，为环保用复合微生物菌剂固体颗粒产品的规模化生产奠定基础。
优选地，所述基础培养基由以下质量百分比的原料组成：葡萄糖1.5-3%，硫酸铵0.2-0.8%，有机氮源0.5-1.5%，磷酸二氢钠0.4-2.5%，乙酸钠0.1-0.3%，七水硫酸镁0.5-1.6%，微量元素补充剂0.1-2%，水余量。
优选地，所述微量元素补充剂包括以下含量的成分：无水氯化钙0.03-0.05%，七水硫酸亚铁0.02-0.04%，七水硫酸锌0.01-0.02%，五水硫酸锰0.005-0.02%，五水硫酸铜0.0001-0.0008%，硼酸0.0001-0.0005%。
优选地，所述步骤C中，调整分段发酵pH值的所用酸为磷酸、硫酸、盐酸、乙酸和硝酸中的至少一种，所用碱为氢氧化钠、氢氧化钾、氨水和尿素中的至少一种。
优选地，所述步骤C中，分段发酵后组成环保用复合微生物的各微生物菌种含量均不少于108 CFU/mL。
优选地，所述步骤（1）中，所述环保用复合微生物高密度发酵前由第一菌剂、第二菌剂和第三菌剂复配而成，所述第一菌剂、第二菌剂和第三菌剂的质量比为1-2:0.1-3:1-5。
优选地，所述第一菌剂为产碱菌、节杆菌、黄杆菌和假单胞菌中的至少一种；所述第二菌剂为伯克氏菌、短杆菌、假诺卡氏菌、黄单胞菌、芽孢杆菌、棒杆菌、红球菌、鞘氨醇单胞菌和戈登氏菌中的至少一种；所述第三菌剂为生丝微菌、乳酸杆菌和冢村氏菌中的的至少一种。
在实际废水、废气处理工程中，pH往往波动比较大。该混合菌剂中含有能适应较宽pH范围的微生物，这些微生物在废水、废气处理过程中是一种协同生长，协同处理作用，但不同的微生物具有不同的最适pH生长范围。在混合菌剂的高密度发酵过程中，如果仅仅采用一种pH进行发酵，则会造成最适生长pH不在该范围的微生物繁殖量减少，甚至不繁殖，从而导致有效微生物种类含量失衡，打破复合微生物的协同生长、协同处理作用，降低复合微生物对废水、废气的处理效率。复合微生物采用酸碱梯度控制培养方法，当发酵过程控制某一pH时，最适生长pH在该范围的微生物即大量繁殖，酸碱梯度控制培养可以保证各种类微生物含量均衡。
本发明还提供了一种根据上述制备方法制得的环保用复合微生物菌剂固体颗粒产品。
本发明的有益效果：本发明的环保用复合微生物菌剂固体颗粒产品制备方法所使用的物料价格低廉，工艺操作简单，生产效率高，可为环保产业提供经济、高效的微生物菌剂产品，可有效用于废水、废气、废渣污染物的治理；该方法通过添加干燥保护剂可有效避免微生物菌剂在干燥过程中的细胞损伤，提高微生物菌剂存活率，添加的辅料可为微生物菌剂提供营养物质，促进微生物使用时的快速萌发；所制得的环保用复合微生物菌剂固体颗粒产品微生物活性高、有效微生物含量达4.10×109CFU/g以上，可长期保存，便于保藏和运输。
附图说明
图1是实施例1环保用复合微生物菌剂进行高密度发酵培养的生长曲线；
图2是实施例2环保用复合微生物菌剂进行高密度发酵培养的生长曲线；
图3是实施例3环保用复合微生物菌剂进行高密度发酵培养的生长曲线；
图4是实施例4环保用复合微生物菌剂进行高密度发酵培养的生长曲线；
图5是实施例5环保用复合微生物菌剂进行高密度发酵培养的生长曲线；
图6是环保用复合微生物菌剂进行传统分批发酵的生长曲线。
具体实施方式
结合以下实施例对本发明作进一步描述。
实施例1
本实施例中，一种环保用复合微生物菌剂固体颗粒产品的制备方法，包括以下步骤：
（1）进行环保用复合微生物的高密度发酵培养，得到高密度发酵液，调整高密度发酵液中微生物的固含量为30%；
（2）按干燥保护剂和调整后高密度发酵液的重量比，往调整后高密度发酵液中添加干燥保护剂麦芽糖9.8%、明胶0.2%，混合均匀，获得菌浆；
（3）将菌浆和辅料按质量比1:3.8在造粒机中混合造粒，得到固体颗粒；辅料由质量比为1:1:1:2的青玉米秸秆粉、珍珠岩、细粘土和膨润土混合而成，所述辅料细度≥80目；
（4）将固体颗粒在30℃温度下烘干，烘干时间为38h，得到环保用复合微生物菌剂固体颗粒产品。
经检测，经烘干后，环保用复合微生物菌剂固体颗粒产品水分去除率为88%，有效微生物含量为2.14×109CFU/g。
优选地，所述步骤（1）中，所述环保用复合微生物高密度发酵培养前由第一菌剂、第二菌剂和第三菌剂复配而成，所述第一菌剂、第二菌剂和第三菌剂的质量比为1:0.5:2。
所述一类菌种为产碱菌和节杆菌按质量比1:0.5组成的混合物，所述二类菌种为伯克氏菌、假诺卡氏菌、黄单胞菌、棒杆菌、红球菌、鞘氨醇单胞菌和戈登氏菌按质量比0.5:1.5:2.5:7:0.1:4:2组成的混合物，所述三类菌种为生丝微菌、乳酸杆菌和冢村氏菌按质量比4:3:5组成的混合物。
优选地，所述步骤（1）中，环保用复合微生物的高密度发酵培养包括以下步骤：
步骤A：将环保用复合微生物菌种接种于含基础培养基的摇瓶中，在15℃温度下震荡培养24 h，震荡培养转速为300rpm，得一级种子液；
步骤B：将步骤A得到的一级种子液按0.5%的接种量转接于一级种子罐中培养24h，培养温度为15℃，罐压为0.04MPa，通过调节搅拌桨转速和通气量控制种子罐中溶解氧溶解氧浓度为10%，得二级种子液；
步骤C：将步骤B得到的二级种子液按25%的接种量转接于发酵罐中进行分段发酵，流加磷酸和氢氧化钠将各段发酵的pH依次调整为7.6、7.0、6.5和5.6，各段的发酵时间均为12.5 h，发酵温度均为15℃，罐压均为0.04MPa，溶解氧浓度均为40%。
发酵过程中检测pH和溶解氧含量的变化，当发酵过程pH、溶解氧骤然上升，即碳源不时，流加体积为发酵液6%的葡萄糖；当发酵过程pH骤然下降、溶解氧骤然上升，即氮源不足时，流加体积为发酵液1%的酵母粉。进一步地，所述葡萄糖的质量百分比浓度为50%；酵母粉的质量百分比浓度为15%。
优选地，所述基础培养基由以下质量百分比的原料组成：葡萄糖1.5%，硫酸铵0.5%，玉米浆干粉1.5%，磷酸二氢钠0.8%，乙酸钠0.2%，七水硫酸镁3.5%，微量元素补充剂0.5%，水余量。所述微量元素补充剂包括以下含量的成分：无水氯化钙0.03%，七水硫酸亚铁0.02%，七水硫酸锌0.02%，五水硫酸锰0.005%，五水硫酸铜0.0001%，硼酸0.0001%。
本实施例，分段发酵后组成环保用复合微生物的各微生物菌种含量均不少于108 CFU/mL。
如图6所示，按传统的分批发酵方法，菌体发酵速率不稳定，而且最终的发酵的菌浓仅可达(OD600)22.01，远远小于本发明高密度发酵的菌浓，不能满足实现生产需要。
本实施例的环保用复合微生物菌剂进行高密度发酵培养的生长曲线如图1所示，经过高密度发酵培养发酵的菌体浓度(OD600)为79，菌体湿重193g/L，微生物含量达7.8×1012CFU/mL，为环保用复合微生物菌剂固体颗粒产品的规模化生产奠定基础。
根据药物稳定性试验指导原则(2015版药典)进行产品储存稳定性加速试验，通过对产品的外观、有效微生物含量，pH等全性能试验来证明本发明的环保用复合微生物菌剂固体颗粒产品在有效期内，产品可靠有效。
将固体颗粒产品按市售包装在温度40±2℃、相对湿度75±5％的条件下放置6个月，在试验期间第1、2、3、4、5、6个月末分别取样一次，实施例1的产品各项参数分别如表1所示：
表1
Figure 359994DEST_PATH_IMAGE001
本实施例的固体颗粒产品性状无变化，有效微生物减少量≤50%，含水率≤16%，产品符合标准要求。
实施例2
本实施例中，一种环保用复合微生物菌剂固体颗粒产品的制备方法，包括以下步骤：
（1）进行环保用复合微生物的高密度发酵培养，得到高密度发酵液，调整高密度发酵液中微生物的固含量为70%；
（2）按干燥保护剂和调整后高密度发酵液的重量比，往调整后的高密度发酵液中添加干燥保护剂可溶性淀粉0.3%、甘油5%，混合均匀，获得菌浆；
（3）将菌浆和辅料按质量比1:1在造粒机中混合造粒，得到固体颗粒；辅料由质量比为1:1的草炭粉和细粘土混合而成，所述草炭粉和细粘土的细度≥80目；
（4）将固体颗粒在60℃下烘干，烘干时间为24h，得到环保用复合微生物菌剂固体颗粒产品。
经检测，经烘干后，环保用复合微生物菌剂固体颗粒产品水分去除率为94%，有效微生物含量为4.11×109CFU/g。
所述步骤（1）中，所述环保用复合微生物高密度发酵培养前由第一菌剂、第二菌剂、和第三菌剂复配而成，所述第一菌剂、第二菌剂和第三菌剂的质量比为1:3:4。
优选地，本实施例的一类菌种为产碱菌、节杆菌、黄杆菌和假单胞菌按质量比0.1:2:5:4组成的混合物；所述二类菌种为伯克氏菌、假诺卡氏菌、芽孢杆菌、棒杆菌、红球菌、鞘氨醇单胞菌、戈登氏菌按质量比2:4:1:3:6:0.1:1组成的混合物；所述三类菌种为生丝微菌、乳酸杆菌和冢村氏菌按质量比2:3:4组成的混合物。
优选地，所述步骤（1）中，环保用复合微生物的高密度发酵培养包括以下步骤：
步骤A：将环保用复合微生物菌种接种于含基础培养基的摇瓶中，在25℃下震荡培养22 h，震荡培养转速为120rpm，得一级种子液；
步骤B：将步骤A得到的一级种子液按20%的接种量转接于一级种子罐中培养24h，培养温度为25℃，罐压为0.02MPa，通过调节搅拌桨转速和通气量控制种子罐中溶解氧溶解氧浓度为60%，得二级种子液；
步骤C：将步骤B得到的二级种子液按20%的接种量转接于发酵罐中进行分段发酵，加入盐酸、尿素将各段发酵的pH依次调整为7.4、7.2、6.6和5.2，各段的发酵时间均为10.5h，发酵温度均为28℃，罐压均为0.02MPa，溶解氧浓度均为15%。优选地，步骤B和步骤C均采用基础培养基。
分段发酵过程中监测pH和溶解氧含量的变化，当碳源不足时，流加体积为发酵液体积2%的葡萄糖；当氮源不足时，流加体积为发酵液体积0.5%的酵母粉。进一步地，葡萄糖的质量百分比浓度为50%，酵母粉的质量百分比浓度为16%。
优选地，所述基础培养基由以下质量百分比的原料组成：葡萄糖1.5%，硫酸铵0.5%，玉米浆干粉1.5%，磷酸二氢钠0.4%，乙酸钠0.3%，七水硫酸镁1.0%，微量元素补充剂0.1%，水余量。
优选地，所述微量元素补充剂包括以下含量的成分：无水氯化钙0.03%，七水硫酸亚铁0.04%，七水硫酸锌0.01%，五水硫酸锰0.02%，五水硫酸铜0.0001%，硼酸0.0005%。
分段发酵后组成环保用复合微生物的各微生物菌种含量均不少于108 CFU/mL。
本实施例的环保用复合微生物菌剂进行高密度发酵培养的生长曲线如图2所示，经过高密度发酵培养发酵的菌体浓度(OD600)为91，菌体湿重220g/L，微生物含量达9.51×1012CFU/mL，为环保用复合微生物菌剂固体颗粒产品的规模化生产奠定基础。
将固体颗粒产品按市售包装在温度40±2℃、相对湿度75±5％的条件下放置6个月，在试验期间第1、2、3、4、5、6个月末分别取样一次，实施例2的产品各项参数分别如表2所示：
表2
Figure 409990DEST_PATH_IMAGE002
本实施例的固体颗粒产品性状无变化，有效微生物减少量≤50%，含水率≤16%，产品符合标准要求。
实施例3
本实施例中，一种环保用复合微生物菌剂固体颗粒产品的制备方法，包括以下步骤：
（1）进行环保用复合微生物的高密度发酵培养，得到高密度发酵液，调整高密度发酵液中微生物的固含量为20%；
（2）按干燥保护剂和调整后高密度发酵液的重量比，往调整后的高密度发酵液中添加干燥保护剂聚乙烯比咯烷酮7%，混合均匀，获得菌浆；
（3）将菌浆和辅料按质量比1:5在造粒机中混合造粒，得到固体颗粒；辅料由质量比为1:1:1的草炭粉、蛭石粉和黄绵土混合而成，所述辅料的细度≥80目；
（4）将固体颗粒在75℃温度下烘干，烘干时间为16h，得到环保用复合微生物菌剂固体颗粒产品。
经检测，经烘干后，环保用复合微生物菌剂固体颗粒产品水分去除率为95%，有效微生物含量为1.37×109CFU/g。
所述步骤（1）中，所述环保用复合微生物高密度发酵培养前由第一菌剂、第二菌剂、和第三菌剂复配而成，所述第一菌剂、第二菌剂和第三菌剂的质量比为2:3:0.4。
优选地，所述一类菌种为产碱菌、节杆菌、黄杆菌、假单胞菌按质量比2:1:1:2组成的混合菌种；所述二类菌种为伯克氏菌、短杆菌、假诺卡氏菌、黄单胞菌、芽孢杆菌、棒杆菌、戈登氏菌按2:3:2:1:1.5:0.5:1组成的混合菌种；所述三类菌种为生丝微菌、乳酸杆菌、冢村氏菌按质量比0.5:1:4组成的混合菌种。
优选地，所述步骤（1）中，环保用复合微生物的高密度发酵培养包括以下步骤：
步骤A：将环保用复合微生物菌种接种于含基础培养基的摇瓶中，在24℃下震荡培养22 h，震荡培养转速为110rpm，得一级种子液；
步骤B：将步骤A得到的一级种子液按20%的接种量转接于一级种子罐中培养24h，培养温度为32℃，罐压为0.08MPa，通过调节搅拌桨转速和通气量控制种子罐中溶解氧溶解氧浓度为35%，得二级种子液；
步骤C：将步骤B得到的二级种子液按10%的接种量转接于发酵罐中进行分段发酵，加入乙酸、氢氧化钠将各段发酵的pH依次调整为7.8、6.8、6.2和5.8，各段的发酵时间均为8h，发酵温度均为25℃，罐压均为0.08MPa，溶解氧浓度均为60%。
分段发酵过程中监测pH和溶解氧含量的变化，当即碳源不足时，流加体积为发酵液体积5%的碳源，碳源由质量比为1:1的蔗糖和葡萄糖组成；当氮源不足时，流加体积为发酵液体积1%的氯化铵。进一步地，所述混合碳源的质量百分比浓度为50%；氯化铵的质量百分比浓度为18%。
优选地，所述基础培养基由以下质量百分比的原料组成：葡萄糖2%，硫酸铵0.5%，玉米浆干粉1.2%，磷酸二氢钠1.0%，乙酸钠0.15%，七水硫酸镁1.6%，微量元素补充剂2%，水余量。
优选地，所述微量元素补充剂包括以下含量的成分：无水氯化钙0.05%，七水硫酸亚铁0.02%，七水硫酸锌0.02%，五水硫酸锰0.005%，五水硫酸铜0.0008%，硼酸0.0001%。
分段发酵后组成环保用复合微生物的各微生物菌种含量均不少于108 CFU/mL。
本实施例的环保用复合微生物菌剂进行高密度发酵培养的生长曲线如图3所示，经过高密度发酵培养发酵的菌体浓度为(OD600)110，菌体湿重270g/L，微生物含量达1.1×1013CFU/mL，为环保用复合微生物菌剂固体颗粒产品的规模化生产奠定基础。
将固体颗粒产品按市售包装在温度40±2℃、相对湿度75±5％的条件下放置6个月，在试验期间第1、2、3、4、5、6个月末分别取样一次，实施例3的产品各项参数分别如表3所示：
表3
Figure 276314DEST_PATH_IMAGE003
本实施例的固体颗粒产品性状无变化，有效微生物减少量≤50%，含水率≤16%，产品符合标准要求。
实施例4
本实施例中，一种环保用复合微生物菌剂固体颗粒产品的制备方法，包括以下步骤：
（1）进行环保用复合微生物的高密度发酵培养，得到高密度发酵液，调整高密度发酵液中微生物的固含量为50%；
（2）按干燥保护剂和调整后高密度发酵液的重量比，往调整后的高密度发酵液中添加干燥保护剂麦芽糖5%和碳酸钙3%，混合均匀，获得菌浆；
（3）将菌浆和辅料按质量比1:2.2在造粒机中混合造粒，得到固体颗粒；辅料由质量比为1:1的草炭粉和蛭石粉混合而成，所述草炭粉和蛭石粉的细度≥80目；
（4）将固体颗粒在80℃温度下烘干，烘干时间为12h，得到环保用复合微生物菌剂固体颗粒产品。
经检测，经烘干后，环保用复合微生物菌剂固体颗粒产品水分去除率为98.5%，有效微生物含量为3.17×109CFU/g。
所述步骤（1）中，所述环保用复合微生物高密度发酵培养前由第一菌剂、第二菌剂、和第三菌剂剂复配而成，所述第一菌剂、第二菌剂和第三菌剂的质量比为1:1:2。
优选地，所述一类菌种为产碱菌、节杆菌、黄杆菌、假单胞菌按质量比2:1:4:0.5组成的混合物，所述二类菌种为伯克氏菌、短杆菌、假诺卡氏菌、黄单胞菌、棒杆菌、红球菌、鞘氨醇单胞菌和戈登氏菌按质量比1:4:7:2:3:1.5:0.1:2组成的混合物，所述三类菌种为生丝微菌、乳酸杆菌和冢村氏菌按质量比0.4:0.5:2组成的混合物。
优选地，所述步骤（1）中，环保用复合微生物的高密度发酵培养包括以下步骤：
步骤A：将环保用复合微生物菌种接种于含基础培养基的摇瓶中，在34℃温度下震荡培养18h，震荡培养转速为190rpm，得一级种子液；
步骤B：将步骤A得到的一级种子液按20%的接种量转接于一级种子罐中培养24h，培养温度为34℃，罐压为0.05MPa，通过调节搅拌桨转速和通气量控制种子罐中溶解氧溶解氧浓度为35%，得二级种子液；
步骤C：将步骤B得到的二级种子液按20%的接种量转接于发酵罐中进行分段发酵，加入硫酸、氨水将各段发酵的pH依次调整为7.6、7.0、6.5和5.6，各段的发酵时间均为7.25h，发酵温度均为34℃，罐压均为0.05MPa，溶解氧浓度均为19%。
分段发酵过程中监测pH和溶解氧含量的变化，当即碳源不足时，流加体积为发酵液体积8%的碳源，碳源由质量比为1:1的蔗糖和葡萄糖组成；当氮源不足时，流加体积为发酵液体积1.5%的氯化铵。进一步地，所述混合碳源的质量百分比浓度为60%；氯化铵的质量百分比浓度为20%。
优选地，所述基础培养基由以下质量百分比的原料组成：葡萄糖3%，硫酸铵0.8%，酵母粉0.8%，磷酸二氢钠1.2%，乙酸钠0.2%，七水硫酸镁0.9%，微量元素补充剂0.1%，水余量。
优选地，所述微量元素补充剂包括以下含量的成分：无水氯化钙0.04%，七水硫酸亚铁0.03%，七水硫酸锌0.015%，五水硫酸锰0.01%，五水硫酸铜0.0005%，硼酸0.0003%。
本实施例的环保用复合微生物菌剂进行高密度发酵培养的生长曲线如图4所示，经过高密度发酵培养发酵的菌体浓度(OD600)为162，菌体湿重370g/L，微生物含量达2.23×1013CFU/mL。为环保用复合微生物菌剂固体颗粒产品的规模化生产奠定基础。
将固体颗粒产品按市售包装在温度40±2℃、相对湿度75±5％的条件下放置6个月，在试验期间第1、2、3、4、5、6个月末分别取样一次，实施例4的产品各项参数分别如表4所示：
表4
Figure 428072DEST_PATH_IMAGE004
本实施例的固体颗粒产品性状无变化，有效微生物减少量≤50%，含水率≤16%，产品符合标准要求。
本实施例的其余内容同实施例1，这里不再赘述。
实施例5
本实施例中，一种环保用复合微生物菌剂固体颗粒产品的制备方法，包括以下步骤：
（1）进行环保用复合微生物的高密度发酵培养，得到高密度发酵液，调整高密度发酵液中微生物的固含量为61%；
（2）按干燥保护剂和调整后高密度发酵液的重量比，往调整后的高密度发酵液中添加干燥保护剂麦芽糊精1%、麦芽糖3%、甘油0.5%，混合均匀，获得菌浆；
（3）将菌浆和辅料按质量比1:1.4在造粒机中混合造粒，得到固体颗粒；辅料由质量比为1:1:1的硅藻土、草炭和蛭石粉混合而成，所述硅藻土、草炭和蛭石粉的细度≥80目；
（4）将固体颗粒在45℃下烘干，烘干时间为18h，得到环保用复合微生物菌剂固体颗粒产品。
经检测，烘干后环保用复合微生物菌剂固体颗粒产品水分去除率为85%，有效微生物含量为3.58×109CFU/g。
所述步骤（1）中，所述环保用复合微生物高密度发酵培养前由第一菌剂、第二菌剂和第三菌剂复配而成，所述第一菌剂、第二菌剂和第三菌剂的质量比为1.3:1:2。
优选地，所述一类菌种为产碱菌和节杆菌按质量比0.5:7组成的混合物，所述二类菌种为伯克氏菌、假诺卡氏菌、黄单胞菌、棒杆菌、红球菌、鞘氨醇单胞菌和戈登氏菌按质量比1:4:7:5:10:2.5:0.1组成的混合物，所述三类菌种为生丝微菌和乳酸杆菌按质量比1:4组成的混合物。
优选地，所述步骤（1）中，环保用复合微生物的高密度发酵培养包括以下步骤：
步骤A：将环保用复合微生物菌种接种于含基础培养基的摇瓶中，在39℃温度下震荡培养14h，震荡培养转速为50rpm，得一级种子液；
步骤B：将步骤A得到的一级种子液按15%的接种量转接于一级种子罐中培养24h，培养温度为39℃，罐压为0.06MPa，通过调节搅拌桨转速和通气量控制种子罐中溶解氧溶解氧浓度为30%，得二级种子液；
步骤C：将步骤B得到的二级种子液按15%的接种量转接于发酵罐中进行分段发酵，加入硫酸、氢氧化钠将各段发酵的pH依次调整为7.6、7.0、6.5和5.6，各段的发酵时间均为7h，发酵温度均为39℃，罐压均为0.06MPa，溶解氧浓度均为34%。
分段发酵过程中监测pH和溶解氧含量的变化，当即碳源不足时，流加体积为发酵液体积10%的碳源，碳源由质量比为1:1的蔗糖和葡萄糖组成；当氮源不足时，流加体积为发酵液体积1.5%的玉米浆干粉。进一步地，所述混合碳源的质量百分比浓度为46%；玉米浆干粉的质量百分比浓度为18%。
优选地，所述基础培养基由以下质量百分比的原料组成：葡萄糖2.5%，硫酸铵0.2%，玉米浆干粉1.2%，磷酸二氢钠1.2%，乙酸钠0.2%，七水硫酸镁0.5%，微量元素补充剂0.1%，水余量。
优选地，所述微量元素补充剂包括以下含量的成分：无水氯化钙0.03%%，七水硫酸亚铁0.04%，七水硫酸锌0.02%，五水硫酸锰0.005%，五水硫酸铜0.0008%，硼酸0.0001%。
本实施例的环保用复合微生物菌剂进行高密度发酵培养的生长曲线如图1所示，经过高密度发酵培养发酵的菌体浓度(OD600)为143，菌体湿重333g/L，微生物含量达1.99×1012CFU/mL，为环保用复合微生物菌剂固体颗粒产品的规模化生产奠定基础。
将固体颗粒产品按市售包装在温度40±2℃、相对湿度75±5％的条件下放置6个月，在试验期间第1、2、3、4、5、6个月末分别取样一次，实施例5的产品各项参数分别如表5所示：
表5
Figure 38045DEST_PATH_IMAGE005
本实施例的固体颗粒产品性状无变化，有效微生物减少量≤50%，含水率≤16%，产品符合标准要求。
本实施例的其余内容同实施例1，这里不再赘述。
最后应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细地说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。

Claims (6)

1.一种环保用复合微生物菌剂固体颗粒产品的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：
(1)进行环保用复合微生物的高密度发酵培养，得到高密度发酵液，调整高密度发酵液中微生物的固含量为20-70％；
(2)往调整后的高密度发酵液中添加干燥保护剂，干燥保护剂的加入量为调整后高密度发酵液重量的0.1-10％，混合均匀，获得菌浆；
(3)将菌浆和辅料按质量比1:1-5混合造粒，得到固体颗粒；
(4)将固体颗粒在25-80℃下烘干，烘干时间为8-48h，得到环保用复合微生物菌剂固体颗粒产品；
所述步骤(1)中，环保用复合微生物的高密度发酵培养包括以下步骤：
步骤A：将环保用复合微生物菌种接种于含基础培养基的摇瓶中，在15-39℃下震荡培养10-24h，震荡培养转速为50-300rpm，得一级种子液；
步骤B：将步骤A得到的一级种子液按0.5-20％的接种量转接于一级种子罐中，培养10-24h，培养温度为15-39℃，罐压为0.02-0.08MPa，溶解氧浓度为5-65％，得二级种子液；
步骤C：将步骤B得到的二级种子液按5-25％的接种量转接于发酵罐中进行分段发酵，各段发酵的pH依次调整为7.4-7.8、6.8-7.2、6.2-6.6和5.2-5.8，各段的发酵时间均为5-12.5h，发酵温度均为15-39℃，罐压均为0.02-0.08MPa，溶解氧浓度均为5-65％；
所述步骤(1)中，所述环保用复合微生物在高密度发酵培养前由第一菌剂、第二菌剂和第三菌剂复配而成，所述第一菌剂、第二菌剂和第三菌剂的质量比为1-2:0.1-3:1-5；
所述第一菌剂为产碱菌、节杆菌、黄杆菌和假单胞菌中的至少一种；所述第二菌剂为伯克氏菌、短杆菌、假诺卡氏菌、黄单胞菌、芽孢杆菌、棒杆菌、红球菌、鞘氨醇单胞菌和戈登氏菌中的至少一种；所述第三菌剂为生丝微菌、乳酸杆菌和冢村氏菌中的至少一种。
2.根据权利要求1所述的环保用复合微生物菌剂固体颗粒产品的制备方法，其特征在于：所述干燥保护剂为麦芽糖、碳酸钙、可溶性淀粉、明胶、麦芽糊精、聚乙烯比咯烷酮和甘油中的至少一种。
3.根据权利要求1所述的环保用复合微生物菌剂固体颗粒产品的制备方法，其特征在于：所述辅料为草木灰、草炭粉、青玉米秸秆粉、珍珠岩、细粘土、膨润土、硅藻土、蛭石粉和黄绵土中的至少一种，所述辅料细度≥80目。
4.根据权利要求1所述的环保用复合微生物菌剂固体颗粒产品的制备方法，其特征在于：所述基础培养基由以下质量百分比的原料组成：葡萄糖1.5-3％，硫酸铵0.2-0.8％，有机氮源0.5-1.5％，磷酸二氢钠0.4-2.5％，乙酸钠0.1-0.3％，七水硫酸镁0.5-1.6％，微量元素补充剂0.1-2％，水余量。
5.根据权利要求4所述的环保用复合微生物菌剂固体颗粒产品的制备方法，其特征在于：所述微量元素补充剂包括以下含量的成分：无水氯化钙0.03-0.05％，七水硫酸亚铁0.02-0.04％，七水硫酸锌0.01-0.02％，五水硫酸锰0.005-0.02％，五水硫酸铜0.0001-0.0008％，硼酸0.0001-0.0005％。
6.一种环保用复合微生物菌剂固体颗粒产品，其特征在于：所述环保用复合微生物菌剂固体颗粒产品根据权利要求1-5任一所述的制备方法制得。
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