CN109321464B - 一种环保用复合微生物液体菌剂及其保藏方法 - Google Patents

一种环保用复合微生物液体菌剂及其保藏方法 Download PDF

Info

Publication number
CN109321464B
CN109321464B CN201710641676.2A CN201710641676A CN109321464B CN 109321464 B CN109321464 B CN 109321464B CN 201710641676 A CN201710641676 A CN 201710641676A CN 109321464 B CN109321464 B CN 109321464B
Authority
CN
China
Prior art keywords
microbial inoculum
fermentation
liquid
environment
microbial
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
CN201710641676.2A
Other languages
English (en)
Other versions
CN109321464A (zh
Inventor
张保安
王云
杨秋婵
罗仕宽
黄来云
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Guangdong Zhongwei Environmental Protection Biotechnology Co ltd
Original Assignee
Guangdong Zhongwei Environmental Protection Biotechnology Co ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Guangdong Zhongwei Environmental Protection Biotechnology Co ltd filed Critical Guangdong Zhongwei Environmental Protection Biotechnology Co ltd
Priority to CN201710641676.2A priority Critical patent/CN109321464B/zh
Publication of CN109321464A publication Critical patent/CN109321464A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN109321464B publication Critical patent/CN109321464B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/04—Preserving or maintaining viable microorganisms
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Abstract

本发明涉及生物发酵技术领域，尤其一种环保用复合微生物液体菌剂及其保藏方法，包括以下步骤：（1）进行环保用复合微生物的高密度发酵培养，得到高密度发酵液，对高密度发酵液温和离心后，除去上清液，获得菌泥；（2）用0.18‑0.22mol/L磷酸盐缓冲液稀释菌泥，得到稀释后菌液，调整稀释后菌液中微生物的固含量为6‑20%，pH为4.0‑6.0；（3）在稀释后菌液中添加保护剂后，密闭保藏，并置于阴凉干燥处。本发明的保藏方法操作简单，成本低廉，在保证有效微生物含量的前提下，大大延长液体微生物菌剂的保存时间。

Description

一种环保用复合微生物液体菌剂及其保藏方法
技术领域
本发明涉及生物发酵技术领域，尤其一种环保用复合微生物液体菌剂及其保藏方法。
背景技术
目前，市场上的微生物菌剂产品大部分为固体保存状态，固体微生物菌剂产品的保存时间虽然较之液体菌剂产品长，但其制备方法较之液体菌剂产品多了很多设备、工序、人工和成本投入。
一般液体微生物菌剂产品大部分为全发酵液。但发酵液中除了含有大量的有效微生物菌体外，还含有菌体分泌的蛋白(肽)类物质，残留的碳源、氮源等营养物质，所以，在液体微生物菌剂存储过程中会出现酸败，产气现象，有效微生物量也会随之大量减少。
发明内容
本发明的目的是针对现有技术中的上述不足，提供一种环保用复合微生物液体菌剂的保藏方法，该方法操作简单，成本低廉，在保证有效微生物含量的前提下，大大延长微生物液体菌剂的保存时间。
本发明的另一目的是提供一种环保用复合微生物液体菌剂产品，
本发明的目的通过以下技术方案实现：
一种环保用复合微生物液体菌剂的保藏方法，包括以下步骤：
（1）进行环保用复合微生物的高密度发酵培养，得到高密度发酵液，对高密度发酵液以转速为2500-4500rpm离心后，除去上清液，获得菌泥；
（2）用0.18-0.22mol/L磷酸盐缓冲液稀释菌泥，得到稀释后菌液，调整稀释后菌液中微生物的固含量为6-20%，pH为4.0-6.0；
（3）在稀释后菌液中添加保护剂后，密闭保藏，并置于阴凉干燥处。
优选地，稀释后菌液中添加保护剂后，置于空气相对湿度在60%以下，温度不超过20℃的环境下密闭保藏。
优选地，所述保护剂由对羟基苯甲酸，吐温20，海藻糖和维生素C组成，对羟基苯甲酸、吐温20、海藻糖和维生素C的添加量分别为稀释后菌液重量的0.1-0.6%、0.5-2%、2-10%和0.1-0.5%。本发明的保护剂具有营养剂成分，根据复合微生物菌剂的菌剂特性添加于稀释后菌液中，可有效保持菌剂性能，在保证有效微生物含量的前提下，大大延长微生物液体菌剂的保存时间。
可满足微生物液体菌剂应用于环境污染物处理的需要，具有较高的实用价值。
优选地，所述步骤（1）中，环保用复合微生物的高密度发酵培养包括以下步骤：
步骤A：将环保用复合微生物菌种接种于含基础培养基的摇瓶中，在15-39℃下震荡培养10-24h，震荡培养转速为50-300rpm，得一级种子液；
步骤B：将步骤A得到的一级种子液按0.5-20%的接种量转接于一级种子罐中，培养10-24h，培养温度为15-39℃，罐压为0.02-0.08MPa，溶解氧浓度为5-65%，得二级种子液；
步骤C：将步骤B得到的二级种子液按5-25%的接种量转接于发酵罐中进行分段发酵，各段发酵的pH依次调整为7.4-7.8、6.8-7.2、6.2-6.6和5.2-5.8，各段的发酵时间均为5-12.5 h，发酵温度均为15-39℃，罐压均为0.02-0.08MPa，溶解氧浓度均为5-65%。
分段发酵发酵过程中根据pH和溶解氧含量的变化，流加碳源和/或氮源。优选地，所述碳源为葡萄糖、蔗糖和糖蜜中的至少一种；所述氮源为氯化铵、硫酸铵、玉米浆、玉米浆干粉和酵母粉中的至少一种。发酵过程中检测pH和溶解氧含量的变化，当发酵过程pH、溶解氧骤然上升，即碳源不足时，流加发酵液体积2-10%的碳源；当发酵过程pH骤然下降、溶解氧骤然上升，即氮源不足时，流加发酵体积0.5-2%的氮源。进一步地，所述碳源的质量百分比浓度为40-60%；氮源的质量百分比浓度为10-20%。
本发明采用多菌混合高密度液体发酵的工艺来生产复合环保微生物菌剂，生产过程能够严格控制，产品效果稳定；物质传递充分，缩短发酵周期，提高生产效率；可实现全过程大规模的自动化和连续化生产；该混合发酵方式具有多菌共生、酶系互补、作用全面、省工节能、简化工艺的特点，为环保用复合微生物液体菌剂产品的规模化生产奠定基础。
优选地，所述基础培养基由以下质量百分比的原料组成：葡萄糖1.5-3%，硫酸铵0.2-0.8%，有机氮源0.5-1.5%，磷酸二氢钠0.4-2.5%，乙酸钠0.1-0.3%，七水硫酸镁0.5-1.6%，微量元素补充剂0.1-2%，水余量。
优选地，所述有机氮源为玉米浆、玉米浆干粉和酵母粉中的至少一种。
优选地，所述微量元素补充剂包括以下含量的成分：无水氯化钙0.03-0.05%，七水硫酸亚铁0.02-0.04%，七水硫酸锌0.01-0.02%，五水硫酸锰0.005-0.02%，五水硫酸铜0.0001-0.0008%，硼酸0.0001-0.0005%。
优选地，所述步骤C中，调整分段发酵pH值所用酸为磷酸、硫酸、盐酸、乙酸和硝酸中的至少一种，所用碱为氢氧化钠、氢氧化钾、氨水和尿素中的至少一种。
优选地，所述步骤C中，分段发酵后组成环保用复合微生物的各微生物菌种含量均不少于108 CFU/mL。
优选地，所述步骤（1）中，所述环保用复合微生物高密度发酵前由第一菌剂、第二菌剂和第三菌剂复配而成，所述第一菌剂、第二菌剂和第三菌剂的质量比为1-2:0.1-3:1-5。
优选地，所述第一菌剂为产碱菌、节杆菌、黄杆菌、假单胞菌中的至少一种；所述第二菌剂为伯克氏菌、短杆菌、假诺卡氏菌、黄单胞菌、芽孢杆菌、棒杆菌、红球菌、鞘氨醇单胞菌、戈登氏菌中的至少一种；所述第三菌剂为生丝微菌、乳酸杆菌、冢村氏菌中的的至少一种。
在实际废水、废气处理工程中，pH往往波动比较大。该混合菌剂中含有能适应较宽pH范围的微生物，这些微生物在废水、废气处理过程中是一种协同生长，协同处理作用，但不同的微生物具有不同的最适pH生长范围。在混合菌剂的高密度发酵过程中，如果仅仅采用一种pH进行发酵，则会造成最适生长pH不在该范围的微生物繁殖量减少，甚至不繁殖，从而导致有效微生物种类含量失衡，打破复合微生物的协同生长、协同处理作用，降低复合微生物对废水、废气的处理效率。复合微生物采用酸碱梯度控制培养方法，当发酵过程控制某一pH时，最适生长pH在该范围的微生物即大量繁殖，酸碱梯度控制培养可以保证各种类微生物含量均衡。
本发明还提供了一种环保用复合微生物液体菌剂产品，所述环保用复合微生物液体菌剂产品的制备包括以下步骤：
（一）进行环保用复合微生物的高密度发酵培养，得到高密度发酵液，对高密度发酵液温和离心后，除去上清液，获得菌泥；
（二）用0.18-0.22mol/L磷酸盐缓冲液稀释菌泥，得到稀释后菌液，调整稀释后菌液中微生物的固含量为6-20%，pH为4.0-6.0，得到环保用复合微生物液体菌剂产品。
本发明的有益效果：本发明采用温和离心法将易腐败的发酵液除去，并用磷酸盐缓冲液稀释菌泥，维持微生物细胞渗透压和保存pH，添加保护剂，大大延长液体菌剂贮藏期，本发明的保藏方法操作简单，成本低廉，在保证有效微生物含量的前提下，大大延长液体微生物菌剂的保存时间。
附图说明
图1是实施例1环保用复合微生物菌剂进行高密度发酵培养的生长曲线；
图2是实施例2环保用复合微生物菌剂进行高密度发酵培养的生长曲线；
图3是实施例3环保用复合微生物菌剂进行高密度发酵培养的生长曲线；
图4是实施例4环保用复合微生物菌剂进行高密度发酵培养的生长曲线；
图5是实施例5环保用复合微生物菌剂进行高密度发酵培养的生长曲线；
图6是进行传统分批发酵培养的生长曲线。
图7是对照例的有效微生物存活率随时间变化的曲线图。
图8是采用本发明保藏方法的有效微生物存活率随时间变化的曲线图。
具体实施方式
结合以下实施例对本发明作进一步描述。
实施例1
本实施例中，一种环保用复合微生物液体菌剂的保藏方法，包括以下步骤：
（1）进行环保用复合微生物的高密度发酵培养，得到高密度发酵液，对高密度发酵液以转速为4000rpm离心后，除去上清液，获得菌泥；
（2）用0.2mol/L磷酸盐缓冲液稀释菌泥，得到稀释后菌液，调整稀释后菌液中微生物的固含量为10%，pH为5.0；
（3）在稀释后菌液中添加保护剂后，密闭保藏，并置于阴凉干燥处。
优选地，所述保护剂由对羟基苯甲酸，吐温20，海藻糖和维生素C组成，对羟基苯甲酸、吐温20、海藻糖和维生素C的添加量分别为稀释后菌液重量的 0.5%、0.8%、2%和0.3%。
优选地，所述步骤（1）中，所述环保用复合微生物高密度发酵培养前由第一菌剂、第二菌剂和第三菌剂复配而成，所述第一菌剂、第二菌剂和第三菌剂的质量比为1:0.5:2。
所述一类菌种为产碱菌和节杆菌按质量比1:0.5组成的混合物，所述二类菌种为伯克氏菌、假诺卡氏菌、黄单胞菌、棒杆菌、红球菌、鞘氨醇单胞菌和戈登氏菌按质量比0.5:1.5:2.5:7:0.1:4:2组成的混合物，所述三类菌种为生丝微菌、乳酸杆菌和冢村氏菌按质量比4:3:5组成的混合物。
优选地，所述步骤（1）中，环保用复合微生物的高密度发酵培养包括以下步骤：
步骤A：将环保用复合微生物菌种接种于含基础培养基的摇瓶中，在15℃温度下震荡培养24 h，震荡培养转速为300rpm，得一级种子液；
步骤B：将步骤A得到的一级种子液按0.5%的接种量转接于一级种子罐中培养24h，培养温度为15℃，罐压为0.04MPa，通过调节搅拌桨转速和通气量控制种子罐中溶解氧溶解氧浓度为10%，得二级种子液；
步骤C：将步骤B得到的二级种子液按25%的接种量转接于发酵罐中进行分段发酵，流加磷酸和氢氧化钠将各段发酵的pH依次调整为7.6、7.0、6.5和5.6，各段的发酵时间均为12.5 h，发酵温度均为15℃，罐压均为0.04MPa，溶解氧浓度均为40%。
发酵过程中检测pH和溶解氧含量的变化，当发酵过程pH、溶解氧骤然上升，即碳源不足时，流加体积为发酵液6%的葡萄糖；当发酵过程pH骤然下降、溶解氧骤然上升，即氮源不足时，流加体积为发酵液1%的酵母粉。进一步地，所述葡萄糖的质量百分比浓度为50%；酵母粉的质量百分比浓度为15%。
优选地，所述基础培养基由以下质量百分比的原料组成：葡萄糖1.5%，硫酸铵0.5%，玉米浆干粉1.5%，磷酸二氢钠0.8%，乙酸钠0.2%，七水硫酸镁3.5%，微量元素补充剂0.5%，水余量。所述微量元素补充剂包括以下含量的成分：无水氯化钙0.03%，七水硫酸亚铁0.02%，七水硫酸锌0.02%，五水硫酸锰0.005%，五水硫酸铜0.0001%，硼酸0.0001%本实施例，分段发酵后组成环保用复合微生物的各微生物菌种含量均不少于108 CFU/mL。
如图6所示，按传统的分批发酵方法，菌体发酵速率不稳定，而且最终的发酵的菌浓(OD600)仅可达22.01，远远小于本发明高密度发酵的菌浓，不能满足实现生产需要。
本实施例的环保用复合微生物菌剂进行高密度发酵培养的生长曲线如图1所示，经过高密度发酵培养发酵的菌体浓度(OD600)为79，菌体湿重193g/L，微生物含量达7.8×1012CFU/mL，为环保用复合微生物液体菌剂产品的规模化生产奠定基础。
本实施例的微生物液体菌剂保藏时间大大延长，可达6个月，有效微生物含量可维持在109CFU/mL以上。
实施例2
本实施例中，一种环保用复合微生物液体菌剂的保藏方法，包括以下步骤：
（1）进行环保用复合微生物的高密度发酵培养，得到高密度发酵液，对高密度发酵液以转速为2500rpm离心后，除去上清液，获得菌泥；
（2）用0.2mol/L磷酸盐缓冲液稀释菌泥，得到稀释后菌液，调整稀释后菌液中微生物的固含量为6%，pH为5.5；
（3）在稀释后菌液中添加保护剂后，密闭保藏，并置于阴凉干燥处。
优选地，所述保护剂由对羟基苯甲酸，吐温20，海藻糖和维生素C组成，对羟基苯甲酸、吐温20、海藻糖和维生素C的添加量分别为稀释后菌液重量的 0.6%、0.5%、8%和0.1%。
所述步骤（1）中，所述环保用复合微生物高密度发酵培养前由第一菌剂、第二菌剂、和第三菌剂复配而成，所述第一菌剂、第二菌剂和第三菌剂的质量比为1:3:4。
优选地，所述第一菌剂为产碱菌、节杆菌、黄杆菌和假单胞菌按质量比为0.1:2:5:4组成的混合物；所述二类菌种为伯克氏菌、假诺卡氏菌、芽孢杆菌、棒杆菌、红球菌、鞘氨醇单胞菌、戈登氏菌按质量比为2:4:1:3:6:0.1:1组成的混合物；所述三类菌种为生丝微菌、乳酸杆菌和冢村氏菌按质量比2:3:4组成的混合物。
优选地，所述步骤（1）中，环保用复合微生物的高密度发酵培养包括以下步骤：
步骤A：将环保用复合微生物菌种接种于含基础培养基的摇瓶中，在25℃温度下震荡培养22h，震荡培养转速为120rpm，得一级种子液；
步骤B：将步骤A得到的一级种子液按20%的接种量转接于一级种子罐中培养24h，培养温度为25℃，罐压为0.02MPa，通过调节搅拌桨转速和通气量控制种子罐中溶解氧溶解氧浓度为60%，得二级种子液；
步骤C：将步骤B得到的二级种子液按20%的接种量转接于发酵罐中进行分段发酵，加入盐酸、尿素将各段发酵的pH依次调整为7.4、7.2、6.6和5.2，各段的发酵时间均为10.5h，发酵温度均为28℃，罐压均为0.02MPa，溶解氧浓度均为15%。优选地，步骤B和步骤C均采用基础培养基。
分段发酵过程中监测pH和溶解氧含量的变化，当碳源不足时，流加体积为发酵液体积2%的葡萄糖；当氮源不足时，流加体积为发酵液体积0.5%的酵母粉。进一步地，葡萄糖的质量百分比浓度为50%，酵母粉的质量百分比浓度为16%。
优选地，所述基础培养基由以下质量百分比的原料组成：葡萄糖1.5%，硫酸铵0.5%，玉米浆干粉1.5%，磷酸二氢钠0.4%，乙酸钠0.3%，七水硫酸镁1.0%，微量元素补充剂0.1%，水余量。
优选地，所述微量元素补充剂包括以下含量的成分：无水氯化钙0.03%，七水硫酸亚铁0.04%，七水硫酸锌0.01%，五水硫酸锰0.02%，五水硫酸铜0.0001%，硼酸0.0005%。分段发酵后组成环保用复合微生物的各微生物菌种含量均不少于108 CFU/mL。
本实施例的环保用复合微生物菌剂进行高密度发酵培养的生长曲线如图2所示，，经过高密度发酵培养发酵的菌体浓度(OD600)为91，菌体湿重220g/L，微生物含量达9.51×1012CFU/mL，为环保用复合微生物液体菌剂产品的规模化生产奠定基础。
本实施例的微生物液体菌剂保藏时间大大延长，可达6个月，有效微生物含量可维持在109CFU/mL以上。
实施例3
本实施例中，一种环保用复合微生物液体菌剂的保藏方法，包括以下步骤：
（1）进行环保用复合微生物的高密度发酵培养，得到高密度发酵液，对高密度发酵液以转速为4500rpm离心后，除去上清液，获得菌泥；
（2）用0.2mol/L磷酸盐缓冲液稀释菌泥，得到稀释后菌液，调整稀释后菌液中微生物的固含量为15%，pH为4.0；
（3）在稀释后菌液中添加保护剂后，密闭保藏，并置于阴凉干燥处。
优选地，所述保护剂由对羟基苯甲酸，吐温20，海藻糖和维生素C组成，对羟基苯甲酸、吐温20、海藻糖和维生素C的添加量分别为稀释后菌液重量的 0.6%、1.0%、6%和0.4%。
所述步骤（1）中，所述环保用复合微生物高密度发酵培养前由第一菌剂、第二菌剂、和第三菌剂复配而成，所述第一菌剂、第二菌剂和第三菌剂的质量比为2:3:0.4。
优选地，所述一类菌种为产碱菌、节杆菌、黄杆菌、假单胞菌按质量比2:1:1:2组成的混合菌种；所述二类菌种为伯克氏菌、短杆菌、假诺卡氏菌、黄单胞菌、芽孢杆菌、棒杆菌、戈登氏菌按2:3:2:1:1.5:0.5:1组成的混合菌种；所述三类菌种为生丝微菌、乳酸杆菌、冢村氏菌按质量比0.5:1:4组成的混合菌种。
优选地，所述步骤（1）中，环保用复合微生物的高密度发酵培养包括以下步骤：
步骤A：将环保用复合微生物菌种接种于含基础培养基的摇瓶中，在24℃下震荡培养22 h，震荡培养转速为110rpm，得一级种子液；
步骤B：将步骤A得到的一级种子液按20%的接种量转接于一级种子罐中培养24h，培养温度为32℃，罐压为0.08MPa，通过调节搅拌桨转速和通气量控制种子罐中溶解氧溶解氧浓度为35%，得二级种子液；
步骤C：将步骤B得到的二级种子液按10%的接种量转接于发酵罐中进行分段发酵，加入乙酸、氢氧化钠将各段发酵的pH依次调整为7.8、6.8、6.2和5.8，各段的发酵时间均为8h，发酵温度均为25℃，罐压均为0.08MPa，溶解氧浓度均为60%。
分段发酵过程中监测pH和溶解氧含量的变化，当碳源不足时，流加体积为发酵液体积5%的碳源，碳源由质量比为1:1的蔗糖和葡萄糖组成；当氮源不足时，流加体积为发酵液体积1%的氯化铵。进一步地，所述混合碳源的质量百分比浓度为50%；氯化铵的质量百分比浓度为18%。
优选地，所述基础培养基由以下质量百分比的原料组成：葡萄糖2%，硫酸铵0.5%，玉米浆干粉1.2%，磷酸二氢钠1.0%，乙酸钠0.15%，七水硫酸镁1.6%，微量元素补充剂2%，水余量。
优选地，所述微量元素补充剂包括以下含量的成分：无水氯化钙0.05%，七水硫酸亚铁0.02%，七水硫酸锌0.02%，五水硫酸锰0.005%，五水硫酸铜0.0008%，硼酸0.0001%。
分段发酵后组成环保用复合微生物的各微生物菌种含量均不少于108 CFU/mL。
本实施例的环保用复合微生物菌剂进行高密度发酵培养的生长曲线如图3所示，经过高密度发酵培养发酵的菌体浓度(OD600)为110，菌体湿重270g/L，微生物含量达1.1×1013CFU/mL，为环保用复合微生物液体菌剂产品的规模化生产奠定基础。
本实施例的微生物液体菌剂保藏时间大大延长，可达6个月，有效微生物含量可维持在109CFU/mL以上。
实施例4
本实施例中，一种环保用复合微生物液体菌剂的保藏方法，包括以下步骤：
（1）进行环保用复合微生物的高密度发酵培养，得到高密度发酵液，对高密度发酵液以转速为3500rpm离心后，除去上清液，获得菌泥；
（2）用0.18mol/L磷酸盐缓冲液稀释菌泥，得到稀释后菌液，调整稀释后菌液中微生物的固含量为20%，pH为4.0；
（3）在稀释后菌液中添加保护剂后，密闭保藏，并置于阴凉干燥处。
优选地，所述保护剂由对羟基苯甲酸，吐温20，海藻糖和维生素C组成，对羟基苯甲酸、吐温20、海藻糖和维生素C的添加量分别为稀释后菌液重量的0.6%、2.0%、5%和0.5%。
所述步骤（1）中，所述环保用复合微生物高密度发酵培养前由第一菌剂、第二菌剂、和第三菌剂剂复配而成，所述第一菌剂、第二菌剂和第三菌剂的质量比为1:1:2。
优选地，所述一类菌种为产碱菌、节杆菌、黄杆菌、假单胞菌按质量比2:1:4:0.5组成的混合物，所述二类菌种为伯克氏菌、短杆菌、假诺卡氏菌、黄单胞菌、棒杆菌、红球菌、鞘氨醇单胞菌和戈登氏菌按质量比1:4:7:2:3:1.5:0.1:2组成的混合物，所述三类菌种为生丝微菌、乳酸杆菌和冢村氏菌按质量比0.4:0.5:2组成的混合物。
优选地，所述步骤（1）中，环保用复合微生物的高密度发酵培养包括以下步骤：
步骤A：将环保用复合微生物菌种接种于含基础培养基的摇瓶中，在34℃温度下震荡培养18h，震荡培养转速为190rpm，得一级种子液；
步骤B：将步骤A得到的一级种子液按20%的接种量转接于一级种子罐中培养24h，培养温度为34℃，罐压为0.05MPa，通过调节搅拌桨转速和通气量控制种子罐中溶解氧溶解氧浓度为35%，得二级种子液；
步骤C：将步骤B得到的二级种子液按20%的接种量转接于发酵罐中进行分段发酵，加入硫酸、氨水将各段发酵的pH依次调整为7.6、7.0、6.5和5.6，各段的发酵时间均为7.25h，发酵温度均为34℃，罐压均为0.05MPa，溶解氧浓度均为19%。
分段发酵过程中监测pH和溶解氧含量的变化，当碳源不足时，流加体积为发酵液体积8%的碳源，碳源由质量比为1:1的蔗糖和葡萄糖组成；当氮源不足时，流加体积为发酵液体积1.5%的氯化铵。进一步地，所述混合碳源的质量百分比浓度为60%；氯化铵的质量百分比浓度为20%。
优选地，所述基础培养基由以下质量百分比的原料组成：葡萄糖3%，硫酸铵0.8%，酵母粉0.8%，磷酸二氢钠1.2%，乙酸钠0.2%，七水硫酸镁0.9%，微量元素补充剂0.1%，水余量。
优选地，所述微量元素补充剂包括以下含量的成分：无水氯化钙0.04%，七水硫酸亚铁0.03%，七水硫酸锌0.015%，五水硫酸锰0.01%，五水硫酸铜0.0005%，硼酸0.0003%。
本实施例的环保用复合微生物菌剂进行高密度发酵培养的生长曲线如图4所示，经过高密度发酵培养发酵的菌体浓度为菌浓(OD600)162，菌体湿重370g/L，微生物含量达2.23×1013CFU/mL。为环保用复合微生物液体菌剂产品的规模化生产奠定基础。
本实施例的微生物液体菌剂保藏时间大大延长，可达6个月，有效微生物含量可维持在109CFU/mL以上。
本实施例的其余内容同实施例1，这里不再赘述。
实施例5
本实施例中，一种环保用复合微生物液体菌剂的保藏方法，包括以下步骤：
（1）进行环保用复合微生物的高密度发酵培养，得到高密度发酵液，对高密度发酵液以转速为3000rpm离心后，除去上清液，获得菌泥；
（2）用0.22mol/L磷酸盐缓冲液稀释菌泥，得到稀释后菌液，调整稀释后菌液中微生物的固含量为12%，pH为6.0；
（3）在稀释后菌液中添加保护剂后，密闭保藏，并置于阴凉干燥处。
优选地，所述保护剂由对羟基苯甲酸，吐温20，海藻糖和维生素C组成，对羟基苯甲酸、吐温20、海藻糖和维生素C的添加量分别为稀释后菌液重量的 0.5%、1.5%、10%和0.5%。
优选地，所述步骤（1）中，所述环保用复合微生物高密度发酵培养前由第一菌剂、第二菌剂和第三菌剂复配而成，所述第一菌剂、第二菌剂和第三菌剂的质量比为1.3:1:2。
优选地，所述一类菌种为产碱菌和节杆菌按质量比0.5:7组成的混合物，所述二类菌种为伯克氏菌、假诺卡氏菌、黄单胞菌、棒杆菌、红球菌、鞘氨醇单胞菌和戈登氏菌按质量比1:4:7:5:10:2.5:0.1组成的混合物，所述三类菌种为生丝微菌和乳酸杆菌按质量比1:4组成的混合物。
优选地，所述步骤（1）中，环保用复合微生物的高密度发酵培养包括以下步骤：
步骤A：将环保用复合微生物菌种接种于含基础培养基的摇瓶中，在39℃温度下震荡培养14h，震荡培养转速为50rpm，得一级种子液；
步骤B：将步骤A得到的一级种子液按15%的接种量转接于一级种子罐中培养24h，培养温度为39℃，罐压为0.06MPa，通过调节搅拌桨转速和通气量控制种子罐中溶解氧溶解氧浓度为30%，得二级种子液；
步骤C：将步骤B得到的二级种子液按15%的接种量转接于发酵罐中进行分段发酵，加入硫酸、氢氧化钠将各段发酵的pH依次调整为7.6、7.0、6.5和5.6，各段的发酵时间均为7h，发酵温度均为39℃，罐压均为0.06MPa，溶解氧浓度均为34%。
分段发酵过程中监测pH和溶解氧含量的变化，当碳源不足时，流加体积为发酵液体积10%的碳源，碳源由质量比为1:1的蔗糖和葡萄糖组成；当氮源不足时，流加体积为发酵液体积1.5%的玉米浆干粉。进一步地，所述混合碳源的质量百分比浓度为46%；玉米浆干粉的质量百分比浓度为18%。
优选地，所述基础培养基由以下质量百分比的原料组成：葡萄糖2.5%，硫酸铵0.2%，玉米浆干粉1.2%，磷酸二氢钠1.2%，乙酸钠0.2%，七水硫酸镁0.5%，微量元素补充剂0.1%，水余量。
优选地，所述微量元素补充剂包括以下含量的成分：无水氯化钙0.03%%，七水硫酸亚铁0.04%，七水硫酸锌0.02%，五水硫酸锰0.005%，五水硫酸铜0.0008%，硼酸0.0001%。
本实施例的环保用复合微生物菌剂进行高密度发酵培养的生长曲线如图5所示，经过高密度发酵培养发酵的菌体浓度(OD600)为143，菌体湿重333g/L，微生物含量达1.99×1012CFU/mL，为环保用复合微生物液体菌剂产品的规模化生产奠定基础。
本实施例的微生物液体菌剂保藏时间大大延长，可达6个月，有效微生物含量可维持在109CFU/mL以上。
本实施例的其余内容同实施例1，这里不再赘述。
采用实施例1中步骤（1）的高密度发酵液直接置于阴凉干燥处，作为对比例，其有效微生物存活率随时间变化的曲线图如图7所示。本发明实施例1的有效微生物存活率随时间变化的曲线图如图8所示。
由上图可以看出，本发明的保藏方法工艺简单操作简单，成本低廉，保质期可达6个月，有效微生物含量可维持在109CFU/mL以上，在保证有效微生物含量的前提下，大大延长液体微生物菌剂的保存时间。
最后应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细地说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。

Claims (6)

1.一种环保用复合微生物液体菌剂的保藏方法，其特征在于：包括以下步骤：
（1）进行环保用复合微生物的高密度发酵培养，得到高密度发酵液，对高密度发酵液以转速为2500-4500rpm离心后，除去上清液，获得菌泥；
（2）用0.18-0.22mol/L磷酸盐缓冲液稀释菌泥，得到稀释后菌液，调整稀释后菌液中微生物的固含量为6-20%，pH为4.0-6.0；
（3）在稀释后菌液中添加保护剂后，密闭，并置于阴凉干燥处保藏；所述保护剂由对羟基苯甲酸、吐温20、海藻糖和维生素C组成，所述对羟基苯甲酸、吐温20、海藻糖和维生素C的添加量分别为稀释后菌液重量的 0.1-0.6%、0.5-2%、2-10%和0.1-0.5%；
所述步骤（1）中，环保用复合微生物的高密度发酵培养包括以下步骤：
步骤A：将环保用复合微生物菌种接种于含基础培养基的摇瓶中，在15-39℃下震荡培养10-24h，震荡培养转速为50-300rpm，得一级种子液；
步骤B：将步骤A得到的一级种子液按0.5-20%的接种量转接于一级种子罐中，培养10-24h，培养温度为15-39℃，罐压为0.02-0.08MPa，溶解氧浓度为5-65%，得二级种子液；
步骤C：将步骤B得到的二级种子液按5-25%的接种量转接于发酵罐中进行分段发酵，各段发酵的pH依次调整为7.4-7.8、6.8-7.2、6.2-6.6和5.2-5.8，各段的发酵时间均为5-12.5h，发酵温度均为15-39℃，罐压均为0.02-0.08MPa，溶解氧浓度均为5-60%；
所述步骤（1）中，所述环保用复合微生物在高密度发酵培养前由第一菌剂、第二菌剂、和第三菌剂复配而成，所述第一菌剂、第二菌剂和第三菌剂的质量比为1-2:0.1-3:1-5；
所述第一菌剂为产碱菌、节杆菌、黄杆菌和假单胞菌中的至少2种；所述第二菌剂为伯克氏菌、短杆菌、假诺卡氏菌、黄单胞菌、芽孢杆菌、棒杆菌、红球菌、鞘氨醇单胞菌和戈登氏菌中的至少7种；所述第三菌剂为生丝微菌、乳酸杆菌和冢村氏菌中的至少2种。
2.根据权利要求1所述的环保用复合微生物液体菌剂的保藏方法，其特征在于：所述基础培养基由以下质量百分比的原料组成：葡萄糖1.5-3%，硫酸铵0.2-0.8%，有机氮源0.5-1.5%，磷酸二氢钠0.4-2.5%，乙酸钠0.1-0.3%，七水硫酸镁0.5-1.6%，微量元素补充剂0.1-2%，水余量。
3.根据权利要求2所述的环保用复合微生物液体菌剂的保藏方法，其特征在于：所述微量元素补充剂包括以下含量的成分：无水氯化钙0.03-0.05%，七水硫酸亚铁0.02-0.04%，七水硫酸锌0.01-0.02%，五水硫酸锰0.005-0.02%，五水硫酸铜0.0001-0.0008%，硼酸0.0001-0.0005%。
4.根据权利要求2所述的环保用复合微生物液体菌剂的保藏方法，其特征在于：所述有机氮源为玉米浆、玉米浆干粉和酵母粉中的至少一种。
5.根据权利要求1所述的环保用复合微生物液体菌剂的保藏方法，其特征在于：所述步骤C中，调整分段发酵pH值所用酸为磷酸、硫酸、盐酸、乙酸和硝酸中的至少一种，所用碱为氢氧化钠、氢氧化钾、氨水和尿素中的至少一种。
6.一种环保用复合微生物液体菌剂产品，其特征在于：由以下制备方法制得：
（1）进行环保用复合微生物的高密度发酵培养，得到高密度发酵液，对高密度发酵液以转速为2500-4500rpm离心后，除去上清液，获得菌泥；
（2）用0.18-0.22mol/L磷酸盐缓冲液稀释菌泥，得到稀释后菌液，调整稀释后菌液中微生物的固含量为6-20%，pH为4.0-6.0；
（3）在稀释后菌液中添加保护剂后，密闭，得到环保用复合微生物液体菌剂产品；其中，所述保护剂由对羟基苯甲酸、吐温20、海藻糖和维生素C组成，所述对羟基苯甲酸、吐温20、海藻糖和维生素C的添加量分别为稀释后菌液重量的 0.1-0.6%、0.5-2%、2-10%和0.1-0.5%；
所述步骤（1）中，环保用复合微生物的高密度发酵培养包括以下步骤：
步骤A：将环保用复合微生物菌种接种于含基础培养基的摇瓶中，在15-39℃下震荡培养10-24h，震荡培养转速为50-300rpm，得一级种子液；
步骤B：将步骤A得到的一级种子液按0.5-20%的接种量转接于一级种子罐中，培养10-24h，培养温度为15-39℃，罐压为0.02-0.08MPa，溶解氧浓度为5-65%，得二级种子液；
步骤C：将步骤B得到的二级种子液按5-25%的接种量转接于发酵罐中进行分段发酵，各段发酵的pH依次调整为7.4-7.8、6.8-7.2、6.2-6.6和5.2-5.8，各段的发酵时间均为5-12.5h，发酵温度均为15-39℃，罐压均为0.02-0.08MPa，溶解氧浓度均为5-60%；
所述步骤（1）中，所述环保用复合微生物在高密度发酵培养前由第一菌剂、第二菌剂、和第三菌剂复配而成，所述第一菌剂、第二菌剂和第三菌剂的质量比为1-2:0.1-3:1-5；
所述第一菌剂为产碱菌、节杆菌、黄杆菌和假单胞菌中的至少2种；所述第二菌剂为伯克氏菌、短杆菌、假诺卡氏菌、黄单胞菌、芽孢杆菌、棒杆菌、红球菌、鞘氨醇单胞菌和戈登氏菌中的至少7种；所述第三菌剂为生丝微菌、乳酸杆菌和冢村氏菌中的至少2种。
CN201710641676.2A 2017-07-31 2017-07-31 一种环保用复合微生物液体菌剂及其保藏方法 Active CN109321464B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201710641676.2A CN109321464B (zh) 2017-07-31 2017-07-31 一种环保用复合微生物液体菌剂及其保藏方法

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201710641676.2A CN109321464B (zh) 2017-07-31 2017-07-31 一种环保用复合微生物液体菌剂及其保藏方法

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN109321464A CN109321464A (zh) 2019-02-12
CN109321464B true CN109321464B (zh) 2020-10-27

Family

ID=65244954

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201710641676.2A Active CN109321464B (zh) 2017-07-31 2017-07-31 一种环保用复合微生物液体菌剂及其保藏方法

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN109321464B (zh)

Families Citing this family (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN113462573A (zh) * 2021-07-12 2021-10-01 河北科技大学 农用芽孢杆菌液态菌剂的保存方法

Family Cites Families (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101109008A (zh) * 2006-07-18 2008-01-23 上海四季生物科技有限公司 一种含多种活性微生物的水体改良剂及其制备方法
CN101565240B (zh) * 2009-05-23 2011-01-05 无锡绿水之源生物科技有限公司 一种降氨氮和亚硝酸氮的水质改良微生态制剂的制备方法
CN102492642B (zh) * 2011-12-20 2013-04-17 江南大学 一株兼具硝化功能的反硝化菌株及包含该菌株的多种活性微生物的水体改良剂及制备方法
CN104480011B (zh) * 2014-09-16 2017-07-14 中国中化股份有限公司 复合菌剂的保护剂及用于处理工业废水的微生物制剂
CN104357326B (zh) * 2014-10-17 2018-04-20 中海油天津化工研究设计院有限公司 一种污水处理用液态菌剂的保存方法

Also Published As

Publication number Publication date
CN109321464A (zh) 2019-02-12

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN109321482B (zh) 一种环保用复合微生物菌剂固体颗粒产品及其制备方法
US11898140B2 (en) Hyperthermophilic aerobic fermentation inoculant prepared by using municipal sewage sludge and its method
Frankena et al. Effect of different limitations in chemostat cultures on growth and production of exocellular protease by Bacillus licheniformis
US9434969B2 (en) Manufacture of amides
US4393136A (en) Bacterial ethanol production
CN110982706B (zh) 一株白地霉及用其处理高氨氮沼液产单细胞蛋白的方法
CN106278493A (zh) 分级酶解法制备含寡糖海藻有机肥的方法
CN104611267A (zh) 一种生活垃圾低温高效降解功能复合菌剂及其制备方法和应用
CN106811426B (zh) 用于乳化原油的热堆肥芽孢杆菌菌株、培养方法及应用
CN112006066A (zh) 抑菌活性提高的混合发酵液及其制备方法和应用
CN109321464B (zh) 一种环保用复合微生物液体菌剂及其保藏方法
CN110982717B (zh) 一株蜂蜜酵母及用其处理高氨氮沼液产单细胞蛋白的方法
CN112961797A (zh) 一种嗜酸乳杆菌高密度发酵培养基及其应用
CN109321483B (zh) 一种环保用复合微生物菌剂的液体高密度发酵方法
Bognar et al. Control of nitrogenase in a photosynthetic autotrophic bacterium, Ectothiorhodospira sp
CN109182160A (zh) 一种促进海科贝特氏菌生长及絮凝剂积累的方法
CN111172062B (zh) 一株多食鞘氨醇杆菌及其应用
CN101555462B (zh) 苯胺类炼油废水深度处理菌剂及其制备方法
CN114854664A (zh) 一种贝莱斯芽孢杆菌yh-18高效产孢的工业化发酵方法
Chapatwala et al. Screening of encapsulated microbial cells for the degradation of inorganic cyanides
Farid et al. Production of oxytetracycline by immobilized Streptomyces rimosus cells in calcium alginate gels
Chang et al. Growth and production of cholesterol oxidase by alginate‐immobilized cells of Rhodococcus equi No. 23
Chapatwala et al. Degradative capability of Pseudomonas putida on acetonitrile
CN107299117B (zh) 一种用糖蜜生产酒精的方法
CN114736045A (zh) 一种盐碱地用矿源生物土壤改良剂及其制备方法

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant